CN113249479B

CN113249479B - 胰腺癌相关的lncRNA标志物、探针及检测试剂盒在胰腺癌诊断中的应用

Info

Publication number: CN113249479B
Application number: CN202110567302.7A
Authority: CN
Inventors: 项红; 陶旭锋; 周琪; 郭方悦
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113249479A

Abstract

本发明公开了胰腺癌相关的lncRNA标志物、探针及检测试剂盒在胰腺癌诊断中的应用，属于基因工程生物技术领域。所述的lncRNA组合为：CASC2、PVT1以及内参GAPDH；所述CASC2为如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示的引物序列以及SEQ.ID.NO.3所示的探针核苷酸序列；所述PVT1为如SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示的引物序列以及SEQ.ID.NO.6所示的探针核苷酸序列；所述GAPDH为如SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8所示的引物序列以及SEQ.ID.NO.9所示的探针核苷酸序列。本发明上述lncRNA组合可作为胰腺癌诊断标志物：CASC2和PVT1。检测出所述标记物PVT1、CASC2在胰腺癌患者组织中低表达。本发明提供的标记物可应用于制备胰腺癌早期评估产品中，有利于进一步阐明胰腺癌发病机制，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

Description

胰腺癌相关的lncRNA标志物、探针及检测试剂盒在胰腺癌诊断中的应用

技术领域

本发明涉及胰腺癌相关的lncRNA标志物、探针及检测试剂盒在胰腺癌诊断中的应用，属于基因工程生物技术领域。

背景技术

胰腺癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，主要起源于胰腺导管上皮和腺泡细胞。预计到2030年，胰腺癌将成为癌症相关死亡的第二大诱因，甚至在某些地区跃升为头号癌症杀手。据中国国家癌症中心2018年发布的居民癌症数据显示，我国胰腺癌发病率排名第10，死亡率排名第5，5年相对存活率仅为7.2％。胰腺癌患者缺乏早期症状或症状不典型，多数患者就诊时疾病已经进入晚期阶段，往往已丧失手术时机。由于肿瘤细胞已经扩散到胰腺外且对化疗药物耐药，导致传统非手术疗法通常无效。尽管成像技术和肿瘤标志物筛查已经取得了一些进展，但由于缺乏精准可靠观察指标，胰腺癌早期诊断仍面临极大挑战。因此，筛查敏感有效的生物标志物，提高胰腺癌早期诊断水平，是改善胰腺癌预后的一个关键因素。

目前，血清糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CA19-9)是美国食品药品监督管理局批准的唯一的胰腺癌诊断标记物。但CA19-9并不是胰腺癌独有的，其对宿主的炎症反应和阻塞性黄疸也很敏感。因此，现迫切需要一种操作简便且特异性及灵敏度均较高的早期评估方法。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)通常被定义为超过200个核苷酸的非蛋白质RNA转录本。基于高通量测序技术，遗传研究在哺乳动物中发现了成千上万的表达lncRNA转录本的基因位点。目前在人和小鼠中鉴定出的lncRNA的数量分别为172,216和131,697，远远超过了鉴定出的经典蛋白质的数量，并且预计lncRNA的数量还将继续增加。在各种组织和疾病中观察到的不同lncRNA表达模式，可以在发育和病生理环境中调控多种重要的信号转导，并可以表观遗传调控等方式影响肿瘤细胞生长、凋亡、耐药与转移。越来越多的证据显示，胰腺组织lncRNA异常表达与胰腺内、外分泌功能不全以及癌症进展密切相关。lncRNA标记物在胰腺癌调控机制中的研究目前正处于起步阶段。因此，探索lncRNA单独或组合作为胰腺癌早期筛查标记物，不仅对胰腺癌早期诊断具有重要作用，还能为胰腺癌基因靶向治疗提供参考。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述问题，提出一组与胰腺癌相关的lncRNA标志物、以及LncRNA标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组与胰腺癌相关的lncRNA标志物组合，所述的lncRNA标志物组合为：CASC2和PVT1；所述CASC2的引物序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；所述PVT1的引物序列如SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。

本发明提供了一系列基于胰腺癌相关的lncRNA标志物的探针，所述探针能特异性捕获包括权利要求1所述的lncRNA标志物。该探针是由上海生工生物工程股份有限公司定制合成的TaqMan探针。

进一步地，所述探针为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.6所示的核苷酸序列，SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列能特异性捕获CASC2，SEQ.ID.NO.6所示的核苷酸序列能特异性捕获PVT1。

本发明提供了上述的lncRNA标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了所述探针在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了一种胰腺癌诊断试剂盒，所述的试剂盒中包括上述的探针以及内参GAPDH探针；所述试剂盒用于检测胰腺癌中的上述的lncRNA标志物CASC2和PVT1的相对表达量。

进一步地，所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。

进一步地，所述PCR反应常用的试剂和酶包括dNTP/AMV逆转录酶、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等。

发明有益效果

与传统蛋白生物标志物不同，lncRNA是一种新型生物标志物，表达稳定、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，有助于胰腺癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供参考。

本发明上述lncRNA组合可作为胰腺癌诊断标志物：CASC2和PVT1。检测出所述标记物PVT1、CASC2在胰腺癌患者组织中低表达性。本发明提供的标记物可应用于制备胰腺癌早期评估产品中，有利于进一步阐明胰腺癌发病机制，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1为单重PCR结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA CASC2和PVT1在胰腺癌组织中低表达，lncRNA B3GALT5-AS1在胰腺癌组织中高表达。

图2为多重PCR结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA CASC2/PVT1均在胰腺癌组织中低表达。

图3为组织芯片双重FISH(A)和荧光强度统计(B)结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA CASC2/PVT1均在胰腺癌组织中低表达。

图4为诊断性ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve，受试者工作特征曲线)提示该lncRNA CASC2和PVT1组合对胰腺癌有较好的诊断效果，其曲线下面积AUC(Area Under Curve)分别为0.773和0.741。

图5为通过分析lncRNA CASC2与PVT1的表达与临床病理因素发现，lncRNA CASC2与TNM分期中区域淋巴转移密切相关。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

本发明首先分离了胰腺癌病人的癌组织和正常组织样本，提取RNA进行PCR分析，经过初步筛选后通过组织芯片进行验证，进而筛选出一组与胰腺癌高度相关的lncRNA标志物，并基于此研发出可应用于胰腺癌临床诊断的试剂盒，为胰腺癌的筛查和早期诊断提供基础。

本发明筛选lncRNA的方法，包括如下步骤：

1.以标准操作程序(SOP)采集符合标准的组织样本，系统收集完整的临床病例信息资料。

2.基于PCR分析，筛选出差异表达的lncRNA。

3.对前面筛选到的差异表达的lncRNA进行多重PCR及组织芯片定量分析，明确与胰腺癌发病相关的lncRNA组合。

4.基于以上筛选到的lncRNA，研发诊断试剂盒。

本发明按照SOP收集符合标准的组织样本，收集完整的病例资料(包括年龄、性别、病理类型、WHO分级、TMN分期等)，接着采用PCR、多重PCR、组织芯片等方法进行检测。

具体来说包括以下几个部分：

(1)收集病人样本：①经影像学诊断、病理学确认的胰腺癌病例；②所有样本为术前，未经放化疗和新辅助治疗的离体样本；③对照组为病人的胰腺癌癌旁组织。本发明共采用5例符合标准的胰腺癌病人离体癌组织和癌旁组织样本进行研究。

(2)使用Trizol(AG)法提取组织总RNA。

①取20mg组织加入1ml Trizol于1.5ml无酶EP管，加入研磨珠、用组织研磨机研磨1分钟形成组织匀浆；②室温静置5分钟后，加入200μl氯仿，混匀后室温静置10分钟，12,000g 4℃离心15分钟；③缓慢吸取上清液转移至新的EP管，加入500μl异丙醇，混匀室温静置10分钟。12,000g 4℃离心10分钟，可见明显沉淀，吸弃上清液；④加入80％的乙醇(-20℃提前预冷10分钟)1ml，用枪头吹打混匀、上下颠倒混匀后，2,000g 4℃离心10分钟，可见明显沉淀；⑤加入适量无酶水溶解RNA沉淀，并测量RNA浓度。

(3)RT-PCR方法

①提取胰腺癌及癌旁组织总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；②使用生工公司的引物结合高模板耐受性的反转录试剂盒(HiScript III RT SuperMix for PCR+Gdna wiper)(Vizyme，货号323)，进行逆转，合成cDNA；③使用生工公司的TaqMan荧光探针进行PCR反应。所述探针为SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.12和SEQ.ID.NO.15所示的核苷酸序列，分别能特异性捕获CASC2、PVT1、GAPDH、ITSN1-2和B3GALT5-AS1；④检测比较胰腺癌组织与癌旁组织中lncRNA的表达变化，选择具有显著性差异的lncRNA CASC2/PVT1/B3GALT5-AS1作为候选基因。

(4)基于多重PCR技术确定一组lncRNA标志物组合

①多重探针PCR试剂：AceQ Univeral U+probe master mix(Vizyme，货号513)。②多重组合探索：基于单重筛选，分别对各样本及候选基因进行初筛，找到具有表达差异的组别和lncRNA分别进行2～4重PCR探索，确定可配对的组合；③多重PCR重复：根据上述结果，确定多重PCR：GAPDH+PVT1+CASC2。具体操作如表1：

表1 多重PCR步骤

表2 PCR设置条件

表3 多重PCR引物及探针序列

(5)组织芯片双重FISH验证与胰腺癌相关的lncRNA标志物组合。

基于前期生信挖掘及多重PCR技术确定了一组与胰腺癌相关的lncRNA标志物组合：CASC2和PVT1。选取120例胰腺导管癌和30例癌旁组织，进行组织芯片的双重FISH进一步检测验证。lncRNA的表达差异与PCR结果一致。

具体如下：

1)石蜡切片地高辛荧光原位杂交实验步骤

1.1)组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定12小时以上。

1.2)脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

1.3)切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62℃烤箱烤片2小时。

1.4)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15分钟-二甲苯Ⅱ15分钟-无水乙醇Ⅰ5分钟-无水乙醇Ⅱ5分钟，风干，DEPC水浸泡。

1.5)消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml)37℃消化20分钟。纯水冲洗后PBS洗3次×5分钟。

1.6)阻断内源性过氧化物酶：滴加3％甲醇-H₂O₂，室温避光孵育15分钟，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。

1.7)预杂交：滴加杂交缓冲液，37℃孵育1小时。

1.8)杂交：倾去杂交液，滴加含探针PVT1的杂交缓冲液,浓度500nM，恒温箱42℃杂交过夜。

1.9)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10分钟，1×SSC，37℃洗2×5分钟，0.5×SSC室温洗10分钟。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

1.10)二标孵育：滴加含二标探针的杂交液，稀释比1：400，42℃孵育3小时。后2×SSC，37℃洗10分钟，1×SSC，37℃洗2×5分钟，0.5×SSC 37℃洗10分钟。

1.11)滴加封闭液：滴加封闭血清(正常兔血清)。室温30分钟。

1.12)滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37℃孵育50分钟，后PBS洗3次×5分钟。

1.13)滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA试剂，避光室温反应5分钟。后TBST洗3次×10分钟，PBS洗1次×5分钟。

1.14)杂交：杂交缓冲液100μl，室温孵育1小时，倾去杂交液，滴加杂交缓冲液(含探针casc2浓度500nM)，42℃杂交过夜。

1.15)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10分钟，1×SSC，37℃洗2×5分钟，0.5×SSC 37℃洗10分钟。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤

1.16)三标孵育：滴加含三标探针的杂交液，稀释比1：400，42℃孵育3小时。后2×SSC，37℃洗10分钟，1×SSC，37℃洗2×5分钟，0.5×SSC 37℃洗10分钟。

1.17)滴加封闭液：滴加封闭血清(正常兔血清)。室温30分钟。

1.18)滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37℃孵育50分钟，后PBS洗3次×5分钟。

1.19)滴加CY3-TSA：滴加CY3-TSA试剂，避光室温反应5分钟。后PBS洗3次×5分钟.

1.20)DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8分钟，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

1.21)镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。)

2)石蜡切片地高辛荧光原位杂交实验结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素(FITC)标记的绿光，CY3标记的红光。mRNA原位杂交显示结果理论为胞浆阳性，少数核阳性属正常。lncRNA不同指标表达定位不同。根据表达量不同荧光亮度有强弱。

注：上述涉及到的所有试剂，仪器等在RNA原位杂交实验时都需使用DEPC处理后的Rnase free环境。

表4 组织芯片双重FISH探针信息

(6)制备胰腺癌lncRNA诊断试剂盒

前期对收集的临床胰腺癌组织样本进行多重PCR技术、组织芯片双重FISH，最后筛选并确定一组与胰腺癌相关的lncRNA标志物组合：CASC2和PVT1，作为辅助胰腺癌诊断、预后的指标。结果显示，CASC2和PVT1对胰腺癌诊断呈现较高的敏感性和特异性，在此基础上研发胰腺癌诊断试剂盒，该试剂盒包括3个Taqman的探针、逆转录酶、Taq酶、MgCl₂，DEPC水和dNTP等试剂。

(7)数据分析

所有统计检验均使用GraphPad Prism软件7(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国；SanDiego,CA,USA)进行。数据以平均值±SEM表示。P<0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用Shapiro-Wilk检验和Brown-Forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差齐性时，采用单因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)或t检验。

以下是本发明进一步的说明：

基于多重PCR技术，本发明经过单重PCR初筛确定差异分子，多重PCR确定lncRNA组合，进而观察本研究结果的稳定程度。发明人通过组织芯片的双重FISH实验对上述lncRNA组合进行进一步检测验证。

见图1，单重PCR结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA CASC2和PVT1在胰腺癌的表达均呈低表达，lncRNA B3GALT5-AS1在胰腺癌组织中高表达。

见图2，多重PCR结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA CASC2和PVT1在胰腺癌的表达均呈低表达。

见图3，组织芯片双重FISH结果显示，lncRNA CASC2和PVT1在胰腺癌的表达均呈低表达，与PCR结果一致。

见图4，同时，对120例胰腺癌患者进一步分析上述lncRNA组合用于胰腺癌诊断的效果，诊断性ROC曲线显示lncRNA CASC2和PVT1组合的曲线下面积AUC分别为0.773、0.741，提示该lncRNA组合对胰腺癌有较好的诊断效果。

见图5，通过分析lncRNA CASC2与PVT1的表达与临床病理因素发现，lncRNA CASC2与TNM分期中区域淋巴转移密切相关。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学附属第一医院

<120> 胰腺癌相关的lncRNA标志物、探针及检测试剂盒在胰腺癌诊断中的应用

<130> 2021

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

tgcctctttt ctgtgacgc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

aactgcaggc actcaggttg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

tgctggaggc gaagtggtgt cagct 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ccagattcac aagccccacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

tggggtgttc tgcctcttca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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atcaccccag gaacgcttgg aggctga 27

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 7

acagtcttct gggtggcagt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

atcagcaatg cctcctgcac 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

accaactgct tagcacccct ggcca 25

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 10

gagctccatg aggtccgaga 20

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<211> 20

<212> DNA

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tccactgcac tgatggtgac 20

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<212> DNA

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acctgaagac gcccagctca gcagaga 27

<210> 13

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<212> DNA

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<212> DNA

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tggtgctccg tgaaagatgc 20

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

tctacaaatg ctccggctcc gaagccc 27

Claims

1.一组与胰腺癌相关的lncRNA标志物组合，其特征在于，所述的lncRNA标志物组合为：CASC2和PVT1；所述CASC2的引物序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；所述PVT1的引物序列如SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5所示。

2.一系列基于胰腺癌相关的lncRNA标志物的探针，其特征在于，所述探针能特异性捕获包括权利要求1所述的lncRNA标志物。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.6所示的序列，SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列能特异性捕获CASC2，SEQ.ID.NO.6所示的核苷酸序列能特异性捕获PVT1。

4.权利要求1所述的lncRNA标志物的应用，其特征在于，所述lncRNA标记物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

5.权利要求2或3所述的探针的应用，其特征在于，在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

6.一种胰腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求2或3所述的探针以及内参GAPDH探针；所述试剂盒用于检测胰腺组织中lncRNA标志物CASC2和PVT1的相对表达量。

7.根据权利要求6所述的胰腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。

8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR反应常用的试剂和酶包括dNTP/AMV逆转录酶、MgCl₂、DEPC水和Taq酶。