CN108531591A - Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括有针对Septin9基因和NDRG4启动子基因的引物和探针，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3所示，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，以及SEQ ID NO.6所示。本发明通过发明人对Septin9和NDRG4基因甲基化检测的大量研究，对这两种基因的引物和探针进行探索和优化，使其实现在同一个检测系统同时检测，该试剂盒能够提高对样本检测诊断结果的真实性，还能够检测血浆样本中极低浓度的Septin9和NDRG4基因甲基化片段，提高对早期大肠癌患者诊断的灵敏度，同时还具有高度的特异性。

Description

Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人外周血循环肿瘤DNA中Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用。
背景技术
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠恶性肿瘤起源于粘膜下间叶组织，其中由大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性肿瘤统称为大肠癌，癌症发生部位为盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠，所以也称为结直肠癌。
结直肠癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，据统计，2012年全球约有694000例结直肠癌的死亡病例。欧洲结直肠癌新发病例约有447000人，死亡病例约有215000人，美国结直肠癌新发病例约有142820人，死亡病例约有50830人，而在中国，结直肠癌在2012年的新发病例约有400000人，已成为中国人发病率及死亡率第三高的疾病。
结直肠癌是世界范围内导致人类死亡的重大疾病，其病死率在肿瘤疾病中排名第三位。分析其原因，主要是多数患者就诊时结直肠癌已属于中晚期，错过了最佳治疗时机。目前对于结直肠癌早期筛查的方法有限，结肠镜检查因其自身侵入特点、取样不便，粪便隐血试验因特异性低而得不到广泛应用，因此寻找一种简单、快捷、灵敏、特异的标记物成为这领域研究的热点。
大肠癌Septin9及NDRG4基因检测是一种基于荧光定量PCR方法，针对外周血血浆生物标记物的甲基化进行检测，其样品采集方便，检测周期短。一项针对中国人群大肠癌患者研究中，在87例结直肠癌中，癌组织SEPT9检出率为80.5％(70/87)，癌旁组织检出率为8.0％(7/87)，二者比较差异非常显著(P0.01)，特异性为91.9％；结直肠癌外周血SEPT9基因甲基化检测结果与组织检测结果基本一致。SEPT9基因甲基化与大于65岁老年患者和右半结肠癌显著相关；在84例结直肠癌中，癌组织NDRG4检出率为81％，癌旁组织检出率为8.3％，特异性为91.7％；外周血SEPT9、NDRG4基因甲基化联合检测可提高结直肠癌的敏感度。另一项针对多名大肠癌病人(CRC)经肠镜确诊的CRC病例和阴性质控品的研究报道中，都表明可以在CRC病人的血浆中通过检测Septin9和NDRG4基因的甲基化而查到癌细胞的DNA。
EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒Epi proColon2.0CE提供了一种通过PCR荧光探针法检测Septin9基因甲基化的方法，但是，该方法在临床检测中存在着缺陷，如特异性和灵敏度的问题，99例正常的对照受检者中，其中96例样本结果为阴性，其临床特异性为97％，在98例被确诊结直肠癌的样本中，其中79例样本检测为阳性，其临床敏感度为81％，56个早期结直肠癌患者中，Septin9基因甲基化检测试剂盒test检测阳性的有43人(77％)，其中I期18例，II期25例，因此只限于临床诊断辅助试剂盒；适用机型为ABI 7500fast/fast DX及Roche 480I/II，而上述机型的普及率很低，导致很多医院无法顺利开展该检测，临床的推广和普及更加困难。因此，若想顺利推广大肠癌基团甲基化的临床检测，特异性、灵敏度和适用机型是必须要解决的问题。
发明内容
为了解决现在技术中存在的问题，本发明的目的之一，是提供一种Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，该试剂盒可以通过同时Septin9基因和NDRG4启动子基因甲基化多重PCR检测，具有高特异性和灵敏度，并具有很好的仪器适应性。
实现上述目的技术方案如下：
一种Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，包括有针对Septin9基因和NDRG4启动子基因的引物和探针，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3所示，
所述针对NDRG4启动子基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，以及SEQ ID NO.6所示。
在其中一个实施例中，还包括有内参引物和内参探针，所述内参引物的序列如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述内参探针的序列如SEQ ID NO.9所示。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有核酸提取试剂，所述酸提取试剂包括核酸裂解吸附液，所述核酸裂解吸附液组成为2M盐酸胍、15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、5％SDS、4M异硫氰酸胍、10％无水乙醇、10％异丙醇、30％甘油和纯化水。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有核酸提取试剂，所述酸提取试剂包括蛋白酶K溶液，所述蛋白酶K溶液组成为25mg/ml蛋白酶K、25mMTris-HCl、25mM氯化钾、50mM氯化钠、50mM氯化钙、10％TritonX-100、40％甘油和纯化水。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有亚硫酸盐转化试剂，所述亚硫酸盐转化试剂包括有转化液，所述转化液组成为50％亚硫酸氢铵、20％亚硫酸铵、20％亚硫酸氢钠、2M氢氧化钠和纯化水。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有亚硫酸盐转化试剂，所述亚硫酸盐转化试剂包括有结合液，所述结合液组成为10％TritonX-100、100mM Tris-HCl、5M异硫氰酸胍、2M氯化钠、20％异丙醇、30％甘油和纯化水。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有亚硫酸盐转化试剂，所述亚硫酸盐转化试剂包括有脱磺液，所述脱磺液组成为5M氢氧化钠、10mMTris-HCl、95％异丙醇、100mM氯化钠、和纯化水。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；其中，所述阴性质控品包括四季青牛血清白蛋白溶液和100pg/ml Septin9及NDRG4基因非甲基化的人基因组DNA，所述阳性质控品包括四季青牛血清白蛋白溶液和25pg/ml Septin9及NDRG4基因甲基化的人基因组DNA。
本发明的另一目的是提供了上述检测试剂盒的使用方法。
一种人外周血循环肿瘤DNA中Septin9及NDRG4基因甲基化检测试剂盒的使用方法，所述方法包括：
(a)外周血血浆分离后用核酸提取试剂根据磁珠法提取游离DNA；
(b)用亚硫酸盐转化试剂将游离DNA亚硫酸盐转化；
(c)用引物和探针将亚硫酸盐转化后的DNA进行实时荧光定量PCR检测。
本发明通过发明人对Septin9和NDRG4基因甲基化检测的大量研究，对这两种基因的引物和探针进行探索和优化，使其实现在同一个检测系统同时检测，该试剂盒能够提高对样本检测诊断结果的真实性，还能够检测血浆样本中极低浓度的Septin9和NDRG4基因甲基化片段，提高对早期大肠癌患者诊断的灵敏度，同时还具有高度的特异性。本发明使用两个标记物目的基因Septin9和NDRG4同一个检测系统同时检测，以市场上的单目标基因Septin9检测产品EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒和本发明试剂盒进行对医院收集到早期大肠癌患者进行检测诊断，本发明能够检测出早期大肠癌患者阳性率比EpigenomicsAG公司的试剂盒高出21.5％。
此外，本发明还优化了整个检测系统，本发明所述的试剂盒能够适用于多种荧光PCR仪，有良好的仪器兼容性，方便于医院和第三方检验机构开展工作。
附图说明
图1实施例7中灵敏度测试实验结果图。
图2实施例8中所述试剂盒检测样本特异性实验结果图-健康人20例。
图3实施例8中所述试剂盒检测样本特异性实验结果图-胃癌20例、小肠癌20例。
图4实施例8中所述试剂盒检测样本特异性实验结果图-肝癌20例、肺癌20例
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒
包括有针对Septin9基因和针对NDRG4基因以及内参基因的引物和探针，生工Sangon Biotech合成，具体组成如下：
所述的引物、探针有Septin9基因的V2区域甲基化特异引物、探针：
正向引物：5’-GGTTTTTCGTTGGTGTTATGG-3’SEQ ID NO:1
反向引物：5’-GCGACTAACAAACAAAATCCC-3’SEQ ID NO:2
探针：5’FAM-TCGTATGTTCGTTTTGCGTTTTTCGG-BHQ3’SEQ ID NO:3
所述的引物、探针有NDRG4启动子的甲基化特异引物、探针：
正向引物：5’-TAAATAAAGATTACGGTAGCGTC-3’SEQ ID NO:4
反向引物：5’-CGAACTATACTAAATACGCTACG-3’SEQ ID NO:5
探针：5’ROX-CGGGAATTCGACGTCGCGCGGTTATAGG-BHQ3’SEQ ID NO:6
所述的引物、探针有ACTB内参基因引物、探针：
正向引物：5’-AGCCAATGGGACCTGCTCCTC-3’SEQ ID NO:7
反向引物：5’-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGC-3’SEQ ID NO:8
探针：5’JOE-TGTGTCTGCCACTGTGTGCTGGGTG-BHQ3’SEQ ID NO:9
还包括质控品试剂，分别是阳性质控品，由四季青牛血清白蛋白和25pg/mlSeptin9及NDRG4基因甲基化的人基因组DNA组成；阴性质控品，由四季青牛血清白蛋白和100pg/ml Septin9及NDRG4基因非甲基化的人基因组DNA组成，其中Septin9及NDRG4基因非甲基化的人基因组DNA为企业购买的TAKALA公司的HCT116细胞非甲基化基因组DNA使用超纯水稀释，Septin9及NDRG4基因甲基化的人基因组DNA为企业购买的TAKALA公司的HCT116细胞甲基化基因组DNA使用超纯水稀释。
所述试剂盒还包括核酸提取及亚硫酸盐转化试剂，作用是提取血浆中游离的DNA，并将提取出来的DNA进行亚硫酸盐转化；所述核酸提取及亚硫酸盐转化试剂包括裂解液，蛋白酶K溶液，结合液，转化液，磁珠，洗涤液，脱磺液，洗脱液；其中所述核酸裂解吸附液组成为2M盐酸胍、15％TritonX-100、30mM Tris-HCl、5％SDS、4M异硫氰酸胍、10％无水乙醇、10％异丙醇、30％甘油和纯化水；所述蛋白酶K溶液组成为25mg/ml蛋白酶K、
25mMTris-HCl、25mM氯化钾、50mM氯化钠、50mM氯化钙、10％TritonX-100、40％甘油和纯化水；所述转化液组成为50％亚硫酸氢铵、20％亚硫酸铵、20％亚硫酸氢钠、2M氢氧化钠和纯化水；所述结合液组成为10％TritonX-100、100mM Tris-HCl、5M异硫氰酸胍、2M氯化钠、20％异丙醇、30％甘油和纯化水；所述脱磺液组成为5M氢氧化钠、10mMTris-HCl、95％异丙醇、100mM氯化钠、和纯化水。
实施例2.所述试剂盒的应用
血浆分离及游离DNA提取
1.血浆分离
1)用K2EDTA或游离核酸采血管，按照生产厂家建议采血10mL；
2)将采血管放入离心机进行离心，转速1350±150rcf，离心12分钟；
3)把血浆转移到聚丙烯材质，圆锥底的15mL离心管中，再次离心，转度1350±150rcf，离心12分钟；
4)收集3.5mL的血浆加入新的离心管中，标记好样本号；
5)收集完成的血浆样本至于-20℃保存。
2.游离DNA的提取
1)在15mL离心管中加入3.5mL血浆样本，然后依次加入350μL蛋白酶K溶液、8.75mL核酸裂解吸附液和35μL磁珠，涡旋混匀，把离心管在56℃中放置10分钟。
2)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入1mL洗液A，混匀确保磁珠彻底重悬，将悬浮磁珠移至到1.5mL的离心管中；
3)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入0.6mL洗液B，混匀确保磁珠彻底重悬；
4)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入0.6mL洗液C，混匀确保磁珠彻底重悬；
5)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10-100μL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥2分钟；
6)加入50μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠,把离心管在56℃中孵育3分钟；
7)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的0.2mL PCR管中。
2.游离DNA亚硫酸盐转化
1)50μL DNA的0.2mL PCR管中加入100μL亚硫酸盐溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀后短暂离心，将离心管置于普通PCR仪中进行反应，反应条件设置为95℃5分钟、60℃10分钟、95℃5分钟、60℃10分钟；
2)将反应结束后的DNA溶液转移到新的1.5mL离心管中，加入600μL结合液和2μL磁珠涡旋混匀，室温静置5分钟；
3)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
4)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL脱磺液，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，室温静置15分钟；
5)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
6)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500μL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
7)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入250μL洗液C，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
8)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10-100μL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥2分钟；
9)加入50μL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠,把离心管在56℃中孵育4分钟；
10)将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的1.5mL PCR管中备用。
荧光定量PCR检测目的基因
1.试剂准备
1)从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并瞬时低速离心备用；
2.加样
在准备好试剂的PCR反应管中分别加入待测样本DNA、阴性质控品、阳性质控品，每个待测样本、阴性质控品、阳性质控品重复3管，每管PCR反应液中各加15μL，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
3.荧光定量PCR检测
1)样品设置：根据样本类型设置样本编号、阴性质控和阳性质控；
2)荧光通道选择：每个样本选择FAM、HEX(JOE)和ROX共3个通道。参比荧光(Passive Reference)设置为none；
3)反应条件设定如下表(反应体积设定为50μL)：
4)保存文件，运行程序
4.结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End值可设在10～20，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为undet)，点击Analysis自动获得分析结果。
结果判定
单个PCR反应的结果解释根据表2所示。如果内参ACTB显示单个中加入DNA的量足够的话(ACTB Ct值见表3中)，那么Septin9及NDRG4结果视为本次PCR反应结果。如果ACTB的Ct值大于表2中所设的阈值，那么定义该PCR反应为“无效”。
表2：对单个PCR反应结果的解释
如果Septin9三次重复PCR反应中有两次阳性，则病人样本的测试结果为“阳性”，如果NDRG4三次重复PCR反应中有两次阳性，则病人样本的测试结果为“阳性”，如果Septin9及NDRG4三次结果均有两次为阴性，则病人样本的测试结果为阴性。如果结果为其它情况,视为无效。
实施例3.仪器适用性研究
选用ABI 7500荧光PCR仪与天隆科技TL988荧光PCR仪进行对试剂盒的灵敏度、特异性的比较，实验步骤如下：
1)从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并瞬时低速离心备用；
2)取35μLPCR反应液加入到200μLPCR小管进行分装；
3)加样为参考品LC，PCR重复20次；
4)进行平行实验在两种仪器上检测目的基因。
实验结果：ABI 7500荧光PCR仪检测到20次为septin9及NDRG4阳性，且内参扩增正常，相同的实验方法在天隆科技TL988荧光PCR仪的结果与ABI 7500灵敏度一致。
实施例4.企业试剂盒对比实验
使用EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒做为本发明的对比试剂盒，本发明的优点在于比对比试剂盒多一项NDRG4甲基化检测，能提高阳性样本的检出率。
1)样本收集
在一家三甲肿瘤医院选择100例按临床分期设计组织学确诊的结直肠癌样本和100例肠镜检测阴性的正常样本，涵盖不同发展阶段，年龄36～81岁，平均年龄53岁。全部受检者抽血前空腹，使用K2EDTA采血管抽血10mL，当天分离血浆后-20℃保存。
2)样本处理
血浆样本按本发明实施例1所述试剂盒的组成的游离DNA提取方法对全部血浆样本进行提取，提取得到的DNA按本发明亚硫酸盐转化程序进行转化处理，最终得到纯化的DNA进行4℃保存，待后续检测使用；相同的血浆样本按对比试剂盒的说明书要求进行处理。
3)PCR检测
分别从冰箱拿出两个试剂盒的PCR反应液放置室温解冻，各自按该试剂盒说明书(本发明试剂盒的操作参见实施例2)进行操作，加样量同一为30uL，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测。
4)实验结果与分析
本发明试剂盒数据结果：在100例正常的对照受检者中，其中99例样本结果为阴性，其临床特异性为99％，在100例被确诊结直肠癌的样本中，其中96例样本检测为阳性，其临床敏感度为96％。56个早期结直肠癌患者中，试剂盒检测阳性的有52人(92.9％)，其中I期23例，II期29例；对比试剂盒数据结果：100例正常的对照受检者中，其中97例样本结果为阴性，其临床特异性为97％，在100例被确诊结直肠癌的样本中，其中81例样本检测为阳性，其临床敏感度为81％。56个早期结直肠癌患者中，试剂盒检测阳性的有40人(71.4％)，其中I期17例，II期23例，结论是从上述的实验结果可以看出本发明的实施例1所述试剂盒在早期结直肠癌患者中的检出率会比博尔城公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒的检出率高。
实施例5试剂盒游离DNA提取试剂对比实验
使用QIAGEN公司的血浆游离DNA提取试剂盒和EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒里面的血浆游离DNA提取试剂与本发明实施例1所述血浆游离DNA提取试剂做对比实验，比较各自试剂盒的血浆游离DNA提取试剂对血浆的游离DNA提取效率。
实验步骤：1.采血
1)挑选3免健康的受试者，使用K2EDTA采血管，采血10mL，两管；
2)将采血管放入离心机进行离心，转速1350±150rcf，离心12分钟；
3)把血浆转移到聚丙烯材质，圆锥底的15mL离心管中，再次离心，转度1350±150rcf，离心12分钟，再将同一名的受试者的两支血浆混合为一管；
2.血浆游离DNA提取
1)使用QIAGEN公司、EpigenomicsAG公司和本发明实施例1的血浆游离DNA提取试剂，各自按说明书进行血浆游离DNA提取，样本血浆量统一为3.5ml，最终洗脱为60ulDNA；
3.qPCR检测DNA含量
使用设计好的β-Actin基因特异扩增的引物和探针，引物对及探针核酸序列如下，
β-Actin基因正向引物F：5’-GCGACTGAGGATGTTCAG-3’SEQ ID NO:10
β-Actin基因反向引物R：5’-ATACGTCAGGATGTTCCA-3’SEQ ID NO:11
β-Actin基因探针P：5’JOE-CACCACGAGTCACTACTAACACGAA-BHQ3’SEQ ID NO:12
与TAKALA公司的Premix EX Taq试剂配制PCR反应液，配制表如下：
配制好PCR反应液分装到PCR八联管中，每孔量为40ul，DNA加样为10ul，总体系为50ul，使用仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪，设置温度程序为：95℃,5min,(95℃,5s变性,55℃35s退火、延伸及检测荧光,40个循环)，荧光通道选择为JOE，反应体积50ul；
4.结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，如下表：
从上表的结果来看，本发明的试剂与另两个试剂盒的血浆游离DNA提取试剂相互比较，Ct值差异都很小，说明三个试剂盒的提取血浆的游离DNA效率相当一致。
实施例6试剂盒DNA亚硫酸盐转化试剂对比实验
使用QIAGEN公司的DNA亚硫酸盐转化试剂盒和EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂盒里面的DNA亚硫酸盐转化试剂与本发明实施例1所述的DNA亚硫酸盐转化试剂做对比实验，比较各自试剂盒的DNA亚硫酸盐转化试剂对甲基化DNA转化效率。
实验步骤：
1.DNA亚硫酸盐转化
1)样本选择为企业购买的TAKALA公司的HCT116细胞甲基化基因组DNA和正常HCT116细胞未甲基化基因组DNA,再分别稀释甲基化DNA成100pg/ml、25pg/ml两个浓度，和稀释未甲基化DNA成10ng/ml、1ng/ml两个浓度；
2)使用QIAGEN公司、EpigenomicsAG公司和本发明实施例1的DNA亚硫酸盐转化试剂，各自按说明书的温度程序和实验方法进行DNA转化，样本DNA量统一为10ul，再按说明书要求量补充ddH2O,最终洗脱为50ulDNA；
2.qPCR检测DNA转化效率
使用QIAGEN公司、EpigenomicsAG公司和本发明实施例1的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂PCR反应液，分别进行检查，各自按说明书要求分装PCR反应液到八联管，DNA加样统一为10ul，再按说明书要求量补充ddH2O，统一使用仪器ABI 7500荧光定量PCR仪进行实验，扩增温度程序及荧光通道按各自说明书要求设置；
3.结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，如下表：
表5：EpigenomicsAG公司的大肠癌Septin9基因甲基化检测试剂PCR反应液结果
表6：本发明PCR反应液结果
从上表的结果来看，本发明的实施例1所述试剂与QIAGEN公司试剂盒的DAN转化试剂相互比较，Ct值差异都很小，说明本发明实施例1所述的试剂与QIAGEN公司试剂盒DNA转化的效率相当一致，而本发明实施例1的试剂与EpigenomicsAG公司相比，EpigenomicsAG公司比本发明差了1-2个Ct值，也就是转化效率比本发明实施例1的转化试剂效率差2-4倍。在高浓度的未甲基化DNA 10ng/ml中EpigenomicsAG公司的检测通道FAM为阳性，结果为假阳性，本发明的试剂与QIAGEN公司试剂盒为阴性，导致假阳结果，可能原因是EpigenomicsAG公司的试剂对高浓度的未甲基化DNA转化不完全造成样本结果为假阳性。由数据分析来看，本发明实施例1的转化试剂效率可以与QIAGEN公司试剂盒的一致，对高浓度的未甲基化DNA转化效率完全，特异性好。
实施例7试剂盒灵敏度测试试验
1)样本选择
样本选择为企业购买的TAKALA公司的HCT116细胞甲基化基因组DNA,使用超纯水将其稀释为甲基化DNA成100pg/ml，再4倍梯度稀释分别为25pg/ml、6.25pg/m、l.56pg/ml，共4个浓度，企业购买的TAKALA公司的HCT116细胞未甲基化基因组DNA,使用超纯水将其稀释为甲基化DNA成10ng/ml作为阴性对照组，超纯水作为空白对照组。
2)样本荧光定量PCR检测
取出试剂盒的PCR反应液放置室温解冻，试剂盒说明书(试剂盒的组成参见实施例1，具体操作参见实施例2)进行操作，每个检查组样本重复2管,阴性组、空白组重复4管，每管PCR反应液中各加15μL，盖紧管盖后，瞬时低速离心，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测。
3)实验结果与分析
从上表的结果来看，本发明的实施例1所述PCR反应液试剂能够检测到HCT116细胞甲基化基因组DNA浓度1.56pg/ml，具有极高的灵敏度。本发明试剂可大大提高针对甲基化DNA含量低的样本检测结果阳性检出率，有效地对早期大肠癌患者作出真实的诊断。参见图1。
实施例8试剂盒样本检测特异性试验
1)样本选择
选择肠镜检测为正常的健康人、临床确诊为胃癌、小肠癌、肝癌、肺癌患者，各20名，涵盖不同发展阶段，年龄36～81岁，平均年龄53岁。
2)样本处理
全部受检者抽血前空腹，使用K2EDTA采血管抽血10mL，当天分离血浆，将血浆样本以及试剂盒的阴阳性质控品一同进行游离DNA提取及亚硫酸盐转化，按试剂盒说明书(试剂盒的组成参见实施例1，具体操作参见实施例2)进行操作。
3)样本荧光定量PCR检测
取出试剂盒的PCR反应液放置室温解冻，试剂盒说明书(参见实施例2)进行操作，每个待测样本、阴性质控品、阳性质控品重复3管，每管PCR反应液中各加15μL，盖紧管盖后，瞬时低速离心，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测。
4)实验结果与分析
参见图2-图4。在100例受检者中，其中健康人20例均检测为阴性，特异性100％；其中临床确诊为胃癌患者20例中均检测为阴性，特异性100％；小肠癌患者20例中均检测为阴性，特异性100％；肝癌患者20例中均检测为阴性，特异性100％；肺癌患者20例中均检测为阴性，特异性100％。100例样本中均为阴性，特异性100％，从数据中分析，可见本发明对大肠癌检测特异性极好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州瑞博奥生物科技有限公司
<120> Septin9及NDRG4基因甲基化的检测试剂盒和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtttttcgt tggtgttatg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgactaaca aacaaaatcc c 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtatgttc gttttgcgtt tttcgg 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taaataaaga ttacggtagc gtc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaactatac taaatacgct acg 23
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggaattcg acgtcgcgcg gttatagg 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agccaatggg acctgctcct c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtgatgga ggaggctcag c 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtgtctgcc actgtgtgct gggtg 25

Claims (10)

1.一种Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，包括有针对Septin9基因和NDRG4启动子基因的引物和探针，所述针对Septin9基因的引物和探针的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3所示；所述针对NDRG4基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，以及SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，还包括有内参引物和内参探针，所述内参引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述内参探针的序列如SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求1或2所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括有核酸裂解吸附液，蛋白酶K溶液，磁珠，洗涤液，洗脱液。
4.根据权利要求3所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸裂解吸附液包括有1M～5M盐酸胍、10％～20％TritonX-100、10mM～100mM Tris-HCl、1％～5％SDS、2M～8M异硫氰酸胍、10％～20％无水乙醇、10％～20％异丙醇、30％～50％甘油和纯化水；和/或
所述蛋白酶K溶液组成为5～50mg/ml蛋白酶K、10mM～100mMTris-HCl、10mM～100mM氯化钾、10mM～100mM氯化钠、10mM～100mM氯化钙、10％～20％TritonX-100、30％～50％甘油和纯化水；和/或
所述洗涤液包括洗液A、洗液B和洗液C，所述洗液A和洗液B组成为2M～8M盐酸胍、10mM～100mM氯化钠、10％～20％无水乙醇、10％～20％异丙醇和纯化水，所述洗液C组成为80％～95％无水乙醇、80％～95％异丙醇、10mM～100mM氯化钠、和纯化水。
5.根据权利要求1或2所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，还包括有亚硫酸盐转化试剂，所述亚硫酸盐转化试剂包括有转化液，结合液，脱磺液，磁珠，洗涤液，洗脱液。
6.根据权利要求5所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，，所述转化液组成为50％～60％亚硫酸氢铵、20％～30％亚硫酸铵、20％～30％亚硫酸氢钠、2M～8M氢氧化钠和纯化水；
所述结合液组成为10％～20％TritonX-100、10mM～100mM Tris-HCl、2M～8M异硫氰酸胍、2M～8M氯化钠、10％～20％无水乙醇、10％～20％异丙醇、30％～50％甘油和纯化水；
所述脱磺液组成为0.5～5M氢氧化钠、10mM～100mMTris-HCl、80％～95％无水乙醇、80％～95％异丙醇、10mM～100mM氯化钠、和纯化水。
7.根据权利要求1或2所述的Septin9和NDRG4基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；其中，所述阴性质控品包括四季青牛血清白蛋白溶液和100pg/ml Septin9及NDRG4基因非甲基化的人基因组DNA，所述阳性质控品包括四季青牛血清白蛋白溶液和25pg/ml Septin9及NDRG4基因甲基化的人基因组DNA。
8.权利要求1-7任一项所述的Septin9及NDRG4基因甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)外周血血浆分离后用核酸提取试剂根据磁珠法提取游离DNA；
(b)用亚硫酸盐转化试剂将游离DNA亚硫酸盐转化；
(c)配置反应体系，用所述引物和探针将亚硫酸盐转化后的DNA进行实时荧光定量PCR检测。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，DNA亚硫酸盐转化反应条件设置为95℃ 5分钟、60℃ 10分钟、95℃ 5分钟、60℃ 10分钟。
10.根据权利要求8或9所述的使用方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应条件如下：
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