CN110541030B - 膀胱癌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种膀胱癌检测试剂盒及其应用，通过检测肿瘤来源的外泌体中miR‑423‑5p、miR‑203‑3p、miR‑21‑5p、miR‑30b‑5p中的至少一种的表达，提供一种能够利用尿液这种生物样本进行肿瘤的检测，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性的试剂盒。

Description

膀胱癌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种膀胱癌检测试剂盒及其应用。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的泌尿系统最常见的恶性肿瘤，平均发病年龄约为65岁，其中约90％是移行细胞癌，其它10％主要为鳞癌和腺癌，其在2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。由于存在明显的预后差、易复发特征，且早发现、早治疗的膀胱癌患者5年存活率大于90％，因此早诊断对该病的治疗具有重要的意义。膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌最可靠的方法，通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否有肿瘤，但因其有创性且价格昂贵，病人依从性较差，且易刺激膀胱壁肿瘤，可能造成肿瘤的恶性膨胀和转移，不适合大规模筛查；尿脱落细胞学检查对尿路上皮癌诊断特异性高，但对分级低的膀胱癌敏感度低，易形成假阴性结果，且细胞的不典型或退行性变、泌尿系统感染、结石、膀胱灌注治疗及不同检查者间观察偏倚较大等因素也会对尿细胞学检查有影响。因此，无创简便、标本易获取的肿瘤标志物法在膀胱癌的早期诊断和术后检测方面的应用引起了更多研究者的关注。
目前市场上膀胱癌相关产品有膀胱癌细胞染色体及基因异常检测试剂盒(荧光原位杂交法)检测脱落细胞中3，7，17号染色体非整倍体以及P16(9p21)的缺失，以及相关肿瘤标志物产品如膀胱肿瘤相关抗原BTA定量测定试剂盒(微孔板化学发光法)、尿核基质蛋白22(NMP-22)检测试剂盒(胶体金法)等。其中尿脱落上皮细胞FISH技术较适用于尿路上皮癌术后复发的检测，但对低级别尿路上皮癌，缺乏与尿路上皮癌相关的遗传学异常会导致漏诊，易形成假阴性结果。NMP-22是参与维持细胞核功能的一种三维网状结构蛋白，可通过细胞凋亡而释放到尿液中，因而被认为与尿路上皮肿瘤密切相关，有研究表明其在膀胱癌上皮细胞内含量要比正常尿路上皮高数十倍。文献对NMP-22敏感度及特异性报道不一(47％～90％)，存在较大争议。膀胱肿瘤相关抗原(BTA)又称补体因子H相关蛋白，由尿路上皮肿瘤细胞和巨噬细胞产生，是膀胱肿瘤生长过程中释放进入膀胱的复合物，当尿液BTA水平较高时，提示尿路上皮肿瘤的发生，因此其可用于尿路上皮肿瘤的早期检测和复发监测。膀胱癌诊断治疗指南指出：BTA是较早用于检测膀胱癌的肿瘤标记物，多采用BTAStat和BTATrak方法检测，其中BTAStat是一种快速定性方法，根据相关文献报道敏感度和特异性分别为29％～74％和56％～86％；BTATrak是酶联免疫定量方法，敏感度和特异性分别为60％～83％和60％～79％，敏感度随着肿瘤分级和分期上升而提高。NMP-22及BTA检测无创、方便、快捷，但当出现血尿、尿路感染、泌尿系结石、前列腺增生等泌尿系统疾病，特别是行膀胱灌注化疗后，NMP-22及BTA检测假阳性率较高，因此高特异性及敏感度的膀胱癌肿瘤标志物仍亟待开发。
外泌体是细胞主动分泌的一类穿梭于细胞间，直径为30～150nm、密度为1.10～1.18g/ml的双分子层结构囊泡样小体，其可由不同类型细胞(包括肿瘤细胞)脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等中均可检测到。由于外泌体包含蛋白质、DNA、RNA等成分，能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息，且现已有较多的文献报道外泌体内含物在细胞间通讯、肿瘤免疫及治疗等领域研究成果，因此提取细胞外的外泌体在疾病、肿瘤等方面的诊断、监控有巨大的应用潜能。目前国内关于外泌体的专利主要集中在外泌体的分离和检测层面，但尿液中提取外泌体应用于膀胱癌辅助诊断的公开报道较少，只浙江大学公布了一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片，通过检测尿液外泌体中的癌症信息以期用于膀胱癌的无创诊断、监控，该方法利用外泌体跨膜蛋白CD63这一特有的标志物建立了一种芯片ELISA快速诊断方法，但并未进行膀胱癌特异性肿瘤标志物的筛选。
若能在提取的尿液样本外泌体中寻找并筛选出高特异性和敏感度的肿瘤标志物并借助分子手段进行快速检测，对于辅助膀胱癌的早期诊断和术后检测意义重大。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种膀胱癌检测试剂盒及其应用，通过检测肿瘤来源的外泌体中miR-423-5p、miR-203a-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p中的至少一种的表达，提供一种能够利用尿液这种生物样本进行肿瘤的检测，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性的试剂盒。
为解决上述问题，
一方面，本发明在于提供一种膀胱癌检测试剂盒，其包括检测miR-423-5p基因表达产物、miR-203a-3p基因表达产物、miR-21-5p基因表达产物、miR-30b-5p基因表达产物中的至少一种的试剂。
进一步地，所述miR-423-5p基因表达产物、miR-203a-3p基因表达产物、miR-21-5p基因表达产物、miR-30b-5p基因表达产物中的至少一种来自尿液外泌体RNA。
进一步地，所述miR-423-5p基因表达产物、miR-203-3p基因表达产物、miR-21-5p基因表达产物、miR-30b-5p基因表达产物中的至少一种来自尿液外泌体。
进一步地，所述检测miR-423-5p基因表达产物的试剂包括扩增miR-423-5p miRNA的特异引物。
更进一步地，所述扩增miR-423-5p miRNA的特异引物的序列为：TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTT。
进一步地，所述检测miR-203a-3p基因表达产物的试剂包括扩增miR-203-3pmiRNA的特异引物。
更进一步地，所述扩增miR-203a-3p miRNA的特异引物的序列为：AACCCGTAGATCCGATCTTGTG。
进一步地，所述检测miR-21-5p基因表达产物的试剂包括扩增miR-21-5p miRNA的特异引物。
更进一步地，所述扩增miR-21-5p miRNA的特异引物的序列为：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA。
进一步地，所述检测miR-30b-5p基因表达产物的试剂包括扩增miR-30b-5p miRNA的特异引物。
更进一步地，所述扩增miR-30b-5p miRNA的特异引物的序列为：TGTAAACATCCTACACTCAGCT。
进一步地，所述膀胱癌检测试剂盒包括cDNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂。更进一步地，所述膀胱癌检测试剂盒包括提取尿液外泌体的试剂、提取尿液外泌体RNA的试剂、cDNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂。更进一步地，所述膀胱癌检测试剂盒包括提取尿液外泌体的试剂、提取尿液外泌体RNA的试剂、cDNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂、PEG8000、Trizol等。
进一步地，所述cDNA反转录试剂包括mRQ Buffer(2x)、mRQ Enzyme。
进一步地，所述荧光定量PCR试剂包括通用下游引物mRQ 3’Primer、miRNA特异引物、SYBR Green Master Mix(2×)。其中，本试剂盒中提取尿液外泌体的试剂、提取尿液外泌体RNA的试剂、cDNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂、PEG8000、Trizol等均为市售所得，miRNA特异引物为新设计的。
一方面，本发明在于提供一种miR-423-5p基因表达产物、miR-203a-3p基因表达产物、miR-21-5p基因表达产物、miR-30b-5p基因表达产物中的至少一种在制备膀胱癌治疗试剂盒中的用途。
一方面，本发明在于提供一种检测miR-423-5p基因表达产物、miR-203a-3p基因表达产物、miR-21-5p基因表达产物、miR-30b-5p基因表达产物中的至少一种的试剂在制备膀胱癌治疗试剂盒中的用途。
一方面，本发明在于提供一种检测miR-423-5p基因表达水平、miR-203a-3p基因表达水平、miR-21-5p基因表达水平、miR-30b-5p基因表达水平中的至少一种的试剂在制备膀胱癌治疗试剂盒中的用途。
一方面，本发明提供一种在膀胱癌病人尿液中检测肿瘤相关标志物的方法，包括如下步骤：
1)采集膀胱癌病人尿液样本，经离心后，上清液经PEG沉淀法分离得到尿液外泌体；
2)所述尿液外泌体以Trizol法抽提得到外泌体RNA；
3)外泌体RNA经逆转录合成cDNA；
4)将cDNA经qPCR扩增，扩增结果用Ct值来表示，miR-16-5p为内参基因，得到肿瘤相关标志物；
所述肿瘤相关标志物为miR-423-5p基因、miR-203a-3p基因、miR-21-5p基因、miR-30b-5p基因中的至少一种。
进一步地，所述miR-423-5p基因的序列为：UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU。
进一步地，所述miR-203a-3p基因的序列为：AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG。
进一步地，所述miR-21-5p基因的序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
进一步地，所述miR-30b-5p基因的序列为：UGUAAACAUCCUACACUCAGCU。
进一步地，步骤3)中逆转录的反应体系如下：
mRQ Buffer(2x)5ul
肿瘤相关标志物3.75ul
mRQ Enzyme 1.25ul
反应条件：37℃ 1h；85℃ 5min；4℃，保持。
进一步地，步骤4)中qPCR检测的反应体系如下：
Figure BDA0002175672660000041
反应条件为：
Stage 1：95℃ 10sec
Stage 2：40cycle
95℃ 5sec
60℃ 30sec；
所述扩增miR-423-5p miRNA的特异引物的序列为：TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTT；
所述扩增miR-203a-3p miRNA的特异引物的序列为：AACCCGTAGATCCGATCTTGTG；
所述扩增miR-21-5p miRNA的特异引物的序列为：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；
所述扩增miR-30b-5p miRNA的特异引物的序列为：TGTAAACATCCTACACTCAGCT。
一方面，本发明提供一种用于膀胱癌诊断的尿液外泌体miRNA标志物，所述尿液外泌体miRNA标志物包括miR-423-5p基因、miR-203a-3p基因、miR-21-5p基因、miR-30b-5p基因中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种膀胱癌检测试剂盒，通过检测尿液外泌体中的生物标志物实现判断膀胱癌的几率，是一种具有非侵袭性、高敏感性、高特异性，适用于普查筛选大样本调查的液体诊断监控技术。
通过检测肿瘤来源的外泌体中miR-423-5p、miR-203a-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p中的至少一种的表达，提供一种能够利用尿液这种生物样本进行肿瘤的检测，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，并由于其无创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反馈动态检测患者的疾病钻沟通，有助于临床医生迅速掌握患者病情，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。
采用本申请的试剂盒，尿液外泌体4个标志物组合诊断性能明显优于传统的尿液脱落细胞学检查，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，检测灵敏度高，4个miRNA标志物(miR-423-5p、miR-203a-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p)组合灵敏度和特异度可达81.5％和91.2％。
相对于CN2018116118930.8，本申请通过检测miRNA来判断膀胱癌，其采用患者尿液，实现无创检测，检测效果好，特异性高，敏感性高。
附图说明
图1膀胱癌组(125例)及对照组(146)中miR-423-5p、miR-203a-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p相对表达量。
图2 4个miRNA对膀胱癌的诊断ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例1：
1尿液样本收集及预处理：125例膀胱癌患者(治疗前的患者)及146例对照(包括健康人50例，泌尿系统良性疾病患者96例)尿液样本，共271例尿液样本。尿液为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液，15ml以上。采集后及时送检，室温下保存时间不应超过2小时。尿液样本经2000g，离心10min，上清移入新的离心管中用于提取外泌体。沉渣用瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。
2分离尿液外泌体：采用PEG沉淀法分离外泌体。15-20ml尿液上清，3000g，4度离心15min，取上清至另一新的离心管中，加入终浓度为8％的PEG8000，混匀后4度孵育过夜，然后3200g，4度离心15min，弃上清，沉淀即为外泌体。100ul PBS重悬外泌体。
3 RT-qPCR检测miRNAs表达
分离外泌体后以Trizol法常规抽提外泌体RNA。采用RT-qPCR检测miR-126-3p，miR-18a-5p，miR-203a-3p，miR-152-5p，miR-182-5p，miR-21-5p，miR-30b-5p，miR-155-5p，miR-15a-5p，miR-191-5p、miR-200a-3p、miR-423-5p、miR-532-3p、miR-16-5p表达量。miR-126-3p，miR-18a-5p，miR-203a-3p，miR-152-5p，miR-182-5p，miR-21-5p，miR-30b-5p，miR-155-5p，miR-15a-5p，miR-191-5p、miR-200a-3p、miR-423-5p、miR-532-3p、miR-16-5p序列见下表。
Figure BDA0002175672660000061
Figure BDA0002175672660000071
RT-qPCR具体步骤如下：
(1)cDNA合成：采用Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit(来自Takara公司的Clontech品牌)进行RNA逆转录合成cDNA，反应体系见下：
mRQ Buffer(2x) 5ul
RNA样品 3.75ul
mRQ Enzyme 1.25ul
反应条件：37℃ 1h；85℃ 5min；4℃，hold。
(2)qPCR检测:反转录结束后得到的cDNA加入90ul ddH2O稀释，取2ul进行qPCR检测。SYBR Green Master Mix试剂购自Applied Biosystems公司，通用下游引物mRQ 3’Primer为Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit自带，miRNA特异引物为自主设计，其序列如表1所示。
Figure BDA0002175672660000072
Figure BDA0002175672660000081
*内参miRNA
qPCR反应体系见下：
SYBR Green Master Mix(2×) 10μl
miRNA特异引物(10μM) 0.4μl
mRQ 3’Primer(10μM) 0.4μl
cDNA 2μl
ddH2O 7.2μl
反应条件为：
Stage 1：95℃ 10sec
Stage 2：40cycle
95℃ 5sec
60℃ 30sec
(3)PCR数据处理：将Stage 2中的60℃-95℃数据绘制溶解曲线，PCR扩增结果用Ct值来表示，miR-16-5p为内参基因。样品miRNA的相对表达采用△Ct方法表示(△Ct＝目标miRNA的Ct-miR-16的Ct)。
(4)结果：上述10个miRNAs经qRT-PCR验证，以平均Cq值小于32，且膀胱癌组和对照组表达差异P<0.01为标准，鉴定出4个膀胱癌相关miRNAs，分别为miR-423-5p、miR-203-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p，见图1。从图1可以看出，膀胱癌相关miRNAs中miR-423-5p、miR-203-3p、miR-30b-5p的表达量偏高；miR-21-5p的表达量偏低。
实施例2四个miRNAs诊断性能评估
通过ROC曲线分析来比较4个血清miRNA区分膀胱癌患者和对照的诊断能力。miR-423-5p、miR-203-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p四个miRNAs ROC曲线下面积(AUC)分别为：0.880(95％CI 0.836-0.917)、0.703(95％CI 0.645-0.757)、0.799(95％CI 0.746-0.845)、0.850(95％CI 0.802-0.890)，见图2。miR-423-5p灵敏度69.9％，特异度92.8％；miR-203-3p灵敏度63.7％，特异度76.0％；miR-21-5p灵敏度65.8％，特异度91.2％；miR-30b-5p灵敏度69.9％，特异度86.4％。为了更准确的预测膀胱癌，生物标志物组合是更好的选择。采用logistic回归和神经元算法等方法建立联合诊断模型。4个miRNA标志物(miR-423-5p、miR-203-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p)组合灵敏度和特异度可达81.5％和91.2％，阳性预测值91.5％，阴性预测值80.9％，总符合率86.0％。而传统的尿液脱落细胞检查灵敏度60.3％，特异度89.5％。因此，尿液外泌体4个标志物组合诊断性能明显优于传统的尿液脱落细胞学检查，如下表1、表2。
表1：4个miRNA标志物组合诊断膀胱癌结果
Figure BDA0002175672660000091
表2：尿液脱落细胞学检查结果
Figure BDA0002175672660000092
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测尿液外泌体 miRNA 标志物组合的表达水平的试剂在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述尿液外泌体 miRNA 标志物组合由 miR-423-5p、miR-203a-3p、miR-21-5p和miR-30b-5p组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括扩增所述miRNA标志物组合物的特异引物；
所述特异引物的序列为：TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTT、AACCCGTAGATCCGATCTTGTG、TAGCTTATCAGACTGATGTTGA、TGTAAACATCCTACACTCAGCT。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌检测试剂盒包括cDNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌检测试剂盒还包括提取尿液外泌体的试剂、提取尿液外泌体RNA的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌检测试剂盒包括PEG8000、Trizol。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述cDNA反转录试剂包括2×mRQ 缓冲液、mRQ酶。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂包括通用下游引物mRQ 3’ 引物、所述特异引物、2×SYBR Green Master Mix。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述miR-423-5p的序列为：UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU；
所述miR-203a-3p的序列为：AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG；
所述miR-21-5p的序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
所述miR-30b-5p的序列为：UGUAAACAUCCUACACUCAGCU。
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