CN105624271A - 一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于核酸诊断治疗领域，具体涉及一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用。本发明所述的与结直肠癌相关的miRNA是miR-1290。本发明提供了miR-1290用于制备在受试者的血液样本中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒的用途。本发明首次确定了miR-1290是与结直肠癌相关的miRNA诊断标记物，建立了新型的结直肠癌肿瘤进展检测指标。在此基础上，本发明提供了miR-1290在结直肠癌初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。

Description

一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用

技术领域

本发明属于核酸诊断治疗领域，具体涉及一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用。

背景技术

结直肠癌是严重危害人民健康的最常见恶性肿瘤之一，在发达国家高居癌症发病率第1位、死亡率第2位，高居我国癌症死亡率第4位，且发病率逐年上升。在广州，结直肠癌的粗发病率和死亡率分别为9.6/10万和5.0/10万，并以接近5％的增幅增加。患者的生存和预后取决于肿瘤的检出时间，早期发现、早期治疗是提高结直肠癌远期生存率的唯一途径，如按Dukes分期，5年生存率，A期可达90±％，B期降为75±％，C期低于50％，D期不及10％。B、C、D三期病例占96.17％，表明结直肠癌患者就诊时多为中晚期，可见早期诊治的重要性。因此对于结直肠癌的防治，迫切需要灵敏度高的对结直肠癌早期进行诊断的方法。

microRNA(简称miRNA)是一类长约22nt的单链内源性高保守、非编码核苷酸，其在转录后水平调控基因的表达，几乎参与到机体所有的生理进程，如增殖、分化、凋亡等重要的细胞活动的调控，并与肿瘤关系密切，参与到调控肿瘤(包括结直肠癌)的发生、发展、侵袭、转移。这显示了miRNA作为一类新的诊断标记和治疗靶点的巨大潜力。

目前对结肠癌的诊断和分期依赖于组织学检验和放射成像。前者取决于组织病理学家的判断，该方法初步诊断不仅耗时，而且对淋巴结组织学检查很容易错过微小转移，导致切除的肿瘤不能准确分期；后者的安全性和检查成本亦值得考虑。

研究表明，在血清中提取并测量稳定的游离miRNA，可以作为潜在的生物标志物的来源。基于血液miRNA的诊断技术，从另一方面提供了更快速的活检初步诊断和更精确的分期，亦不会对患者造成创伤，能加快对结肠癌的检测，对常规组织学检验提供有益的参考。

由于高灵敏度结直肠癌早期进行诊断的方法和试剂对结直肠癌的防治至关重要，因此存在极大的需求来寻找与结直肠癌相关的miRNA分子标志物，以用于结直肠癌的早期诊断和治疗。

发明内容

本发明的目的在于为提供一种与结直肠癌相关的miRNA以及基于该miRNA的用途。

本发明所述的与结直肠癌相关的miRNA是miR-1290。

miR-1290在人胚胎肝细胞中首次被发现，首次报道该序列的文献是MorinRD,O’ConnorMD,GriffithM,etal.ApplicationofmassivelyparallelsequencingtomicroRNAprofilinganddiscoveryinhumanembryonicstemcells[J].Genomeresearch,2008,18(4):610-621。miR-1290可通过调控细胞增殖周期进而参与肿瘤的演进过程，随后研究发现miR-1290表达量在胰腺癌、乳腺癌中均有不同程度的变化，同时Wu等发现上调miR-1290能损害胞质分裂，影响结直肠癌细胞的重编程，但其在结直肠癌中的具体表达状况尚未见研究报道。

本发明通过检测对比结直肠癌患者及健康体检者血浆中miR-1290的表达水平，分析其与结直肠癌患者临床特征的关系，探讨了miR-1290在结直肠癌发生发展中的作用。发明人发现，miR-1290在结直肠癌患者血浆中表达上调，其高表达与结直肠癌的分期相关，有望成为结直肠癌诊断及治疗的指标之一。

本发明所述的miRNA的用途是：miR-1290用于制备在受试者的血液样本中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒的用途。

本发明还提供了一种用于在受试者的血液样品中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒。

本发明所述的用于在受试者的血液样品中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒，包括：(a)适合于检测miRNA的检测试剂；以及(b)适合于测定由所述检测试剂检测的miRNA的量的装置；其中，所述的miRNA是miR-1290。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述(b)装置是点样有寡核苷酸探针的试纸条。

优选地，所述寡核苷酸探针的序列是miR-1290的互补序列。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述(b)装置是miRNA芯片。

优选地，所述miRNA芯片包括：固相载体；以及固定在所述固相载体上的互补于miR-1290的寡核苷酸探针。

本发明还提供了一种miRNA用于制备结直肠癌早期诊断的试剂的用途，所述miRNA是miR-1290。

本发明的优势在于：

(1)本发明首次确定了miR-1290是与结直肠癌相关的miRNA诊断标记物，建立了新型的结直肠癌肿瘤进展检测指标。

(2)本发明提供了miR-1290在结直肠癌初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒，基于miRNA的血液检测的操作，对血液样本快速、低成本、高灵敏地获得检测结果，以用于进一步的医疗诊断分析。本发明所述的用途和试剂盒不会对患者造成创伤，而能更快速的活检初步诊断和更精确的分期，加快对结肠癌的诊断和治疗。

本发明利用检测血液中相关miRNA的表达差异，结合相关miRNA在结直肠癌中的表达现象，在临床上采用血液检测，提供对于结直肠癌的早期的安全快速检测方法。根据本发明，可以对结直肠癌做到早发现、早治疗，提高结直肠癌的治愈力，减少患者死亡率。本发明也解决了目前对结肠癌的诊断和分期依赖于组织学检验和放射成像，存在的对患者组织采样存在的转移的风险和或者安全性的问题。

本发明建立了标准化和规范化的广州地区结肠癌组织与体液标本库以及病例资料库，系统地分析了结直肠癌肿瘤和正常组织样本之间、不同部位的结直肠癌、处于不同时期结直肠癌、以及结直肠癌肿瘤与其他常见肿瘤的之间的miRNA表达差异，以及对重要miRNA靶标的确证，获得结直肠癌的miRNA表达特征图谱，开发基于血液miRNA的普遍适用的、简单、低成本、高灵敏的结直肠癌早期诊断方法和建立新型的结直肠癌肿瘤进展检测指标，用于不会对患者造成创伤的更快速的活检初步诊断和更精确的分期，加快对结肠癌的检测和治疗。同时为阐明结肠癌细胞分化的miRNA调控机制奠定基础，为结直肠癌的防治提供新的潜在治疗靶点。

具体实施方式

实施例1：与结直肠癌相关的miRNA的筛选方法

(1)建立标准化和规范化的广州地区结直肠癌组织与体液标本库以及病例资料库

广州医学大学第三附属医院(简称“广医三院”)为项目参与单位，标本库及数据库的建立由广医三院建立，规范收集了广州地区200余例结直肠癌患者肿瘤、瘤旁组织及血浆且于-80℃保存，并对收集的样本临床数据(如：样本的住院号、病理号、组织部位、肿瘤分期分级、手术方式、化疗方案、随访)及实验数据(如：提取miRNA的浓度、分光度、电泳图片、定量PCR实验结果)进行了统计、整理，建立可供分享的结直肠癌miRNA数据库。

发明人利用了该结直肠癌miRNA数据库进行了与结直肠癌相关的miRNA的筛选工作。

(2)通过miRNA表达谱的系统性的分析比较，对照病理检测数据和临床结果，获得不同部位和不同时期的结直肠癌的miRNA特异性表达谱：

A.系统地分析结直肠癌肿瘤和正常组织样本之间、不同部位的结肠癌、不同时期结肠癌、以及结肠癌肿瘤与其他肿瘤的之间的miRNA表达差异；

B.由于miRNA具有根据肿瘤特征重叠表达的特点，某些miRNA在多种肿瘤均有特异性的表达升高或沉默，为此还需与其他常见的肿瘤中miRNA特异表达谱进行比较，在去除多种肿瘤中重叠miRNA基础上，获得属于结直肠癌独有的miRNA表达特征谱。

(3)根据结直肠癌的miRNA表达特征谱，对miRNA的靶标进行筛选和确证，辅助判断miRNA表达差异在结直肠癌中意义。

(4)以血液中miRNA为生物标记物，开发结直肠癌早期诊断方法和建立肿瘤进展中的检测指标：

A.直肠癌特异性的血液miRNA与结直肠癌相关性的确证；

B.开发直肠癌特异性的血液miRNA定量PCR试剂；

(5)检测预测结直肠癌相关miRNAs，预测结直肠癌的步骤：

A.采取血液样本，分离上清，抽提上清液中RNA，保证RNA的质量；

B.运用人结肠直肠癌相关miRNA表达量定量检测阵列(广州复能基因有限公司，即本申请人)，筛查关键的miRNA的表达差异。分析检测至少一种相关miRNA表达情况。

C.结合生物信息学方法，结合已公布的结直肠癌特异性表达的miRNA，预测是否患有结直肠癌或者已患的处于的期。

实施例2：miR-1290在结直肠癌患者及健康体检者血浆中的表达差异

采用荧光定量PCR检测219例结直肠癌患者及年龄、性别相匹配的45例健康体检者血浆中miR-1290的表达情况，分析其与临床特点之间的关系，具体方法如下：

(1)血浆样本的收集：使用EDTA试管采集的每例待检者外周血2mL，静置后离心吸取上清，置于-80℃冰箱中保存备用。

(2)血浆总RNA的提取：用TRIzol法，抽提获得的RNA置于-80℃冰箱中保存备用。

(3)cDNA合成：以2μg总RNA为模板，按照BestarqPCRRTKit说明书配制逆转录反应体系，合成cDNA，收集后-20℃保存备用。

(4)荧光定量PCR检测miR-1290：特异性引物序列在miRBase中检索，miR-1290及U6序列，引物由公司合成，优化荧光定量PCR的条件。荧光定量PCR扩增的反应体系为20μL，采用AgilentStratagene荧光定量PCR仪Mx3000P进行荧光定量检测，反应结束由计算机自动计算各反应管内的Ct值。对于荧光定量PCR结果的统计，目的基因的表达量以2^-ΔCt表示，每个血浆标本miR-1290PCR平均扩增值△Ct＝Ct^{miR-1290-CtU6}。结直肠癌患者血浆中miR-1290表达量的平均2^-ΔCt值除以健康体检者血浆中miR-1290表达量的平均2^-ΔCt值，为结直肠癌患者血浆中miR-1290的表达倍数变化。

(5)统计学处理：采用SPSS统计软件，miRNA相对表达量呈偏态分布、方差不齐，以中位数和四分位数间距表示；两组间或多组间比较采Mann-WhitneyU检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果：在健康体检者与结直肠癌患者两组中，结直肠癌组血浆中miR-1290表达量增高，有统计学意义(P<0.05)；以年龄分组(≥60岁，<60岁)，高龄组人群中血浆miR-1290的表达水平较低龄组增高，有统计学意义(P<0.05)；以性别(男、女)分组，血浆miR-1290的表达水平变化无统计学意义(P>0.05)。

结论：miR-1290在结直肠癌患者血浆中表达上调，其高表达与CRC的分期相关，有望成为结直肠癌诊断及治疗的指标之一。

通过生物软件预测，miR-1290可能通过调节转录因子或抑癌基因等机制来发挥促癌miRNA的作用。

实施例3：基于miR-1290的结直肠癌实时荧光定量PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种用于在受试者的血液样品中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒，该试剂盒包括：适合于检测miR-1290的检测试剂；以及适合于测定由所述检测试剂检测的miR-1290的量的装置。

该试剂盒是结直肠癌实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括点样有寡核苷酸探针的试纸条，该寡核苷酸探针的序列是miR-1290的互补序列。

本试剂盒的其他试剂可参照已知的实时荧光定量PCR检测试剂盒来制备。

本试剂盒的检测步骤包括：(1)样品总RNA的抽提；(2)检测RNA质量；(3)反转录RNA；(4)实时荧光定量PCR检测，结果分析。

本试剂盒的检测原理与常规的实时荧光定量PCR检测试剂盒相同。

实施例4：基于miR-1290的基因芯片检测试剂盒

本实施例提供了一种用于在受试者的血液样品中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒，该试剂盒包括：适合于检测miR-1290的检测试剂；以及适合于测定由所述检测试剂检测的miR-1290的量的装置。

该试剂盒是结直肠癌基因芯片检测试剂盒，包括miRNA芯片，该miRNA芯片包括：固相载体；以及固定在所述固相载体上的互补于miR-1290的寡核苷酸探针。

本试剂盒的检测原理是：将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。

本试剂盒的检测步骤是：(1)miRNA探针制备；(2)样品RNA提取，RNA质量检测；(3)样品RNA处理固定，探针杂交；(4)杂交信号检测，结果分析。

Claims (7)

1.一种miRNA用于制备在受试者的血液样本中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒的用途，所述的miRNA是miR-1290。

2.一种用于在受试者的血液样品中区分结直肠癌样本和正常样本的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)适合于检测miRNA的检测试剂；以及

(b)适合于测定由所述检测试剂检测的miRNA的量的装置；

其中，所述的miRNA是miR-1290。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述(b)装置是点样有寡核苷酸探针的试纸条。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针的序列是miR-1290的互补序列。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述(b)装置是miRNA芯片。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA芯片包括：固相载体；以及固定在所述固相载体上的互补于miR-1290的寡核苷酸探针。

7.一种miRNA用于制备结直肠癌早期诊断的试剂的用途，所述miRNA是miR-1290。