CN108949969B

CN108949969B - 长链非编码rna在结直肠癌中的应用

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Publication number: CN108949969B
Application number: CN201710358446.5A
Authority: CN
Inventors: 刘寒梢; 张笑人
Original assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: CN108949969A

Abstract

本发明提供了一种分离的长链非编码RNA(LncRNA)集合，其包括LncRNA 91H、和选自PVT‑1和MEG3的一种或多种。具体地，本发明提供了一种或多种长链LncRNA及其组合在结直肠癌早期无创性诊断中的应用。本发明发现的LncRNA 91H、PVT‑1、MEG3组合诊断由更好的可信区间，且在结直肠癌早期便出现了显著增高，有利于结直肠癌的早期诊断。

Description

长链非编码RNA在结直肠癌中的应用

技术领域

本发明属于基因治疗和诊断技术领域，特别是涉及一种长链非编码RNA基因及其表达产物在结直肠癌的早期诊断和治疗中的应用。

背景技术

结直肠癌是最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居前位。GLOBOCAN2012数据显示，2012年约有136万新发结直肠癌患者，达到恶性肿瘤的第3位，排在肺癌、乳腺癌之后；结直肠癌死亡患者约69万例，仅次于肺癌、肝癌和胃癌，占恶性肿瘤第4位。过去的的10年，全球结直肠癌发病率和死亡率基本持平，但在全球恶性肿瘤发病和死亡的比例有所增加。结直肠癌发病的地域分布差异较大，发达地区较发展中国家的结直肠癌发病率高。

结直肠癌的高发严重地威胁着人类生命健康，造成了很大的社会医疗成本。当前常规的结直肠癌诊断依赖于结肠镜下的病理活检，此法花费较大且存在一定并发症风险，不利于大规模推广；此外，大多数结直肠癌患者被确诊时时已处于相对较晚的分期，此时很少有病人能获得较好的生存质量。传统的联苯胺法粪便隐血试验是最常用的普查方法，在中老年病例的筛查中，其诊断结直肠癌的敏感性甚至高达90％左右，但特异性远低于50％。

目前临床上常采用肿瘤标志物CEA和CA19-9联合检测来对结直肠癌进行监测和诊断，但二者表达增高也常见于其他消化道肿瘤，故特异性不高。鉴于结直肠癌高发生率和高死亡率，结直肠癌的有效预防依赖于早期发现和早期治疗。因此，本领域迫切需要新的筛检方式。

发明内容

本发明提供了一种多种长链LncRNA及其组合在结直肠癌早期无创性诊断中的应用。

本发明第一方面，提供了一种分离的长链非编码RNA(LncRNA)集合，所述的集合包含选自以下两种或两种以上的LncRNA或其互补序列：

(a)LncRNA 91H；

(b)LncRNA MEG3；和

(c)LncRNA PVT-1。

在另一优选例中，所述集合中的LncRNA均分离自人或非人哺乳动物的血液和/或组织。

在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。

在另一优选例中，所述的血液不包括血细胞。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等；较佳地为人。

在另一优选例中，所述的组织包括肿瘤组织和/或正常组织和/或癌旁组织；较佳地为结直肠肿瘤组织。

在另一优选例中，所述集合中的LncRNA分离自人血浆。

在另一优选例中，所述集合中的LncRNA分离自结直肠癌疑似和/或高危的人血浆。

在另一优选例中，所述的集合包括LncRNA 91H和LncRNA MEG3或其互补序列；

所述的集合包括LncRNA 91H和LncRNA PVT-1或其互补序列；

所述的集合包括LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1或其互补序列；或

所述的集合包括LncRNA 91H、LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1或其互补序列。

在另一优选例中，所述的集合还含有LncRNA GAS5。

本发明第二方面，提供了一种分离的lncRNA，所述的lncRNA选自：

LncRNA 91H、LncRNA MEG3、LncRNA PVT-1、和其互补序列。

本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸集合，所述的多核苷酸集合能分别被人细胞转录成权利要求1所述的LncRNA或本发明第二方面所述的分离的LncRNA。

本发明第四方面，提供了一种载体，它含有本发明第三方面所述的分离的多核苷酸集合，或表达本发明第一方面所述的LncRNA集合、或表达本发明第二方面所述的分离的LncRNA。

本发明第五方面，提供了本发明第一方面所述的LncRNA集合、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备用于诊断结直肠癌的芯片、试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的诊断是早期诊断。

在另一优选例中，所述的早期指的是结直肠癌TMN分期I期或其之前。

本发明第六方面，提供了一种LncRNA诊断结直肠癌的芯片，所述的芯片包括：

固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于权利要求1所述LncRNA集合或本发明第二方面所述分离的LncRNA。

本发明第七方面，提供了本发明第六方面所述芯片的用途，用于制备诊断结直肠癌的试剂盒。

本发明第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面所述集合或其检测试剂、或本发明第六方面所述的芯片；和使用说明书。

在另一优选例中，所述说明书中对试剂盒的使用方法具有以下记载：

(I)从来自检测对象的样本中提取一种或多种LncRNA；

(II)对所述一种或多种LncRNA的含量进行检测，并将结果与正常人群中的LncRNA含量进行比较，

若样本中的所述一种或多种LncRNA的含量E1显著高于正常人群的LncRNA含量E0，则说明该检测对象患有结直肠癌的概率高。

在另一优选例中，所述显著高于是指E1/E0≥1.5，优选地，≥2.0，更优选地，≥5。

在另一优选例中，所述检测对象包括未患有结直肠癌的正常人、疑似患有结直肠癌的患者或确诊结直肠癌的患者。

在另一优选例中，所述正常人群指的是LncRNA 91H＜0.0095，PVT-1＜0.0165；MEG3＜0.163范围内的人群。

在另一优选例中，所述的一种或多种LncRNA包括：LncRNA 91H、和一种或两种选自LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1的序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中，LncRNA91H、LncRNA MEG3、或LncRNA PVT-1用于阳性对照。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相集合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A-G.Real-time PCR显示预筛LncRNA在结直肠癌患者血浆标本和正常对照组的表达差异。

图2A-F.Real-time PCR显示初筛LncRNA在大样本结直肠癌患者血浆标本中和正常对照组的表达差异。

图3A-D.ROC曲线分析LncRNA在大样本结直肠癌患者血浆标本中和正常对照组的表达差异。

图4A-B.ROC曲线分析联合LncRNA在大样本结直肠癌患者血浆标本中和正常对照组的表达差异:A为三种LncRNA差异绘制于同一ROC曲线内；B。通过逻辑回归加权获得的联合诊断预测值P，并绘制P的ROC曲线。

图5A-C.Real-time PCR显示已筛LncRNA在正常人血浆标本及结直肠癌TNM各分期血浆标本中的表达差异。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从大量的消化道异常LncRNA中筛选获得了3个在结直肠癌中高表达的LncRNA 91H、LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1，将这三者进行组合用于结直肠癌早期诊断时，特异性和灵敏度均非常高，并且在大样本中验证了这三个LncRNA联用时与结直肠癌具有高度的相关性，诊断准确性高。由于这三个LncRNA可以在早期进行血液样品的筛查，因此可以作为早期的微创性结直肠癌诊断标记物，而在确诊的结直肠癌患者中，可以通过检测这些LncRNA或其集合，监测其治疗效果或对该罹患疾病的患者进行预后性判断。在此基础上，完成了本发明。

非编码RNA(Non-coding RNAs)

如本文所用，术语“非编码RNA”是指不编码蛋白质的RNA。在人类基因组中，大部分为非编码RNA。人类基因组中仅有2％产生的转录本是可编码RNA，剩余98％均为非编码RNA，它们是不能翻译成蛋白质的功能性RNA分子。这些非编码RNA广泛参与人体生理、病理活动，与众多肿瘤密切相关。

在非编码RNA中，根据大小的不同，具有调控作用的分子主要分为两类：短链非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)。这些ncRNA广泛参与人体几乎所有的生理、病理活动，包括参与、调控或介导众多肿瘤的发生、发展过程。

长链非编码RNA(LncRNA)及其集合

长链非编码RNA(1ong noncoding RNA，LncRNA)是一类转录本长度不少于200个核苷酸且自身不能编码蛋白的RNA分子。LncRNA最初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的伴随产物，归于基因组转录过程中的“噪音”，本身不具备相应的生物学功能。然而此后的研究并非如此，近年来的研究发现，长链非编码RNA可通过影响X染色体沉默、基因组表达和修饰、转录的激活或干扰、核内外运输等多种机制，在多个层面上影响着基因的表达水平，然而，截止目前，大部分LncRNA的作用仍不清楚。

而LncRNA在肿瘤形成的阶段可能充当以下几种角色。(1)信号分子，LncRNA能够识别转录因子在信号通路中的连接位点进而调控靶基因的表达；(2)诱饵分子，LncRNA能够诱导转录因子、蛋白质分子等相关大分子化合物与其结合，阻断这些分子对靶基因的作用，间接影响到目标基因的转录；如DNA损伤活化P21相关长链非编码RNA与核转录因子Y-α结合后，通过负向调控凋亡相关基因的表达实现了抑制细胞凋亡的能力。如LncRNA GAS5，即生长因子特异性转录本5，能与与糖皮质激素受体接合，进而抑制了糖皮质激素受体介导的相关基因的调控表达。(3)增强或激活子，LncRNA通过调节靶基因启动子的增强和激活进而影响到靶基因的过表达。(4)引导分子，招募遗传物质修饰相关酶，同时能指导该蛋白复合物顺式或反式定位到相关调控位点；LncRNA XIST(失活X染色质特异性转录本)能引导多梳抑制复合物(PRC)2原位定位于X染色体，从而导致了X染色体失活。(5)支架分子，作为中央平台招募多种蛋白质分子并能与之形成核糖核蛋白复合物，影响了组蛋白修饰，实现了在表观遗传方面对靶基因进行调控。如LncRNA ANRIL能募集并结合到PRC2复合物(H3K27三甲基化的抑制物)，进而致使目的基因的沉默，在全程中仅起到了支架作用。值得一提的是，上述lncRNA的作用模式是存在内在联系的，并非孤立存在。

如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

本发明所述LncRNA集合包含选自以下两种或两种以上的LncRNA或其互补序列：

(a)LncRNA 91H；

(b)LncRNA MEG3；和

(c)LncRNA PVT-1。

例如，所述的集合包括LncRNA 91H和LncRNA MEG3或其互补序列；

所述的集合包括LncRNA 91H和LncRNA PVT-1或其互补序列；

所述的集合包括LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1或其互补序列；或

更佳地，本发明的LncRNA集合还可以含有其它与结直肠癌诊断具有高度相关性的LncRNA。

其中：

LncRNA 91H

位于11号染色体的11q15.5,5’端位于MRPL23基因的第一内含子中,在H19基因转录起始位点后的47348bp,3’端位于H19基因转录起始位点的-72044bp。可以用5’引物GCTGTGGGGACCTCTGTGT(SEQ ID NO.:31)和3’引物ACAATGGTGTGAAAGTGATG(SEQ ID NO.:32)扩增全长。

LncRNA MEG3

位于14号染色体的14q32.2,可以用5’引物AGCCCCTAGCGCAGACGGCG(SEQ ID NO.:33)和3’引物GTTAAGACAGGAAACACATT(SEQ ID NO.:34)扩增全长。

LncRNA PVT-1

位于8号染色体的8q24.21,可以用5’引物CTCCGGGCAGAGCGCGTGTG(SEQ ID NO.:35)和3’引物TAGTAGAAAAAGAATTTAATAGACACG(SEQ ID NO.:36)扩增全长。

本发明所述LncRNA均分离自人或其它哺乳动物的血液和/或组织，优选为人的血浆或肿瘤组织。当从人血浆中分离出本发明LncRNA或其集合，可以用于针对其序列制备可结合于所述LncRNA的探针及芯片。

本发明提供了多种从血液中分离的长链非编码RNA或其集合，以及其在结直肠癌中的早期诊断应用。

如本文所用，术语“血液”可以为血浆、血清，但不包括血细胞。

如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

当然，还可以根据数据库中相对于的LncRNA序列或其互补序列，根据常规技术化学合成LncRNA或其检测试剂(如可以与LncRNA相结合的寡核苷酸作为探针，并进一步制备成芯片)，或采用其cDNA序列制备成表达载体，并转录为LncRNA。

LncRNA可从前体LncRNA加工而来，前体LncRNA可被剪切生成成熟的LncRNA，所述成熟的LncRNA可能与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

反义寡核苷酸/互补序列

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”、“互补序列”“AS-Ons”、或“ASO”含义相同。根据本发明所提供的LncRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸/互补序列，所述的反义寡核苷酸可相应结合本发明LncRNA集合中的LncRNA或在体内下调相应的LncRNA的量或LncRNA的表达。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”或“互补序列”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人LncRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的LncRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的LncRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成LncRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的LncRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的LncRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的LncRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

LncRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的LncRNA序列，还可以制备相应的LncRNA检测芯片，进而研究其表达谱以及LncRNA的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析LncRNA表达谱的芯片。本发明的所述的LncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于本发明LncRNA或其集合，优选地，所述的集合至少含有2或3种LncRNA。

具体地，可根据本发明所述的LncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的LncRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一方面，本发明还提供了一种通过LncRNA芯片检测人或非人哺乳动物血液中LncRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人或非人哺乳动物血液的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的LncRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在150-250之间。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获LncRNA的准确性。

本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与LncRNA芯片进行杂交时，可以先将LncRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与LncRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在LncRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片，或本发明的LncRNA或其集合、或其检测试剂。所述的试剂盒可用于检测血液中所述LncRNA的表达。

优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。优选地，本发明所述试剂盒中所含有的LncRNA或其集合可以用于进行阳性对照。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明有益效果

本发明发现的LncRNA 91H、PVT-1、MEG3均有较好的敏感度和特异度，且在结直肠癌早期便出现了显著增高，有利于结直肠癌的早期诊断。相较于目前的结直肠癌肿瘤标志物CEA和CA199，LncRNA 91H、PVT-1、MEG3，尤其是其集合，具备更好的诊断优势，可作为结直肠癌的特异性诊断标志物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料与方法

1.材料与仪器

1.1.材料

1.2.实验仪器

2.方法

2.1血浆样品收集

(1)采集外周血2mL(结直肠癌患者和正常对照组)，迅速转入EDTA抗凝管中，涡旋或用移液器混匀。

(2)在1小时(室温条件下)或2小时(4℃条件下)内进行下面的操作：820g，4℃，离心10分钟。

(3)吸取约1mL上清转至洁净的1.5mL离心管中，16000g,4℃,离心10分钟，小心吸取上清到新的离心管中，置于-80℃保存备用。

2.2血浆样品Total RNA提取

(1)-80℃冰箱取出血浆样本，冰上融化。

(2)取0.25ml样本加入0.75ml

LS Reagent，吹打混匀，静置5min。

(3)加入0.2ml氯仿，充分震荡15s，常温静置5-15min。

(4)4℃,12000xg离心15min，移取上清液至新的1.5ml离心管。

(5)向新离心管加入1ulGlycogen(10ug/ul),充分混匀。

(6)再加入0.5ml异丙醇，混匀，常温孵育10min。

(7)4℃,12000xg离心10min，弃上清液。

(8)加入1ml 75％乙醇，混匀。

(9)4℃,7500xg离心5min，弃上清液。

(10)离心管放置超净台静置5-10min，不要等完全晾干，加入DEPC水20-50ul。

(11)将离心管放置在干式加热器上，55-60℃，助融10min。收集管中的液体即为提取的Total RNA，置于-80℃保存备用。

2.3 cDNA的制备

(1)-80℃冰箱取出Total RNA样本，冰上融化。Nano drop测得样本浓度。

(2)去基因组DNA反应，取0.2ml PCR管，依如下配比：

(3)反转录反应，采用<SYBR

Green qPCR法>，反应液按以下配比：

试剂	使用量
		步骤(2)反应液	10ul
PrimeSccript RT Enzyme MixⅠ	1ul
		RT Prime Mix	1ul
5x PrimeSccript Buffer 2	4ul
		RNase Free dH2o	4ul
Total	20ul

用PCR扩增仪进行反转录反应：37℃15min；

85℃5sec；

4℃

(4)将扩增好的cDNA放在-20℃冰箱保存备用。

2.4引物设计

根据基因芯片数据库挑选在结直肠癌组织标本中表达增高的LncRNA 450个，并对其进行分批预筛选，最后获得13个表达增高(Fold Change>1.5)的LncRNA。本课题所选LncRNA引物均来自数据库，引物合成由铂尚生物(上海)提供。

表1.预筛获得的13种LncRNA及2种内参引物的两条链序列

2.5 Real Time PCR反应

(1)应用Applied Biosystems 7900 Fast Real-Time PCR System的操作方法，按以下组份配置PCR反应液(反应液配置在冰上进行)：

(2)进行Real Time PCR反应

两步法阶段1：预变性95℃30sec(Reps 1)

阶段2：PCR反应Reps 40

95℃5sec

60℃30-34sec

解离阶段

(3)计算实验结果

由PCR反应曲线获得的Ct值(threshold cycle number，阈值循环数)，△Ct为同一样本目的与内参基因Ct值之差，即△Ct＝Ct(所选LncRNA)-Ct(b-actin)。某一样本LncRNA的表达水平用2-ΔCt表示。计算结直肠癌血浆和正常血浆中某一LncRNA的相对表达量的差异的方法是：将两组中所有血浆样本的某一LncRNA表达水平进行比较。

2.6统计学方法

本实验中结直肠癌血浆与正常对照血浆的某一LncRNA表达水平比较采用T检验，结直肠癌相对某一LncRNA的表达水平与癌症临床病理指标之间的关系采用χ²检验，受试者工作特征曲线(ROC)和线下面积AUC用于评价每一个候选标志物的诊断价值，最佳标准值是使用Youden’s index(回归系数)判定，每一个LncRNA回归系数是由逻辑回归模式得到的，并且作为权重构成了联合诊断预测值P。P<0.05定义为差异具有统计学意义。统计方法采用SAS软件包完成，柱状图和散点图绘图采用Prism6软件完成，ROC曲线图绘制采用Medcalc软件。

实施例1确定内参

本发明对常用的内参进行了筛选，并且同时检测两种常用内参，发现Beta-ACTINrealtime RT-PCR数据更稳定，因此所有PCR结果均以Beta-ACTIN作为内参。

实施例2初筛LncRNA的实验结果

本实验预实验从数据库450个人数据中，经过分批筛选，并最终选取了13个在结直肠癌组织中表达异常的LncRNA(PVT-1、UCA1、H19、RMRP、NEAT1、NEAT1_2、CCAT1-L、CCAT2、HOTAIR、MALAT1、91H、GAS5、MEG3)，以Beta-ACTIN为内参，应用RT-PCR在20对血浆样本(结直肠癌患者血浆18例和正常对照组20例)中验证所选LncRNA的表达情况。20对样本数据信息整理如下：

表2.肿瘤组和对照组血浆样本的年龄及性别的组成分析。

由表2可知，年龄，性别的卡方检验P值均大于0.05，排出了年龄及性别对样本分组的干扰，说明两组之间可以进行比较分析。

实验中发现，LncRNA UCA1、RMRP、NEAT1、CCAT2和NEAT1_2因表达量过低或者血液中分泌减少等因素导致荧光定量PCR仪未能检出，MALAT1的pcr结果显示：其在肿瘤病人血液或正常对照组中差异不显著。以上六个LncRNA均被排除作为筛选指标，剩余7个LncRNA表达存在差异，其Real-timePCR结果如图1所示。

从图1中可知，7个LncRNA在20对血浆标本验证中，P均小于0.05，表示在两组血浆标本中存在显著差异，这些LncRNA或许可以作为筛检指标。实验中的LncRNA HOTAIR已被文献报道在血浆中存在差异，本实验中选择HOTAIR作为阳参，本次实验数据(P＝0.0321<0.05)也支持LncRNA HOTAIR在血浆中存在差异，间接支持其他在血浆中表达差异的LncRNA的真实性和稳定性。接下来的实验，筛选剩余的六个LncRNA进行大样本验证。

实施例3大样本验证初筛LncRNA的实验结果

本实验从预实验初筛出7个已证实在结直肠癌组织中表达异常的LncRNA，本次实验去除HOTAIR阳参，剩余6个LncRNA同样选择以Beta-ACTIN为内参，应用RT-PCR在血浆标本(58个结直肠癌患者血浆和56个正常对照组)中验证所选LncRNA的表达情况。样本数据信息统计如表3

表3肿瘤血浆样本及对照组血浆样本的病理资料统计与分析

由表三可知，在大样本验证实验中，性别及年龄统计的P值均大于0.05，两组间不存在性别，年龄差异，可以直接进行数据比较。

实验中，剩余6个表达差异LncRNA如图2所示。由图2可知，LncRNA H19(p＝0.0644)和LncRNA CCAT1-L(0.0660)的P值均大于0.05，显示H19及CCAT1-L在肿瘤样本中的表达上调，但没有统计学差异，故不能作为筛选LncRNA的指标。剩余四个：LncRNA 91H(P＝0.0231)说明91H在两组血浆样本中存在差异；PVT-1(P＝0.001)、MEG3(P＝0.002)及GAS5(P＝0.002)说明PVT-1、MEG3及GAS5在两组血浆样本中存在差异。LncRNA91H、PVT-1、MEG3及GAS5或可能作为筛选结直肠癌的指标。

实施例4差异表达的LncRNA的ROC曲线分析

为了进一步证实LncRNA 91H、PVT-1、MEG3及GAS5是否可作为筛选结直肠癌的指标，对四种LncRNA在两组样本中(58个结直肠癌患者血浆和56个正常对照组血浆样本)相应的ROC曲线,显示结果如图3所示。

由图3可知，LncRNA GAS5的ROC曲线AUC＝0.642(当标准值>0.025时，敏感度＝82.1，特异度＝46.5,标准差为0.0535，95％可信区间为0.547-0.730)，作为独立的诊断指标，其价值较低；

LncRNA 91H的ROC曲线AUC＝0.870(当标准值>0.0095时，敏感度＝86.2，特异度＝80.4,标准差为0.0348，95％可信区间为0.794-0.926)，LncRNA 91H可作为一种独立的诊断指标；

LncRNA PVT-1的ROC曲线AUC＝0.786(当标准值>0.0165时，敏感度＝69.0，特异度＝82.1，标准差为0.0429，95％可信区间为0.699-0.857)，LncRNA PVT-1可作为一种独立的诊断指标；

LncRNA MEG3的ROC曲线AUC＝0.819(当标准值>0.163时，敏感度＝75.2，特异度＝82.1，标准差为0.0395，95％可信区间为0.736-0.885)，LncRNA MEG3可作为一种独立的诊断指标。

由此可见，LncRNA 91H、LncRNA PVT-1和LncRNA MEG3的特异度和敏感度均一般，均可以用于作为独立的诊断指标。

实施例5差异表达的LncRNA联合检测的ROC曲线分析

为了从这些指标中筛选出最佳的诊断指标或联合指标，本实验使用逻辑回归方式计算每一个lncRNA的回归系数，并以此为加权计算出指标联用时的诊断预测值P值(见图4)。结果发现，逻辑回归计算仅把LncRNA 91H、PVT-1及MEG3作为结直肠癌的潜在指标，而没有把GAS5加入，提示GAS5的诊断价值可能与这三个指标存在一定的覆盖。为证实这一观点，我们进一步使用相关分析观察GAS5与联合预测值的相关性，发现两者的皮尔逊相关系数r＝0.5251且P<0.0001,提示两者的确存在中度相关，也从侧面说明三指标联用的诊断价值可能更为全面。由图4可知，LncRNA 91H、PVT-1及MEG3联合检测ROC曲线采用逻辑回归所得AUC＝0.877(当P值>0.3797时，敏感度＝82.8，特异度＝78.6，标准差为0.0331，95％可信区间为0.802-0.931)，三者联合的AUC值大于任意单独一种的LncRNA，且三者联用其诊断误差最小，置信区间最高。由此可见，将三者联合使用的诊断效果可能更好。

实施例6已筛LncRNA在血浆中的表达量与结直肠癌病理分期的联系

为了更加直观地观察中已筛目的LncRNA在结直肠癌中的表达情况，实验中统计了大样本血浆标本(58个结直肠癌患者血浆和56个正常对照组血浆样本)的病理资料，并把与Lnc91H、PVT-1及MEG3与肿瘤分期的关系整理如图5所示。

由图5可知：

91H在各TNM分期均与正常组存在表达差异(正常组与Ⅰ期比较的P＝0.0073,与Ⅱ期比较的P＝0.009，与Ⅲ和Ⅳ期比较的P＝0.0001)；

PVT-1在各TNM分期均与正常组存在表达差异(正常组与Ⅰ期比较的P＝0.0001,与Ⅱ期比较的P＝0.0018，与Ⅲ和Ⅳ期比较的P＝0.0002)；

MEG3在各TNM分期均与正常组存在表达差异(正常组与Ⅰ期比较的P＝0.0001,与Ⅱ期比较的P＝0.001，与Ⅲ和Ⅳ期比较的P＝0.0018)。

由此可见，各个lncRNA在肿瘤组的表达都明显上调，但以早期的升高更为明显，由此推测91H,MEG3,PVT-1可能可以作为结直肠癌的早期筛选指标。

讨论

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。结直肠癌流行病学研究显示：结直肠癌的发病率和死亡率总体仍呈上升趋势，每年全世界新增结直肠癌病例超过100万例，发达国家中结直肠癌的总体致死率仍高达33％。即便术后病理发现癌组织周边淋巴结未检测到明显转移，其复发率也可达25％，由此可知传统的病理学检测并不足以检出隐蔽的转移灶。绝大多数的结直肠癌病例死亡是由于机体出现了远端转移。敏感的筛查指标及有效的筛查技术是预防结直肠癌发病的根本措施。目前，我国尚未出台规范的结直肠癌筛检指南，虽然存在一些筛检方式，但初筛率不高，筛查的顺应性亟需改进。改进筛查技术，提升筛查指标的效率，及早诊断肿瘤，能够在最大程度降低结直肠癌患者的发病率和死亡率，使得结直肠癌防治成为可能。

目前针对结直肠癌的研究主要集中于小分子遗传化合物，如甲基化的DNA，微小RNA以及长链非编码RNA，这些小分子参与到结直肠癌的EMT(上皮-间质转化)过程，即参与到结直肠癌的早期形成。这些小分子在结直肠癌中表达异常，影响着结直肠癌的发生，或许能成为新的结直肠癌筛检指标。非编码RNA是近些年来发展迅猛的一个细胞生物学与分子生物学研究方向，许多研究指出长链非编码RNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关，并在不同个体中有较为特定的表达水平，异常表达的LncRNA在结直肠癌的发病机理中扮演重要角色。这些异常表达的LncRNA可能成为作为新的分子标志物，使得结直肠癌的早期诊断成为可能。

作为潜在的分子标志物，LncRNA如微小RNA和甲基化DNA一样，已受到越来越多的重视。目前最为科学的方法是筛选出在结直肠癌发生过程中特异表达的LncRNA，而每个检测指标一般都是与结直肠癌的发生发展密切相关，其表达水平与肿瘤的关系最好已得到充分论证。多个LncRNA联合检测或许可降低个体差异性，提高诊断精确度。完善的分子标志即需要很高特异性，又必须限制检测指标的数量，因此，对候选LncRNA在结直肠癌中所起到的作用及其表达水平与疾病进程的相关性进行全面深入的研究，是判断其是否可作为肿瘤分子标志的基础。

本发明利用Real-time PCR试验分小样本初筛已选LncRNA和大样本验证表达差异的LncRNA两步来筛选出血浆中存在的与结直癌相关的并且差异表达LncRNA。这些差异表达的LncRNA靶标或许可以成为新的LncRNA靶点。

在小样本初筛LncRNA实验中发现，8个LncRNA(PVT-1、H19、HOTAIR、CCAT1-L、HOTAIR、91H、GAS5、MEG3)P值均小于0.05，表示在两组血浆标本中存在显著差异，这些LncRNA达到了进一步筛选的目的。本发明选择已经报道在结直肠癌血浆中高表达并且可以作为筛检指标的HOTAIR作为阳参，实验中HOTAIR的PCR结果P值为0.03<0.05，在两组中存在表达差异。表达增高的HOTAIR间接的说明了其他增高LncRNA的探索价值，这些增高LncRNA或许也可以作为新的结直肠癌诊断标志物。但小样本存在较大误差和随机，作为诊断指标需要满足在大量样本中检出表达的差异性，故本发明又选择在大样本血浆中加以验证以上指标，希望能获得更加准确的诊断指标。

在大样本验证实验中，因为HOTAIR作为阳参被舍弃。剩余6个LncRNA(PVT-1、H19、CCAT1-L、91H、GAS5、MEG3)在两组血浆样本中表达差异。H19(P＝0.064)及CCAT1-L(P＝0.066)的P值均大于0.05，在两组血浆样本中比较无统计学意义。但这和的预实验数据H19(P＝0.034)及CCAT1-L(P＝0.032)存在偏差，但是从图2可以看出H19及CCAT1-L在肿瘤的表达量是有增高趋势的，导致本次不存在P值或许和样本量有关，本次实验标本量仍不足。剩余4个LncRNA(PVT-1、91H、GAS5、MEG3)P值均有统计学意义。结合预筛实验，说明在较大样本中，上述4个LncRNA满足了作为诊断靶标的一些标准，可为候选的肿瘤标志物。之后需进一步分析表达量与临床病理之间的联系，当满足一定条件时，方能作为诊断标志物。

在接下来的数据分析当中，在绘制大样本中GAS5表达量的ROC曲线图时，发现其AUC＝0.642<0.7(当标准值>0.025时，敏感度＝82.1，特异度＝46.5,)，GAS5虽然在结直肠癌表达增高，但特异度较差，在其他肿瘤也存在增高趋势。故GAS5在结直肠癌中不能作为独立的诊断标志物。剩余的三个LncRNA(91H、PVT-1、MEG3)：91H的ROC曲线AUC＝0.870>0.7(当标准值>0.0095时，敏感度＝86.2，特异度＝80.4,)；PVT-1的ROC曲线AUC＝0.786>0.7(当标准值>0.0165时，敏感度＝69.0，特异度＝82.1)；MEG3 ROC曲线AUC＝0.819>0.7(当标准值>0.163时，敏感度＝75.2，特异度＝82.1)；以上数据可说明91H、PVT-1、MEG3可作为一种独立的诊断指标。之后通过逻辑回归得到三者联合检测的AUC为0.877。即三者联合检测时，AUC适当增大，这说明更利于结直肠癌的检出。

实验中也发现一个特殊现象，LncRNA MEG3层在组织中被证实低表达，有一定的抑癌性。但本次实验中的MEG3在血浆中高表达,这与肿瘤组织中的低表达存在一定的偏颇。这可能肿瘤选择性分泌或释放有关。

整体而言，本发明意外地发现并证实91H、PVT-1、MEG3在正常组血浆和结直肠癌血浆中表达存在显著差异，从现有的数据可以看出血浆中91H、PVT-1、MEG3的增高可以作为肿瘤发生的早期诊断靶标。

肿瘤标志物一般特指由肿瘤组织或细胞产生的某类特定化合物，在肿瘤患者细胞内外液或者瘤体中能够被检测，而在正常人群中其含量极低甚至完全没有。肿瘤的早期诊断能极好的保证肿瘤患者的生存，虽然肿瘤的早期阶段很难被影像学技术检测到，但此时一些血清学指标可能已发生改变，所以肿瘤标志物的研究就尤为关键和迫切。目前，血清肿瘤标志物CEA及CA19-9的阳性率被证实与结直肠癌的大小、浸润深度、淋巴结转移及远处转移存在密切关系。CEA敏感度较低，术前其阳性率约为40％-50％，而且在其他肿瘤中也表达增高，特异度不足，对结直肠癌筛选作用微弱。CA199的升高也常见于其他消化道肿瘤，在结直肠癌特异性较低。此外研究还显示，CA19-9水平升高能够作为反应晚期结直肠癌的良好指标，并且CEA与CA19-9同时升高是中晚期CRC肿瘤的重要指标,但早期诊断仍欠佳。本发明筛选的91H、PVT-1、MEG3均有较好的敏感度和特异度，而且在结直肠癌早期便出现了显著增高，有利于结直肠癌的早期诊断。相较于目前的结直肠癌肿瘤标志物CEA和CA199，本发明LncRNA91H、PVT-1、MEG3，尤其是其集合，具备更好的诊断优势，可作为结直肠癌的诊断标志物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 长链非编码RNA在结直肠癌中的应用

<130> P2017-0811

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

tgagaactgt ccttacgtga cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

ctctccattg ggttcaccat tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

tgctgcactt tacaaccact g 21

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 4

cgtgctgaag gcctgtatcc 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

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<223> 引物

<400> 5

cttcctccct ttaacttatc cattcac 27

<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

cagttagttt atcagttctc ccatcca 27

<210> 7

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ccacgtgcac atatttgaat tg 22

<210> 8

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<400> 8

tttagcagct gcatcgctcc atag 24

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acattctgcc ctgatttccg 20

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gacggaggtt gagatgaagc 20

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gcttgtcagt agagtgcgcc 20

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cttgcctgga ccagcttaat 20

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ctgcccatct acacctcacg 20

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gcggcaggtc ttaagagatg ag 22

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atggtgtctt tgatgttggg c 21

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tagtagaaaa agaatttaat agacacg 27

Claims

1.一种分离的长链非编码RNA(LncRNA)集合的检测试剂在制备诊断结直肠癌的芯片、试剂或试剂盒中的用途，其中，所述芯片、试剂或试剂盒用于检测血液样品，并且所述的集合包含：

(a)LncRNA 91H；(b)LncRNA MEG3；和(c)LncRNA PVT-1的序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的集合包括：LncRNA 91H、LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1或其互补序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血液包括血浆和/或血清。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的集合还含有LncRNA GAS5。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断是早期诊断。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断是早期诊断，且所述的早期指的是结直肠癌TMN分期I期或其之前。

7.一种LncRNA诊断结直肠癌的芯片，其特征在于，所述的芯片包括：

固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LncRNA集合，所述集合包括LncRNA 91H、LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1的序列。

8.权利要求7所述芯片在制备诊断结直肠癌的试剂盒中的用途。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有集合的检测试剂、或权利要求7所述的芯片；和使用说明书；所述集合包括LncRNA 91H、LncRNA MEG3和LncRNA PVT-1的序列。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有LncRNA91H、LncRNAMEG3和/或LncRNA PVT-1用于阳性对照。