CN112143814A - 一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂，该生物标志物包括外泌体ecDNA生物标志物C‑myc、EGFR和CyclinD1，作为预测早期肺癌的生物标志物。本发明首次提出并验证了外泌体ecDNA作为生物标志物表达水平用于肺癌早诊时具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的优点，对于肺癌早期诊断具有重要意义。

Description

一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂 及其用途

技术领域

本发明涉及疾病早期检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂。

背景技术

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌早期病情隐匿，通常无任何症状，但大部分患者在初诊时已处于中晚期，失去了手术切除的机会。晚期肺癌患者的五年生存率不足5％，而早期肺癌患者的五年生存率可达90％以上。因此，早期诊断是肺癌患者获得良好预后的一个重要机会。

外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。

ecDNA是近期肿瘤学领域的研究热点，ecDNA指的是从染色体上脱落以环状结构存在的DNA。研究表明ecDNA普遍存在于肿瘤细胞中，是生物标志物的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并与肿瘤的发生、发展密切相关。

目前肺癌的早期诊断主要是根据早期临床症状、影像学、支气管镜活检以及痰液脱落细胞学等各方面配合进行诊断，但都具有其缺点和局限性。

肺癌在早期通常以肺结节的形式出现。利用影像学技术可以检测出肺结节发生。影像学是利用X射线的透射性与摄影效应使人体内部结构和器官形成影像。人体组织结构是由不同元素所组成，各种组织单位体积内各元素量总和的大小而有不同的密度。基于人体组织有密度和厚度的差别，密度高对X线吸收多，照片上呈白影；密度低X线吸收少，照片上呈黑影。从而通过成像了解人体解剖与生理功能状况以及病理变化，以达到诊断的目的。但采用影像学技术进行检测，受制于深浅组织的影像相互重叠和隐藏，有时需要多次多角度拍摄X光片才能清楚分辨，操作难度大，对人员专业水平要求很高；X射线能穿透人体组织，有可能使人体体液和组织细胞产生生理和生物化学改变，引起不同程度的损伤；采用影像学技术误漏诊率高、特异性差。

支气管镜检查是将细长的支气管镜经口或鼻置入患者的下呼吸道，即经过声门进入气管和支气管以及更远端，直接观察气管和支气管的病变，并根据病变进行相应的检查和治疗。大多数肺部及气道疾病，如肿瘤、间质性肺病、肉芽肿性疾病以及某些感染性疾病需要通过经支气管镜活检术来确定诊断，这是最常用的一项检查项目。但支气管镜活检属于“盲穿”，精准率偏低；实施过程中有穿刺到血管的危险，对病人有较大的风险。

咳嗽会产生强大的气流，会使肿瘤细胞更容易脱落和痰液一起被咳出，肺部脱落细胞学检查是肺癌早期诊断的重要方法之一。痰液细胞学检查就是将怀疑肺癌患者排出的痰液进行涂片，然后在显微镜下观察，根据涂片中细胞形态特点，检查癌前病变,恶性肿瘤细胞或癌细胞，做出初步的细胞类型诊断。但在实际使用中，样本采集要求较高，且仅能作为一种初步的定性诊断；由于诊断细胞学主要是观察细胞形态变化而看不到组织结构的改变，因此存在一定的局限性，易出现假阴性或假阳性。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂，利用人血液或体液外泌体ecDNA作为生物标志物区分早期肺癌患者时具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的优点，能够辅助肺癌早期诊断。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括外泌体ecDNA生物标志物，所述外泌体ecDNA生物标志物为C-myc、EGFR和CyclinD1的组合。

进一步地，所述C-myc、EGFR和CyclinD1的外泌体ecDNA组合生物标志物在肺癌患者的外泌体中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。

进一步地，所述对照样本为非肺癌患者样本。

本发明还涉及一种用于肺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如上所述的检测试剂。

本发明还涉及一种使用如上所述检测试剂在制备通过如下方法进行肺癌早期诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、采集疑似为肺癌患者的血液或体液样本，分离并纯化样本中的外泌体；

S2、分离并纯化外泌体中的ecDNA；

S3、对ecDNA生物标志物C-myc、EGFR和CyclinD1的组合进行表达检测和关联性分析。

进一步地，所述步骤S1包括使用含有沉淀剂和洗涤剂A的沉淀法分离并纯化样本中的外泌体；所述沉淀剂包括终浓度为10％至60％的PEG10000；所述洗涤液A包括终浓度为0.1至30mmol/L的KH₂PO₄和终浓度为0.3-28mmol/L的Na₂H₂PO₄。

进一步地，所述所述沉淀剂包括终浓度为15％的PEG10000；所述洗涤液A包括终浓度为1mmol/L的KH₂PO₄和终浓度为4mmol/L的Na₂H₂PO₄。

进一步地，所述步骤S2包括使用含有裂解液、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶K、外切酶、ATP和EDTA的磁珠法分离并纯化外泌体中的ecDNA；所述裂解液包括终浓度为1至5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5至10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.01至1g/ml的Polidocanol和体积百分比为5至45％的乙醇；所述洗涤液B包括终浓度为0.1至5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为50至100mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为0.5％至5％的Tween-20和体积百分比为30至80％的乙醇；所述洗涤液C包括终浓度为0.1至5mol/L的NaCl和终浓度为1至20mmol/L的Tris-HCl；所述洗脱液为终浓度5至20mmol/L、pH为8.5的Tris-HCL；所述磁珠悬液包括终浓度为1至30mg/mL且直径为300nm的硅羟基磁珠和体积百分比为10至50％的甘油；所述蛋白酶K包括终浓度为1至50mg/mL的Proteinase K和终浓度为10至50mmol/L的Tris-HCl；所述外切酶包含1至10units的核酸外切酶V。

进一步地，所述裂解液包括终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为7mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.08g/ml的Polidocanol和体积百分比为10％的乙醇；所述洗涤液B包括终浓度为2mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为70mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为3％的Tween-20和体积百分比为50％的乙醇；所述洗涤液C包括终浓度为0.14mol/L的NaCl和终浓度为5mmol/L的Tris-HCl；所述洗脱液为终浓度10mmol/L、pH为8.5的Tris-HCL；所述磁珠悬液包括终浓度为15mg/mL且直径为300nm的硅羟基磁珠和体积百分比为20％的甘油；所述蛋白酶K包括终浓度为15mg/mL的Proteinase K和终浓度为30mmol/L的Tris-HCl；所述外切酶包含5units的核酸外切酶V。

进一步地，所述步骤S3包括使用荧光PCR法检测疑似为肺癌患者样本及对照样本外泌体中ecDNA的C-myc、EGFR和CyclinD1生物标记物的表达量，并将疑似为肺癌患者样本的生物标记物表达量与对照样本的生物标记物表达量相比较获得关联性分析结果；所述荧光PCR法使用的引物探针包括对应C-myc的引物探针C-MYC-F、C-MYC-R、C-MYC-P，对应EGFR的引物探针EGFR-F、EGFR-R、EGFR-P以及对应CyclinD1的引物探针CyclinD1-F、CyclinD1-R、CyclinD1-P。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述用于肺癌早期诊断的生物标志物检测试剂能够从疑似患者血液或体液中针对性的获取外泌体ecDNA生物标志物C-myc、EGFR和CyclinD1，并与对照样本的正常表达量进行差异化的关联性分析以设置判断标准，在区分早期肺癌患者的应用中具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的效果，特别是可用于结合影像学检测提高肺癌早诊敏感性、降低假阴性；采用来自外泌体ecDNA的C-myc、EGFR和CyclinD1三个基因同时组合检测作为生物标志物可以更准确的进行诊断，提高准确度，而且结合外泌体中的ecDNA检测特点更加提高检测灵敏度；同时，本发明所述检测试剂使用过程为液体活检技术，对人体无创伤，且样本要求低、易于采集，检测灵敏度和精准度较高。

附图说明

图1a为不同样本C-myc检测结果对比。

图1b为不同样本EGFR检测结果对比。

图1c为不同样本CyclinD1检测结果对比。

图2a为对照样本C-myc检测分布图。

图2b为对照样本EGFR检测分布图。

图2c为对照样本CyclinD1检测分布图。

图3a为不同样本ecDNA和ctDNA的C-myc检测结果对比。

图3b为不同样本ecDNA和ctDNA的EGFR检测结果对比。

图3c为不同样本ecDNA和ctDNA的CyclinD1检测结果对比。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

本发明采用针对人血液或体液外泌体ecDNA生物标志物的检测试剂用于协助提高肺癌早期诊断的敏感性和准确性，降低假阴性，减少早期肺癌患者的漏诊，减少患者的额外痛苦、减轻家庭和社会负担。

在实际应用本发明进行肺癌早期诊断的过程中，可以通过如下步骤实现：

S1、采集疑似为肺癌患者的血液或体液样本，分离并纯化样本中的外泌体；

S2、分离并纯化外泌体中的ecDNA；

S3、对ecDNA生物标志物C-myc、EGFR和CyclinD1的组合进行表达检测和关联性分析。

其中，分离并纯化样本中的外泌体优选采用沉淀法，一种典型的实施方式可以包括如下步骤：

取1.5mL离心管，加入血浆样本(或其他体液样本)和沉淀剂，震荡混匀，所使用的沉淀剂优选的包括终浓度为15％的PEG10000；

取上述混匀样本3,000g，4℃，离心10min，弃上清(同时注意不要碰到底部沉淀)；

加入洗涤液A，涡旋震荡混匀(管底部如有少部分沉淀黏壁，需使用1mL移液器吹打混匀)，所采用的洗涤液A优选的包括终浓度为1mmol/L的KH₂PO₄和终浓度为4mmol/L的Na₂H₂PO₄；

加入沉淀剂，涡旋震荡混匀；3,000g，4℃，离心10min，弃上清(注意不要碰到底部沉淀)；

加入洗涤液A，涡旋震荡30s，使用200μL移液器反复吹打混匀，所得即血浆外泌体重悬液；

-80℃保存，用于后续实验。

分离并纯化外泌体中的ecDNA优选采用磁珠法，一种典型的实施方式可以包括如下步骤：

(1)、将外泌体样本于离心管中加入裂解液和蛋白酶K，震荡混匀后室温静置5min；所使用的裂解液优选的包括终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为7mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.08g/ml的Polidocanol和体积百分比为10％的乙醇，所使用的蛋白酶K优选的包括终浓度为15mg/mL的Proteinase K和终浓度为30mmol/L的Tris-HCl；

(2)、向(1)所得混合液中加入磁珠悬液，震荡混匀后室温静置10min；所使用的磁珠悬液优选的包括终浓度为15mg/mL且直径为300nm的硅羟基磁珠和体积百分比为20％的甘油；

(3)、将(2)所得混合液瞬时离心约3s，吸弃液体；

(4)、向(3)离心管中加入洗涤液B，混合，瞬时离心约3s，吸弃液体；所使用的洗涤液B优选的包括终浓度为2mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为70mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为3％的Tween-20和体积百分比为50％的乙醇；

(5)、向(4)离心管中加入洗涤液C，混合，瞬时离心约3s，吸弃液体；所使用的洗涤液C优选的包括终浓度为0.14mol/L的NaCl和终浓度为5mmol/L的Tris-HCl，特别是其中NaCl可以有效的去除RNA同时保留住DNA；

(6)、将(5)离心管瞬时离心约5s，吸弃残留液体，室温静置5min；

(7)、向(6)离心管中加入洗脱液，充分震荡混匀，50℃震荡孵育15min；所使用的洗脱液优选的为终浓度10mmol/L、pH为8.5的Tris-HCL；

(8)、将(7)所得混合液瞬时离心约5s，吸磁后将洗脱液转移至新的离心管中；

(9)、向(8)离心管中加入5units的外切酶(优选核酸外切酶V)和1mmol的ATP，震荡混匀，37℃孵育4h；

(10)、向(9)所得混合液加入终浓度为0.5mol/L的EDTA，70℃加热30min灭活，得到的即为需要纯度的ecDNA。

所获得的ecDNA中，C-myc基因可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因，C-myc基因已知与多种肿瘤发生发展有关；EGFR基因在许多实体肿瘤中存在高表达或异常表达；CyclinD1基因为一种生物标志物，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。用于针对性检测上述ecDNA中生物标志物的引物探针设计如表1所示：

表1基因检测引物探针设计

优选的，可以采用qPCR检测比较对照样本(例如非肺癌患者样本)与疑似肺癌患者上述3种生物标志物的表达。

在构建上述ecDNA作为肺癌生物标志物时，可以参考如下步骤进行：

样本收集，健康正常人与肺癌患者各采集血浆5ml，其中正常人采集10例，肺癌患者采集10例(7例早期，3例中晚期)；

采用沉淀法将20例样本进行外泌体的分离与纯化，获得血浆外泌体；

通过磁珠法核酸提取技术提取纯化外泌体中的ecDNA；

以获得的ecDNA为模板进行qPCR扩增，分别分析比较生物标志物C-myc、EGFR、CyclinD1的表达差异；

根据正常人与肺癌患者的基因表达差异分析生物标志物与肺癌发生的关联性，确定各生物标志物在肺癌早诊应用中的判断基准，例如检测所得Ct值。

在获得以外泌体ecDNA中C-myc、EGFR、CyclinD1的表达差异为判断基准的生物标志物后，使用上述ecDNA作为肺癌生物标志物进行肺癌早期诊断时，可以参考如下步骤进行：

样本收集，样本来源为正常人采集血浆5ml，入组样本数量为30人；

采用沉淀法将30例样本进行外泌体的分离与纯化，获得血浆外泌体；

通过磁珠法核酸提取技术提取纯化外泌体中的ecDNA；

以获得的ecDNA为模板进行qPCR扩增，分别分析比较生物标志物C-myc、EGFR、CyclinD1的表达差异；

对研究样本进行肺癌病变分析。

对于上述生物标志物，通过图1a至图1c所示不同样本检测对比结果的Ct值分布(图1a至图1c依次对应C-myc、EGFR、CyclinD1)可以得知上述生物标志物在10例对照样本(正常人，非肺癌样本)、7例早期肺癌、3例晚期肺癌之间的表达差异。其中，正常人的3个生物标志物表达量明显低于肺癌患者；肺癌患者中也存在差异，中晚期患者在生物标志物表达上明显多于早期患者；可通过qPCR检测结果做出肺癌早期诊断。如果检测样本同时满足C-myc基因检测Ct值小于33.0、EGFR基因检测Ct值小于33.5且CyclinD1基因检测Ct值小于31.5三个条件则说明存在较高的肺癌风险；当检测样本同时满足上述三个条件中的任意两个，则说明存在中等肺癌风险；当检测样本仅满足上述三个条件中的任意一个，则说明存在较低肺癌风险。

进一步地，通过对入组样本进行检测，所得到结果如图2a至图2c所示，可以明确得到入组的30例样本中的29例测试样本在3个生物标志物qPCR检测结果均未达到对应的肺癌早诊应用中的判断基准(检测所得Ct值)，即C-myc基因检测Ct值小于33.0、EGFR基因检测Ct值小于33.5和CyclinD1基因检测Ct值小于31.5三个条件均不满足，从图2a至图2c中可知这部分测试样本(图中测试样本上方多点集中部分)所得测试点Ct值明显区别于肺癌患者对照Ct值，不存在患肺癌的风险；1例样本在3个生物标志物qPCR检测结果均达到对应的肺癌早诊应用中的判断基准，即C-myc基因检测Ct值小于33.0、EGFR基因检测Ct值小于33.5和CyclinD1基因检测Ct值小于31.5三个条件均满足，存在患肺癌的高风险，从图2a至图2c中也能明确得到这一结果，该测试样本(图中测试样本下方单独测试点)所得Ct值与肺癌患者对照Ct值非常接近，且与其他测试样本Ct值具有显著不同。由此可知，本发明所涉及的生物标志物对于尚未表现出明确患病特征或不能通过常规检测检出的肺癌潜在患者具有较好的区分度，能够辨明潜在患者肺癌患病风险并与低风险样本明确区分，提供可靠、简便的肺癌早诊手段。

为了进一步说明本发明的技术效果，图3a至图3c分别给出了不同样本在使用外泌体ecDNA与ctDNA(循环肿瘤DNA)的结果对比(其中图3a至图3c依次对应C-myc、EGFR、CyclinD1)。具体实验方法包括：

采集4例健康人血液样本(样本一)，1例肺癌患者血液样本(样本二)，按照如下的比例进行混合：300ul健康人血+700ul肺癌患者血(样本三)；700ul健康人血+300ul肺癌患者血(样本四)；

分别提取并纯化上述各样本中的ctDNA、ecDNA，分别以获得的ctDNA、ecDNA为模板进行qPCR扩增，分别分析比较生物标志物C-myc、EGFR、CyclinD1的表达差异。

从图3a至图3c可以看到，在健康正常样本检测到的ctDNA浓度比外泌体中的ecDNA浓度高，但是ecDNA对肿瘤细胞浓度变化比ctDNA更为敏感，在正常人的血中加入肿瘤血，ecDNA可以检测出明显的差别，ctDNA检测无明显差别。因此，ecDNA检测在微量肿瘤细胞发生时候就可以更为敏感的检测出，但是ctDNA需要更高的肿瘤细胞浓度，证明采用外泌体ecDNA作为生物标志物具有非常大的优势。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于肺癌早期诊断的外泌体ecDNA生物标志物检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括外泌体ecDNA生物标志物，所述外泌体ecDNA生物标志物为C-myc、EGFR和CyclinD1的组合。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述C-myc、EGFR和CyclinD1的外泌体ecDNA组合生物标志物在肺癌患者的外泌体中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。

3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述对照样本为非肺癌患者样本。

4.一种用于肺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1至3任一项所述的检测试剂。

5.一种使用权利要求1至3任一项所述检测试剂在制备通过如下方法进行肺癌早期诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、采集疑似为肺癌患者的血液或体液样本，分离并纯化样本中的外泌体；

S2、分离并纯化外泌体中的ecDNA；

S3、对ecDNA生物标志物C-myc、EGFR和CyclinD1的组合进行表达检测和关联性分析。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤S1包括使用含有沉淀剂和洗涤剂A的沉淀法分离并纯化样本中的外泌体；所述沉淀剂包括终浓度为10％至60％的PEG10000；所述洗涤液A包括终浓度为0.1至30mmol/L的KH₂PO₄和终浓度为0.3-28mmol/L的Na₂H₂PO₄。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述所述沉淀剂包括终浓度为15％的PEG10000；所述洗涤液A包括终浓度为1mmol/L的KH₂PO₄和终浓度为4mmol/L的Na₂H₂PO₄。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤S2包括使用含有裂解液、洗涤液B、洗涤液C、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶K、外切酶、ATP和EDTA的磁珠法分离并纯化外泌体中的ecDNA；所述裂解液包括终浓度为1至5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5至10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.01至1g/ml的Polidocanol和体积百分比为5至45％的乙醇；所述洗涤液B包括终浓度为0.1至5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为50至100mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为0.5％至5％的Tween-20和体积百分比为30至80％的乙醇；所述洗涤液C包括终浓度为0.1至5mol/L的NaCl和终浓度为1至20mmol/L的Tris-HCl；所述洗脱液为终浓度5至20mmol/L、pH为8.5的Tris-HCL；所述磁珠悬液包括终浓度为1至30mg/mL且直径为300nm的硅羟基磁珠和体积百分比为10至50％的甘油；所述蛋白酶K包括终浓度为1至50mg/mL的Proteinase K和终浓度为10至50mmol/L的Tris-HCl；所述外切酶包含1至10units的核酸外切酶V。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述裂解液包括终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为7mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.08g/ml的Polidocanol和体积百分比为10％的乙醇；所述洗涤液B包括终浓度为2mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为70mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为3％的Tween-20和体积百分比为50％的乙醇；所述洗涤液C包括终浓度为0.14mol/L的NaCl和终浓度为5mmol/L的Tris-HCl；所述洗脱液为终浓度10mmol/L、pH为8.5的Tris-HCL；所述磁珠悬液包括终浓度为15mg/mL且直径为300nm的硅羟基磁珠和体积百分比为20％的甘油；所述蛋白酶K包括终浓度为15mg/mL的Proteinase K和终浓度为30mmol/L的Tris-HCl；所述外切酶包含5units的核酸外切酶V。

10.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤S3包括使用荧光PCR法检测疑似为肺癌患者样本及对照样本外泌体中ecDNA的C-myc、EGFR和CyclinD1生物标记物的表达量，并将疑似为肺癌患者样本的生物标记物表达量与对照样本的生物标记物表达量相比较获得关联性分析结果；所述荧光PCR法使用的引物探针包括对应C-myc的引物探针C-MYC-F、C-MYC-R、C-MYC-P，对应EGFR的引物探针EGFR-F、EGFR-R、EGFR-P以及对应CyclinD1的引物探针CyclinD1-F、CyclinD1-R、CyclinD1-P。

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