CN114277132A

CN114277132A - 免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用

Info

Publication number: CN114277132A
Application number: CN202111214570.7A
Authority: CN
Inventors: 赫捷; 孙楠; 张志慧; 张超奇; 骆玥君
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2021-10-19
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用。本发明所要保护的一个技术方案是八种lncRNA作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者的预后产品和/化疗获益的产品中的应用。八种lncRNA包括ENOX1‑AS1,AC005162,LINC00092,RPL34‑AS1,AC104135,AC015971,AC126544和AP001189。实验证明，基于八种lncRNA基因表达谱的风险值预测模型可以有效对小细胞肺癌的预后和辅助化疗获益进行预测。该发明可为未来化疗在SCLC患者中的临床应用提供参考依据，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。

Description

免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用。

背景技术

随着转录组测序技术的显着进步，长链非编码RNA(Long-coding RNAs，lncRNAs)在肿瘤发生和进展中的关键作用已被阐明。LncRNAs是核苷酸长度长于200的RNA 亚群。LncRNAs通过调节基因组和转录组的改变并影响肿瘤免疫微环境，进而影响对肿瘤细胞。重要的是，LncRNA主动调节与免疫反应和激活相关的基因的表达，这通过促进不同免疫细胞的浸润增加了肿瘤免疫微环境的异质性。

小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)是高致死性的高级别神经内分泌肿瘤，其特点是倍增时间短、生长迅速和早期转移扩散。SCLC约占肺癌的15％，五年生存率不足7％。尽管分子靶向药物、免疫检查点抑制剂等新的治疗措施不断发展，小细胞肺癌患者的治疗策略近几十年仍未有明显的突破，化疗仍然是小细胞肺癌患者不可替代的一线治疗方案。然而，大多数小细胞肺癌患者即使对化疗敏感，但治疗后快速产生耐药。且患者病情进展迅速，极易发生转移，治疗手段十分有限。因此，临床亟需精准筛选预测辅助化疗获益及预后的标志物，以便提高患者治疗效果，提高患者的预后。

综上所述，鉴于小细胞肺癌的高度恶性、有限的治疗措施和较差的预后，识别并建立小细胞肺癌的预后预测和化疗获益预测标志物意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后和/或确定小细胞肺癌的预后预测和/或化疗反应预测的标志物。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了八种lncRNA作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者的预后的产品中的应用。所述八种lncRNA为ENOX1-AS1、AC005162、LINC00092、RPL34-AS1、AC104135、AC015971、AC126544和AP001189。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了八种lncRNA作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者的预后的产品中的应用。所述八种lncRNA为ENOX1-AS1、AC005162、LINC00092、RPL34-AS1、AC104135、AC015971、AC126544和AP001189。

上文所述应用中，所述ENOX1-AS1可为ENOX1-AS1(Gene ID:100874129, updatedon 24-Mar-2019)。所述AC005162可为AC005162(GenBank:AC005162.1， updated on 03-FEB-2000)。所述LINC00092可为LINC00092(Gene ID:100188953, updated on 4-Jul-2021)。所述RPL34-AS1可为RPL34-AS1(Gene ID:285456,updated on 5-Jul-2021)。所述AC104135可为AC104135(GenBank:AC104135.5，updated on 30-APR-2005)。所述AC015971可为AC015971(GenBank:AC015971.4，updated on 03-JAN-2002)。所述AC126544可为AC126544(GenBank:AC126544.5，updated on 18-OCT-2002)。所述AP001189可为AP001189(GenBank:AP001189.5，updated on 18-FEB-2000)。

上文所述应用中，所述产品可为试剂盒和/或装置。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了预测小细胞肺癌患者预后和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的装置。所述装置可包括用于获取ENOX1-AS1基因、AC005162 基因、LINC00092基因、RPL34-AS1基因、AC104135基因、AC015971基因、AC126544 基因和AP001189基因这八种lncRNA基因的表达量的模块。

上文所述装置中，所述ENOX1-AS1可为ENOX1-AS1(Gene ID:100874129, updatedon 24-Mar-2019)。所述AC005162可为AC005162(GenBank:AC005162.1， updated on 03-FEB-2000)。所述LINC00092可为LINC00092(Gene ID:100188953, updated on 4-Jul-2021)。所述RPL34-AS1可为RPL34-AS1(Gene ID:285456,updated on 5-Jul-2021)。所述AC104135可为AC104135(GenBank:AC104135.5，updated on 30-APR-2005)。所述AC015971可为AC015971(GenBank:AC015971.4，updated on 03-JAN-2002)。所述AC126544可为AC126544(GenBank:AC126544.5，updated on 18-OCT-2002)。所述AP001189可为AP001189(GenBank:AP001189.5，updated on 18-FEB-2000)。

上文所述装置还可包括所述lncRNA基因表达量数据处理模块。所述lncRNA基因表达量数据处理模块用于将来自待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织中所述八种lncRNA基因的表达量转换为风险值，根据所述风险值预测所述待预测小细胞肺癌患者的预后和/或是否从化疗中获益。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测ENOX1-AS1基因、AC005162基因、LINC00092基因、RPL34-AS1基因、AC104135基因、AC015971基因、AC126544 基因和AP001189基因这八种lncRNA基因的表达量的物质在制备预测小细胞肺癌患者预后的系统和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统中的应用。

上文所述应用中，所述物质可包括检测所述八种lncRNA基因的表达量所需的试剂和/或仪器。

上文所述应用中，所述预测小细胞肺癌患者预后的系统可包括所述物质和所述lncRNA基因表达量数据处理模块。所述lncRNA基因表达量数据处理模块用于将来自待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织中所述八种lncRNA基因的表达量转换为风险值，根据所述风险值预测所述待预测小细胞肺癌患者的预后。

上文所述应用中，所述预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统可包括所述物质和所述lncRNA基因表达量数据处理模块。所述lncRNA基因表达量数据处理模块用于将来自待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织中所述八种lncRNA基因的表达量转换为风险值，根据所述风险值预测所述待预测小细胞肺癌患者是否从化疗中获益。

上文所述应用中，所述lncRNA基因表达量数据处理模块可根据公式I得到所述风险值。

所述公式I可为：风险值＝(0.3647×ENOX1-AS1基因表达量值)+(0.1062×AC005162基因表达量值)+(0.1935×RPL34-AS1基因表达量值)+(0.0329× AC104135基因表达量值)+(0.3833×AC015971基因表达量值)+(0.1074× AC126544基因表达量值)-(0.4814×LINC00092基因表达量值)-(0.0665× AP001189基因表达量值)。

上文所述应用中，所述lncRNA基因表达量数据处理模块可利用R语言软件中的survminer软件包中的surv_cutpoint确定所述风险值的阈值。

上文所述的预测小细胞肺癌患者预后的系统和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统也属于本发明的保护范围。

上文所述八种lncRNA可均来自于人(Homo sapiens)。

上文所述化疗可为辅助化疗。

上文所述的小细胞肺癌组织可来自所述待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织经过福尔马林固定石蜡包埋制备的样本。

本发明从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载GSE65002队列作为训练队列建立了基于SCLC中8个免疫相关lncRNA(包括ENOX1-AS1, AC005162,LINC00092,RPL34-AS1,AC104135,AC015971,AC126544和AP001189) 的分子模型(风险值预测模型)来预测SCLC患者的辅助化疗反应和预后风险。并在国家癌症中心收集148例小细胞肺癌患者福尔马林固定石蜡包埋的FFPE组织样本作为验证队列，用于模型验证。结果表明本发明建立的免疫相关lncRNA的风险值预测模型在对不同生存时间、不同临床亚组的小细胞肺癌患者的总生存期或无复发生存期的预后预测和辅助化疗获益预测中均得到了很好的验证，预测能力都是最好的；8个免疫相关lncRNA可作为小细胞肺癌的预后预测和辅助化疗获益预测的标志物。该发明可为未来化疗在SCLC患者中的临床应用提供参考依据，可用于指导可进行化疗的患者，使不受益者免于化疗，避免过度治疗，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。

附图说明

图1为小细胞肺癌中最重要的影响预后的免疫相关lncRNA的筛选。(a)单变量 cox回归分析筛选出的20个重要的影响预后的免疫相关lncRNA。(b)免疫相关 lncRNA与SCLC预后之间关联的森林图。(c)和(d)用于在LASSO Cox模型中调整参数选择的100倍交叉验证；(c)的纵坐标为似然偏差，(d)的纵坐标为系数。(e)免疫相关lncRNA与免疫基因之间的相关性。

图2为训练队列中患者的免疫相关lncRNA预测模型及存活率。(a)所选定的影响预后的免疫相关lncRNA的LASSO Cox系数分布。横坐标为系数，纵坐标为入选基因。(b)预测模型中的免疫相关lncRNA表达与风险值之间的相关性矩阵图。(c)训练队列中患者生存状态的风险值分布，上图为风险值，纵坐标为风险值，横坐标为不同患者；中图为患者预后情况，纵坐标为生存时间，横坐标为不同患者，深色点表示患者死亡，浅色点表示存活。下图为训练队列中8个免疫相关lncRNA的表达分布。 (d)基于风险评分的48名训练队列患者的OS的Kaplan-Meier曲线。纵坐标为总生存率，横坐标为患者术后时间(月)(e)免疫相关lncRNA预测模型1、3和5年的存活率的ROC分析。纵坐标为敏感性，横坐标为1-特异性。

图3为使用qPCR数据验证独立队列中的预测模型。(a)验证队列中，预测模型风险值的OS Kaplan-Meier曲线。纵坐标为总生存率，横坐标为患者术后生存时间 (月)(b)独验证队列中，用于预测1、3和5年生存率的风险评分的ROC分析。纵坐标为灵敏性，横坐标为1-特异性。(c)验证队列中OS的风险值和不同临床参数的ROC分析。纵坐标为不同临床参数，横坐标为C指数值。(d)验证队列中，预测模型风险值的RFS Kaplan-Meier曲线。纵坐标为无复发生存率，横坐标为患者术后生存时间(月)(e)验证队列中预测1、3和5年RFS的风险值的ROC分析。纵坐标为灵敏性，横坐标为1-特异性(f)验证队列中RFS的风险评分和不同临床参数的 ROC分析。纵坐标为不同临床参数，横坐标为C指数值。(g)验证队列中，基于风险值的辅助化疗亚组中OS的Kaplan-Meier曲线。纵坐标为总生存率，横坐标为患者术后生存时间(月)(h)在验证队列的辅助化疗亚组中预测1、3和5年OS的风险评分的ROC分析。纵坐标为灵敏性，横坐标为1-特异性(i)验证队列辅助化疗亚组中RFS的风险值和不同临床参数的ROC分析。纵坐标为不同临床参数，横坐标为C指数值。

图4为跨临床亚组中风险值的OS和RFS预测性能。(a)训练队列中男性患者 OS的Kaplan-Meier曲线。(b)训练队列中年老患者OS的Kaplan-Meier曲线。(c) 训练队列中吸烟患者OS的Kaplan-Meier曲线。(d)验证队列中男性患者OS的 Kaplan-Meier曲线。(e)验证队列中年老患者OS的Kaplan-Meier曲线。(f)验证队列中吸烟患者OS的Kaplan-Meier曲线。(g)验证队列中男性患者RFS的 Kaplan-Meier曲线。(h)验证队列中年老患者RFS的Kaplan-Meier曲线。(i)验证队列中吸烟患者RFS的Kaplan-Meier曲线。纵坐标为总生存率或无复发生存率，横坐标为患者术后生存时间(月)。

图5为训练和验证队列中预测模型分风险值与其他临床参数的Cox回归分析。 (a)风险值和临床参数的单变量Cox回归分析。(b)风险值和临床参数的多变量 Cox回归分析。纵坐标为HR的对数值，横坐标为不同临床特征。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、小细胞肺癌辅助化疗疗效预测和耐药治疗靶点的应用

从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载GSE65002队列作为训练队列，用于构建小细胞肺癌预测模型；并国家癌症中心(NCC)收集小细胞肺癌患者福尔马林固定石蜡包埋的FFPE组织作为验证队列，用于模型验证。所有患者的临床特征如表1所示。

表1小细胞肺癌患者的临床特征

注：SCLC,小细胞肺癌；OS,5年的总生存率.

验证队列中，小细胞肺癌患者的入选标准均如下：1)患者经过国家癌症中心诊断为小细胞肺癌；2)患者诊疗信息完善；3)患者术前未接受辅助治疗；4)患者病理组织经过2位临床病理医师的独立评估，均确认为小细胞肺癌。

辅助化疗以铂类药物为基础。

一、小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA预测模型的建立

1.1免疫相关lncRNA的筛选

(1)免疫基因和lncRNA基因的筛选

从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载GSE60052数据作为训练队列进行分析。从训练队列中的79例患者的测序结果中，对免疫基因和lncRNA基因进行识别和筛选，共有764个免疫基因和2942个lncRNA基因被筛选。

为了保证入选基因对预后的更好预测价值，对上步入选的基因进一步进行高表达筛选，共有607个免疫基因和1202个lncRNA基因被进一步筛选。

(2)免疫相关lncRNA的筛选

将上步入选的607个免疫基因和1202个lncRNA基因进行Pearson相关分析，以 |R|>0.6和P<0.0001为标准，同时满足上述2个条件的lncRNA被认定为免疫相关 lncRNA。最终，共有316个免疫相关的lncRNA被选中。

(3)预后相关的免疫相关lncRNA的筛选

在训练队列中有预后数据的48例患者中，对上步入选的免疫相关lncRNA进行Cox分析，筛选出了20个与预后关系密切的免疫相关lncRNA。(图1中a和b)

1.2免疫相关lncRNA预测模型的建立

(1)在训练队列中，为了建立小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA的治疗疗效及预后预测模型，采用单因素Cox比例回归模型，对其中有预后信息的48例患者，研究免疫相关lncRNA对总生存期(OS)预后指标的影响。

为了使预后模型更加优化和实用，采用逐步Cox比例风险回归模型，最终构建出一个包括如下8个基因的预后模型：ENOX1-AS1(Gene ID:100874129,updated on 24-Mar-2019),AC005162(GenBank:AC005162.1),LINC00092(Gene ID:100188953, updated on 4-Jul-2021),RPL34-AS1(Gene ID:285456,updated on 5-Jul-2021), AC104135(GenBank:AC104135.5),AC015971(GenBank:AC015971.4),AC126544 (GenBank:AC126544.5),AP001189(GenBank:AP001189.5)。

(2)根据每个患者目的基因的相对表达量，通过LASSO分析，得出如下公式I 用于计算每个患者的风险值(图1中c和d)：

风险值＝(0.3647×ENOX1-AS1基因表达量值)+(0.1062×AC005162基因表达量值)+(0.1935×RPL34-AS1基因表达量值)+(0.0329×AC104135基因表达量值)+ (0.3833×AC015971基因表达量值)+(0.1074×AC126544基因表达量值)-(0.4814× LINC00092基因表达量值)-(0.0665×AP001189基因表达量值)

下文中，将公式I简称为风险值预测模型。

(3)将纳入风险值预测模型的8个lncRNA的基因，对其进行免疫相关因素分析，结果如图1中e所示。

(4)将纳入风险值预测模型的8个lncRNA的基因，对其功能进行分析，结果显示，有6个风险性的lncRNA的基因(ENOX1-AS1,AC005162,RPL34-AS1,AC104135, AC015971,AC126544)，2个保护性的lncRNA的基因(LINC00092,AP001189)(图2 中a)。

(5)将纳入风险值预测模型的8个基因，对其进行模型风险值分析，结果如图2 中b所示。

1.3免疫相关lncRNA预测模型的验证

(1)通过R语言软件的“survminer”软件包的“surv_cutpoint”确定阈值，具体方法如下：将待预测小细胞肺癌患者的风险值与匹配的预后信息，输入至R语言软件中，在“survminer”软件包的“surv_cutpoint”的算法下，软件会自动计算出P值最小的分割点，该分割点即为高风险组和低风险组的阈值(最优cutoff点)。

结果显示，训练队列中，计算出的高风险组和低风险组的阈值为2.0810，患者风险值大于等于2.0810的为高风险组，患者风险值小于2.0810的为低风险组。(图2 中c)

(2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析训练队列的高风险组和低风险组患者的总生存率OS差异

利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析结果显示，训练队列中高风险组患者的OS比低分患者短 (P<0.001)(图2中d)。

(3)风险值预测模型的ROC分析

将训练队列患者的1年、3年和5年预后情况与风险值预测模型进行ROC检验，结果显示，该风险值预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的， 1年：AUC＝0.829；2年：AUC＝0.87；5年：AUC＝0.883(图2中e)。

二、小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA预测模型对预后预测能力的验证

为了验证步骤一中建立的风险值预测模型的可重复性和效果，用验证队列对风险值预测模型的有效性进行验证。

2.1收集148例SCLC患者(表1)的FFPE组织作为验证队列，提取组织样本的 RNA，通过PCR检测基因的表达量。

具体检测方法如下：

1)组织样本处理

a.取FFPE样本小细胞肺癌组织和癌旁组织，各100mg，放入2mL无酶EP管中，加入1mL RNAiso Plus(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)；

b.加4粒灭菌后的钢珠，放入高速低温组织研磨仪，参数设置为50Hz，匀浆处理5min，去除组织匀浆液；

c.用4℃离心机，用12000rpm/min离心10min，吸取上清液加入新的EP管中，置于冰上。

2)RNA浓度测定

a.打开NanoDrop，选择RNA检测模式，用1μL无酶水清洗探头3次，吸水纸擦干；

b.用1μL无酶水，校准仪器，调零；

c.加1μL待测样品至探头，检测RNA浓度，检测完毕后，用吸水纸擦干；

d.重复上一步骤，至所有样品检测完成；

e.用无酶水清洗探头3次。

3)RNA质控

通过NanoDrop检测的RNA浓度，同时观察以下两个值：

a.A260/A280比值：为RNA浓度与蛋白浓度的比值，1.8-2.0间表示质控合格；

b.A260/A230比值：为RNA浓度与共提取污染的比值，1.8-2.2间表示质控合格。

4)反转录

用cDNA反转录试剂盒(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)，具体如下：

a.去除基因组DNA：体系详见表2.

表2去除基因组DNA体系

在冰上进行配置反应体系，混匀并短暂离心，42℃反应2min。

b.反转录反应：体系详见表3。

表3反转录体系

将反应体系短暂离心并放置于PCR仪中，程序为37℃，15min，85℃反应5s，获得FFPE组织样本的cDNA。

4)PCR扩增

采用SYBR Green试剂(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)，通过循环阈值(Cyclethreshold valve,Ct)和标准曲线对起始模板进行定量分析。所需要的LncRNAs基因特异性引物均由捷瑞科技有限公司合成，检测各个目的LncRNAs基因和GAPDH基因的引物序列如表4(序列1-序列18)所示。

以cDNA为模板，每个基因表达的检测需要设置三个复孔，其反应体系如下(表 5)：

表4目的基因引物序列

表5 PCR扩增体系

按照上述体系进行配置，并在冰上避光加入到PCR仪器专用的八联排离心管中，涡旋混匀。注意轻弹无气泡后离心。

在ABI 7900HT荧光定量PCR仪中，设置反应条件如下：95℃ 10min；95℃ 10 s，60℃ 10s，72℃ 10s，共40个循环，溶解曲线。以GAPDH作为内参，按公式ΔCt＝ Ct Gene-CtGAPDH进行数据分析，Folds＝2^-ΔΔCt公式计算目的LncRNAs基因的相对表达量。

2.2按照步骤1.2中(2)的方法分别对验证队列地患者FFPE样本的8个基因的相对表达量，计算风险值。

2.3风险值预测模型对验证队列总生存率(Overall survival，OS)的预后预测

(1)按照步骤1.3中(1)的方法，将验证队列的患者样本的风险值与OS，输入至R语言软件中确定OS阈值。结果确定阈值为0.0222，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于0.0222的为高风险组，患者风险值小于0.0222 的为低风险组。

(2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率OS差异

利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析OS,结果显示，验证队列中高风险组图3中a的High risk 患者的OS比低分(图3中a的Low risk)患者短(HR＝4.27，P<0.001)(图3中a)。

(3)不同生存时间中风险值预测模型的效用验证

在验证队列不同的生存时间(1年，3年，5年)中，风险值预测模型效用也得到了很好的验证。

对不同的生存时间进行ROC分析，结果证实，在不同的生存时间(生存期)，风险值预测模型均体现了较好的预测效能(图3中b)。具体的，1年生存期(图3中b 中1year)：AUC＝0.601；3年生存期(图3中b中3year)：AUC＝0.683和5年生存期(图3中b中5year)：AUC＝0.735。

(4)不同临床亚组中预测模型的效用验证

在验证队列不同的临床亚组(性别、是否吸烟)中，预测模型效用也得到了很好的验证。

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行对5年OS的ROC分析，结果证实，与患者年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期等比较，风险值预测模型预测能力最好(图3中c)。具体的，风险值预测模型(图3中c的 Risk score)：AUC＝0.735、性别(图3中c的Sex)AUC＝0.541、年龄(图3中c的 Age)AUC＝0.595、是否吸烟(图3中c的Smoking)AUC＝0.584和肿瘤分期(图3 中c的SCLC_staging)AUC＝0.57。

2.4预测模型对验证队列无复发生存期(Relapse-free survival,RFS)的预后预测

(1)按照步骤1.3中(1)方法，将验证队列的患者样本的风险值与RFS，输入至R语言软件中确定RFS阈值。结果确定阈值为0.0255，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于0.0255的为高风险组，患者风险值小于0.0255 的为低风险组。

(2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率RFS差异

利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析RFS,结果显示，验证队列中高风险组(图3中d的High risk) 患者的RFS比低分(图3中d的Low risk)患者短(HR＝2.81，P<0.001)(图3中 d)。

(3)不同生存时间中预测模型的效用验证

在验证队列不同的RFS时间(1年，3年，5年)中，风险值预测模型效用也得到了很好的验证。

对不同的生存时间进行ROC分析，结果证实，在不同的生存时间(RFS时间)，风险值预测模型均体现了较好的预测效能(图3中e)。具体的，1年RFS(图3中e 中的1year)：AUC＝0.654、3年RFS(图3中e中的3year)：AUC＝0.674和5年 RFS(图3中e中的5year)：AUC＝0.704。

(4)不同临床亚组中预测模型的效用验证

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行对5年RFS的ROC分析，结果证实，与患者年龄(图3中f的Age)、性别(图 3中f的Sex)、是否吸烟(图3中f的Smoking)和肿瘤分期(图3中f的SCLC_staging) 等比较，预测模型(图3中f的Risk score)预测能力最好(图3中f)。具体的，风险值预测模型：AUC＝0.704、性别AUC＝0.578、年龄AUC＝0.552、是否吸烟AUC＝0.601 和肿瘤分期AUC＝0.587。

三、小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA预测模型对辅助化疗获益程度预测能力的验证

为了验证预测模型对辅助化疗获益程度预测的能力，选取验证队列中接受辅助化疗的患者对预测模型的有效性进行验证。

3.1预测模型对辅助化疗后OS获益的验证

(1)按照步骤1.3中(1)的方法，确定OS阈值。将验证队列128例接受辅助化疗的患者样本的风险值与辅助化疗后OS，输入至R语言软件中结果确定辅助化疗后 OS阈值为0.0222，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于 0.0222的为高风险组，患者风险值小于0.0222的为低风险组。

利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析OS,结果显示，验证队列中高风险组(图3中g的High risk) 患者的OS比低分(图3中g的Low risk)患者短(HR＝3.66，P<0.001)(图3中g)。

(3)不同生存时间中预测模型的效用验证

在验证队列不同的生存时间(RFS时间：1年，3年，5年)中，风险值预测模型效用也得到了很好的验证。

对不同的生存时间进行ROC分析，结果证实，在不同的生存时间，预测模型均体现了较好的预测效能(图3中h)。具体的，1年生存期(图3中h中的1year)：AUC＝0.546、 3年生存期(图3中h中的3year)：AUC＝0.67和5年生存期(图3中h中的5year)： AUC＝0.721。

(4)不同临床亚组中预测模型的效用验证

在验证队列不同的临床亚组(性别、是否吸烟)中，风险值预测模型效用也得到了很好的验证。

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行对5年OS的ROC分析，结果证实，与患者年龄(图3中i的Age)、性别(图 3中i的Sex)、是否吸烟(图3中i的Smoking)和肿瘤分期(图3中i的SCLC_staging) 等比较，风险值预测模型(图3中i的Risk score)预测能力最好(图3中i)。具体的，风险值预测模型：AUC＝0.721、性别AUC＝0.523、年龄AUC＝0.601、是否吸烟 AUC＝0.576和分期AUC＝0.572。

四、小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA预测模型在不同临床亚组中对预后预测能力的验证

4.1风险值预测模型在训练队列的不同临床亚组中对OS的Kaplan-Meier分析

在训练队列中，通过对SCLC患者的不同亚组的OS进行Kaplan-Meier分析，结果显示，在年龄、性别和是否吸烟等临床亚组中，高风险组患者的OS比低分患者短。具体的，在男性患者中，高风险组(图4中a的High risk)患者的OS比低分(图4 中a的Low risk)患者短(P<0.001)；在老年患者中，高风险组(图4中b的High risk) 患者的OS比低分(图4中b的Lowrisk)患者短(P<0.001)；在吸烟患者中，高风险组(图4中c的High risk)患者的OS比低分(图4中c的Low risk)患者短(P<0.001)。 (图4中a-c)

4.2风险值预测模型在验证队列的不同临床亚组中对OS的Kaplan-Meier分析

在验证队列中，通过对SCLC患者的不同亚组的OS进行Kaplan-Meier分析，结果显示，在年龄、性别和是否吸烟等临床亚组中，高风险组患者的OS比低分患者短。具体的，在男性患者中，高风险组(图4中d的High risk)患者的OS比低分(图4 中d的Low risk)患者短(P<0.001)；在老年患者中，高风险组(图4中e的High risk) 患者的OS比低分(图4中e的Lowrisk)患者短(P<0.001)；在吸烟患者中，高风险组(图4中f的High risk)患者的OS比低分(图4中f的Low risk)患者短(P<0.001)。 (图4中d-f)

4.3风险值预测模型在验证队列的不同临床亚组中对RFS的Kaplan-Meier分析在验证队列中，通过对SCLC患者的不同亚组的RFS进行Kaplan-Meier分析，结果显示，在年龄、性别和是否吸烟等临床亚组中，高风险组患者的RFS比低分患者短。具体的，在男性患者中，高风险组(图4中g的High risk)患者的RFS比低分(图4 中g的Low risk)患者短(P<0.001)；在老年患者中，高风险组(图4中h的High risk) 患者的RFS比低分(图4中h的Lowrisk)患者短(P<0.001)；在吸烟患者中，高风险组(图4中i的High risk)患者的RFS比低分(图4中i的Low risk)患者短(P<0.001)。 (图4中g-i)

五、小细胞肺癌患者免疫相关lncRNA预测模型预测能力分析

5.1风险值预测模型对SCLC患者预后预测能力验证

(1)风险值预测模型对训练队列中OS的预测能力

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中a的Traning Cohort 组Sex行：P＝0.974，95％CI：0.287-3.341)、年龄(图5中a的Traning Cohort组Age 行：P＝0.890，95％CI：0.407-2.181)、是否吸烟(图5中a的Traning Cohort组Smoking 行：P＝0.389,95％CI：0.593-3.831)和肿瘤分期(图5中a的Traning Cohort组SCLC staging行：P＝0.002,95％CI：1.706-10.374)，风险值预测模型对OS的预测能力最好 (图5中a的Traning Cohort组Risk score行：P<0.001，95％CI：3.138-36.295)。(图 5中a)

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中b的Traning Cohort 组Sex行：P＝0.913，95％CI：0.161-5.125)、年龄(图5中b的Traning Cohort组Age 行：P＝0.280，95％CI：0.665-4.088)、是否吸烟(图5中b的Traning Cohort组Smoking 行：P＝0.942,95％CI：0.261-3.478)和肿瘤分期(图5中b的Traning Cohort组SCLC staging行：P＝0.007,95％CI：1.405-8.588)，风险值预测模型对OS的预测能力最好(图 5中b的Traning Cohort组Risk score行：P<0.001,95％CI：2.631-32.827)。(图5中 b)

(2)风险值预测模型对验证队列中OS的预测能力

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中a的Validation Cohort (OS)组Sex行：P＝0.785，95％CI：0.635-1.824)、年龄(图5中a的Validation Cohort (OS)组Age行：P＝0.062，95％CI：0.979-2.366)、是否吸烟(图5中a的Validation Cohort(OS)组Smoking行：P＝0.243,95％CI：0.829-2.098)和肿瘤分期(图5中a 的Validation Cohort(OS)组SCLC staging行：P＝0.007,95％CI：1.108-1.915)，风险值预测模型对OS的预测能力最好(图5中a的Validation Cohort(OS)组Risk score 行：P<0.001，95％CI：2.665-8.245)。(图5中a)

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中b的Validation Cohort (OS)组Sex行：P＝0.284，95％CI：0.343-1.367)、年龄(图5中b的Validation Cohort (OS)组Age行：P＝0.131，95％CI：0.901-2.246)、是否吸烟(图5中b的Validation Cohort(OS)组Smoking行：P＝0.272，95％CI：0.767-2.557)和肿瘤分期(图5中b 的Validation Cohort(OS)组SCLC staging行：P＝0.012,95％CI：1.081-1.887)，风险值预测模型对OS的预测能力最好(图5中b的Validation Cohort(OS)组Risk score 行：P<0.001，95％CI：2.529-7.032)。(图5中b)

(3)风险值预测模型对验证队列中RFS的预测能力

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行RFS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中a的Validation Cohort (RFS)组Sex行：P＝0.211，95％CI：0.829-2.335)、年龄(图5中a的Validation Cohort (RFS)组Age行：P＝0.310，95％CI：0.821-1.860)、是否吸烟(图5中a的Validation Cohort(RFS)组Smoking行：P＝0.082,95％CI：0.952-2.278)和肿瘤分期(图5中a 的Validation Cohort(RFS)组SCLC staging行：P＝0.018,95％CI：1.055-1.757)，风险值预测模型对OS的预测能力最好(图5中a的Validation Cohort(RFS)组Risk score 行：P<0.001，95％CI：1.827-4.578)。(图5中a)

对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与风险值预测模型同时进行RFS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(图5中b的Validation Cohort (RFS)组Sex行：P＝0.877，95％CI：0.556-1.990)、年龄(图5中b的Validation Cohort (RFS)组Age行：P＝0.264，95％CI：0.823-1.958)、是否吸烟(图5中b的Validation Cohort(RFS)组Smoking行：P＝0.495，95％CI：0.701-2.089)和肿瘤分期(图5中 b的Validation Cohort(RFS)组SCLC staging行：P＝0.073,95％CI：0.978-1.643)，风险值预测模型对OS的预测能力最好(图5中b的Validation Cohort(RFS)组Risk score 行：P<0.001，95％CI：1.727-4.283)。(图5中b)

综上所述，本发明确定了SCLC中免疫相关lncRNA基因的表达谱，并建立了基于8个免疫相关lncRNA(包括ENOX1-AS1,AC005162,LINC00092,RPL34-AS1, AC104135,AC015971,AC126544和AP001189)的分子模型(风险值预测模型)来预测SCLC患者的辅助化疗反应和预后风险。结果表明本发明所建立的免疫相关 lncRNA的风险值预测模型可以有效对小细胞肺癌的预后和辅助化疗获益进行预测；8 个免疫相关lncRNA可作为小细胞肺癌的预后预测和辅助化疗获益预测的标志物该发明可能会为未来化疗在SCLC患者中的临床应用提供参考依据，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用

<130> GNCSQ212674

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcactgcca tgtgttttca 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgcctctg aggacactat aa 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggatcccat ccttttccat aaa 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accctatgac cagcctctga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggtgaatt gtcggaagca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggccgtta aaaccccaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaagccgcaa agagcaaagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagtggtagc gatggagagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggacctgg ctccgaaatg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctatcgctgt ccagcctcac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agctacctct tccacccgat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgaagccaa aggtcaggga 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agggtatggt tgaacgtctc tg 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgccaggttc ttggcttatg t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtccacagga tcaaccgct 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaagtcccag gaagactgtg c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaatcaagtg gggcgatgct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caaatgagcc ccagccttct 20

Claims

1.八种lncRNA作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者的预后的产品中的应用，所述八种lncRNA为ENOX1-AS1、AC005162、LINC00092、RPL34-AS1、AC104135、AC015971、AC126544和AP001189。

2.八种lncRNA作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者的化疗获益的产品中的应用，所述八种lncRNA为ENOX1-AS1、AC005162、LINC00092、RPL34-AS1、AC104135、AC015971、AC126544和AP001189。

3.预测小细胞肺癌患者预后和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的装置，所述装置包括用于获取ENOX1-AS1基因、AC005162基因、LINC00092基因、RPL34-AS1基因、AC104135基因、AC015971基因、AC126544基因和AP001189基因这八种lncRNA基因的表达量的模块。

4.检测ENOX1-AS1基因、AC005162基因、LINC00092基因、RPL34-AS1基因、AC104135基因、AC015971基因、AC126544基因和AP001189基因这八种lncRNA基因的表达量的物质在制备预测小细胞肺癌患者预后的系统和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述物质包括检测所述八种lncRNA基因的表达量所需的试剂和/或仪器。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述预测小细胞肺癌患者预后的系统包括所述物质和lncRNA基因表达量数据处理模块，所述lncRNA基因表达量数据处理模块用于将来自待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织中所述八种lncRNA基因的表达量转换为风险值，根据所述风险值预测所述待预测小细胞肺癌患者的预后。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统包括所述物质和lncRNA基因表达量数据处理模块，所述lncRNA基因表达量数据处理模块用于将来自待预测小细胞肺癌患者的分离的小细胞肺癌组织中所述八种lncRNA基因的表达量转换为风险值，根据所述风险值预测所述待预测小细胞肺癌患者是否从化疗中获益。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述lncRNA基因表达量数据处理模块根据公式I得到所述风险值；

所述公式I为：风险值＝(0.3647×ENOX1-AS1基因表达量值)+(0.1062×AC005162基因表达量值)+(0.1935×RPL34-AS1基因表达量值)+(0.0329×AC104135基因表达量值)+(0.3833×AC015971基因表达量值)+(0.1074×AC126544基因表达量值)-(0.4814×LINC00092基因表达量值)-(0.0665×AP001189基因表达量值)。

9.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：所述lncRNA基因表达量数据处理模块利用R语言软件中的survminer软件包中的surv_cutpoint确定所述风险值的阈值。

10.权利要求4-9中任一所述的预测小细胞肺癌患者预后的系统和/或预测小细胞肺癌患者化疗获益的系统。