CN107881239A - 血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用，属于生物技术和医学技术领域，其中，血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物为miR‑96、miR‑99b、miR‑155、let‑7a和let‑7b中的任意一种或几种。本发明筛选出的血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA对预测结直肠癌转移的特异性和灵敏度均显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA，大大提高了诊断的准确性。

Description

血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学技术领域。更具体地说，本发明涉及血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道癌症之一，并且是全世界癌症相关死亡的第三主要原因。结直肠癌肝转移的发生是一个多因素和多步骤的过程。约20-25％的CRC患者最初被诊断为肝转移，并且高达40-50％的患者在原发性肿瘤切除术后发生肝转移。大多数结直肠肝转移患者不适合根治性手术切除，五年存活率≤10％。

结直肠癌患者肝转移的发生除了与原癌基因及抑癌基因表达情况异常或丢失有关，也与“表观遗传学”，如乙酰化、甲基化和非编码RNA调控紧密相关。有研究证实，在结直肠癌的肝转移发生进展过程中，miRNA广泛参与其调控，有学者称这类miRNA为“metastamiR”。

微小RNA(miRNA)是类长度为18-25个核苷酸的内源非编码RNA，其通过与信使RNA的3'非翻译区(UTR)碱基结合，在转录后水平调节靶基因的表达，从而使翻译受到抑制或信使RNA裂解。高达20-30％的基因的表达由miRNA来调节。通过调节生理和病理过程，差异表达的miRNA在肿瘤的发生、进展、转移和复发中起着重要作用。2003年，Michael首次提出结直肠癌中存在差异表达的miRNA。随后，关于结直肠癌的miRNA的研究越来越多。某研究表明，存在miRNA在结直肠肿瘤发生和发展的不同阶段差异表达(高级别腺瘤-肿瘤早期-肿瘤晚期)。miR-543通过靶向HMGA2，KRAS和MTA1来抑制结直肠癌细胞系的增殖和转移，并且有望成为转移性结直肠癌的新型诊断和预后生物标志物。与健康受试者相比，CRC患者中较高水平的miR-211提示较差的预后。大量的研究表明，循环miRNA可作为潜在的诊断和预后标志物。近年，虽然miRNA已经得到大量的研究和验证，但是结直肠癌肝转移相关miRNA潜在的作用和功能很大程度上仍然未知，需要进一步发现和验证。

结直肠癌肝转移的病人，以手术为主，辅以放化疗、介入治疗及靶向治疗的综合治疗使患者生存时间得到了显著提高。但随着治疗策略的不断提升，新的问题也不断涌现。根治性手术治疗可将结直肠癌肝转移的5年生存率提高至50％，对于选择性高的结直肠癌肝转移患者，甚至可以达到60％；但对于可切除的结直肠癌肝转移病人，术后仍有将近50％的患者会出现肿瘤复发。

传统的筛检方法，如腹腔镜，细针抽吸细胞学和影像学方法，如增强计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)为侵入性的、并发症高或典型指征不足，因此难以成为结直肠癌肝转移患者早期筛选的有效方法。因此，迫切需要寻找早期诊断和预后评估的非侵入性精准的生物标志物，用于结直肠癌患者的诊断和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用，通过生物信息学方法挖掘与结直肠癌肝转移有关的miRNA标志物，进一步釆用结直肠癌患者的血浆标本进行验证，同时分析差异表达miRNA与结直肠癌诊断的关系。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。

优选的是，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b和let-7a中的任意一种或几种。

优选的是，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b和let-7a的组合。

所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

第一，血浆较易获得，且与传统的筛检方法相比，属于无创检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦。

第二，血浆中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确而详细的指导意义。

第三，所筛选出的与结直肠癌转移相关的miRNA或miRNA的组合对预测结直肠癌转移的特异性和灵敏度均显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA，大大提高了诊断的准确性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的技术方法和数据分析流程框图；

图2为本发明所述的肝癌组织及其癌旁正常肝组织差异性miRNA聚类分析表达谱图；

图3为本发明所述的血浆中总RNA凝胶电泳图；

图4为本发明所述的血浆中miRNAs实时荧光定量PCR的扩增和熔解曲线图；

图5为本发明所述的结直肠癌患者无远处转移和肝转移患者、健康人血浆miRNA的表达水平图；

图6为本发明所述的ROC曲线分析miRNA的肝转移鉴别效能；

图7为本发明所述的Kaplan–Meier法分析miR-96和miR-155与结直肠癌肝转移患者总体生存期的关系图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

第一部分：结直肠癌转移相关miRNA的生物信息学分析和筛选

材料与方法

1.技术方法和数据分析流程(见图1)

2.miRNA及基因表达数据的获取

本研究在GEO数据库中的检索关键词为“Colorectal cancer”，“Colon cancer”，“rectal cancer”，“Colonic carcinoma”，“Metastasis”，“Hepatic metastasis”，“livermetastasis”，“MicroRNAs”。并补充检索了Google Scholar和百度学术，在不同时间点检索两次，纳入芯片集在2010年之后，没有语言限制。纳入芯片集见表1-1。

表1-1结直肠癌转移相关的芯片集

其中，*：芯片集类型为安捷伦品牌的miRNA芯片。

3.肝癌组织及其癌旁正常肝组织miRNA芯片数据处理

本研究选取的miRNA芯片数据来自于本课题组前期研究(①Gao B,Ning S,Li J,et al.Integrated analysis of differentially expressed mRNAs and miRNAsbetween hepatocellular carcinoma and their matched adjacent normal livertissues.Oncol Rep.2015.34(1):325-33.

②高冰,宁淑芳,唐艳萍,刘海洲,利基林,张力图.人肝癌组织及癌旁正常肝组织的

mRNA差异表达谱.世界华人消化杂志.2014.(31):4734-4744.)中肝癌患者的2对肝癌组织及癌旁正常肝组织，组织均源自广西医科大学附属肿瘤医院标本库，所有患者对参与科学研究均知情同意，所有标本均为原发病灶的首次手术切除样本，均未接受过化疗，放疗等。切除的组织标本经液氮速冻后立即予以-80℃保存。

miRNA芯片实验数据提取及分析，芯片通过Agilent芯片扫描仪进行扫描，获得杂交图片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件分析杂交图片并获取数据，使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。

4.PUBMED文献检索

为了综合评价以上差异微小RNA(microRNA，miRNA)对结直肠癌转移/肝转移的诊断及预后价值。本研究对差异基因进行了全面的文献检索(包括Pub Med、The CochraneLibrary、ISI Web of Science、CNKI、万方和维普数据库)，按照纳入与排除标准收集各数据库从2010年至2017年3月发表的关于不同miRNA与肿瘤相关的文献。在文献检索中我们按照：差异miRNA与肿瘤转移相关(包括参与调控EMT、细胞增殖与侵袭；参与某些致癌基因的调控，例如P53、KRAS等)，由此选出miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b五个基因做详细的文献检索表格并列出文献中涉及miRNA的差异表达倍数。

5.统计方法

5.1主要统计软件

R-3.3.3网址：https://www.r-project.org/

Fun rich网址：http://www.funrich.org/

GraphPad Prism 7网址：http://www.graphpad.com/

5.2芯片数据的标准化处理

数据获取后，首先我们将RNA原始数据和相关芯片的注释文件相结合，并进行分组，然后运用R语言的limma包进行标准化和表达差异分析，如果芯片所属文献中包含临床数据，我们将对其中信息重命名，并将差异基因和临床信息进行比对，找到完整信息的芯片集纳入研究。

筛选差异表达的miRNA，我们使用目前国内外研究都普遍使用的SAM方法，由斯坦福大学开发，并被广泛使用，是一种以t检验为基础的筛选差异基因的算法。本研究的筛选条件为P<0.1。即miRNA在转移灶和原发灶组织表达差异有统计学意义。本课题组前期研究的肝癌miRNA芯片数据的差异化筛选同上。

结果：

1.GEO数据集中差异表达的miRNA

1.1结直肠癌原发灶/转移灶组织相关的差异表达miRNA

入选的数据集为GSE72199，芯片标本分别来自结直肠癌原发灶和肝转移灶，应用28例结直肠癌原发灶和8例肝转移灶对照样本的标准化表达数据，进行分析筛选，根据是否有统计学意义及其差异倍数，符合条件的差异表达的miRNA共有83个，其中在转移灶组织中上调的33个，下调的50个，上调、下调的miRNA表达情况见表1-2。由于差异表达的miRNA数据相对较多，后续我们结合前期研究和文献分析再缩小研究范围。

表1-2 GSE72199中人结肠癌组织相对其肝转移组织差异表达的miRNA

2.前期研究中肝癌组织与相匹配癌旁正常组织中差异表达的miRNA

利用miRNA芯片技术，对原始数据进行处理后，我们得到了33个差异性表达的miRNA，其中上调的miRNA有21个，下调的miRNA有12个，结果见表1-3。

表1-3人肝癌组织相对其正常肝组织差异性表达miRNA

对差异性的miRNA进行聚类分析，结果显示肝癌组织(C)及其癌旁肝组织(N)有明显不同的表达谱，见图2，图2中，C1和C2代表肝癌组织，N1和N2代表癌旁肝组织。

3.差异表达miRNA与肿瘤相关关键词的文本挖掘与文献检索

在pubmed数据库中，我们在差异表达的miRNA中，将miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b与“Neoplasms(disease)”、“Colorectal Neoplasms(alias COLORECTALCANCER)”关键词共同检索。miR-96与结直肠癌关联检索的结果发现其与肝癌、肿瘤转移、生存及预后等关键词有密切关联；miR-99b与肿瘤、结直肠癌联合检索皆没有发现其与其他关键词有关联；miR-155与肿瘤联合检索发现其与细胞迁移、肿瘤分期、生存和TP53等关键词有密切关联；let-7a与结直肠癌关联检索结果发现其与肿瘤的表达调控，甲基化，DNA修复，腹腔内化疗及TP53、MYC、ras家族基因等关键词密切相关；let-7b与结直肠癌关联检索的结果发现其与肿瘤的表达调控，肿瘤转移、帕尼单抗、生存及预后、KRAS基因等关键词密切相关。

利用文本挖掘的上述5个miRNA，符合我们进一步研究的入组要求。我们对其中一些重点文献进行了检索，其结果见表1-4。其中，研究普遍认为miR-96、miR-155、let-7a、let-7b四个基因参与了肿瘤的转移，并且被认为是潜在的预后标志物；其中miR-96、let-7a、let-7b的表达被认为与TP53，ras家族基因，KRAS基因相关；由于miR-99b在GEO数据库和前期研究中均发现为高表达，但是其在肿瘤和结直肠癌中的报道相对较少，为了探究其在结直肠癌中的潜在作用机制和价值，因此，我们将miR-99b纳入我们分析研究的指标中。

表1-4文献中miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a、let-7b表达情况一览表

注：*在癌组织/细胞/循环血中的表达。

综上所述，通过生物信息学方法，我们分析和筛选得到了在结直肠癌中与转移相关的5个miRNA，分别是miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b，各自的序列见表1-5。它们可能在结直肠癌的发生、发展或转移中有重要作用，针对此推测可进行进一步分子生物学实验。

表1-5 miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b的序列

第二部分：结直肠癌患者血浆中肝转移相关miRNA的表达及其诊断和预后价值

1.实验材料

病例选择和标本收集

本研究已通过广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会的批准，每位受试者均已签署知情同意书同意使用标本及临床资料。收集2008年12月30日至2011年12月30日期间在广西医科大学附属肿瘤医院就诊的CRC患者90例，同时收集2016年9月1日至2016年9月30日体检的健康人20例。患者中位年龄为55.9岁(年龄范围20-84岁)。男性56例，女性34例；左半结肠24例，右半结肠24例，直肠42例；低分化肿瘤26例，中分化肿瘤53例，高分化肿瘤11例；肿瘤直径＜5cm的57例，肿瘤直径≥5cm的33例；T1+T2有11例，T3+T4有79例；N0有22例，N1+N2有68例；临床分期为I+II的有20例，临床分期III+IV的有70例；无远处转移患者41例，肝转移患者49例。通过UICC和AJCC进行临床分期评估。详见表2-1。

结直肠癌肝转移患者入组标准：收集时所有患者均未接受过化疗、放疗、靶向治疗等综合治疗，收集的血浆均为术前血浆；未合并其他位置的远处转移和/或复发，未同时患有其他良性疾病。

结直肠癌无远处转移患者入组标准：无远处转移和/或复发，未同时患有其他良性疾病。

健康受试者入组标准：无肠道疾病史、无肿瘤病史。

表2-1 90例结直肠癌患者和20例健康受试者的临床病理基本特征

2.实验方法

2.1健康人血浆标本采集及初步处理

2.1.1收集健康人外周血2mL，立即置于含EDTA真空采血管中，室温静置约30min；

2.1.2将室温静置的血浆标本，以3000rpm离心15min，室温，取1mL上清；

2.1.3将所得上清，以12000rpm在4℃中离心15min，取上清分装，每管200μL，贴好标签，置于-80℃待用。

2.2结直肠癌患者血浆标本收集及处理(同上)

2.3血浆总RNA的提取

2.3.1将200μL血浆样品从-80℃冰箱取出，于室温解冻；

2.3.2向已解冻好的血浆中加入5体积(1mL)的裂解液，用移液器捶打充分混匀。常温静置约5min；

2.3.3在上述混合液中加入200μL的氯仿，用涡旋器混匀15s，常温静置约5min。此处的充分混匀是后续逆转录和聚合酶链反应顺利进展的保证；

2.3.4使用低温(4℃)离心机12000rpm，离心15分钟；

2.3.5小心将上清(约600μL)转移至新的1.5mL的离心管中，加入1.5倍体积(约900μL)的无水乙醇，用移液器充分混匀；

2.3.6取700μL上述混合液加入离心柱中，4℃，以12000rpm离心1min，弃废液；

2.3.7重复以上步骤，将剩下的混合液加入离心柱中离心；

2.3.8在离心柱中加入700μL初次冲洗缓冲液，12000rpm，4℃，离心1min，弃废液；

2.3.9在离心柱中加入500μL二次冲洗缓冲液，12000rpm，4℃，离心1min，弃废液；

2.3.10配制体积分数为80％的焦炭酸二乙酯酒精，在每个离心柱中加入500μL焦炭酸二乙酯酒精，于低温离心机12000rpm离心5min，弃废液；取出离心柱，避免酒精残留；

2.3.11将离心柱放置于新的离心管中，揭开盖子，4℃，12000rpm，离心5分钟，甩干管内膜片，弃废液；

2.3.12将离心柱置于新的离心管中，加入14μL无酶水，常温静置5min；

2.3.13将离心柱以12000rpm，离心5min，待用。

2.4测定血浆中miRNA表达水平

2.4.1血浆总RNA的逆转录

取12μL上述总RNA，按照凯捷公司小RNA逆转录试剂盒进行逆转录。整个配制过程在4℃中进行，37℃中反应60分钟，进行Poly(A)加尾和逆转录反应，95℃中5分钟灭活酶小RNA逆转录体系。反应体系见表2-2：

表2-2反应体系

在得到的20μL逆转录产物中加入200μL无酶水，将所得产物cDNA进行浓度和纯度检测后置于-20℃冰箱保存备用。保存于-80℃冰箱中待用。

2.4.2荧光定量PCR

以逆转录后的cDNA为模板，按照小RNA聚合酶链反应染料法试剂盒的说明书配制PCR反应体系，引物均来自天根。每条引物重复3个复孔，每次试验重复3次。上游引物为天根公司设计的引物，下游引物为凯捷公司设计的通用引物。反应的条件按照试剂盒的要求设置：预变性95℃中15min；变性94℃中15s；退火延伸55℃中30s；40次循环，在70℃时绘制熔解曲线。反应体系见表2-3。引物序列见表2-4。

表2-3反应体系

表2-4引物序列

我们以miR-16为标准计算各个miRNA的差异表达水平，每个miRNA的表达水平采用方法进行计算，其中-△△CT＝(CT实验组-CT标准参照)-(CT对照组-CT标准参照)，分析miRNA在结直肠癌患者和健康对照人群中的差异表达情况。

2.5生存分析

收集2008年12月30日至2011年12月30日期间在广西医科大学附属肿瘤医院就诊的结直肠癌患者，采用电话和走访的形式定期随访，以死亡为终点事件，截止至末次随访时未发生终点事件或失访都归入截尾数据。随访截止时间为2016年9月，中位随访时间为47.8月。

2.6统计分析

采用SPSS 20.0、GraphPad Prism5.0或者Medcalc12.2.1进行数据分析。正态分布资料采用均数±标准差表示；采用t检验、单因素方差分析或者非参数检验评估不同组之间各个的miRNA表达差异；采用受试者工作曲线(ROC)和二元线性回归评估miRNA的联合诊断效能；采用单因素和多因素生存分析评估各个miRNA的预后价值；通过生物信息学方法分析miRNA的靶基因及其涉及的信号通路。P值小于0.05视为有统计学意义。

结果：

1结直肠癌患者血浆miRNAs表达水平和临床病理参数的关系

1.1提取的总RNA质量鉴定及PCR扩增和熔解曲线图

经微量核酸测定仪检测，各样本总RNA的260/280的OD值在1.8-2.0间；经琼脂糖凝胶电泳实验，各样本28S、18S、5S的条带清晰，28S条带亮度大于18S和5S，故提取的RNA质量可靠完整，可用于下一步研究，如图3所示，图3中从左至右1-3为结直肠癌患者，4-6为健康人。

本研究中，内参和目的miRNA的荧光定量PCR的扩增曲线均呈现出S型，走形光滑，有明显的扩增期和平台期，表示扩增结果理想；内参和目的miRNA的荧光定量PCR的熔解曲线均为一狭窄的单峰曲线，熔点峰均在76℃-80℃之间，无明显双峰，表明扩增产物特异性好。如图4所示，图4中A，miR-16；B，miR-96；C，miR-99b；D，miR-155；E，let-7a；F，let-7b。图4中A-F横坐标为：Cycle；纵坐标为：Fluorescence(dR)。横坐标由0开始，所标数值大小间隔2；纵坐标由0开始，所标数值大小间隔10000。

1.2血浆miRNAs表达水平和临床病理参数的关系

我们检测了90例CRC患者和20例健康受试者的5个miRNA的表达水平，其和临床特征的关系如下表2-5。由2-5表可知，本研究中，血浆miR-96、miR-155和let-7a在肝转移组表达上调，而miR-99b和let-7b在肝转移组表达下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。此外，本研究中5个miRNA的表达与肿瘤的N分期及临床分期有关，差异有统计学意义(P＜0.05)；miR-96、miR-99b和miR-155与肿瘤直径有关，差异有统计学意义(P＜0.05)；miR-96、miR-99b、miR-15和Let-7b与肿瘤T分期有关，差异有统计学意义(P＜0.05)；我们的研究未观察到此5个miRNA与其它临床病理参数的关系，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2-5结直肠癌患者miRNA的表达情况及与临床病理特征的关系(均数±标准差)

其中，*单因素方差分析；**秩和检验。

2结直肠癌患者和健康受试者血浆miRNAs表达水平

为了探索本研究中5个miRNA在CRC患者和健康受试者血浆之间是否有差异表达，我们采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来检测这5个miRNA在血浆的表达水平。如表2-6所示，统计分析表明，miR-96、miR-155和let-7a在CRC患者血浆中高表达，而在健康受试者中呈现低表达；miR-99b和let-7b在CRC患者血浆中低表达，在健康受试者血浆中呈现高表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2-6结直肠患者和健康人血浆miRNA的表达水平

为了进一步寻找上述5个差异表达的血浆miRNA与肝转移的关系，我们将90例CRC患者分为无远处转移组(临床分期I-III)和肝转移组(临床分期IV)，比较各个血浆miRNA的表达水平是否有差异。统计分析表明，血浆miR-96、miR-155和let-7a在肝转移组中高表达，在无远处转移组中低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；而血浆miR-99b和let-7b在肝转移组中低表达，在无远处转移组中高表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，如图5所示，图5为结直肠癌患者无远处转移(n＝41)、肝转移患者(n＝49)、健康人血浆(n＝20)miRNA的表达水平(A:miR-96；B:miR-99b；C:miR-155；D:Let-7a；E:Let-7b。注：*为P＜0.05；**为P＜0.01；***为P＜0.001)。

3结直肠癌患者血浆中miRNA的诊断效能分析

为了检测上述差异表达的血浆miRNA在检出肝转移方面是否具有诊断价值，我们采用受试者工作曲线(ROC)和二元线性回归模型进行分析各个miRNA在各组之间的诊断效能，见表2-7。首先，我们分析了上述5个差异表达的血浆miRNA在CRC患者和健康受试者之间的诊断效能，ROC和曲线下面积(AUC)表明本研究中5个血浆miRNA均有较好的诊断效能，miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b的曲线下面积分别为AUC＝0.823(CI:0.738-0.889)，0.86(CI:0.781-0.919)，0.858(CI:0.778-0.917)，0.908(CI:0.837-0.954)，0.869(CI:0.792-0.926)，差异均有统计学意义。

表2-7结直肠癌患者血浆中miRNA的诊断效能分析

在上述研究的基础上，我们进一步分析上述具有较优诊断价值的miRNA在鉴别和诊断无远处转移(临床分期I－III)和肝转移(临床分期IV)患者上的效能，如表2-7。

本研究同时检测了CEA的表达水平，试图比较我们候选的5个miRNA和CEA的诊断效能。ROC曲线分析的结果表明，血浆miR-96的曲线下面积为0.937(0.866-0.978)，血浆miR-99b的曲线下面积为0.929(0.855-0.973)，血浆miR-155的曲线下面积为0.806(0.710-0.882)，血浆let-7a的曲线下面积为0.843(0.751-0.911)，血浆let-7b的曲线下面积为0.782(0.682-0.862)，CEA的曲线下面积为0.693(0.587-0.786)，在这6个血浆检测指标中，miR-96，miR-99b和let-7a在诊断无远处转移患者和肝转移患者中的单独诊断价值最高，而CEA的诊断效能低于本研究其他的5个指标。

接着，我们通过二元线性回归模型分析了miRNA的联合诊断效能，miR-96，miR-99b和let-7a的联合诊断效能：曲线下面积为0.971(CI:0.911-0.995)，最佳截点值为0.565，敏感性为91.84％，特异性为80.49％。由此，我们的结果表明，血浆miR-96，miR-99b，let-7a三个指标的联合诊断的价值优于CEA及其它指标，见图6，图6中，A：miRNAs鉴别无远处转移和肝转移结直肠癌患者的ROC曲线；B：miR-96，mR-99b和Let-7a联合鉴别无远处转移和肝转移结直肠癌患者的ROC曲线。研究结果表明，血浆中miR-96、miR-99b和let-7a组合可能作为结直肠癌患者，特别是结直肠癌肝转移患者新型非侵入性诊断和监测的生物标志物，可能作为结直肠癌治疗的分子靶点。

4生存分析

为了评估本研究中5个血浆中miRNA和结直肠癌肝转移患者预后的关系，我们将49例肝转移患者根据各个miRNA表达水平的中位数将患者分为高表达组和低表达组，通过Kaplan–Meier法、Log-Rank检验和Cox多因素回归模型分析血浆miRNA的表达和总体生存期的关系。单因素分析结果表明高表达的miR-96，miR-155患者总体生存时间较低表达患者短(log-rank检验示P分别为0.031，0.047)；而高表达的miR-99b患者总体生存时间较低表达的患者长(log-rank检验示P分别为0.025)，见表2-8。然而，未发现其它miRNA及临床病理参数，例如CEA表达水平、年龄、性别和肿瘤直径等与总体生存时间的差异有统计学意义(P＞0.05)。多因素Cox回归模型示血浆中miR-96、miR-155的表达是结直肠癌肝转移患者预后的独立危险因素，见图7。表明血浆中miR-96和miR-155对结直肠癌肝转移患者具有预后评估价值。

表2-8结直肠癌患者总体生存时间的单因素和多因素分析

CI可信区间，RR相对危险比

与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。

在上述方案中，血浆中5个miRNA的诊断效能均优于CEA。

一个优选的方案中，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b和let-7a中的任意一种或几种。

在上述方案中，血浆中miR-96、miR-99b和let-7a在诊断无远处转移患者和肝转移患者中的单独或组合诊断价值较高。

一个优选的方案中，所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物中，该标志物在血浆中为miR-96、miR-99b和let-7a的组合。

在上述方案中，血浆中miR-96，miR-99b和let-7a三个指标联合的诊断价值优于CEA及其它指标。

所述的与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110> 广西壮族自治区肿瘤防治研究所

<120> 血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

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Claims (4)

1.血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。

2.如权利要求1所述的血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-96、miR-99b和let-7a中的任意一种或几种。

3.如权利要求1所述的血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miR-96、miR-99b和let-7a的组合。

4.如权利要求1所述的血浆中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断试剂、试剂盒中的应用。