CN104975082A - 一组用于评估肺癌预后的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于评估肺癌预后的基因,包括SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示核苷酸序列的基因。此外,本发明还公开了上述基因组的应用,包括在制备用于肺癌预后的基因芯片中的应用,以及在制备用于肺癌预后的试剂盒中的应用。本发明有助于提高结肺癌患者术后的生存率。在肺癌患者接受根治性手术后,即可通过对上述基因芯片的检测和联合分析,快速评估该患者术后复发转移或死亡的风险级别,从而能够对风险级别高的患者及早地进行辅助治疗,帮助延长患者的生存时间。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌的预后领域,主要是评估患者肺癌术后复发转移或死亡的风险级别。更具体而言,涉及一组用于评估肺癌预后的基因及其应用。
背景技术
肺癌在我国乃至全球范围内是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率居恶性肿瘤的第一位(Jemal A,et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin.2010;60(5):277-300.)。肺癌包括小细胞肺癌、腺癌、鳞癌等多种病理类型,其中腺癌是最为常见的肺癌类型,其特点为容易出现术后远处转移,恶性程度高、预后差。尽管多年来从分子水平认识肺癌的发生发展为肺癌的治疗和预防创造了条件,各种新的诊治方法和药物层出不穷,但是肺癌的治疗效果并没有取得同步提高,其总的五年生存率仅在10%左右。在目前的临床实际工作中,大部分临床医师对肺癌治疗是基于临床分期、患者的功能状态、病理分型、药物不良反应的评价等临床因素来制定肺癌个体化治疗,是基于循证医学基础上的规范化治疗。组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。肺癌的组织病理学分型和临床分期是目前肺癌的临床预后指标。然而即使同为非小细胞肺癌,甚至TNM分期相同的肺腺癌(TNM分期系统是目前国际上最为通用的肿瘤分期系统。首先由法国人Pierre Denoix于1943年至1952年间提出,后来美国癌症联合委员会(AJCC,American Joint Committee on Cancer)和国际抗癌联盟(UICC,Union for International Cancer Control)逐步开始建立国际性的分期标准,并于1968年正式出版了第1版《恶性肿瘤INM分类法》手册。目前已经成为临床医生和医学科学工作者对于恶性肿瘤进行分期的标准方法),采用同样的治疗方案却会产生截然不同的治疗效果。事实上,由于肺癌是一类分子水平上高度异质性的疾病,组织学形态相同的肿瘤,其分子遗传学改变不尽一致,从而导致了肺癌治疗反应和预后的差别,因此对其进行分子分型是肺癌个体化治疗的必然要求。目前大多数的分子分型是基于新鲜组织的全基因表达谱,而新鲜组织在临床上的获取及保存还存在着一定的问题,相比之下石蜡组织更易于获取及保存,因此石蜡组织的基因表达谱分析更适合今后的临床应用。NanoString nCounter system数字式单分子基因表达谱分析系统在分析石蜡样本表达谱分析领域非常有优势。该平台是直接对基因表达进行多重计数的全新数字式技术,利用分子条形码和单分子成像来检测及统计每一个反应体系中特定转录本的 数量,表现出极高的灵敏度、精确度和重复性。分子分型对于预测肿瘤进展或复发转移风险,预测肿瘤预后,指导肿瘤治疗方式具有重要的临床意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组用于肺癌预后的基因及其应用,能够评估患者肺癌术后复发转移或死亡的风险级别,有助于提高结肺癌患者术后的生存率。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
在本发明的一方面,提供一组用于评估肺癌预后的基因,包括SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示核苷酸序列的基因。
在本发明的另一方面,提供一组用于评估肺癌预后的基因在制备用于肺癌预后的基因芯片中的应用,所述基因芯片包括固相载体和探针,所述探针与待测SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示基因序列和/或其互补序列进行杂交。
所述探针包括下列三组核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列;
(2)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列中每条序列的互补链;
(3)与SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。
优选的,所述探针包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
在本发明的另一方面,提供一组用于评估肺癌预后的基因在制备用于肺癌预后的试剂盒中的应用,所述试剂盒包含:与SEQ ID No.5~SEQ ID No.8中至少一个基因序列进行杂交的探针。
所述探针包括下列三组核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列;
(2)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列中每条序列的互补链;
(3)与SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。
优选的,所述探针包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
在本发明的另一方面,提供一组用于肺癌预后的探针,所述探针是SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
本发明通过多基因计算模型预测肺癌患者术后复发转移危险度和生存期的检测方法,主要包括以下步骤:
(1)收集肺癌患者的手术切除癌组织石蜡标本;
(2)提取石蜡组织的RNA;
(3)RNA质量控制:用Alignent2100生物分析仪检测抽提的总RNA的质量;
(4)通过定制的NanoString nCounter system40基因的表达谱芯片检测,发现4个探针在非复发转移组和复发转移组样本中存在差异表达(所述探针为SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列);
(5)计算上述4个探针的基因表达权重,对患者术后预后进行评价;预测预后危险度计算公式如下:C为权重值的常数,C=-4.26;B为每个基因的权重系数;X为每个基因在四分类方法中的赋值;y=C+(B1*X1…B4*X4),P=EXP(y)/((1+EXP(y))。根据计算的P值来预测肺癌病人的预后:P<0.26非复发转移,生存期长,患者属于低风险人群;P>0.26复发转移,生存期短,患者属于高风险人群。所述探针的表达计算所得概率越大,该患者术后的预后越差。
为解决上述技术问题,本发明人等针对全基因组表达谱筛选出的肺癌预后相关基因反复进行研究,通过定制的Nanostring 40基因芯片(见表1)检测得到的4个基因模型,用于评估肺癌患者的术后预后情况。模型的建立包括以下步骤:采集肺癌患者的手术切除石蜡标本;抽提石蜡组织RNA;检测223例肺癌石蜡组织的Nanostring 40基因芯片,通过统计分析得出在死亡组和生存组样本中存在差异表达的该4个特异性探针,以用于预测术后复发转移或死亡风险;通过计算公式得出每个探针的表达权重,进而评估该患者的预后。本发明还公开了由上述探针组成的探针组,以及包含该探针组的计算过程及公式。本发明通过对肿瘤石蜡组织的Nanostring 40基因芯片的检测,通过对4个差异探针的联合分析,来快速评估患者肺癌术后复发转移或死亡的风险级别,从而可以在术后及早筛查出复发转移或死亡风险较高的肺癌患者,并对其进行积极的辅助治疗,以提高结肺癌患者术后的生存率,延长患者的生存时间。
附图说明
图1是本发明实施例中训练组无病生存和总生存曲线图;其中,图1(A)为训练组无病生存曲线图;图1(B)为训练组总生存曲线图;
图2是本发明实施例中验证组无病生存和总生存曲线图;其中,图2(A)为验证组无病生存曲线图;图2(B)为验证组总生存曲线图;
图3是本发明实施例中训练组早期(I期)病人无病生存和总生存曲线图;其中,图3(A)为训练组早期(I期)病人无病生存曲线图;图3(B)为训练组早期(I期)病人总生存曲线图;
图4是本发明实施例中训练组晚期(II-III期)病人无病生存和总生存曲线图;其中,图4(A)为训练组晚期(II-III期)病人无病生存曲线图;图4(B)为训练组晚期(II-III期)病人总生存曲线图;
图5是本发明实施例中验证组早期(I期)病人无病生存和总生存曲线图;其中,图5(A)为验证组早期(I期)病人无病生存曲线图;图5(B)为验证组早期(I期)病人总生存曲线图;
图6是本发明实施例中验证组晚期(II-III期)病人无病生存和总生存曲线图;其中,图6(A)为验证组晚期(II-III期)病人无病生存曲线图;图6(B)为验证组晚期(II-III期)病人总生存曲线图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件。
1、实验对象
本实施例的研究对象选择2007年1月—2011年4月间复旦大学附属肿瘤医院病理科肺癌术后石蜡组织223例。纳入及排除标准:
(1)新发肺癌患者(需以手术标本的病理诊断为标准);
(2)年龄18-65岁之间,病理诊断为腺癌;
(3)临床分期:I-III期;
(4)患者手术前未接受放射性治疗、化学药物治疗及分子靶向药物治疗,术后采用相同或相近的放化疗方案治疗。
(5)无其他器官肿瘤病史;无肺癌家族史。
2、实验方法
采集上述223例患者的手术切除癌组织标本,用Ambion公司的RecoverAllTM FFPE组织总核酸分离试剂盒,按照试剂盒的说明,抽提RNA样本。抽提后的RNA样本保存在-70℃的深低温冰箱中。
用Aligent2100生物分析仪,检测抽提的总RNA的质量及片段化程度。
用美国Nanostring公司定制的40基因的寡核苷酸芯片。按照Nanostring ncounter system基因表达谱芯片操作说明规定的标准操作步骤,对223例石蜡组织的RNA样本进行40基因组表达谱的检测。采用分子条形码技术扫描芯片,用nSolver分析软件读取数据,FOV百分比>75%,探针结合率介于0.05和2.25之间,阳性对照线性值>0.95的数据为质检合格的数据,采用nSolver分析软件自带标化功能进行标准化处理分析,得出每一个基因在每一个样本中的表达值。
3、结果分析
结合223例患者的临床随访结果,随机分成训练组和验证组,训练组111例,验证组112例。为了去除极值的影响,我们将所有探针的表达值进行四分法分类分别赋值为1、2、3、4;进一步进行二分类Logistic回归分析(我们分析时不将1、2、3、4看作亚变量分析,仍看作连续变量)后我们在训练组筛选得到4个探针模型。探针名称、对应基因及权重系数见表2。根据每个基因表达量进行权重后,得出预测生存情况的计算公式。具体预测计算公式如下:C为权重值的常数,C=-4.26;B为每个基因的权重系数;X为每个基因在四分类方法中的赋值;y=C+(B1*X1…B4*X4),P=EXP(y)/((1+EXP(y))。根据计算的P值来预测肺癌病人的预后:P<0.26非复发转移,生存期长,属于低风险人群;P>0.26复发转移,生存期短,属于高风险人群。Kaplan-Meier生存分析表明该模型在训练组中针对无病生存期或者总生存期能够准确的区分低风险人群和高风险人群,P值均小于0.0001,如图1。在验证组中针对无病生存期或者总生存期亦能准确的区分低风险人群和高风险人群,P值均有意义,如图2。将训练组或验证组样本按照临床分期分为早期(I)和晚期(II-III)时,分层分析显示该样本能够在临 床分期相同的样本中准确的区分低风险人群和高风险人群,P值均有意义,如图3,图4,图5,图6。
表1 nanostring40基因芯片名称
序号 | NM号 | 基因名 |
1 | NM_001101.2 | ACTB |
2 | NM_000291.2 | PGK1 |
3 | NM_003194.3 | TBP |
4 | NM_000849.4 | GSTM3 |
5 | NM_001753 | CAV1 |
6 | NM_006829 | C10orf116 |
7 | NM_021127 | PMAIP1 |
8 | NM_001993 | F3 |
9 | NM_006186 | NR4A2 |
10 | NM_002639 | SERPINB5 |
11 | NM_024501 | HOXD1 |
12 | NM_003843 | SCEL |
13 | NM_001202858 | ECM1 |
14 | NM_000663 | ABAT |
15 | NM_001114978 | TP63 |
16 | NM_014331 | SLC7A11 |
17 | NM_024490 | ATP10A |
18 | NM_001142270 | DHRS9 |
19 | NM_001242463 | FBXO32 |
20 | NM_005929,NM_033316 | MFI2 |
21 | NM_032899,NM_207006 | FAM83A |
22 | NM_001873 | CPE |
23 | NM_006169 | NNMT |
24 | NM_014905 | GLS |
25 | NM_004755.2 | RPS6KA5 |
26 | NM_001001549 | GRB10 |
27 | NM_002089 | CXCL2 |
28 | NM_001056 | SULT1C2 |
29 | NM_001025366 | VEGFA |
30 | NM_001079528 | ABCC6 |
31 | NM_001276310 | STMN3 |
32 | NM_178818 | CMTM4 |
33 | NM_003948 | CDKL2 |
34 | NM_175900 | C16orf54 |
35 | NM_000584 | IL8 |
36 | NM_001116 | ADCY9 |
37 | NM_138420 | AHNAK2 |
38 | NM_138426 | GLCCI1 |
39 | NM_004438 | EPHA4 |
40 | NM_005978 | S100A2 |
[0048] 表2本发明中的4个探针及基因名称
4、在预后判断中的应用
采集待检结肺癌患者的手术切除癌组织石蜡标本,按照前述方法,抽提石蜡组织RNA样本,并利用定制的Nanostring基因表达谱检测上述4个特异性探针在该患者肿瘤组织RNA样本中的表达,然后,计算每个探针表达量,再根据预测模型公式,评估患者肺癌术后复发转移或死亡的风险级别。
Claims (8)
1.一组用于评估肺癌预后的基因,其特征在于,包括SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示核苷酸序列的基因。
2.如权利要求1所述的一组用于评估肺癌预后的基因在制备用于肺癌预后的基因芯片中的应用,所述基因芯片包括固相载体和探针,其特征在于,所述探针与待测SEQ ID No.5~SEQ ID No.8所示基因序列和/或其互补序列进行杂交。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述探针包括下列三组核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列;
(2)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列中每条序列的互补链;
(3)与SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述探针包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
5.如权利要求1所述的一组用于评估肺癌预后的基因在制备用于肺癌预后的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂盒包含:与SEQ ID No.5~SEQ ID No.8中至少一个基因序列进行杂交的探针。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述探针包括下列三组核苷酸序列之一:
(1)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列;
(2)SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列中每条序列的互补链;
(3)与SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述探针包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
8.一组用于肺癌预后的探针,其特征在于,所述探针是SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示序列。
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CN104975082B (zh) | 2018-11-02 |
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