KR20190048019A

KR20190048019A - lncRNA를 포함하는 폐암의 상피-중간엽 세포전이 진단 또는 암 예후 예측용 조성물

Info

Publication number: KR20190048019A
Application number: KR1020170142484A
Authority: KR
Inventors: 안영호; 김정선
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-05-09
Also published as: KR102017243B1

Abstract

본 발명은 lncRNA를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트, 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 및 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1 lncRNA는 폐암의 암화 및 전이에 영향을 주는 상피-중간엽 세포전이와 상관관계가 있는 바이오마커이다. 따라서 본 발명의 상기 lncRNA 바이오마커를 이용하면 폐암 환자의 시료로부터 암세포가 상피성 또는 중간엽성 특성을 나타내는지를 진단할 수 있고, 이를 통한 폐암의 예후 예측을 정확하고 용이하게 할 수 있다.

Description

lncRNA를 포함하는 폐암의 상피-중간엽 세포전이 진단 또는 암 예후 예측용 조성물{Compositions comprising lncRNA for diagnosis and prognosis of epithelial-mesenchymal transition in lung cancer}

본 발명은 lncRNA를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트, 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 및 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

국가암정보센터 (www.cancer.go.kr)의 발표에 따르면, 2014년 대한민국의 전체 암 환자 중 폐암 환자의 비율은 남성이 14.8%, 여성이 7.0%로 각각 2위와 5위를 차지하지만, 암종별 사망률을 분석하면 남성은 26.6%, 여성은 16.2% (2015년 기준)로 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 또한 5년 암생존율 (2010-2014년)도 25.1%로 다른 암종에 비해 상대적으로 낮은 수치를 보이고 있다. 이렇게 폐암환자들에게서 높은 사망률이 나타나는 원인은 폐암의 초기진단이 어렵기 때문인데, 미국의 한 연구에 따르면, 폐암으로 처음 확진되는 환자들 중 57%가 이미 전이 (metastasis)단계이고, 이들의 5년 생존율도4%로 상당히 나쁜 예후를 보이고 있다. 이처럼 전이는 폐암을 비롯한 대다수의 상피성 종양 (epithelial tumor) 환자의 주요 사망 원인이나, 외과적 수술이나 화학요법, 방사능 요법 등으로는 완전하게 치료할 수 없는 현실이다. 따라서 폐암 환자의 치료와 보다 높은 생존율을 달성하기 위해서는 폐암의 전이 기작과 원인을 규명하는 연구가 필수적이다.

기존의 많은 연구 결과들에 따르면, 전이는 높은 plasticity를 지닌 암세포들에서부터 시작되는데, 이러한 plasticity는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)의 주요 특성 중 하나이다. 전체 암조직 중 일부 특별한 집단의 다능성(pluripotent) 세포들 (cancer stem cells)이나, 비정상적인 체세포 돌연변이로 인해 새로운 생물학적 활성을 띈 암세포들로부터 전이가 시작된다고 알려져 있다. 이러한 가설에 따르면, 초기 암세포 집단 중 일부가 상피-중간엽 세포전이 (epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) 과정을 거쳐 전이가 개시된다고 설명된다. 즉 전이는 1) EMT로 인한 세포 활동성의 증가 2) 혈관 내로의 침윤 3) 2차 조직으로의 이동 4) 2차 조직 내에서의 역전과정, 즉 중간엽-상피 세포전이(mesenchymal-to-epithelial transition, MET), 5) 2차 조직에서의 정착 및 성장 등의 과정으로 이루어진다. 따라서 전이성 암 세포들의 이러한 생물학적 특성들에 초점을 맞추어 치료법을 개발하면 폐암 및 기타 상피성 암환자들에서 전이를 억제하고 생존율 및 치료 가능성을 높일 수 있다. 이러한 전략 개발을 위해서는 암세포의 stem-ness 즉, plasticity와 EMT 등에 대한 유전학적, 생화학적 기반연구가 필수적이다.

암세포의 EMT는 ZEB1/1, SNAIL1/2, TWIST1과 같은 다양한 전사조절인자에 의해 개시될 수 있다. 그 중 ZEB1은 zinc finger 도메인을 지니고 있고, 유전자 프로모터의 E-box 모티프에 결합하여 하위단계 유전자의 발현을 조절하는데, 특히 상피성 마커인 E-cadherin의 발현을 억제함으로써 EMT를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 ZEB1은 암세포의 EMT 및 전이 과정에 주요한 역할을 하는 miR-200, miR-183, miR-34a 등과 같은 microRNA들의 발현도 조절한다. 최근 microRNA 뿐만 아니라 또 다른 비암호화 RNA인 long non-coding RNA (lncRNA)중 상당수가 ZEB1에 의해 발현이 조절될 수 있음이 밝혀졌다.

lncRNA는 단백질을 암호화하지 않는, 길이 200 nt 이상의 비암호화 RNA로, 세포 내에 수만 종이 존재한다고 밝혀지고 있는데, 그중 상당수가 분화된 조직 및 특정한 암세포에서 특이적으로 발현된다고 알려져 있다. 몇몇 lncRNA들은 다른 RNA들 (mRNA 및 microRNA)과의 결합, 단백질과의 결합, 혹은 특정 염색체 부위의 DNA와의 결합을 통해 다양한 생리적-병리적 기능을 조절한다. 최근엔 이들 lncRNA를 활용하여 암 진단 및 예후판별, 그리고 항암 치료제를 개발하려는 연구도 활발히 진행되고 있다. 하지만, 대다수 lncRNA 전사체의 기능에 대해서는 밝혀진 바가 거의 없다.

이에 본 발명자들은 lncRNA 전사체의 기능을 연구하던 중 폐선암 세포주에서 ZEB1에 의해 발현이 변화하는 lncRNA 중 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1이 폐암의 EMT와 관련이 깊음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트, 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 및 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 암환자의 시료로부터 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 암 세포에서 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 암세포에 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제용 후보물질을 처리하는 단계; (c) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (a) 단계의 서열번호 1 또는 2의 발현과 상기 (c) 단계의 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1 lncRNA는 폐암의 암화 및 전이에 영향을 주는 상피-중간엽 세포전이와 상관관계가 있는 바이오마커이다. 따라서 본 발명의 상기 lncRNA 바이오마커를 이용하면 폐암 환자의 시료로부터 암세포가 상피성 또는 중간엽성 특성을 나타내는지를 진단할 수 있고, 이를 통한 폐암의 예후 예측을 정확하고 용이하게 할 수 있다.

도 1은 폐암 세포주 393P에 EMT 유도인자 ZEB1를 과발현 시킨 후 EMT가 유도된 393P 세포주(상피성(좌), 중간엽성(우))의 형태변화를 나타낸 도이다.
도 2는 ZEB1을 과발현 한 폐암세포주 393P (ZEB1)와 대조군 (vector)에서 차세대염기서열 분석법을 통한 RNA sequencing의 결과를 나타낸 도이다(fold change>2, p-value<0.01).
도 3은 lncRNA 32종의 후보군의 quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR)을 수행하여 RNA 시퀀싱 결과와 비교분석한 결과로 lncRNA 발현 변화양상을 나타낸 도이다.
도 4는 ZEB1을 knock-out 시킨 암세포 EMT 역전 세포주와 TGF-β룰 처리하여 EMT를 유도시킨 세포주에서 qRT-PCR를 통해 조사한 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1의 발현양상을 나타낸 도이다.
도 5는 lncRNA와 이웃하는 유전자들의 염색체 상의 위치(도 5A) 및 lncRNA와 상기 이웃 유전자들의 발현 조사결과(도 5B)를 나타낸 도(**p<0.01)이다.
도 6은 폐암 세포에서 ZEB1과 lncRNA 발현 사이의 상관관계를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 lncRNA는 단백질을 암호화하지 않는 길이 200 nt 이상의 비암호화 RNA를 의미한다. 세포 내에 수만 종이 존재하며 그 중 상당수가 분화된 조직 및 특정한 암세포에서 특이적으로 발현된다고 알려져 있다. 본 발명에서 사용하는 lncRNA는 NR2F1-AS1(생쥐 lncRNA 명칭 : A830082K12Rik) 및 PAX8-AS1(생쥐 lncRNA 명칭 : Gm13415)이며, 상기 lncRNA는 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 구성되는 lncRNA이다. NR2F1-AS1은 NR2F1의 안티센스 전사체이며, PAX8-AS1는 PAX8의 안티센스 전사체이다.

폐암 세포는 ZEB1과 miRNA-200 등의 EMT 마커의 발현 정도에 따라 상피성 (epithelial) 또는 중간엽성 (mesenchymal) 세포로 나눌 수 있다. 상피성 세포들과 비교할 때 중간엽성 세포들은 세포 이동, 침윤, 암화 및 암 전이에서 높은 활성을 보이는 세포이다. 본 발명에서는 EMT를 유도하기 위하여 유도인자인 ZEB1를 과발현할 수 있고, TGF-β을 처리할 수 있다. 또한 lncRNA와 EMT와의 상관관계를 알아보기 위하여 EMT의 역전인 중간엽-상피 세포전이(MET)를 유도할 수 있으며, 본 발명은 일 실시예를 통해 ZEB1을 Knock-out시키는 방법을 사용하였다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 NR2F1-AS1는 EMT 현상에 의해 발현이 증가하는 lncRNA이며, 또한 서열번호 2로 표시되는 PAX8-AS1은 EMT 현상에 의해 발현이 감소하는 lncRNA이다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 lncRNA인 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1의 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 여부뿐만 아니라 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋을지 여부에 대해서까지 예측이 가능한 것을 의미한다. 예컨대 암세포에서 lncRNA의 발현수준을 측정하여 암세포가 EMT가 일어난 암세포인지 여부를 판단하여 예후를 예측할 수 있으며, EMT가 발생한 중간엽성 세포인 것으로 진단되면 주변 조직으로의 침윤 및 암화, 암전이가 일어나 환자의 예후가 좋지 않음을 예측할 수 있다.

본 발명에서 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 제제는 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에서 EMT의 진단 또는 예후 예측이 가능한 암은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성 종양을 제한 없이 포함할 수 있으나, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 폐암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 비소세포 폐암일 수 있다.

또한 본 발명은 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트로 활용하는 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 이러한 본 발명에 따른 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열인 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함한다. 또한 상기 키트는 바람직하게는 상기 lncRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 키트에는 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트는 마이크로어레이 칩 키트, 유전자 증폭 키트 또는 나노스트링 키트일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 요 및 조직생검으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

구체적으로, 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제용 후보 물질의 존재 및 부존재하에서 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질으로서 선택할 수 있다.

즉, 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제용 후보 물질을 처리한 경우에 상기 물질이 세포에서 NR2F1-AS1의 발현을 감소시키고 PAX8-AS1의 발현을 증가시켜 중간엽성 특성을 나타내는 암세포로부터 상피성 세포로 lncRNA의 발현수준을 변화시켰다면, 상기 물질을 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질로 예측할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 폐암의 상피- 중간엽 세포전이 진단 및 예후 예측을 위한 lncRNA 바이오마커의 선별

1.1 폐암 세포 배양

Kras/p53 돌연변이 생쥐의 폐암에서 유래된 KP 생쥐 폐암세포주 13종 (307P, 344LN, 344P, 344SQ, 393LN, 393P, 412P, 531LN1, 531LN2, 531LN3, 531P1, 531P2, 713P)을 RPMI1640 배양액에 10% FBS를 첨가하여 배양하였다. 393P 세포에 ZEB1유전자 플라스미드 (pcDNA3.1_ZEB1)를 형질주입한 뒤 G418 (500 μg/ml)를 배양액에 첨가하여 형질 주입된 세포만을 선별하여 실험에 사용하였다.

1.2 ZEB 1에 의해 발현이 변화하는 lncRNA 후보군의 선별

폐암세포주에 상피-중간엽 세포전이(EMT)를 유도하는 강력한 전사조절자인 ZEB1을 통해 폐암의 EMT와 관련있는 lncRNA를 선별하기 위해 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 상기 실시예 1.1에서 수득한 대조군 세포 (393P_vector)와 ZEB1이 과발현된 세포 (393P_ZEB1)를 각각 3개씩 따로 배양한 뒤, 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA에 대하여 차세대염기서열법으로 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 이들 세포에서 발현이 검출된 5,000 여종의 lncRNA 중에서 ZEB1의 과발현에 의해 fold change가 2를 초과하는 유의성 있는 발현 변화(p-value < 0.01)를 보이는 lncRNA 총 200종을 선별하였다. 상기 ZEB1에 의해 EMT 현상이 일어난 393P 세포를 도 1에 나타내었고, 차세대염기서열 분석법을 통한 RNA 시퀀싱 실험 수행결과를 도 2에 나타내었다.

도 1에서 확인한 바와 같이, 상피성 (epithelial) 생쥐 폐선암 세포 393P 세포에 EMT 유도인자 ZEB1을 과발현하면 393P 폐암세포주는 중간엽성 (mesenchymal) 세포 형태로 변형됨을 확인하여, ZEB1에 의한 폐암의 EMT 현상이 유도될 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 2에서 확인한 바와 같이, 상기와 같이 EMT 유도인자 ZEB1 과발현 후 차별적 발현이 증가된 lncRNA는 85종이었고, 감소한 lncRNA는 115종으로 확인하였다. 상기 차별적 발현의 lncRNA를 폐암의 EMT 현상을 진단해 폐암환자의 예후를 예측할 수 있는 후보군으로 선정하였다.

1.3 상피- 중간엽 세포전이 진단 및 예후 예측을 위한 lncRNA의 선별

폐암의 진단 및 예후 예측의 바이오마커로 사용하기 위한 lncRNA을 선별하기 위하여 quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)을 수행하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 상기 실시예 1.2에서 수행한 RNA 시퀀싱을 통해서 선별한 200여종의 lncRNA 중 시퀀싱 read 값 등의 분석으로 ZEB1에 의해 발현이 증가되는 22종과 발현이 감소되는 10종의 후보 lncRNA를 다시 선별하였다. 그리고 이들 32종 lncRNA의 발현 변화를 실제로 검증하기 위한 적합한 프라이머를 디자인하여 quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. 상기 qRT-PCR은 추출한 전체 RNA를 역전사 키트를 활용하여 각각의 cDNA를 만들어 이를 PCR을 위한 template로 사용하여 수행하였다. qRT-PCR은 SYBR-Green을 기반으로 하는 시스템을 활용하였고, RPL32 유전자를 보정을 위한 control로 사용하여 ΔΔCt 방법으로 비교 정량 분석을 실시하였다. 그 후, RNA 시퀀싱 결과와 비교 분석하였다. 상기 qRT-PCR에서 사용한 프라이머를 표 1에, RNA 시퀀싱의 결과를 도 3에 나타내었다.

프라이머	염기서열	서열번호
RPL32-forward	GGAGAAGGTTCAAGGGCCAG	3
RPL32-reverse	TGCTCCCATAACCGATGTTTG	4
NR2F1-AS1-forward	GATGCCTGCCGGGTAAACTA	5
NR2F1-AS1-reverse	ACATCTGGCTTTCCTGTGGG	6
PAX8-AS1-forward	CCGGATCTCCCAAGCAAACA	7
PAX8-AS1-reverse	CCATGGGAGCGTTACATCCA	8
NR2F1-forward	CCAACAGGAACTGTCCCATCG	9
NR2F1-reverse	CCGTTTGTGAGTGCATACTGGC	10
PAX8-forward	TGCTCAGCCTGGCAATGACAAC	11
PAX8-reverse	ACGAAGGTGCTTTCGAGGACCA	12
ZEB1-forward	ATTCAGCTACTGTGAGCCCTGC	13
ZEB1-reverse	CATTCTGGTCCTCCACAGTGGA	14

도 3에서 나타난 바와 같이, qRT-PCR로 검증한 전체 32종 중에서 Gm 26892 및 Gm16066을 제외한 30종의 lncRNA의 발현 변화 양상이 RNA sequencing에서의 결과와 일치하는 것으로 확인되어, 전반적인 실험이 신뢰도 높게 수행되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이들 lncRNA 중 ZEB1에 의해 발현이 증가하는 A830082K12Rik (human lncRNA 명칭: NR2F1-AS1)와 ZEB1에 의해 발현이 감소하는 Gm13415 (human lncRNA 명칭: PAX8-AS1)을 바이오마커로 선정하였다.

실시예 2. 선별된 lncRNA 바이오마커의 폐암 예측

2.1 EMT 유도 및 역전에 의한 NR2F1 -AS1 및 PAX8 -AS1 lncRNA의 발현 변화

ZEB1에 의해 조절되는 lncRNA의 발현 변화를 검증하기 위해 ZEB1을 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 knock-out (KO)시켜 실험을 수행하였다. 중간엽성 (mesenchymal) 특성을 보이는 생쥐 폐암 세포주인 344SQ 세포에서 ZEB1을 knock-out 하기 위하여 Cas9 (lentiCas9-Blast)과 ZEB1에 대한 guide RNA (lentiGuide-Puro)를 렌티바이러스(lentivirus)를 이용하여 형질주입하였다. 중간엽성 (mesenchymal) 특성을 보여 폐암 중 침윤성 및 전이성이 높은 생쥐 폐암 세포주인 344SQ 세포에서 ZEB1을 KO시키면 EMT가 역전되어 다시 상피성 (epithelial) 세포의 특성을 띄게 되는데, 이런 특성을 띄는 세포들에서 RNA를 추출하여 후보 lncRNA의 발현 양상을 qRT-PCR로 조사하였다.

또한, EMT를 유도할 수 있는 추가적인 방법을 사용하여 lncRNA 발현 변화를 측정하기 위하여, 상피성 393P 세포에 transforming growth factor beta (TGF-β) 5 ng/ml를 7일간 처리 후 393P 세포에서 RNA를 추출하여 후보 lncRNA의 발현 양상을 qRT-PCR를 수행하여 확인하였다. 상기 두가지 실험의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, ZEB1 과발현과는 반대로 ZEB1을 KO 시키면 NR2F1-AS1의 발현은 감소하였고, PAX8-AS1의 발현은 증가하였다. 상기와 같은 결과를 통해서 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1 lncRNA의 발현이 ZEB1 및 ZEB1에 의해 유도되는 EMT에 의해 조절된다는 것을 재확인하였다. ZEB1 과발현에 의한 EMT 유도시와 마찬가지로, EMT 유도제인 TGF-β를 처리하면 NR2F1-AS1의 발현은 증가하였고, PAX8-AS1의 발현은 감소하였다. 상기 실험의 결과를 통해 NR2F1-AS1와 PAX8-AS1의 발현이 EMT에 의해 조절된다는 것을 확인하였다.

2.2 ZEB1에 의한 lncRNA와 그 이웃 mRNA의 발현 변화 조사

도 5A에 나타난 바와 같이, NR2F1-AS1와 PAX8-AS1는 각각 NR2F1와 PAX8의 안티센스 전사체이며, lncRNA는 염색체 상에서 주변에 위치하는 이웃 유전자의 프로모터 부위에서 작용하여 그 유전자의 발현을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, lncRNA인 NR2F1-AS1와 PAX8-AS1도 이웃 유전자들인 NR2F1와 PAX8의 발현을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. ZEB1 과발현 세포에서 NR2F1과 PAX8 mRNA의 발현 변화를 qRT-PCR 방법으로 측정하였으며, 상기 NR2F1-AS1와 PAX8-AS1 유전자들의 염색체 상의 위치를 도 5A에, lncRNA와 이웃 유전자들의 발현 조사결과를 도 5B에 나타내었다.

도 5B에서 나타난 바와 같이, NR2F1 mRNA의 발현은 NR2F1-AS1 lncRNA와 마찬가지로 ZEB1에 의해 증가하였고, PAX8 mRNA의 발현은 PAX8-AS1 lncRNA와 비슷하게 ZEB1에 의해 감소하였다. 따라서 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1은 폐암 세포의 침윤성 및 전이성을 상승시키며 이웃하는 유전자들의 발현을 조절하여 상피-중간엽 세포전이를 유도하는 것을 확인하였다.

2.3 폐암 세포에서 ZEB1과 NR2F1 -AS1 및 PAX8 -AS1 lncRNA 발현 사이의 상관관계 확인

다양한 폐암 세포주에서 후보 lncRNA와 ZEB1 mRNA 발현과의 상관관계를 확인하여 바이오마커로서 다양한 폐암을 진단하고 예후를 예측할 수 있는지 알아보기 위하여 실험을 수행하였다. Kras/p53 돌연변이 생쥐의 폐암에서 유래된 KP 생쥐 폐암세포주로 실시예 1에서 사용한 13종에서 RNA를 분리하여 lncRNA와 ZEB1의 발현양을 qRT-PCR로 측정하였다. 이후 lncRNA와 발현양 사이의 상관관계를 분석하기 위하여 Spearman's rank correlation 방법을 사용하여 상관계수(r)와 p-값(p)을 구하였으며, 그 결과인 상대적 발현량을 세포주 별로 도 6A에 나타내었으며, 상기 실험의 결과를 통해 확인한 상관관계를 lncRNA 별로 도 6B에 나타내었다.

도 6 A 및 6B에서 확인한 바와 같이, NR2F1-AS1는 ZEB1과 양의 상관관계를 (r=0.4754, p=0.05), PAX8-AS1은 음의 상관관계를 (r=-0.5769, p=0.02) 보임을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1이 EMT를 진단할 수 있는 마커로 활용될 수 있음을 나타낸다.

NR2F1-AS1 및 PAX8-AS1는 각각 EMT 유도상태 및 EMT 역전 상태에서 발현이 유의적으로 변화되고, 이는 강력한 EMT 유도인자인 ZEB1과도 연관성을 나타내는 바, 이들의 발현양상 분석을 통해 EMT 진단, 폐암 세포의 상피성 특성 또는 중간엽성 특성을 나타내는지 여부의 진단 및 이에 따른 예후 진단을 할 수 있음을 확인하였다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Compositions for diagnosis and prognosis of epithelial-mesenchymal transition in lung cancer <130> 1-9P <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2868 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaagccgccg ctgccgccgc cgggggtggg agccgcgctc gcccgcccgc ccctcgactc 60 gcgagggcgt aaaagtttgt ctcagctcga gcattcctag cgccaacacg ccctcaggta 120 aaggtggaag taaatggcca cgctgtattg acagagacag ggactgagaa acggaaatac 180 taccatcctc cagccaatct gttgggagga ctgcttgcag aggactcgtg ctccagatgt 240 tgcactagag gcgctgcaag tgtgagcagc aggtagatga aactcaagag aaaaggtgtg 300 gataaatgaa actagcccat gatgaacctg ttttctccgt gaccacaata ttaaccagga 360 tgaatggcgg tggcagtggg cctgcatcac aggttgcagc agatgttctc aatatttcta 420 ttaaaatttc cttatttcca tatgcaagag gagccccaga gctgcatcct tatggtagct 480 accatgccgt gatgtaagct gccattcact ggggagcttt ggcaatagaa ttggctagat 540 caggaagcct atgtcaacta tggaacaaca acttgcagct catctctatt gatgatggaa 600 tctcgctatg tcaccaggct ggagtgcagt ggcgcaacct 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ttccgcctga cagccagcca agctcttcag tcccccgccc 300 tccacctgcc agggaggctc cgggcgttgt acctgccacc acggggtagg tctggtacaa 360 agcactggga atacaacctt gaacaagaca agaatcctgg ccttcaagga acttcgaacc 420 ttttggggga tatgataaga cacattagga atcaccatgt taatggttat ctttcttgaa 480 ggatataagt ccagacacat atactcacag aaatgagtta tttaaagaag acggtccaga 540 ttccacagtc caaaaaaaaa agaggtttgc cctgcttctg aaggagtcag ggtatgaatg 600 cagaggtctt cctgttggct cacatatcag atcttcaacg tcaacattaa atgcgagtga 660 tgcttccccc tctgtgaatg tggctttggg tatggctaat ccacaccctg cactctggcc 720 ttcagaagcc cagggagaga agcctcccag aagcaacctt ccagaacctt ctccatcctc 780 ccaccgacct ccccagcccc tgtcctctct ttgaatctcg ttgtcaagtt cttcccgcag 840 acacctggct ccttgagggg aggtgcagct ttcatctgac catgcaggcg tgctttgcag 900 tgggtagagc agtgctttcc tcctcccagc tgcacactgg aatcacctgg agagtccaga 960 aacttcccgc ctcagtgaaa gaacatcagt gtatcagcac agcaaatatt ccaaatgcca 1020 ggctggattc cctccaatta ccaggacctc caggcttctc ctcctttcaa gaactttctg 1080 accctggatc cagtctaaat gttggttata 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caagggccag 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of RPL32 <400> 4 tgctcccata accgatgttt g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of NR2F1-AS1 <400> 5 gatgcctgcc gggtaaacta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of NR2F1-AS1 <400> 6 acatctggct ttcctgtggg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of PAX8-AS1 <400> 7 ccggatctcc caagcaaaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of PAX8-AS1 <400> 8 ccatgggagc gttacatcca 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of NR2F1 <400> 9 ccaacaggaa ctgtcccatc g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of NR2F1 <400> 10 ccgtttgtga gtgcatactg gc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of PAX8 <400> 11 tgctcagcct ggcaatgaca ac 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of PAX8 <400> 12 acgaaggtgc tttcgaggac ca 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of ZEB1 <400> 13 attcagctac tgtgagccct gc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of ZEB1 <400> 14 cattctggtc ctccacagtg ga 22

Claims

서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 lncRNA는 상피-중간엽 세포전이에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 lncRNA는 상피-중간엽 세포전이에 의해 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 lncRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 lncRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 조성물.
제4항 또는 제5항의 조성물을 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 칩 키트, 유전자 증폭 키트, 또는 나노스트링 키트인 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측용 키트.
암환자의 시료로부터 서열번호 1 또는 2로 표시되는 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 요 및 조직생검으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 상피-중간엽 세포전이(EMT) 진단 또는 암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
(a) 암 세포에서 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 암세포에 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제용 후보물질을 처리하는 단계;
(c) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계의 서열번호 1 또는 2의 발현과 상기 (c) 단계의 서열번호 1 또는 2의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 암 상피-중간엽 세포전이(EMT) 억제 물질의 스크리닝 방법.