CN111139298A

CN111139298A - 4-LncRNA分子标签在肺癌预后评估中的应用

Info

Publication number: CN111139298A
Application number: CN201811307081.4A
Authority: CN
Inventors: 王辉云; 龙潇冉; 张美殷; 买世娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: CN111139298B

Abstract

本发明公开了4‑LncRNA分子标签在肺癌预后评估中的应用。本发明通过4‑LncRNA分子标签评估肺癌患者的总生存时间和无病生存时间，发现高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者显著缩短；此外，4‑LncRNA分子标签可提高肺癌临床分期系统的预后评估价值。在Lnc‑GAN1和NEAT1的后续功能和机制探索中，发现Lnc‑GAN1在肺癌中发挥抑癌基因样作用和NEAT1在肺癌中发挥癌基因样作用。说明本发明4‑LncRNA分子标签的任何一个或二个以上的组合可作为肺癌预后评估的检测标记物，可为肺癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等，具有快速性、客观性和准确性等优点。

Description

4-LncRNA分子标签在肺癌预后评估中的应用

技术领域

本发明涉及生物标志物在制备肿瘤患者预后评估试剂盒生产的应用领域，具体涉及4-LncRNA分子标签在评估肿瘤患者预后特别是肺癌患者和产生肿瘤预后评估中的应用。

背景技术

肺癌是世界范围内致死率最高的肿瘤之一，其中大约有80％为非小细胞肺癌。临床实践中，诊断滞后和预后预测指标的缺乏往往是非小细胞肺癌较差预后的主要原因之一。晚期肺癌病人的五年生存率只有不到15％，而与之相比，I期病人的五年生存率却可达83％。现行非小细胞肺癌诊断依据及预后预测指标主要仍为病理组织学分型与临床TNM分期，但是近年来国内外临床研究多发现，临床及病理学分型完全相同的病人的预后情况却可能存在较大的差异，说明现有的诊断及预后预测指标存在着明显的滞后性与局限性。因此，通过探索新的肿瘤标志物以提高肺癌诊断效率及预后预测准确性将有助于改善患者生存质量，延长生存时间。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其异常表达参与了许多疾病过程，并与肿瘤的发生与发展密切相关。研究发现，LncRNA的异常表达参与了肿瘤的发生发展过程。LncRNA分子标签用于癌症诊断及预后预测的标志物研究也日益成为热点。例如，LncRNA PCGEM1在前列腺癌中过量表达可导致肿瘤细胞的增殖和克隆形成，MALAT-1 RNA的高表达与胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤的恶性化程度密切相关。

尽管已有一些研究报道了少数的LncRNA在非小细胞肺癌中的作用和意义，但非小细胞肺癌中LncRNA的表达情况尚无系统地研究报道，尚未有采用基因芯片大规模了解和寻找肺癌中关键LncRNA的报道。因此，临床上急需开发出一种用于检测、治疗及评估肺癌患者预后的LncRNA分子标签试剂盒，将对肺癌病人的治愈率和生存率具有重要的意义。

目前临床上急需开发出一种用于评估肝癌患者预后的LncRNA分子标签试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一在于提供定量检测4-LncRNA(NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245、BC041921R)的试剂在检测制备评估或辅助评估肺癌预后产品中的应用。

本发明的另一目的在于提供Lnc-GAN1、促进Lnc-GAN1表达的物质和/或抑制NEAT1表达的物质在制备治疗或辅助治疗肺癌药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

定量检测LncRNA的试剂在制备评估或辅助评估肺癌预后产品中的应用；所述LncRNA选自NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

进一步的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

进一步的，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合的引物或探针。

进一步的，能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的引物分别为SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8。

进一步的，能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的探针分别为SEQ ID NO：9～12。

进一步的，所述肺癌预后产品包括肺癌预后评估所用的试剂盒或相应的多聚酶链反应试剂或芯片检测试剂或测序试剂。

一种用于评估或辅助评估肺癌预后的产品，该产品中含有定量检测LncRNA的试剂，所述LncRNA为NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

进一步的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

进一步的，能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的引物如上所述。

进一步的，能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的探针如上所述。

Lnc-GAN1、促进Lnc-GAN1表达的物质和/或抑制NEAT1表达的物质在制备治疗或辅助治疗肺癌药物中的应用。

进一步的，促进Lnc-GAN1表达的物质包括Lnc-GAN1的过表达载体。

进一步的，抑制NEAT1表达的物质选自沉默NEAT1表达的siRNA、沉默NEAT1表达的shRNA、沉默NEAT1表达的反义寡核苷酸链中的至少一种。

进一步的，所述治疗或辅助治疗肺癌包括抑制肺癌增殖和/或抑制肺癌迁移。

进一步的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种可以有效改善非肺癌患者预后评估准确性的LncRNA分子标签(NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和/或BC041921R这4种长链非编码RNA)，可以有效评估预测肺癌患者的预后，可为肺癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等作用。

2.本发明通过检测肺癌患者肺癌组织中4-LncRNA(NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和、或BC041921R这4种长链非编码RNA)分子标签的表达，建立风险分数模型，通过4-LncRNA分子标签评估非小细胞肺癌患者的总生存时间和无病生存时间，发现高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者显著缩短。

3.此外，4-LncRNA分子标签可提高肺癌临床分期系统的预后评估价值，即评估预测同一临床分期(TNM分期)的患者，发现两组患者在生存时间上有明显差异。再者，结合4-LncRNA分子标签和临床分期系统组成联合预测之后，可将肺癌患者分为高、中、低风险三组，三组患者在生存时间上均具有明显差异。说明本发明4-LncRNA分子标签可作为肺癌预后评估的检测标记物，可为肺癌患者提供预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等，具有快速性、客观性和准确性等优点。

4.本发明4-LncRNA分子标签的任何一个或二个以上的组合可作为肺癌预后评估、肺癌检测、肺癌治疗的标记物，可为肺癌患者提供诊断、治疗、预后效果评价、观察和监测以及用于判断患者预后状况等，具有快速性、客观性和准确性等优点。

附图说明

图1：在训练组、验证组和独立验证组中根据4-LncRNA分子标签区分的高/低风险组患者的Kaplan-Meier生存曲线分析；根据4-lncRNA分子标签所计算得出的风险分数分为高风险组及低风险组，对两组的总生存及无病生存进行Kaplan-Meier曲线分析：A，训练组：根据风险分数分为高风险组及低风险组后，训练组中病人总生存及无病生存的K-M分析。B，验证组：根据风险分数分为高风险组及低风险组后，验证组中病人的总生存及无病生存的K-M分析。C，独立验证组：根据风险分数分为高风险组及低风险组后，独立组中病人的总生存及无病生存的K-M分析。注：Overall Survival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Low Risk,低风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；P，概率

图2：不同临床分期的患者根据4-LncRNA分子标签区分为高/低风险组患者的Kaplan-Meier生存曲线分析；根据4-lncRNA分子标签计算得出的风险分数分为高风险组及低风险组，对临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的总生存(OS)及无病生存(DFS)进行Kaplan-Meier曲线分析。注：Clinic Stage I，I期；Clinic Stage II，II期；Clinic Stage III，III期；OverallSurvival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Low Risk,低风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；p，概率；HR,hazard ratio，风险比；95％CI,95％confidence interval，95％置信区间；P值，P value，概率。

图3：训练组中不同TNM分期病人的总生存(OS)和无病生存(DFS)的Kaplan-Meier曲线；根据4-LncRNA分子标签和TNM分期把患者分为高、中和低风险组并进行K-M生存分析。注：I stage，I期II stage，II期；III stage，III期；Overall Survival,总生存率；Diseasefree Survival,无瘤生存率；Low Risk,低风险；Median Risk，中度风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；P，概率。

图4：验证组中不同TNM分期病人的总生存(OS)和无病生存(DFS)的Kaplan-Meier曲线；根据4-LncRNA分子标签和TNM分期把患者分为高、中和低风险组并进行K-M生存分析。注：I stage，I期II stage，II期；III stage，III期；Overall Survival,总生存率；Diseasefree Survival,无瘤生存率；Low Risk,低风险；Median Risk，中度风险；High Risk，高风险；Number at Risk，人数；P，概率。

图5：独立验证组中不同TNM分期病人的总生存(OS)和无病生存(DFS)的Kaplan-Meier曲线；根据4-LncRNA分子标签和TNM分期把患者分为高、中和低风险组并进行K-M生存分析。注：I stage，I期II stage，II期；III stage，III期；Overall Survival,总生存率；Disease free Survival,无瘤生存率；Low Risk,低风险；Median Risk，中度风险；HighRisk，高风险；Number at Risk，人数；P，概率。

图6：采用ROC曲线分析4-LncRNA，TNM分期和联合该2项指标预测患者生存的敏感性和特异性。注：Sensitivity，敏感度；Specificity，特异度；Signature+TNM stage,LncRNA分子标签+TNM分期；Signature，LncRNA分子标签；TNM，TNM分期；AUC,ROC曲线下面积；95％confidence interval，95％置信区间；P，概率。

图7：NEAT1、Lnc-GAN1在病人样本中的表达情况及与预后相关。

图8：qPCR检测肺组织细胞株Beas-2B及肺癌细胞株A549、H460、1299、1650中NEAT1及LNC-GAN1表达情况。

图9：qPCR检测肺组织细胞株A549、H460中LNC-GAN1过表达及NEAT1敲降情况。

图10：CCK8实验检测稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1后细胞的生长曲线。

图11：流式细胞仪检测稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1后细胞的细胞周期改变。

图12：流式细胞仪检测稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1后明显促使肿瘤细胞发生凋亡。

图13：平板克隆实验表明稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1对肺癌克隆形成能力具有抑制作用。

图14：Transwell实验表明稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1对肺癌细胞迁移能力具有抑制作用。

图15：裸鼠成瘤实验表明稳定过表达Lnc-GAN1抑制肺癌细胞成瘤能力。

图16：qRT-PCR验证全基因组表达谱芯片结果。

图17：qPCR检测P53、P21mRNA水平表达情况说明过表达Lnc-GAN1后p21、p53mRNA水平表达上调。

图18：Western Blot检测MDM2-P53-P21-CDK2/CDK6信号通路蛋白的表达变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

发明人利用LncRNA芯片分析训练组194对肺癌组织及配对癌旁组织中的LncRNA表达谱，通过SAM分析发现在肺癌及癌旁组织中共有305个差异表达倍数超过1.25倍的LncRNA，其中138个LncRNA在肺癌组织中上调，167个在肺癌组织中下调。单因素COX回归分析305个LncRNA与训练组肺癌患者预后的关系，结果发现有15个LncRNA与肺癌患者的生存密切相关。在这15个LncRNA中筛选LncRNA分子标签，为了寻找预测预后最佳的分子标签，从这15个与预后相关的LncRNA中，逐步减去一个LncRNA，直至现存的分子标签具有最佳预后评估效果为止。通过这样的方法，4个LncRNA组成的分子标签最终被筛选出来。在这4个LncRNA(NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R)中，有1个LncRNA在肺癌组织中表达上调(NEAT1)，是风险性LncRNA，另外3个在肺癌组织中表达下调，是保护性的LncRNA(Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R)。根据这4个LncRNA的芯片表达值和单因素COX回归分析的权重，计算每位患者的风险分数，并以总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组，最后Kaplan-Meier生存分析表明高风险组患者的总生存时间和无病生存时间比低风险组患者均显著缩短。4-LncRNA分子标签可预测肺癌病人的预后。

为了验证训练组中的该结果，在验证组中也按同样的公式计算风险分数和中位值，将验证组分为高风险组和低风险组。通过K-M生存分析，在验证组中也发现了和训练组中相似的结果。高风险组的病人的总生存时间和无病生存时间都比低风险组的病人缩短。结果提示，4-LncRNA分子标签可以预测肺癌肺癌病人的预后。

为了再次验证4-LncRNA分子标签对生存的预测是否具有普遍实用性，从云南省肿瘤医院得到73例非小细胞肺癌癌样本，得到的这组样本数据组成一个独立验证组，采用qRT-PCR法检测了73例样本的4-LncRNA表达水平，再次验证4-LncRNA分子标签与生存的关系。利用与之前组建风险分数模型的相同方法，通过COX回归得到计算风险分数的公式的权重，使用这个公式计算出每个病人相应的风险分数，用中位风险分数把病人分为高风险和低风险，通过Kaplan-Meier生存分析比较两组之间的总生存时间和无瘤生存时间。与预期结果一致，高风险组的病人的总生存时间和无瘤生存时间均较低风险组的病人差。

1.实验材料及方法：

1.1样品

2003年至2008年间行肺癌根治性切除术的病例中筛选出366例符合入组标准的病例，并取得每个病例配对的肺癌及癌旁组织标本。366病例随机分为两组，一组为194例，作为训练组，另一组172例，作为验证组。其次，从云南省肿瘤医院获得73例非小细胞肺癌，作为独立验证组。

1.2设备、试剂

抽提RNA的试剂盒购自Invitrogen公司。所需的探针、引物由life公司合成。qRT-PCR试剂盒购自Promega公司。所需的Cyanine-5-dUTP购自Enzo Life Sciences。DMSO购自Sigma-Aldrich USA；杂交液：10×Denhart's solution，10×SSC，1.0％SDS。多功能酶标仪SpectraMaxM5公司，细胞周期检测使用ACEA NovoCyte^TM流式细胞仪，细胞凋亡检测使用BECKMAN流式细胞仪，倒置显微镜Olympus(XDS-1)。Cell Counting Kit-8试剂盒购自广州威佳，细胞周期检测试剂盒购自贝博公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基公司，Transwell专用小室购自BD公司。

1.3数据分析软件及网址

探针同源性比对：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST；探针杂交信号量化：GenePix Pro6.0；芯片数据提取、去背景、标准化：GPR；差异表达基因筛选：SAM(Significance Analysis of Microarrays)；统计学分析：SPSS20.0；统计作图：GraphPad.Prism。

1.4标本

用Trizol试剂提取组织RNA，参照Invitrogen Trizol说明书

1.5LncRNA芯片探针设计

从LncRNA数据库(Noncode、Genecode、LncRNA、Refseq)中筛选恶性肿瘤相关LncRNA，共筛选出2412个LncRNA转录本，并利用Array Designer 4.4软件设计针对每个转录本特异性的寡核苷酸探针，并交由Invitrogen公司合成。Lnc-GAN1的碱基序列为SEQ IDNO：13所示，ASLNC11245为SEQ ID NO：14所示，BC041921R为SEQ ID NO：15所示。

其中，芯片检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的探针分别为：NEAT1探针P1：GACGAGATTAGATGGGCTCTTCTGGATTTGTTCCTCATTTGTCACAGGTGTCTTGT(SEQ ID NO：9)；Lnc-GAN1探针P2：AGTTTTGTTGCGGGGGGTGGGATATTGATCATTTGAACATATGCCAGTTGTTTCTCCTGC(SEQ ID NO：10)；ASLNC11245探针P3：CCTGGAATTGTTTTCCATACAACCCTGACCCATTAGTACATTTGGGTTTCTAA(SEQ ID NO：11)；BC041921R探针P4：GATACATTATTTGTAGCAAAGCCAAGCCTAAATTTTCTCTGAAGCAAATCCTAACCCTCC(SEQ ID NO：12)。

1.6芯片点制

(1)玻片的清洗

(2)芯片的点制按照前述方法设计好的LncRNA探针和本实验室发明的点样液混合均匀后，放置于384孔板中，再用本实验室的北京博奥Smart Arrayer TM 136printer点样仪将探针点在按照前述方法清洗好的玻片上，温度控制在23℃～24℃之间，湿度控制在33％～35％之间。每一个探针点制两个重复点，一张玻片可点制两个相同的矩阵。

具体步骤如下：A.取200μmol/L LncRNA探针2μl与8μl点样液混合均匀，放置于384孔板内，使得探针的最终浓度为40μmol/L。B.将玻片和上述384孔板放置于点样仪的相应位置，并将点样针置于点样仪相应的位置。C.开启点样仪以及电脑，启动Smart Arrayer软件。D.在Smart Arrayer软件中进行设定点片的参数，设定后运行软件，等待点样仪开始运行，取样和点样。待点片结束后，将芯片置于同样温度和湿度条件下过夜。第二天将其储存于玻片盒中，密闭真空保存待用。接下来根据点样顺序和芯片位置生成.gal文件，以便于进行芯片实验后的数据提取工作。

1.7LncRNA标记

(1)将肺癌或癌旁组织样品总RNA经过逆转录将带荧光的dUTP碱基渗入到cDNA中，使逆转录合成的cDNA带上荧光，具体反应体系如下：

冰上配置：

冰上配置：

然后将反应体系放于PCR仪中，退火25℃5min，延伸42℃60min，灭活转录酶70℃15min，完成后置于冰上保存。

(2)反转录cDNA纯化、干燥，

将柱子Micro Bio-Spin 30Column底部的阻塞胶块掰断，并将柱子放入配套的离心管中，使柱子内部的缓冲液慢慢滴至离心管中，最后弃置缓冲液。柱子和离心管置于离心机中，1000g离心2min，注意观察柱子内部是否变干，然后将离心管弃置。将去掉缓冲液的柱子放置于另一个EP管中。将标记了荧光的cDNA加入柱子中，1000g离心4min，过滤出来的溶液就是被纯化的荧光标记cDNA。然后将EP管中的液体真空干燥，20min后，补Rnase FreeWater至25μl，该步骤可得到了标记纯化cDNA。

1.8LncRNA芯片杂交

(1)将芯片用蒸馏水浸泡1min，后低速甩干。(2)将芯片放置于杂交盒中，然后在盒子两边底部分别加入30μl蒸馏水，以便保持盒内的湿度。(3)芯片阵列两边贴上胶条，放上盖玻片。(4)取25μl标记纯化好的cDNA，加入等体积的2×Hybridization Buffer，混匀后加到阵列上。(5)封装好杂交盒。然后置于预热好的杂交炉中，45℃，16小时。(6)拿出芯片后，待冷却，然后放置于1×SSC和0.1％SDS的混合溶液中振荡清洗2min，再放置于另一瓶同样的洗液中浸泡10min，以便充分去掉残余的未结合上的cDNA。(7)最后放置于0.5×SSC溶液和0.1×SSC溶液中再各清洗1min(重复1次)。(8)然后1min，1000rpm离心，甩干芯片上残余液体，最后准备扫描芯片。

1.9LncRNA芯片扫描

LncRNA芯片扫描过程具体步骤如下：(1)打开扫描仪电源，开启电脑。打开软件界面，预热程序，待扫描。(2)点击软件弹出扫描仪的托盘。(3)将上述清洗后的芯片放置于托盘内，关闭托盘返回扫描仪内。(4)为了确定阵列位置及具体扫片的强度，首先进行预扫程序。(5)根据预扫后所得图像，将阵列所在区域仔细框出，然后选择适当power值和强度进行扫描。(6)采用Genepix 6.0软件采集芯片杂交扫描图的数据信息，获得每个样本杂交图像中LncRNA的杂交信号的中位置，每一个杂交点的信号代表了一种LncRNA在该标本中的表达情况，并将数据信息保存为gpr文件。

1.10数据分析方法

(1)将所有样本的gpr文件导入GPR分析软件，先采用GPR软件去除背景值，然后再用GPR软件进行标准化。(2)在差异表达LncRNA中单因素COX回归分析方法筛选出肺癌预后相关的LncRNA。采用Kapan-Meier生存分析LncRNA与肺癌患者预后的关系；(3)采用单因素COX回归分析的方法分析肺癌预后相关的LncRNA和各个临床特征(年龄、性别等)之间的关系，同时结合单因素COX回归分析和多因素COX回归分析各个临床特征与肺癌预后的关系。(4)采用逐步回归计算风险分数的方法筛选和鉴定肺癌预后相关的LncRNA分子标签。(5)采用卡方检验、t检验以及Fisher精确概率法比较不同分组病例相关临床特征的差异；采用Kapan-Meier生存分析方法比较高(中)低风险组病例总生存时间和无病生存时间的差别，绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating characteristic Curve，ROC曲线)以比较不同方法的预后评估价值。

1.11实时荧光定量RT-PCR

检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245和BC041921R的qRT-PCR引物分别为：

NEAT1：

正向引物1-1：CCTGCCTTCTTGTGCGTTTC(SEQ ID NO：1)；

反向引物1-2：CTTGTACCCTCCCAGCGTTT(SEQ ID NO：2)；

Lnc-GAN1：

正向引物2-1：GACAGTGTTGGCAAGAACGG(SEQ ID NO：3)；

反向引物2-2：CTTGCCCAGCACTCTTCTTTG(SEQ ID NO：4)；

ASLNC11245：

正向引物3-1：CTCCTGCTCCACTACTCCTG(SEQ ID NO：5)；

反向引物3-2：GGGAACACAGCTTTCCCTAC(SEQ ID NO：6)；

BC041921R：

正向引物4-1：TGTTGGCCCAAAAGTTTTCCT(SEQ ID NO：7)；

反向引物4-2：CCTCAAGCATAACAGCACA(SEQ ID NO：8)。

以GAPDH作为内参，以Threshold cycle(CT)法进行表达水平的比较分析，以2^-△△Ct方法计算相对定量。

1.12分别构建Lnc-GAN1稳定过表达株和NEAT1稳定敲降细胞株

(1)选择Lnc-GAN1表达相对较低的肺癌细胞株A549、H460作为基础细胞，将Lnc-GAN1在A549、H460细胞中稳定过表达，并同时建立空载作为对照细胞株；选择NEAT1表达相对较高的肺癌细胞株A549、H460作为基础细胞，将NEAT1在A549、H460细胞中稳定敲降，并同时建立空载作为对照细胞株；过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1采用慢病毒感染，病毒液购自于上海吉玛公司，为带GFP荧光蛋白的需嘌呤霉素筛选的稳定过表达病毒。

(2)构建稳定过表达和稳定敲降细胞株：0.25％胰蛋白酶常规消化肺癌细胞株A549、H460，细胞计数后，取1×10⁵cells/well，加入6孔板，2ml完全培养液，37℃、5％CO2细胞孵育箱培养；细胞贴壁后，在生物安全柜里将病毒稀释到合适浓度，本实验为1：100，即20ul病毒原液，2ml细胞培养液，然后加入终浓度为5ug/ml的Polybrene，将混合液缓慢混匀，吸出旧的培养液，加入上述混匀的病毒液，37℃、5％CO2培养；病毒感染24h后移去病毒液，加入2ml完全培液，37℃、5％CO2培养，此时，可在荧光显微镜下观察细胞是否有荧光表达；根据细胞生长速度，可以将细胞移植到75cm²细胞培养瓶中继续培养和后续试验，可根据情况加入嘌呤霉素筛选阳性细胞。

(3)qPCR验证构建后的稳定细胞株：将稳定过表达Lnc-GAN1和稳定敲降NEAT1的细胞扩大培养至一定数量后，用qPCR来验证过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1的效果。分别获得Lnc-GAN1稳定过表达株A549-LNC-GAN1、H460-LNC-GAN1；以及NEAT1稳定敲降细胞株A549-NEAT1siRNA-1139、A549-NEAT1siRNA-2228，H460-NEAT1siRNA-1139、H460-NEAT1siRNA-2228。

1.13CCK-8测细胞增殖及绘制生长曲线

(1)分别取对数生长期的A549-NC(对照)及A549-NEAT1siRNA-1139、A549-NEAT1siRNA-2228；H460-NC(对照)及H460-NEAT1siRNA-1139、H460-NEAT1siRNA-2228；A549-NC(对照)及A549-LNC-GAN1；H460-NC(对照)及H460-LNC-GAN1细胞常规消化；(2)分别接种于96孔板，每孔100ul,约1000个细胞，每组设6个平行复孔；(3)同时每块板设置空白对照孔(只含100ul培养基，不含细胞)；(4)37℃、5％CO₂培养；(5)每天同一时间每孔加入10ulCCK-8溶液，37℃、5％CO₂条件孵育2h；(6)用酶联免疫检测仪于450nm波长测每孔的OD值；(7)采用多功能酶标仪SpectraMaxM5连续测定7天后绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

1.14细胞周期检测

(1)分别取对数生长期的A549-NC及A549-NEAT1siRNA-1139、A549-NEAT1siRNA-2228；H460-NC及H460-NEAT1siRNA-1139、H460-NEAT1siRNA-2228；A549-NC及A549-LNC-GAN1；H460-NC及H460-LNC-GAN1细胞常规消化，每管保留大约5×10⁵细胞；(2)预冷的PBS洗涤细胞2次；(3)预冷75％乙醇-20℃固定过夜；(4)1000X g、4℃离心5min；(5)预冷PBS洗涤细胞1次；(6)用500ul预冷PBS重悬细胞；(7)加入20ul RnaseA，37℃水浴30min；(8)加入400ul PI，4℃避光孵育30min；(9)细胞过滤后流式细胞仪检测。

1.15细胞凋亡检测

(1)取对数生长期的A549-NC及A549-NEAT1siRNA-1139、A549-NEAT1siRNA-2228；H460-NC及H460-NEAT1siRNA-1139、H460-NEAT1siRNA-2228；A549-NC及A549-LNC-GAN1；H460-NC及H460-LNC-GAN1细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数。以2×10⁵～5×10⁵cells/well的密度将细胞铺至6孔板中，细胞孵育过夜。(2)待细胞贴壁后更换新鲜培养基培养细胞，进行饥饿处理24小时，24小时之后再改用完全培养基继续培养24h。(3)收集每孔中的上清液，用生理盐水洗一遍，冲洗贴壁细胞的生理盐水也收集，然后加入不含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化细胞，加入含血清的培养基终止消化，再将6孔板里每个孔中的液体连同细胞全部收集起来加入相对应的15ml离心管中。2000rpm离心5min，弃上清。(注：0.25％胰蛋白酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)。(4)用预冷的PBS重悬洗涤细胞一次，并转入1.5mlEP管中，离心，2000rpm，5min，弃上清，收集细胞沉淀。(5)用预冷的PBS再次重悬洗涤细胞，离心，2000rpm，5min，弃上清，收集细胞沉淀。(6)加入500ul的Binding Buffer重悬细胞；(7)再加入5ul Annexin V-FITC混匀后，加入5ulPropidium Iodide，混匀；(8)室温，避光，反应5～15min；(9)在1小时之内，用流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

1.16细胞迁移能力测试

(1)用BD公司的Transwell专用小室来测细胞的侵袭及迁移能力。(2)用BD的Matrigel以1:3的比例用1640培养基在冰上稀释后，取50μl加入小室的滤膜表面，加入时注意不要产生气泡，并使其在滤膜上非常均匀的分布。然后将小室放置于24孔板上，放置于细胞培养箱中约8小时后，待Matrigel凝固后可用。使用前30分钟再于小室中加入100μl无血清DMEM培养基放置于培养箱中，待实验使用前再将培养基弃置。(3)取对数生长期的已转染LNC-GAN1、A549或NC的A549、H460细胞，用0.25％胰酶消化下来后加入无血清的1640培养基将细胞重悬，再进行细胞计数。(4)下室中加入含10％胎牛血清的1640培养基800μl，上室中加入细胞悬液(根据不同细胞加入25万个细胞)150μl，每组设3个复孔，放置于37℃、5％CO₂条件下细胞培养箱中培养24h。(5)取出Transwell小室，吸干上下层小室的液体后，在下层加入用75％甲醇配置好的2％的结晶紫溶液1ml进行染色30分钟以上。(6)弃置结晶紫溶液后，用生理盐水反复漂洗小室至干净。然后用棉签轻轻擦去于微孔膜上层的细胞。(7)在显微镜下将移至微孔膜下层的细胞数量进行计数，每一个小室在400倍镜下取9个视野后进行计数，后再取平均值。细胞迁移实验中，除上层小室不加Matrigel，细胞数量控制在8万，培养时间控制在14h外，其余实验步骤与上述相同。

1.17平板克隆形成试验

(1)分别取对数生长期的A549-NC及A549-NEAT1shRNA；H460-NC及H460-NEAT1shRNA；A549-NC及A549-LNC-GAN1；H460-NC及H460-LNC-GAN1细胞常规消化；(2)分别接种于6孔板，每孔2ml,约1000个细胞，每组设3个平行复孔；(3)置37℃、5％CO₂条件下培养大约2周；(4)当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，吸去培养基，PBS洗3次；(5)每孔加2mL75％乙醇溶液固定30min；(6)吸去固定液，每孔加2mL 2％结晶紫染液染30min；(7)自来水洗去染色液，空气中自然晾干；(8)将平板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，直接计数克隆数，实验重复3次。

1.18裸鼠成瘤实验实验

选用4-5周大的BALB/c雄性裸鼠进行实验，将购买的雄性裸鼠饲养在SPF级的实验室观察培养一周。取对数生长期构建好的稳定株细胞A549-NC、A549-LNC-GAN1及H460-NC、H460-LNC-GAN1，用胰酶消化下来，细胞计数板计数，裸鼠成瘤实验按每100ul 1×107细胞的浓度用灭菌的PBS重悬，皮下注射到裸鼠腋下，实验组和对照组各6只裸鼠。每三天观察一次，记录肿瘤的长径和宽度。注射后第24天，将裸鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，拍照、称重后置于福尔马林固定，以做后续试验。

1.19全基因组表达谱芯片检测筛查Lnc-GAN1相关信号通路

应用Agilent全基因组表达谱芯片(whole human genome，4×44K)检测了稳定过表达Lnc-GAN1的肺癌细胞株A549及其转染空载对照细胞株A549-NC两组细胞表达谱的变化，经生物信息学分析找出Lnc-GAN1基因相关的相互作用蛋白和调节的信号通路，此部分实验由上海伯豪生物公司协助完成。

1.20Western Blot检测Lnc-GAN1对相关信号通路蛋白的影响

(1)细胞总蛋白的提取：取处于对数生长期的肺癌细胞，常规胰酶消化后转移到15ml离心管，1000RPM离心4min后弃去上清；向离心管中加1ml生理盐水后轻轻吹打细胞，转移至1.5ml EP管中，1000RPM离心4min后弃去上清；向EP管中的细胞沉淀中加入100μl蛋白裂解液(RIPA，美国Thermo Fisher公司)，并按照1：100的比例加入蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor，美国Thermo Fisher公司)以及PMSF(美国Thermo Fisher公司)，冰上裂解至少10min；将EP管放入离心机中，4℃下14000RPM离心10min，取上清转移至另一干净EP管中，-80℃保存。

(2)蛋白浓度的测定：按照BCA试剂盒说明书配置BCA工作液，即50体积试剂A加1体积试剂B，再取一块96孔板，每孔加入200μl配好的BCA工作液；稀释标准蛋白(BSA ProteinStandard，2mg/ml)至1mg/ml。依次加入相应试剂(绘制标准曲线)；待测蛋白孔中加入19μl的去离子水和1μl待测蛋白；震荡混匀，置入37℃隔水培养箱中孵育30min，可观察到96孔板内液体变为紫色；使用酶标仪测定562nm波长下的吸光值；利用标准蛋白绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。

(3)Western Blot：本实验主要用10％和12％浓度的分离胶，采用碧云天公司SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。将配置好的分离胶加入两块玻璃板之间的空槽中，一般加4.5ml左右即可加完后再缓慢加入异丙醇，作用是压胶是分离胶上层处于一条直线上，加完后室温静置至少30min，直至异丙醇与胶之间出现明显分界，说明胶体已完全凝固；配置上层浓缩胶。胶体配好之后，进行后的上样、电泳、转膜等常规的Western Blot操作。

2.结果

(1)评估非小细胞肺癌预后的标志物的筛选与鉴定

发明人利用LncRNA芯片分析训练组194对肺癌组织及配对癌旁组织中的LncRNA表达谱，通过SAM分析发现在肺癌及癌旁组织中共有305个差异表达倍数超过1.25倍的LncRNA，其中138个LncRNA在肺癌组织中上调，167个在肺癌组织中下调。

单因素COX回归分析差异表达的305个LncRNA与训练组肺癌患者预后的关系，发现有15个LncRNA与肺癌患者的生存密切相关(表1)。

表1.与肺癌患者的预后明显相关的15个LncRNA

P值是应用χ2检验或Fisher’s确切概率法检验计算得到。

注：HR,hazard ratio，风险比；95％CI,95％confidence interval，95％置信区间；P值，P value，概率。

在15个LncRNA中筛选LncRNA分子标签，为了寻找预测预后最佳的分子标签，从这15个与预后相关的LncRNA中，逐步减去一个LncRNA，直至现存的分子标签具有最佳预后评估效果为止。最后筛选出NEAT1，Lnc-GAN1，ASLNC11245和BC041921R组成的分子标签，其中，NEAT1在肺癌组织中表达上调，是风险性LncRNA，Lnc-GAN1，ASLNC11245和BC041921R是保护性LncRNA。根据这4个LncRNA的芯片表达值和单因素COX回归分析的权重，构建风险分数的计算式：风险分数＝(0.412×NEAT1的表达值)+(-0.349×Lnc-GAN1的表达值)+(-1.269×ASLNC11245的表达值)+(-0.530×BC041921R的表达值)，通过该公式可计算每位患者的风险分数，并以总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组，其中风险分数高于中位值的判为高风险组，低于及等于中位值的判为低风险组。在训练组病例分为高风险组和低风险组。Kapan–Meier生存分析(简称K-M生存分析)表明高风险组患者的总生存时间和无病生存时间较低风险组患者均显著缩短(图1)。另外，分析本发明4个LncRNA分子标签和临床特征的关系，发现本发明4个LncRNA分子与其他临床特征无明显关系(表2)。

为了验证从训练组中找到的4-LncRNA分子标签在验证组中是否与预后也有显著关系，我们把组的病人也按照同样的公式计算风险分数和中位置，将验证组病人分为高风险组和低风险组。通过K-M生存分析，在验证组中也发现了和训练组相似的结果，高风险组的病人的总生存和无病生存都比低风险组的病人差(图1)。结果提示，4-LncRNA分子标签在训练组和验证组中都同样与预后显著相关，4-LncRNA分子标签可以预测肺癌病人的预后。同时和训练组中一样，在检验组中高低风险组病人，组间其他临床资料的分布没有明显差异(表2)。

下一步为了再次验证4-LncRNA分子标签对生存的预测是否具有普遍适用性，我们用实时荧光定量(qRT-PCR)检测了73例从云南省肿瘤医院得到的非小细胞肺癌样本中这4个LncRNA的表达水平，得到的这组样本数据组成一个独立组，再次验证4-LncRNA分子标签与生存的关系。利用与之前组建风险分数模型的相同方法，通过Cox回归得到计算风险分数公式的权重，风险分数公式如下：Risk Score＝(0.297×NEAT的表达值)+(-0.259×Lnc-GAN1的表达值)+(-0.706×ASLNC11245的表达值)+(-0.153×BC041921R的表达值)，通过该公式可计算每位患者的风险分数，并以独立组的总体风险分数的中位值为分界将患者分为高风险组和低风险组；通过Kapan–Meier生存分析比较两组之间的总生存时间和无病生存时间。与预期结果一样，高风险组的病人的总生存时间和无病生存时间均较低风险组的病人差(图1)。同时与训练组、检验组中一样，高低风险组的病人其他临床资料的分布没有明显差异(表2)。

以上这些结果都证明，通过4-LncRNA分子标签计算的风险分数把病人分为高低风险组后，两组之间的生存有明显差异，提示4-LncRNA分子标签与病人的预后显著相关，可成为预测肺癌患者预后的新的分子标记物。

表2.本发明4个LncRNA分子标签的风险分数结果和肺癌临床病理特征之间的相关性分析

P Values are calculated by X²test or Fisher’s exact test

P值是应用χ2检验或Fisher’s确切概率法检验计算得到，*Log-rank检验法。

注：HR,Hazard Ratio，风险比；95％CI,95％confidence interval，95％置信区间；P值，P value，概率；TNM分期：tumor-node-metastasis分期，肿瘤淋巴结转移分期。

(2)单因素COX回归分析和多因素COX回归分析4-LncRNA分子标签为肺癌患者预后的因素

采用单因素COX回归和多因素COX回归分析4-LncRNA分子标签及各个临床特征与肺癌患者预后的关系。结果显示，在训练组、验证组和独立验证组中4-LncRNA分子标签和TNM分期均是肺癌患者的独立预后因素(表3,4)。

表3.三组肝癌患者总生存率与4-lncRNA标签相关的单因素分析

表4.三组肝癌患者总生存率与4-lncRNA标签相关的多因素分析

(3)4-LncRNA分子标签可以有效评估同一临床分期肺癌患者的预后

现行的肺癌常用的临床分期系统仍为TNM分期，目前一般认为处于同一临床分期的患者之间预后差异不会很大。根据4-LncRNA分子标签计算得出的风险分数的中位值分为高风险组及低风险组，对TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ组的总生存(OS)及无病生存(DFS)进行Kaplan-Meier曲线分析。结果显示在同一临床分期内，高风险组病例的总生存时间和无病生存时间较低风险组病例的总生存时间和无病生存时间明显缩短(图2)。

(4)4-LncRNA分子标签可以有效提高常用临床分期系统的预后评估效力

首先，Kaplan-Meier生存分析结果显示单独的TNM分期并不能准确预测肺癌患者预后，尤其是I、II期患者的总生存时间或者无病生存时间(图3,4,5)。结合4-LncRNA分子标签和TNM分期组成联合预测模型之后，计算肺癌患者的风险分数，即：将4-LncRNA分子标签计算得出的风险分数(低风险＝0分，高风险＝1分)和TNM分期风险分数(I期＝1分，II期＝2分，III期＝3分)相加，可将肺癌病例分为低风险组(1分)，中风险组(2-3分)，高风险组(4分)。接着，采用Kaplan-Meier生存分析分析三组之间总生存时间和无病生存时间之间的差异。结果显示高、中、低风险组的肺癌病例在总生存时间和无病生存时间之间存在明显的差别(图3，4，,5)。

(5)ROC曲线分析结合4-LncRNA分子标签和临床分期对肺癌预后的评估效力优于单纯TNM分期

采用ROC曲线评价联合预测模型(4-LncRNA分子标签+TNM分期)的预后评估效力是否优于单独的TNM分期，结果显示训练组、验证组、独立组联合预测模型预测总生存的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.726、0.734、0.747，预测无病生存的ROC曲线下面积分别为0.723、0.743、0.764，明显优于单独TNM分期(总生存时间：0.644，0.672，0.653；无病生存时间：0.641、0.676、0.656)(图6)。

(6)NEAT1、LNC-GAN1的肺癌芯片检测结果与预后的分析

在肺癌组织及正常肺组织的芯片结果中得知，NEAT1在肺癌组织中的表达均值与它在正常组织中的表达均值的比值约为2.78倍，Lnc-GAN1在肺癌组织中的表达均值与它在正常组织中的表达均值的比值约为0.39倍，因此，NEAT1在肺癌组织中表达明显上调，Lnc-GAN1在肺癌组织中表达明显下调。根据芯片检测NEAT1和Lnc-GAN1的表达情况，NEAT1和Lnc-GAN1分别根据各自的表达中位值为界，将训练组193例样本分为高表达组(n＝97)和低表达组(n＝96)，然后分别分析两组间生存的差异，采用K-M生存分析，如图7所示，NEAT1低表达组的总生存和无病生存明显好于NEAT1高表达组，Lnc-GAN1高表达组的总生存和无病生存明显好于低表达组，提示NEAT1和Lnc-GAN1的表达与病人的生存预后相关。

(7)筛选出稳定表达LNC-GAN1和稳定敲降NEAT1的肺癌细胞系

在正常肺组织细胞株Beas-2B及肺癌细胞株A549、H460、1299、1650中，经qPCR检测，A549、H460、1299、1650细胞株中NEAT1表达增强、A549、H460、1299、细胞株中LNC-GAN1表达减弱(图8)。选取A549及H460细胞构建LNC-GAN1稳定过表达及NEAT1稳定敲降细胞系，qRT-PCR检测过表达LNC-GAN1后的A549、H460细胞的表达水平较阴性对照细胞升高了150-300多倍(图9)，说明成功构建LNC-GAN1的过表达稳定株，所建稳定株用于后续细胞功能实验。同样方法构建并用qPCR验证NEAT1瞬转四个siRNA片段及用shRNA稳定敲降NEAT1细胞系。

(8)过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1能够抑制肺癌细胞的生长

外源稳定过表达Lnc-GAN1的细胞株A549、H460与相应的转染空载体的细胞相比，生长明显受到抑制。而敲降NEAT1的细胞株与转染空载体的细胞相比，生长明显受到抑制(图10)。实验结果表明，上调Lnc-GAN1及下调NEAT1能抑制肿瘤细胞生长。

(9)流式细胞仪检测细胞周期实验证实过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1能够抑制肺癌细胞从G1向S期过渡

外源稳定过表达Lnc-GAN1的细胞株A549、H460与相应的转染空载体的细胞相比，细胞周期明显减慢，G1期细胞比例增多，分裂期细被阻滞在G1期。同样，敲降NEAT1的细胞株与转染空载体的细胞相比G1期细胞比例增多，S期细胞比例减少，分裂期细被阻滞在G1期(图11)。实验结果表明，过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1能抑制肿瘤细胞从G1向S期过渡。

(10)稳定过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1促进肺癌细胞的凋亡

在肺癌细胞A549、H460细胞株中过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1 48小时后进行细胞凋亡实验。以Annexin V-FITC及PI进行标记，用流式细胞仪检测，得到结果，如图12所示。与阴性对照相比，过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1之后，肿瘤细胞的凋亡比例明显增加。实验结果说明，过表达Lnc-GAN1或敲降NEAT1可能可以促使肿瘤细胞发生凋亡。

(11)LncRNA-GAN1与NEAT1影响肺癌细胞的克隆形成能力

同样，将构建好的过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1稳定细胞株株A549、H460进行体外的平板克隆形成实验，结果显示在铺板后两周，结晶紫染色后，过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1的稳转细胞株的克隆形成的个数都明显少于阴性对照组(图13)，说明过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1能够抑制肺癌细胞的克隆形成能力。

(12)Lnc-GAN1和NEAT1对肺癌细胞的迁移能力的影响

稳定过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1的肺癌细胞株A549、H460的transwell实验显示，过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1的肺癌细胞株的迁移能力较阴性对照组显著下降(图14)，说明过表达Lnc-GAN1和敲降NEAT1影响肺癌细胞的迁移能力。

(13)过表达Lnc-GAN1能够抑制肺癌细胞的裸鼠的成瘤能力

细胞的体外实验证实了过表达Lnc-GAN1具有抑制肺癌细胞生长的作用，接下来我们将Lnc-GAN1的过表达稳定株细胞A549、H460皮下注射到裸鼠腋下，观察Lnc-GAN1对体内的成瘤能力的影响。在接种后连续观察了24天，发现过表达Lnc-GAN1组的裸鼠所长肿瘤的大小和重量都明显低于阴性对照组裸鼠的肿瘤(图15)。实验结果表明Lnc-GAN1在体内实验中也能抑制肿瘤的形成能力。

(14)全基因组表达谱芯片检测筛查Lnc-GAN1相关信号通路

为了探索Lnc-GAN1参与了哪些信号通路来抑制肺癌的进展，我们采用了Agilent的全基因组表达谱芯片双色标记检测了上调Lnc-GAN1的A549及其转染空载对照细胞株两组细胞基因表达谱的变化，经生物信息学分析找出了Lnc-GAN1基因可能调控的信号通路。结合芯片得到的信号通路与Lnc-GAN1基因功能的实验结果(Lnc-GAN1基因可以抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成、阻滞细胞周期)，我们推测Lnc-GAN1可能参与调控了P53信号通路进而调控肺癌细胞的生长、分裂及克隆形成。我们挑选芯片中得到的差异表达的11个基因进行了qRT-PCR的验证以验证芯片数据的可靠性(图16)。

(15)Western Blot检测Lnc-GAN1对MDM2-P53-P21-CDK2/CDK6信号通路蛋白表达的影响

综合表达谱芯片实验及细胞功能实验结果，我们推测Lnc-GAN1可能参与调控了MDM2-P53-P21-CDK2/CDK6信号通路从而调控肺癌细胞周期。为了验证这个推测，我们用qPCR检测了Lnc-GAN1稳定上调细胞株A549、H460及其相应的空载对照细胞株中P53、P21mRNA水平表达情况(图17)，并用Western Blot检测MDM2-P53-P21-CDK2/CDK6信号通路蛋白的变化(图18)。结果发现在Lnc-GAN1上调细胞株中细胞周期关键分子p21、p53mRNA水平和蛋白水平表达均上调，CDK2和CDK6表达下调，而MDM2表达并无变化(图17，图18)。因此，我们推测参与调控MDM2-P53-P21-CDK2/CDK6信号通路可能是Lnc-GAN1阻滞细胞周期的进程的作用机制之一。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 王辉云

<120> 4-LncRNA分子标签在肺癌预后评估中的应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgccttct tgtgcgtttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttgtaccct cccagcgttt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacagtgttg gcaagaacgg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgcccagc actcttcttt g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcctgctcc actactcctg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggaacacag ctttccctac 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttggccca aaagttttcc t 21

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcaagcat aacagcaca 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gacgagatta gatgggctct tctggatttg ttcctcattt gtcacaggtg tcttgt 56

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<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agttttgttg cggggggtgg gatattgatc atttgaacat atgccagttg tttctcctgc 60

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctggaattg ttttccatac aaccctgacc cattagtaca tttgggtttc taa 53

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatacattat ttgtagcaaa gccaagccta aattttctct gaagcaaatc ctaaccctcc 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cttaaggctc ccaaggctcc gtttcttatg tggaagaaga atagcaggag aatctcttga 60

acccaggagg cggaggttgc ggtgagccga gatggtgccg ttgcactcca gccgggcaac 120

aagggctaaa ctccatctca aaagaaaaga aagaaaggga agtagaagta ggatttaaca 180

aaggaccgag aagtcggctg aatagccagg ttcagacagt gttggcaaga acggatcttt 240

ggcaagatca cttaaggtga gctactctag cagcatcctg tttgacattt gtatccataa 300

cttgaataaa aatatagaag gcaaagaaga gtgctgggca agatgtgttg ggtgttagat 360

ctgcaatact cttcatagtg taatggctaa atgtaaagtc ttacgtctcg gttcaagaaa 420

gcacgttgct atatgaaatt tcagaaaaaa gttttgttgc ggggggtggg atattgatca 480

tttgaacata tgccagttgt ttctcctgcc ctaggggagg ttggcacggc aaccttccca 540

ctccgtaggt gggtagcctt gctgatgggg cacgtcgtca ccaagggacc tgattgttgt 600

catggttttg tcttgtcctc ctccctggtg aaagtctact gcagttttat tctcagctct 660

ggaaggagag ggaacgagcc tctgcctgtg tgtcctgacc cctcttgcct tgtttttgat 720

ctgctcaggc cgggtgcagt ggctcacgcc tgta 754

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<212> DNA

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tccaccacgc ctcccacctg ccccactgct tcttctcctc tcccttagga actctagctt 60

cacctcgctt cgtaatggac cccaattgct cctgctccac tactcctgca aatgcagaga 120

gtgcaaatgc acctcctgca agacgagctg ctgctcctgc tgccccgtgg gctgtgccaa 180

gtgtgcccag ggatgtgttt gcaaagggac actgacaagt gcagctgctg ctcctgatgt 240

agggaaagct gtgttcccag aagtagaaag tgtacaaacc tggaattgtt ttccatacaa 300

ccctgaccca ttagtacatt tgggtttcta aaaataaaat atgttaatga taataaaagt 360

tgactttatt ct 372

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcgattttt gaagctagtg gtcttctagt atacagtaag gtcaacttat tttgaaacac 60

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Claims

1.定量检测LncRNA的试剂在制备检测或辅助检测肺癌产品、或者评估或辅助评估肺癌预后产品中的应用；所述LncRNA选自NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245、BC041921R这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245、BC041921R这4种长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合的引物或探针。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

4.一种用于检测或辅助检测、或者评估或辅助评估肺癌预后的产品，其特征在于，该产品中含有定量检测LncRNA的试剂，所述LncRNA为NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245、BC041921R这4个长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括检测试剂盒、多聚酶链反应试剂、芯片检测试剂或测序试剂。

6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述定量检测LncRNA的试剂为能够定量检测NEAT1、Lnc-GAN1、ASLNC11245、BC041921R这4个长链非编码RNA中的任何一个或者二个以上的组合的引物或探针。

7.Lnc-GAN1、促进Lnc-GAN1表达的物质和/或抑制NEAT1表达的物质在制备治疗或辅助治疗肺癌药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，促进Lnc-GAN1表达的物质包括Lnc-GAN1的过表达载体。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抑制NEAT1表达的物质选自沉默NEAT1表达的siRNA、沉默NEAT1表达的shRNA、沉默NEAT1表达的反义寡核苷酸链中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。