CN109929932A - 血液中两种长链非编码rna联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液中lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用，lnc_XR_242314.2分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，lnc_TCONS_00011689分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。涉及lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689的发现、检测、应用，设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。血液中的lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689可作为ESCC患者的血浆标志物，两者联合时效果更好。这一检查方法容易被受检者接受，更可成为ESCC患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体为一种血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用。
背景技术
食管癌(esphaogeal carcinoma,EC)是严重威胁人类健康的最常见恶性肿瘤之一，主要有两种病理分型：鳞癌和腺癌。临床上90％的食管癌是鳞状细胞癌(esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)，其分布具有明显的地域差异。我国ESCC发病率占全世界70％以上，预后较差，其5年总体生存率只有15％-25％。食管癌较差的预后与发现时已是中晚期有关，甚至部分患者原发灶很表浅但已经发生远处转移。食管癌的预后与肿瘤的转移有着密切的关联。由于缺乏足够高的诊断敏感性或特异性，食管癌的早期诊断率仍然较差，极易导致明确诊断前即已发生早期转移和较差的预后。因此，不断探索ESCC的发生发展机制，寻找新的早诊、预后以及治疗相关的分子标志物，是提高ESCC患者疗效及改善预后的重要手段。
非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)之前一直被认为是转录过程中产生的“噪音”，随着现代生物学技术的发展，ncRNA得到越来越清晰的认识。其中，lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，通常缺失开放性阅读框，从而缺乏编码蛋白的能力。lncRNA参与多个层面的基因调控，包括表观遗传水平调控、转录水平调控及转录后水平调控。近期，国内关于肿瘤lncRNA表达谱的研究十分火热，包括高通量芯片筛选和RNA深度测序，以及qRT-PCR在内的实验技术均已发展的十分成熟，发现lncRNA与人类疾病密切相关。在同一种疾病中可发现不同的lncRNA差异表达谱，同时也发现同一lncRNA可在多种肿瘤疾病中检测到并在肿瘤进程中发挥不同的生物学作用，如lncRNA-UCA1在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、骨肉瘤等常见恶性肿瘤中。LncRNA具有相对稳定二级结构，且可分泌到体液中，已被证实在人血浆、尿液和唾液甚至是胃液等体液中检测到lncRNA。基于此，研究人员已在此前的研究中探索了lncRNA在体液中(包括血浆中)作为肿瘤生物标记物的潜在作用。例如，在前列腺癌患者血浆中，MALAT1表达水平明显高于非前列腺癌患者，其敏感性和特异性分别为58.6％和84.8％，有望成为前列腺癌诊断和分期的检测指标。在尿液中也有检测到PCA3的表达，可为提高前列腺癌的早期诊断率提供依据。
目前ESCC尚没有血浆肿瘤标志物来评估病情，内镜是金标准。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用，通过检测外周血中的lncRNA分子，这一检查方法容易被受检者接受，更可成为ESCC患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。基于此，采用基因芯片技术检测对食管鳞癌患者(早期和晚期)及正常人外周中lncRNA的表达谱，并且再将不同分期(早期vs晚期)的ESCC患者外周血中的lncRNA作比较，得到在ESCC发生发展的不同阶段的lncRNA表达谱，具有研究价值的与临床分期相关的lncRNA，扩大样本验证其在ESCC患者血浆、组织的表达水平是否一致。肿瘤患者血浆中的lncRNAs作为有价值的分子标志物用于ESCC诊断、分期，同时为食管癌的诊断和治疗提供新的选择。
为了达到以上目的，本发明供如下技术方案：
一种血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用，所述两种长链非编码RNA分别为：lnc_XR_242314.2分子标志物和lnc_TCONS_00011689分子标志物；lnc_XR_242314.2分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，lnc_TCONS_00011689分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
在本应用中，用于食管鳞状细胞癌诊断的试剂为实时定量PCR试剂盒。
本发明中，根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的circ_SLC7A5分子标志物设计了3对引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
特异性引物分别如下：
本发明还公开了一种lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689分子标志物的检测方法，包括样品总RNA提取、芯片表达谱及生物信息学分析、cDNA合成、qRT-PCR-实时荧光定量聚合酶链反应、数据分析。具体步骤如下：
第一步，血浆总RNA提取，血浆、血清总RNA提取使用mir Vana PARIS Kit试剂盒提取，组织总RNA提取Trizol法提取组织及细胞总RNA；第二步，芯片表达谱及生物信息学分析，将ESCC和正常人血浆样本，经CapitalBio Technology Human LncRNA Array v4 andmRNA Array v2技术，检测外周血中的lncRNA和mRNA表达谱，用GeneSpring softwareV13.0对芯片数据进行分析，当两组样本中mRNA或lncRNA表达差异倍数≥2，且p value≤0.05时，定义为差异基因；对差异表达mRNAs及表达差异lncRNAs共表达mRNAs进行疾病分析、GO分析及Pathway分析；第三步，cDNA合成,使用Takara RR047A两步法逆转录反应试剂盒；第四步，qRT-PCR-实时荧光定量聚合酶链反应,对组织和血清中lnc RNA测定采用ABI7500荧光定量PCR仪，使用TakaraPremix Ex TagTMⅡDRR081A荧光定量PCR试剂盒，并根据溶解曲线判断引物反应的特异性，采用ΔCT以及2-ΔΔCT法对目的lncRNA进行表达量和相对表达量分析；第五步，数据分析，组织、血浆或血清间lncRNA差异性分析采用以下统计分析方法：配对t检验，Mann-Whitney,Wilcoxon,χ2,以及Kruskal-Wallis检验；浆lncRNA表达水平和临床病理资料之间相关分析采用卡方检验；受试者特征曲线和曲线下面积来评估血浆lncRNA诊断食管鳞癌效能；所有统计分析均采用SPSS20.0统计分析软件，p＜0.05为差异具有统计学意义。
本发明还公开了一种用于食管鳞状细胞癌诊断的实时定量PCR检测试剂盒，包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的lnc_XR_242314.2分子标志物的和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的lnc_TCONS_00011689分子标志物的设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。采用的特异性引物如序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8。
本发明还公开了一种核苷酸序列为SEQ ID NO.1的lnc_XR_242314.2分子标志物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的lnc_TCONS_00011689分子标志物。
本发明具有如下优点：
本发明的有益效果是：(1)提出了lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689的用途。(2)lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689在ESCC患者和正常人血液样本中表达量存在差异，并且与分期相关，因此lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689具有成为食管鳞癌生物标志物的应用前景。(3)两者联合时，诊断效果更好。
本发明是针对目标人群对食管癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的食管鳞癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在食管鳞状细胞癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。专利发现血浆中的lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689可作为ESCC患者的血浆标志物，同时，两者联合时效果更好。这一检查方法容易被受检者接受，更可成为ESCC患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。
附图说明
图1，lnc_XR_242314.2在ESCC外周血中表达量明显低于对照组正常人血浆；
图2，lnc_XR_242314.2在ESCC癌组织中表达量明显低于癌旁组织；
图3，lnc_TCONS_00011689在ESCC外周血中表达量明显低于对照组正常人血浆；
图4，lnc_TCONS_00011689在ESCC癌组织中表达量明显低于癌旁组织；
图5，ROC曲线用于评价lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689的潜在诊断价值；
图6，在ESCC晚期(IIIA-Ⅳ)lnc_XR_242314.2的表达低于早期(IA－IIB)；
图7，ESCC晚期(IIIA-Ⅳ)中lnc_TCONS_00011689的表达低于早期(IA－IIB)。
＊p<0.05，*p p<0.01，*p p<0.001；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
如图1至图7所示，本发明公开了血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用，lnc_XR_242314.2分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，lnc_TCONS_00011689分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
1.研究材料
1.1实验对象。
本研究以南京医科大学附属南京医院肿瘤外科为研究基地，肿瘤外科常年收治食管鳞癌患者，并建立标本库，能为本研究提供丰富的病例资料。研究患者组织及血液来源于2014年至2017年8月期间在我院接受根治或姑息性手术切除的食管鳞癌患者。正常对照血液样本均来源于南京市第一医院健康体检人群，健康对照人群排除恶性肿瘤病史以及食管相关疾病病史。本实验所有标本均获得患者或其委托人签署知情同意，所有涉及人体标本的研究均获得南京市第一医院伦理委员会批准。
研究患者纳入标准如下：
a.经术后病理学证实为食管鳞状细胞癌(按照第7版(2009年)食管癌TNM分期标准进行临床分期)；
b.住院期间接受根治或姑息性切除的患者，同时排除术前放化疗者；
c.现病史、家族史、个人史以及各种检查资料均完善。
1.2临床资料采集
临床资料的收集主要分为食管鳞癌患者和正常人两部分，均需包含一般资料：包括患者的姓名、性别、年龄、职业、既往病史、家族史、女性月经史以及婚育史等。食管鳞癌患者主要由食管鳞癌患者的住院资料整理而来。主要包括上述一般资料外，还应包括临床特征，包括肿瘤的组织学类型、部位、大小、浸润程度、淋巴结有无转移，肿瘤细胞分化程度，肿瘤TNM分期，手术时间，术后有无放化疗以及常规辅助检查等资料。同时获得所有人的随访同意，检查结果资料完善保存。
1.3标本收集
分为两部分，一部分是血液的收集，每位食管鳞癌患者术前采血一次(5ml/管)用于后续实验研究。所有血液样本应避免发生溶血。其中血浆样本收集采血管为乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)抗凝管，全血样本应在0.5h内完成血浆的离心收集冻存；血清样本收集采血管为常规生化促凝管，样本应在2h内完成血清的析出离心冻存。全血样本通过两步离心法以去除细胞成分影响，首先在2000g，4℃，离心10min，随后小心转移上清至新的EP管中，然后12000g，4℃，离心10min,最后完成血浆及血清样本分装(400μl/管)，放入-80℃冰箱长期保存。
还有一部分是组织标本的收集。临床收集因食管鳞癌而接受根治或姑息手术切除的患者的肿瘤组织及癌旁正常食管组织标本。对照组标本来自于同一患者的癌旁组织(距离肿瘤边缘至少5cm)，术后病理检查未发现切缘癌细胞残留。新鲜肿瘤组织和癌旁正常组织离体后首先尽快用预冷生理盐水清洗两遍，随后剪取约黄豆大小组织放入有RNA保护液的冻存管中充分混匀。所有标本获取后均先速冻于液氮罐中24h，然后及时放入-80℃冰箱中长期保存，以待后续实验使用。
1.4主要仪器
1.5实验试剂
1.6主要引物
2.研究方法
2.1技术路线
2.1.1长链非编码RNA在食管鳞癌患者外周血中的表达谱
2.1.2验证特定lncRNA在外周血、组织中的表达
2.2总RNA提取
a.血浆总RNA提取
1)所有试剂均需恢复到室温下使用，取出血浆/血清样本冰面上融化备用，洗脱液95℃预热备用；
2)400μl血浆/血清样本加入已经添加等体积的2X Denaturing Solution的EP管中，充分震荡混匀；
3)加入等体积的Acid-Phenol:Chloroform，震荡混匀1min，随后室温下10000g离心5min；
4)小心转移上层水相至新的EP管，并记录转移水相体积，随后添加1.25倍体积100％乙醇至EP管中，充分混匀后转移裂解液/乙醇混合物通过滤器(10000g离心30s)；
5)加700μl mi RNA Wash Solution 1清洗滤器1次(10000g离心15s)，随后加入500μl Wash Solution 2/3清洗滤器2次(10000g离心15s)；
6)50μl 95℃预热的无核糖核酸酶水洗脱滤器上的RNA(10000g离心30s)，-80℃长期保存；
7)紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。
b.组织总RNA提取Trizol法提取组织及细胞总RNA,具体步骤如下：
1)清洗瓷质研体后，用DEPC液浸泡过夜(至少12h)，然后高压蒸汽灭菌后放入超低温冰箱冷藏；
2)准备无菌无酶枪头、EP管、离心机4℃遇冷备用
3)从超低温冰箱内取出冻存组织(约50mg)，擦去表面冻存液，研钵(-40℃预冷)内充分研磨，边研磨边添加液氮以防止组织RNA降解。待组织样本研磨成粉状；
4)每份样本添加1ml Trizol裂解液，用枪头吹匀后转移裂解液至EP管，冰面上静置5min，使其完全分解；
5)加氯仿0.2ml，剧烈震荡15s，室温下静置2min，4℃，12000g离心15min；
6)小心转移上层水相至新的EP管中，尽量避免吸取絮状中间层。随后加0.5ml异丙醇，震荡混匀、室温下静置10min,随后4℃，12000g离心10min。现配75％乙醇备用；
7)小心弃去上清，加入75％乙醇1ml震荡清洗沉淀，随后7500g，4℃离心5min；
8)最后弃去上清，用枪头尽可能吸去残余液体，室温风干，根据沉淀大小，加入30-60μl DEPC水溶解RNA沉淀；
9)紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。
2.3.芯片表达谱及生物信息学分析
提供5对ESCC(早期和晚期各5例)和5例正常人血浆样本，交由北京博奥晶典生物技术有限公司，经CapitalBio Technology Human LncRNA Array v4 and mRNA Array v2技术，检测外周血中的lncRNA和mRNA表达谱。用GeneSpring software V13.0(Agilent)对芯片数据进行分析，当两组样本中mRNA或lncRNA表达差异倍数≥2，且p value≤0.05时，定义为差异基因。
利用KOBAS(KEGG Orthology Based Annotation System)软件同时可进行通路、疾病和功能分析，其中包括7个通路数据库，5个人类疾病数据库和1个功能数据库。Pathway包括KEGG PATHWAY、PID Curated、PID BioCarta、PID Reactome、BioCyc、Reactome、Panther数据库；Disease(Homo Sapiens Only)包括OMIM、KEGG DISEASE、FunDO、GAD、NHGRI数据库。Gene Ontology，主要包含biological process，molecular function，cellularcomponent三个方面的内容。对差异表达mRNAs及表达差异lncRNAs共表达mRNAs进行疾病分析、GO分析及Pathway分析，预测lncRNA的功能。同时进行lncRNA-mRNA共表达分析、靶基因预测、转录因子预测等。
2.4cDNA合成
总RNA逆转录前分光光度计测定每份样品的浓度和纯度，样本OD260：OD280介于1.8-2.0，提示总RNA纯度较好，方可用于后续实验。使用Takara RR047A(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)两步法逆转录反应试剂盒，20μl反应体系中，每份样本RNA添加总量为1μg。生成cDNA-20℃长期保存。
去除基因组DNA
反应条件：42℃，2min→4℃，终止反应
逆转录反应：
反应条件：37℃，15min→85℃，5s→4C，终止反应。
2.5.qRT-PCR-实时荧光定量聚合酶链反应(荧光染料法)
对组织和血清中lnc RNA测定采用ABI7500荧光定量PCR仪，使用TakaraPremix Ex TagTM Ⅱ DRR081A荧光定量PCR试剂盒，20μl的反应体系。每个样本设置3个复孔，并根据溶解曲线判断引物反应的特异性。本研究所有引物均经BLAST分析扩增产物特异性，交由上海英潍捷基公司合成。采用ΔCT以及2-ΔΔCT法对目的lncRNA进行表达量和相对表达量分析。
实时荧光定量PCR反应体系：
反应条件：95℃预变性30s→95℃，5s→60℃，34s,共40个循环。
2.6.数据分析
组织、血浆或血清间lncRNA差异性分析根据需要采用以下统计分析方法：配对t检验，Mann-Whitney,Wilcoxon,χ2,以及Kruskal-Wallis检验；浆lnc RNA表达水平和临床病理资料之间相关分析采用卡方检验；受试者特征曲线(Receiver-operating-characteristic,ROC)和曲线下面积(area under the ROC curves,AUC)用来评估血浆lncRNA诊断食管鳞癌效能；所有统计分析均采用SPSS20.0统计分析软件，p＜0.05为差异具有统计学意义。
经过前期筛选，最终确定了lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689两个均在Case1 vs control分组以及case2 vs case1分组中明显低表达的lncRNAs，并将其作为临床分期相关的指标。运用qRT-PCR,分别在52例ESCC患者血浆样本和23例正常人血浆中进行验证，结果显示，lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689在ESCC患者血浆中表达均低于正常人患者血浆，与芯片结果一致如图1、2；在23对ESCC癌组织及癌旁组织中进行验证，结果显示lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689在癌组织中明显低表达，如图3、4。为了验证筛选出的lncRNAs在ESCC诊断中的意义，我们利用ROC-AUC方法统计来分别评估lnc_XR_242314.2，lnc_TCONS_00011689和两者联合诊断的效能，如图5，结果显示：lnc-XR_242314.2诊断时AUC(the area under the ROC curve，AUC曲线下面积)为0.711，lnc_TCONS_00011689AUC为0.697，两者联合时AUC为0.750。然后对lncRNA与临床特征的关系进行分析，包括年龄，肿瘤分期，淋巴结转移，以及肿瘤大小，分化程度等内容，结果显示lnc_XR_242314.2和lnc_TCONS_00011689均与ESCC临床分期有关，如图6、7。
数据如下表：
表1.Lnc_XR_242314.2与临床特征的关系
*P<0.05,low-versus high-expression.
表2.Lnc_TCONS_00011689与临床特征的关系
*P<0.05,low-versus high-expression.
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏万成生物医学研究院有限公司
<120> 血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 412
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gaataaaaat gacactttgg agccttgaaa aatggacttt ccttctgaag tacccaggag 60
agtagacgat ggaaaataaa aacaacaagc aagtgaaact ccctgactta tcaaccttac 120
tcaagaaatg ggaatttctg ccctagagag gtcttggaaa ctttctcacc agaagagcac 180
aacttgatgg caggaagctc ctgatggagg cctgaaaatg gccctgaaag ggatgccagg 240
ggaccagggc tccactatta tcagcgtgtg actttggaca aggatgttaa tggctctgtg 300
actcagttac ctcttctgta ctttgcttag gggtctattg ctttccattt tgtctttttc 360
atttgttaaa tccaatgatg tcactgacag taaaaactag taaatagtaa aa 412
<210> 2
<211> 208
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctggccttca gtttccatat tggtgtcttt gtgaagcttc ctatctttgc ttttcaacta 60
agatgaaaca gcatttaaaa gaaaatgcca tgtgagatga gatcaggaga atggattctt 120
tctttcatct gaatagagag ctgctgttcg agattctaac tcaaatagct caaaggacac 180
cttctccggg aaaccttccc tgacttcc 208
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggcatggact gtggtcatga g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cccaggagag tagacgatgg a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ggagcttcct gccatcaagt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgccatgtga gatgagatca gg 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
agaatctcga acagctctc 19
Claims (9)
1.一种血液中两种长链非编码RNA联合诊断食管鳞状细胞癌中的应用，所述两种长链非编码RNA分别为：lnc_XR_242314.2分子标志物和lnc_TCONS_00011689分子标志物；lnc_XR_242314.2分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，lnc_TCONS_00011689分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：用于食管鳞状细胞癌诊断的试剂为实时定量PCR试剂盒。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的circ_SLC7A5分子标志物设计了3对引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：lnc_XR_242314.2和 lnc_TCONS_00011689分子标志物的检测方法，包括样品总RNA提取、芯片表达谱及生物信息学分析、cDNA合成、qRT-PCR-实时荧光定量聚合酶链反应、数据分析。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：具体步骤包括，第一步，血浆总RNA提取，血浆、血清总RNA提取使用mir Vana PARIS Kit试剂盒提取，组织总RNA提取Trizol法提取组织及细胞总RNA；第二步，芯片表达谱及生物信息学分析，将ESCC和正常人血浆样本，经CapitalBio Technology Human LncRNA Array v4 and mRNA Array v2技术，检测外周血中的lncRNA和mRNA表达谱，用GeneSpring software V13.0对芯片数据进行分析，当两组样本中mRNA或lncRNA表达差异倍数≥2，且 p value≤0.05 时，定义为差异基因；对差异表达mRNAs及表达差异lncRNAs共表达mRNAs进行疾病分析、GO分析及Pathway分析；第三步，cDNA合成, 使用 Takara RR047A两步法逆转录反应试剂盒; 第四步，qRT-PCR-实时荧光定量聚合酶链反应, 对组织和血清中lnc RNA测定采用ABI7500荧光定量PCR仪，使用Takara SYBR® Premix Ex TagTM Ⅱ DRR081A荧光定量PCR试剂盒，并根据溶解曲线判断引物反应的特异性，采用ΔCT以及 2−ΔΔCT法对目的lncRNA进行表达量和相对表达量分析；第五步，数据分析，组织、血浆或血清间lncRNA差异性分析采用以下统计分析方法：配对t检验，Mann-Whitney, Wilcoxon, χ2, 以及Kruskal-Wallis 检验；浆lnc RNA表达水平和临床病理资料之间相关分析采用卡方检验；受试者特征曲线和曲线下面积来评估血浆lncRNA诊断食管鳞癌效能；所有统计分析均采用SPSS20.0统计分析软件，p＜0.05 为差异具有统计学意义。
6.一种用于食管鳞状细胞癌诊断的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的lnc_XR_242314.2分子标志物的和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的lnc_TCONS_00011689分子标志物的设计并合成出特异性用于实时定量 PCR的检测引物。
7.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：采用的特异性引物如序列表中SEQ IDNO.5 、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
8.一种核苷酸序列为SEQ ID NO.1的lnc_XR_242314.2分子标志物。
9.一种核苷酸序列为SEQ ID NO.2的lnc_TCONS_00011689分子标志物。
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