CN107779508A - lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途 - Google Patents

lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。本发明利用胶质瘤公开数据库筛选与EGFR module和PDGFR module型胶质瘤相关的lncRNA，并通过对胶质瘤病人肿瘤组织的检测，发现在肿瘤组织中能够检测到lncRNA‑NEAT1，并且EGFR module肿瘤组织中的lncRNA‑NEAT1含量明显高于PDGFR module，说明该标志物可用于区分EGFR module型胶质瘤以及PDGFR module型胶质瘤。此外本发明还提供了一种胶质瘤的诊断试剂盒，并建立了一种诊断胶质瘤的方法，该方法通过PCR方法进行，相较于传统方法，具有成本低、时间段、灵敏度高等优点，能够满足大规模的实验以及临床应用的需要。

Description

lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试 剂中的用途
技术领域
本发明涉及一种检测胶质瘤的分子病理诊断标志物，特别涉及lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途，还涉及一种胶质瘤诊断试剂盒，本发明属于医药技术领域。
背景技术
肿瘤的分类为肿瘤的临床治疗以及科研提供了重要的方向，目前医学界普遍采用的胶质瘤分类诊断准则(2007年世界卫生组织标准)在很大程度上基于形态学指标。该分型系统不但未能揭示肿瘤发生发展的生物学本质，且主观性强，不一致性高达40％。
分子病理学是利用分子和遗传学方法对肿瘤进行诊断和分类，设计和验证对治疗反应和病情发展的预测性生物标记物，不同的基因构成造成的对肿瘤的个人易感性，还有环境因素和生活方式对肿瘤发生的影响，受主观影响较小，客观性强。科研人员通过对胶质瘤发生发展的核心信号通路的共表达基因谱将胶质瘤分成了EGFR module型和PDGFRmodule型，他们之间具有显著不同的遗传学背景和预后。而目前尚缺乏胶质瘤组织中的分子标志物来详尽的阐述其在胶质瘤分子病理学诊断的作用。
因此，寻找和发现新的胶质瘤中新的分子标志分子弥补EGFR在分子病理学诊断的不足以提高胶质瘤的诊断水平，是胶质瘤防治研究的重要内容。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的胶质瘤分子病理诊断标志物；
本发明的目的之二是建立一种胶质瘤诊断试剂盒及其诊断方法，以克服传统的检测胶质瘤相关的lncRNA的原位杂交技术具有价格昂贵，实验周期较长以及灵敏度较差的缺点以满足大规模的实验以及临床应用的需要。
为了达到上述目的，本发明所采用了以下技术手段：
本发明发明人利用胶质瘤公开数据库筛选与EGFR module和PDGFR module型胶质瘤相关的lncRNA并在临床样本中进行了进一步验证，结果发现lncRNA-NEAT1在EGFRmodule型胶质瘤组织中高表达。
在上述研究的基础上，本发明提出了lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。
其中，优选的，所述的试剂用于区分EGFR module型胶质瘤以及PDGFR module型胶质瘤。
进一步的，本发明还提出了一种胶质瘤诊断试剂盒，所述的试剂盒含有用于扩增lncRNA-NEAT1的引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，优选的，所述的试剂盒还包括反转录PCR反应液、SYBR Premix Ex TaqTM荧光染料PCR反应液、MgCl2、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶以及无RNA酶水。
使用本发明所述的试剂盒用于EGFR module型胶质瘤诊断时，按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本的总RNA
(2)反转录
对步骤(1)提取得到的总RNA进行反转录得到cDNA模板；
(3)荧光定量PCR检测
以步骤(2)得到的cDNA为模板，使用所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：
荧光定量PCR条件为：95℃30s；95℃5s，60℃15s，共进行44个循环，72℃30s，4℃保存；
(4)结果判定
截断值＝1.52。
其中，优选的，所述样本为胶质瘤新鲜病理组织。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种新的胶质瘤分子病理诊断标志物，该标志物可用于区分EGFRmodule型胶质瘤以及PDGFR module型胶质瘤，从而为胶质瘤的治疗提供依据和方向。
2、本发明提供了一种胶质瘤的诊断试剂盒，并建立了一种诊断胶质瘤的方法，该方法通过PCR方法进行，相较于传统方法，具有成本低、时间段、灵敏度高等优点，能够满足大规模的实验以及临床应用的需要。
附图说明
图1为6个lncRNA在胶质瘤组织中的表达检测；
图2为利用原位杂交检测NEAT1在PDGFR module与EGFR module病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达水平；
图3为在CGGA，GSE16011，Rembrandt和TCGA数据库中NEAT1在EGFR module中的受试者工作特征曲线(ROC)；
图4为6对引物检测lncRNA-NEAT1在胶质瘤组织中的表达量；
图5为胶质瘤PDGFR module与胶质瘤EGFR module病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达检测；
图6为NEAT1在EGFR module中的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1lncRNA-NEAT1的筛选、鉴定
本发明发明人利用胶质瘤4大数据库CGGA，Rembrandt，TCGA和GSE16011累计1500例病例中对常见的202个lncRNA进行了筛选发现了6个lncRNA在胶质瘤EGFR module型中高表达，并在上述4大胶质瘤权威公开数据库中对这6个lncRNA在U87-MG细胞系中进行PCR验证，结果发现lncRNA-NEAT1在U87-MG细胞系细胞中表达最高(见图1)。
利用原位杂交检测PDGFR module与EGFR module病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达水平，结果如图2所示。
接着在上述4大权威公开数据库中进行了NEAT1在EGFR module中的受试者工作特征曲线(ROC)的评价，结果如图3所示。
这些结果表明，lncRNA-NEAT1在EGFR module型胶质瘤细胞中高表达，因此提示lncRNA-NEAT1可作为分子病理诊断标志物用于EGFR module型胶质瘤的检测。
实施例2lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在EGFR module型胶质瘤检测中的应用
1、瘤组织样本的采集、处理及提取其中的RNA
(1)胶质瘤组织样本收集：收集胶质瘤患者病理组织。
(2)胶质瘤组织样本处理：用PBS冲洗，液氮保存。
(3)提取胶质瘤组织中的RNA：每个组织样品均取100mg，研磨成粉末，按照从Sigma公司购买的Trizol提取RNA。
(4)反转录成cDNA：每个样品取相同量RNA，用随机引物进行反转录。按照5×M-MLVRT Buffer 5μl、MgCl2 2μl、M-MLV Reverse transcriptase1μl、rRNasin0.5μl(Promega公司)、dNTPs 1μl、随机引物1μl、提取的RNA 2ul、DEPC水(补充H2O使总体积达到20μl)进行反转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过RNA酶灭活处理。
2、引物设计与筛选
(1)引物设计：
利用NCBI查得lncRNA-NEAT1的全长序列(NR_028272.1)，针对lncRNA-NEAT1的序列利用Primer blast网站设计Real-time PCR的6对引物，由北京天一辉远公司负责引物合成。
(2)引物筛选：
采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和美国Bio-Rad公司的Bio-Rad实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：
PCR条件：
按照上述Real-time PCR条件，利用2例前期制备的胶质瘤组织样本反转录产物对6对lncRNA-NEAT1引物进行检测。每个样本均做3个复孔，取其平均值分析。结果6对引物均能检测出信号，且溶解曲线为单峰，其中第5对引物扩增的片段的表达量明显高于其它引物(见图4)，将PCR产物送公司测序，测序结果经比对确实为lncRNA-NEAT1。因此，本发明经过筛选提供了最优化的1对用于胶质瘤组织lncRNA-NEAT1的Real-time PCR引物，序列如下：
上游引物为：GACCTCTCACCTACCCACCT(SEQ ID NO.1)；
下游引物为：CTTGTACCCTCCCAGCGTTT(SEQ ID NO.1)；
3、EGFR module和PDGFR module型胶质瘤中lncRNA-NEAT1的差异表达检测。
按照上述Real-time PCR条件，用筛选出的引物对20例EGFR module型胶质瘤组织和20例PDGFR module型胶质瘤组织的lncRNA-NEAT1表达水平进行检测，结果发现与20例PDGFR module型胶质瘤组织相比，20例EGFR module型胶质瘤组织中的lncRNA-NEAT1含量明显升高，见图5。图6为lncRNA-NEAT1在EGFR module型胶质瘤临床样本中的ROC曲线，其约登指数为(灵敏度与特异度之和减去1)0.70，其所对应的值即为截断值，其截断值为1.52，提示当胶质瘤中NEAT1的相对表达水平≥1.52时，其预测EGFR module的敏感度和特异度达到最大值，分别为85％和85％。这一结果提示：lncRNA-NEAT1可作为EGFR module型胶质瘤的分子病理诊断标志物，使用lncRNA-NEAT1可成为EGFR在分子病理标诊断方面必要和有益的补充。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途
<130> KLPI170927
<160> 2
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
gacctctcac ctacccacct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
cttgtaccct cccagcgttt 20

Claims (6)

1.lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂用于区分EGFR module型胶质瘤以及PDGFR module型胶质瘤。
3.一种胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有用于扩增lncRNA-NEAT1的引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反转录PCR反应液、SYBR Premix ExTaqTM荧光染料PCR反应液、MgCl2、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶以及无RNA酶水。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，用于EGFR module型胶质瘤诊断时，按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本的总RNA
(2)反转录
对步骤(1)提取得到的总RNA进行反转录得到cDNA模板；
(3)荧光定量PCR检测
以步骤(2)得到的cDNA为模板，使用所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：
荧光定量PCR条件为：95℃30s；95℃5s，60℃15s，共进行44个循环，72℃30s，4℃保存；
(4)结果判定
截断值＝1.52。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的样本为胶质瘤新鲜病理组织。
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