CN105219867A - 用于胃癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

用于胃癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于胃癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p。本发明将胃癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA？has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206及has-miR-224-5p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p和has-miR-206表达下调，has-miR-155-5p和has-miR-224-5p表达上调。这5种miRNA可以作为胃癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。

Description

用于胃癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测，具体涉及用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
胃癌作为全球第四大癌症，严重威胁到人类健康。世界每年胃癌新发病例近百万，发展中国家占近2/3，其中42％发生在中国。胃癌的早期诊断与治疗对患者的病情及预后至关重要，也是国内胃癌领域有待突破的主要研究方向。胃癌的发生发展涉及多基因异常调控、多步骤参与，最终使细胞生物学行为由正常演变为异常。当细胞行为异常是基于基因水平发生变化时，便可引发细胞结构和功能的不可逆性改变，很大可能造成细胞癌变。
实现胃癌的早期诊断可以大大提高患者长期生存率及生活质量。目前常用的癌症诊断方法有病理学诊断、物理学诊断和血清学检查癌症相关标志物等，这些方法是在细胞及其代谢物水平进行筛查，对于诊断出阳性结果的患者，体内已出现细胞癌变及癌细胞的异常增殖，严格意义上看并非属于癌症的早期诊断。最新研究较多关注癌症的基因诊断与治疗，基因诊断着眼于细胞基因水平的变化，在细胞形态与功能改变之前进行探索，使得癌症的早发现与早治疗成为可能。目前胃癌的基因诊断主要有胃癌特异癌基因的检测及胃癌相关病因检测。
MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上高度保守，数量约占基因组的1％，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋白质编码基因的表达：通过与其靶基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。人类基因组约30％的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
MiRNA在胃癌中的研究显示了miRNA在胃癌诊治中的研究价值及应用前景。不少文献已揭示了特定miRNAs在胃癌发生发展中的作用。JunLu(JunLu,etal.2005)等对人类多种癌症中的microRNA表达做了分析，发现miRNA表达谱可用于区分诊断不同类型的癌症。他们发现胃肠道癌症(胃癌、结肠癌等)的miRNA表达谱聚集在一起，与其它类型癌症miRNA表达谱距离很远，可以区分癌细胞的大致来源。Xiao(XiaoB,etal.2009)等研究显示胃癌与正常组织中miRNA存在差异，同时发现癌症组织中miR-106a水平要高于非癌症组织，并且miR-106表达水平的变化与肿瘤分期、肿瘤大小及分化程度等特性相关，提示miR-106a可作为胃癌诊断及病情预测的潜在标志物。这些研究为寻找胃癌特异性miRNA作为胃癌诊断生物标记物提供帮助。在胃癌侵袭和转移方面，Song(YongxiSong,etal.1999)等研究显示胃癌组织中miR-194的表达量与胃癌的侵袭程度成反比。他们发现IV型胃癌患者肿瘤组织中miR-194表达量比I、II、III型的表达量低；体外侵袭实验证实转染了miR-194模拟物的胃癌细胞株侵袭率降低，提示miRNA的表达量与癌症病情进展相关。亦有研究显示miRNA在胃癌中的异常改变与癌症的预后相关。2009年的一项研究分析了100名胃癌患者miRNA表达谱，筛选出一组含7个异常miRNAs的表达谱，可作为独立预测患者预后的相关指标，其预测率在后续的50名胃癌患者得到进一步验证(XLi,etal.2009)。提示对于miRNA在胃癌中的研究，有助于提供胃癌诊断、病情判断、预后评估等多方面信息。
发明内容
本发明的目的在于提供用于胃癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一组用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p；所述has-miR-10b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述has-miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述has-miR-206的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述has-miR-155-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述has-miR-224-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
进一步地，所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
所述的microRNA生物标志物在筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
一组人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合，所述microRNA引物、探针的组合包括：has-miR-10b-5p引物、探针；has-miR-100-5p引物、探针；has-miR-206引物、探针；has-miR-155-5p引物、探针；has-miR-224-5p引物、探针。
进一步地，所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。
进一步地，has-miR-10b-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-100-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-206的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-155-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-224-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
所述的人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
一种人胃癌的肿瘤诊断试剂盒，包括所述的miRNA引物、探针的组合。
进一步地，所述的人胃癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
本发明的优点：
本发明将胃癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNAhas-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206及has-miR-224-5p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p和has-miR-206表达下调，has-miR-155-5p和has-miR-224-5p表达上调。这5种miRNA可以作为胃癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
附图说明
图1-图5分别显示has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p单独用于区分胃癌样本和正常对照的ROC曲线；
图6显示为has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p联合用于区分胃癌样本和正常对照的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：胃癌组织差异性miRNA的筛选
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年1月-2014年1月经病理证实为胃癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围的癌旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
1.2主要仪器设备
台式离心机：EppendorfMinispin(美国)Eppendorfcentrifuge5810R(美国)
核酸浓缩仪：Eppendorfconcentrator5301(美国)
紫外分光光度计：DU640、天平(Beckman公司产品)
紫外交联仪：GSGENELINKERUVChamber(BIO-RAD公司产品)
水浴锅(Memert公司产品)
杂交盒、芯片、芯片扫描仪：LuxScan-10K/A(Capitalbio公司产品)
水平摇床：TDK-2(北京通达科技有限公司)
凝胶成像分析仪：GDS-7600(UPV产品)
超净工作台(Memert公司产品)
实时荧光PCR仪：ABIPRISM7500(美国)
1.3主要实验试剂
Trizol、糖原(Invitrogen公司)；T4RNA连接酶(NEB公司)；ControlRNA(Capitalbio公司)；5P’-C-U-Cy3-3’5P’-C-U-Cy5-3’(Dharmacon公司)；Ambion’smiRNAIsolationKit(Ambion公司)；EDPC、甲酞胺、澳酚蓝(Sigma公司)；20×SSC、10％SDS(PIERCE公司)；50×Dhardt’s(鼎国)；MOPS(Bocherigmer公司)；5×RTBuffer(美国Promega公司)、M-MLV逆转录酶：200u/μl(美国Promega公司)；4×dNTP：10mMeach(上海生工生物工程有限公司)；RNase抑制剂40u/μl(大连宝生物工程有限公司)。
1.4组织标本总RNA的提取
Trizol一步法提取组织标本中的总RNA。具体步骤如下：
(1)准备研钵、匀聚器、勺子、剪刀、镊子、液氮等器材和试剂；
(2)研钵预冷：往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷；
(3)带上手套，口罩，迅速从液氮罐中用镊子取出样本，在分析天平中称重，一次提取的组织块重量在0.3-0.5g之间。组织块放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织块融化。
(4)粗研磨后，在超净工作台中，用小勺迅速将研碎的组织移入装有Trizol试剂的勾装器中，按100mg组织加入1mlTrizol，匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。
(5)用滴管将匀浆液转移到1.5ml离心管中，每管放入约，室温放置以上，保存至-80℃冰箱中直至分析。
(6)匀浆标本常温解冻，按0.2ml氯仿/1mlTrizol的比例加入氯仿，vortex30秒，室温放置3min，然后4℃，12000rpm离心15min。
(7)离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相。RNA仅存在水相中，用加样器将上清转移到另一新的1.5ml离心管中，不要吸取中间层。按0.5ml异丙醇/1mlTrizol的比例加入异丙醇，混匀，室温放置10min以上，12000rpm4℃离心15min。
(8)弃去上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用加样器将剩余的异丙醇吸出，加入1ml75％乙醇，vortex，7500rpm4℃离心5min。
(9)弃去75％乙醇，通风橱中自然干燥30min，不要真空离心干燥，RNA不要完全干透，以防不能完全溶解，用DEPC水溶解RNA，每管溶于30μl，60-65℃助溶5min。
(10)RNA定量，吸取1μl的RNA样品，加入49μlDEPC水中，用加样器上下吹打混匀，稀释50倍。用溶解RNA的DEPC水标记空白，吸取50μl加入比色杯中。用紫外分光光度计DU-640测量OD值，计算比值OD260/OD280比值和RNA浓度。
RNA浓度＝OD260×40μg/ml×稀释倍数。
1.5总RNA中miRNA的分离提取
取50-100μg总RNA用Ambion’smiRNAIsolationKit分离miRNA，具体步骤如下：
(1)取50-100μg总RNA加入EP管，定容至适量体积。加入5倍体积的Lysis/BindingBuffer，混匀。
(2)加十分之一体积的miRNAHomogenateAdditive，振荡混匀，置于冰上孵育10分钟。
(3)加三分之一体积的100％乙醇，充分混勾。
(4)将上述混合液加入滤管中，5000rpm离心1分钟，收集滤液(小RNA在滤液中)。
(5)在滤液中加入三分之二体积的100％乙醇，充分混匀。
(6)更换滤管，将步骤(5)的混合物进行过滤，5000rpm离心1分钟，弃去滤液，收集管继续使用。
(7)将滤管放在收集管中，用700μl的miRNAwashingsolution1洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液。
(8)用500μl的miRNAwashingsolution2洗滤管，5000rpm离心1分钟，弃去滤液；再用miRNAwashingsolution2洗一遍；将滤管连同收集管10000rpm离心1分钟，除去滤管中残留的液体。
(9)将elutionsolution加热到95℃；更换一个新的收集管，将50μl95℃的elutionsolution加入滤器，合上盖子，室温孵育2分钟；10000rpm离心1分钟，收集滤液，小RNA在滤液中。重复步骤(9)。
1.6miRNA芯片筛选
1.6.1miRNA芯片
哺乳动物miRNA芯片V3.0针对人677、大鼠292、小鼠461个成熟microRNA，由于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了924条探针(sangermiRNA数据库：miRNABase10.0)。把这些探针用芯片点样仪Smart-ArrayTM(CapitalbioCorp,Beijing,China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括人的U6、tRNA作为内标；8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3)，Hex作为点样阳性对照，，50％DMSO作为杂交阴性对照。
1.6.2miRNA样品的荧光标记
具体步骤如下：
(1)miRNA的荧光标记：取2-5μg癌组织miRNA经聚乙二醇沉淀，用0.1mgATP、50mMHEPES、3.5mMDDT、20mMMgCl2、10mg/mlBSA、10％DMSO、500ngCy3标记的5P’-C-U-Cy3-3’(来自Dharmacon公司)和20单位的T4RNA连接酶，用枪头吹打，轻轻混匀。锡纸包裹样品管，在0℃标记反应2小时。同理用Cy5标记癌旁组织miRNA。两种标记后的miRNA混匀。
(2)miRNA的纯化：在上述荧光标记后的样品内加入DEPC水，补齐至100μl，加入十分之一体积-20℃预冷的3mmol/L醋酸钠(pH5.2)10μl、糖原10μg、2.5倍体积无水乙醇，于-20℃静置1小时。
(3)miRNA沉淀的漂洗：弃去上清，加入-20℃预冷的75％乙醇800μl，充分混匀后4℃下12000rpm离心5分钟。重复2次。弃去上清，在空气中干燥10min，吹干后用于芯片杂交。
1.6.3miRNA芯片杂交
具体步骤如下：
(1)将RNA溶于16μl杂交液中(15％甲酰胺2.4μl；0.2％SDS3.2μl；3×SSC2.4μl；50×Denhardt’s1.6μl，DEPC处理水6.4μl)。
(2)恒温金属浴加温，溶解，振荡，混匀。
(3)取出，放置-20℃冰箱内10分钟，使之降温。
(4)95℃变形3min。
(5)冰上迅速冷却，全部滴加到哺乳动物microRNA芯片V3.0上，加盖硅化盖玻片。
(6)杂交盒内消毒后经双蒸水湿润的滤纸保持湿度，42℃杂交过夜，通常16小时以上。
(7)杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS、2×SSC的液体摇床中漂洗4分钟，而后在室温中含有0.2×SSC液体摇床中室温洗4分钟，玻片置于管中，1600rpm离心1分钟甩干后即可用于扫描。
1.6.4芯体扫描及数据处理
芯片用Luxscan10K/A双通道激光扫描仪(Capitalbio公司)进行扫描。数据提取采用Luxscan3.0图像分析软件(Capitalbio公司)对芯片图像分析，把图像信号转化为数字信号。
1.7miRNA芯片结果realtimeRT-PCR验证
1.7.1miRNArealtimeRT-PCR引物设计
特异的茎环引物(反转录引物序列)约56个核苷酸，其5’端的48个核苷酸序列是固定的，形成一个茎环的结构，其3’端的8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物(PCR前引物)长约30-31个核苷酸，在3’端有约16-17个核苷酸与对应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物(PCR后引物)约为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
1.7.2miRNArealtimeRT-PCR
1.7.2.1cDNA逆转录合成
组织标本总RNA逆转录合成cDNA，反应体系如下：
组分 体积(单位：μl)
总RNA模板 1μg(根据浓度计算体积)
Stem-loop RT primer(500nM) 1
5×RT Buffer 2
100mM DTT 1
dNTPs(10mM each) 0.5
RNase抑制剂(40U/μl) 0.1
M-MLV(200U/μl) 1
加DEPC水 至10μl
反应条件：16℃，30min；42℃，60min；85℃，5min；4℃，hold。
1.7.2.1miRNArealtimeRT-PCR反应
miRNArealtimeRT-PCR反应体系如下：
组分 体积(单位：μl)
SYBRRPremix Ex TaqTM(2×) 12.5
正向引物10μM 0.5
反向通用引物μM 0.5
ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.5
DNA模板(稀释10倍) 2
DEPC处理水 至25
反应条件：95℃预变性10min；95℃5s、60℃34s×40。
1.8统计学分析
基因芯片筛选的结果采用Cluster3.0和SignificanceAnalysisofMicroarrys(SAM，version2.1)进行分析。数据以(±表示，组间比较采用检验，采用软件进行分析处理，为差异有统计学意义。RealtimeRT-PCR数据以(x±s)表示，组间比较采用t检验，采用SPSS17.0软件进行分析处理，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1miRNA基因芯片筛选结果
利用miRNA芯片对8对胃癌组织及配对的癌旁组织中924种miRNA表达情况进行分析，共筛选出23种差异性表达的miRNA，其中has-miR-155-5p、has-miR-193b、has-miR-224-5p表达上调，has-miR-145、has-miR-381、has-miR-132、has-miR-206、has-miR-199b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-335、has-miR-497、has-miR-99a、has-miR-10b-5p、has-miR-125b、has-let-7b、has-miR-10a、has-miR-126、has-miR-30a、has-miR-143、has-miR-125a-5p、has-miR-19b、has-miR-26a、rno-miR-324-3p表达下调。
2.2miRNA基因芯片筛选结果的realtimeRT-PCR验证
用miRNArealtimeRT-PCR对芯片筛查的结果进行验证，共筛选出10种差异性表达的miRNA，其中，has-miR-155-5p、has-miR-224-5p和has-miR-193b表达上调，has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-381、has-miR-132、has-miR-497、has-miR-99a、has-miR-10b-5p表达下调。对其中表达差异性明显的5种miRNA，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206及has-miR-224-5p进行进一步的血清学表达分析。
实施例2：胃癌组织中差异性miRNA的血清学分析
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年5月至2014年3月165例经病理诊断明确的胃癌患者和120例健康人清晨空腹静脉血6ml作为对照。所有胃癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗。120例健康对照组为未患有恶性肿瘤及其他疾病，同时年龄匹配的健康人群。
1.2血清样本采集及处理
抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4℃1300g(或4000rpm)离心15分钟，取上层血清每300μl分装至RNase-freeEP管置于-80℃冰箱储存。
1.3主要仪器设备
Eppendorfcentrifuge(美国)；水平层流洁净工作台(memert公司)；紫外分光光度计nano(Thermo科技)；水浴锅(memert公司)；定时定量PCR仪CFX96(德国BIO-RAD)；Vortex漩涡震荡仪(美国SI)；超低温冰箱(Thermo科技)；MilliQ纯水器(Synthesis公司)。
1.4主要实验试剂
血液总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司)；裂解液RLS；去蛋白液RE；漂洗液RW；RNase-freeH2O；70％乙醇；RNase-free吸附性RA；miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)；E.coliPoly(A)Polymerase(5U/ml)；10×Poly(A)PolymeraseBuffer；5×rATPSolution；10×RTPrime；10×RTBuffer；SuperPuredNTPMixture；Rnasin；QuantRTase；RNase–FreeddH2O；miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)；2×miRNApremix(SYBRROX)；Reverseprimer；50×ROXReferenceDye；Chloroform(Sigma公司)。
1.5引物设计
1.6实验方法
1.6.1血清样本总RNA提取
(1)每250μl血清加入750μl裂解液RLS，用加样枪吹打样品几次，裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3:1。
(2)将样品剧烈震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)4℃条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入新的RNasefree的离心管中。
(4)每毫升RLS加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并室温下放置3分钟。
(5)于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入RA柱中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl事先在65℃水浴中加热的RNasefreewater，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
1.6.2cDNA转录
在血清样品总RNA提取后，采用在miRNA3’末端加多聚A尾Poly(A)，再使用oligo(dT)-universaltag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。
1.6.2.1miRNA3’末端进行Poly(A)处理
(1)在冰上预冷RNasefree的反应管内加入以下试剂至总体积20μl(最后加入E.coliPoly(A)Polymerase)。
组分 体积(μl) 终浓度
总RNA 可达2μg
E.coli Poly(A)Polymerase 0.4 2U
10×Poly(A)Polymerase Buffer 2 1×
10×rATP solution 4 1×
RNase free ddH2O - -
总体积 20 -
(2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟，继续实验。
1.6.2.2Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应
按照下表组分进行反应液的配制
组分 体积(μl)
Poly(A)反应液 2
10×stem-loop RT Prime 2
10×RT Buffer 2
Super Pure dNTP Mixture 1
Rnasin 1
Quant RTase 0.5
RNase-Free ddH2O 11.5
总体积 20
1.6.3realtimeRT-PCR
(1)室温融化2×miRNApremix(SYBR)和Reverseprimer。
(2)将2×miRNApremix(SYBR)上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，轻轻微离心后使用。
(3)将试剂置于冰上，并按照下表配制反应体积。
组分 50μl体系 终浓度
2×miRNA premix(SYBR) 25 1×
Forward primer - 200nM
Reverse primer 1 200nM
miRNA第一链cDNA - -
ddH2O 至50μl -
PCR反应程序按照下表设置
循环 温度(℃) 时间 内容
1× 94 2min 起始模板变性
40-45× 94 20s PCR循环中模板变性
60 34s 退火、延伸
1.6.4PCR数据处理
PCR扩增结果用CT值来表示，CT值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△△CT方法计算，(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数，△CTsample＝CTsample–CTU6sample，△CTcontrol＝CTcontrol–CTU6control，△△CT＝△CTsample-△CTcontrol)。
1.7统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验，血清miRNA相对表达量与胃癌临床病理特征的关系采用MannWhiney检验及KruskalWallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1血清目标miRNA的realtimeRT-PCR检测
本研究对165例胃癌患者和120例健康对照组血清中目标miRNA表达情况进行了定量分析，采用U6作为内标，结果表明miRNA在血清中稳定表达，采用U6作为内参稳定可靠。
2.2胃癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况
对照组与胃癌组has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206、has-miR-224-5p及has-miR-10b-5p相对表达量比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
数据见下表。
组别 例数 has-miR-224-5p has-miR-100-5p has-miR-155-5p has-miR-206 has-miR-10b-5p
对照组 120 1.13±0.22 1.03±0.29 1.18±0.26 0.90±0.12 0.94±0.17
胃癌组 165 2.86±0.25 0.58±0.32 2.88±0.23 0.75±0.14 0.76±0.21
t值 - 2.552 2.694 2.548 2.371 2.395
P值 - 0.011 0.012 0.01 0.010 0.011
本发明利用miRNA芯片对8对胃癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行了分析，共筛选出23种差异性表达的miRNA，实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证，共筛选出10种差异性表达的miRNA，其中has-miR-155-5p、has-miR-224-5p、和has-miR-193b表达上调，has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-381、has-miR-132、has-miR-497、has-miR-99a、has-miR-10b-5p表达下调。肿瘤的发生是一系列分子生物学行为改变累计的结果，涉及到细胞周期、细胞凋亡、增殖分化等各个方面，因此应该有一系列miRNA表达的改变参与肿瘤的发生，基因芯片的结果验证了这一假设，多种miRNA的表达发生了改变。
表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206及has-miR-224-5p进行进一步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p和has-miR-206表达下调，has-miR-155-5p和has-miR-224-5p表达上调。该结果表明，这5种miRNA可以作为胃癌诊断的生物标志物。
实施例3：受试者工作特征曲线(ROC)分析
构建ROC曲线来比较5个血清miRNA区分胃癌病人和健康对照的诊断能力。5个miRNAROC曲线下面积(AUC)分别为：has-miR-10b-5p，0.840(95％置信区间：0.760-0.920)；has-miR-100-5p，0.819(95％置信区间：0.736-0.902)；has-miR-206，0.814(95％置信区间：0.734-0.894)；has-miR-155-5p，0.843(95％置信区间：0.765-0.920)；has-miR-224-5p，0.738(95％置信区间：0.644-0.832)。在最佳的cutoff值下，miRNA的灵敏度和特异性如下：has-miR-10b-5p，分别为83.3％和82.7％；has-miR-100-5p，分别为64.8％和94.2％；has-miR-206，分别为90.7％和61.5％；has-miR-155-5p，分别为70.4％和82.5％；has-miR-224-5p，分别为67.3％和74.1％。这5个miRNA联合起来的AUC可以达到0.973，灵敏度和特异性分别为92.3％和90.7％，明显优于单个miRNA。该结果表明，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p联合起来对胃癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。
实施例4：人胃癌诊断用试剂盒
上述实施例表明，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p联合起来对胃癌检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此，可基于has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p制作用于人胃癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括has-miR-10b-5p引物、探针；has-miR-100-5p引物、探针；has-miR-206引物、探针；has-miR-155-5p引物、探针；has-miR-224-5p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，该试剂盒中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。下表为引物和探针的一种设计。
引物和探针的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (9)

1.一组用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和has-miR-224-5p；所述has-miR-10b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述has-miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述has-miR-206的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述has-miR-155-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述has-miR-224-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于：所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
3.权利要求1或2所述的microRNA生物标志物在筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
4.一组人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于，所述microRNA引物、探针的组合包括：has-miR-10b-5p引物、探针；has-miR-100-5p引物、探针；has-miR-206引物、探针；has-miR-155-5p引物、探针；has-miR-224-5p引物、探针。
5.根据权利要求4所述的人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于：所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。
6.根据权利要求5所述的人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于：has-miR-10b-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-100-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-206的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-155-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；has-miR-224-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
7.权利要求4-6任一所述的人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
8.一种人胃癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求4-6任一所述的miRNA引物、探针的组合。
9.根据权利要求8所述的人胃癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
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