CN105177174A - 用于结肠癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于结肠癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒,所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成:hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p。本发明将结肠癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold,RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA?hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-30a-3p及hsa-miR-26a-5p进行血清学表达分析,结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达,血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-30a-3p表达下调,hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p表达上调。这5种miRNA可以作为结肠癌诊断的生物标志物,且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测,具体涉及用于人结肠癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
结肠癌是全球第三大常见的癌症,其发病率和死亡率仅次于肺癌。目前,唯一有效的治疗方式是手术,而在进展期结肠癌中其生存率也依赖化疗。早期结肠癌患者5年生存率约为90%,但晚期和转移性患者的总生存率仍无明显提高,仅为15%左右。大部分结肠癌患者没有特定预测疾病的危险因子,而目前国际通用预测预后的指标是肿瘤分期。因此,鉴于早期诊断的重要性,需要发现新的诊断标志物来早期发现肿瘤。
MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA,在进化上高度保守,数量约占基因组的1%,现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联系,其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋白质编码基因的表达:通过与其靶基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合,导致mRNA降解或抑制其翻译。人类基因组约30%的基因受miRNA调控,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随着miRNA与癌症关系的不断深入研究,发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段,还涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治疗顺势登上舞台,凸显出很大的研究价值。
目前,已经发现在结肠癌肿瘤组织、细胞系和正常组织中有100多种miRNA的特异表达。Wang等通过对大肠癌组织及其相应非肿瘤黏膜组织miR-195表达情况进行比较,发现miR-195在大肠癌组织中表达下调。在2个大肠癌细胞株HT29和LoVo中,上调miR-195的表达可以减少肿瘤细胞活力、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤形成,其机制与抗凋亡基因Bcl-2有关,表明miR-195有诱导肿瘤细胞凋亡作用。Ma等通过分析人大肠癌细胞株DLD-1中319种miRNA对细胞增殖和凋亡的影响,发现miR-491可诱导细胞凋亡并显著减弱细胞活力,揭示了miRNA在结肠癌的发生与进展中起着重要作用。
miRNA不仅在结肠癌的发生阶段起着重要的作用,在结肠癌的进展及转移阶段同样发挥着作用。根据东京大学回顾性研究指出,miR-2l高表达状态与肿瘤血管浸润、肝转移及肿瘤分期相关miR-155表达与结肠直肠癌淋巴结转移呈正相关,且这2种miRNA高表达的结肠直肠癌患者生存期较短。Agostini等的研究表明miR-20与结肠癌的进展密切相关。而Wang等通过对98例结肠癌患者研究表明,miR-31的表达与结肠癌患者的淋巴结转移以及肿瘤的侵袭性存在明显相关。一项中美两国的合作研究发现,通过联合检测血清CEA及miR-14l的表达,有助于发现结直肠癌远处转移,且miR-14l表达程度与肿瘤预后呈负相关。
不同的研究结果表明,miRNA在结肠癌组织及结肠正常组织中表达存在差异,而检测结肠癌肿瘤类型及分期相关的个体miRNA的表达差异或许将成为结肠癌诊断的一个有效策略。目前对结肠癌的诊断和分期主要依赖于组织学和放射成像。前者取决于组织病理学判断,初步诊断不仅耗时,且对淋巴结的组织学检查很容易忽视微小转移,导致切除的肿瘤不能准确分期;后者的安全性和检查成本亦值得考虑。基于miRNA的诊断技术,从另一方面提供了更快速的活检初步诊断和更精确的分期,亦不会对患者造成创伤,能加快对结肠癌的检测,对常规组织学检验亦能提供有益的参考。
发明内容
本发明的目的在于提供用于结肠癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
一组用于人结肠癌诊断的microRNA生物标志物,所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成:hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p;所述hsa-miR-381-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述hsa-miR-126-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;所述hsa-miR-30a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;所述hsa-miR-19b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;所述hsa-miR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
进一步地,所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
所述的microRNA生物标志物在筛选人结肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。
一组人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合,所述microRNA引物、探针的组合包括:hsa-miR-381-3p引物、探针;hsa-miR-126-5p引物、探针;hsa-miR-30a-3p引物、探针;hsa-miR-19b-3p引物、探针;hsa-miR-26a-5p引物、探针。
进一步地,所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。
进一步地,hsa-miR-381-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-126-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-30a-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-19b-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-26a-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
所述的人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人结肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。
一种人结肠癌的肿瘤诊断试剂盒,包括所述的miRNA引物、探针的组合。
进一步地,所述的人结肠癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
本发明的优点:
本发明将结肠癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold,RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNAhsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-30a-3p及hsa-miR-26a-5p进行血清学表达分析,结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达,血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-30a-3p表达下调,hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p表达上调。这5种miRNA可以作为结肠癌诊断的生物标志物,且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
附图说明
图1-图5分别显示hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p单独用于区分结肠癌样本和正常对照的ROC曲线;
图6显示为hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p联合用于区分结肠癌样本和正常对照的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如教科书和实验指南中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:结肠癌组织差异性miRNA的筛选
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后,收集南京鼓楼医院2013年1月-2014年1月经病理证实为结肠癌患者手术后标本8对,包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围的癌旁组织,所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
1.2主要仪器设备
台式离心机:EppendorfMinispin(美国)Eppendorfcentrifuge5810R(美国)
核酸浓缩仪:Eppendorfconcentrator5301(美国)
紫外分光光度计:DU640、天平(Beckman公司产品)
紫外交联仪:GSGENELINKERUVChamber(BIO-RAD公司产品)
水浴锅(Memert公司产品)
杂交盒、芯片、芯片扫描仪:LuxScan-10K/A(Capitalbio公司产品)
水平摇床:TDK-2(北京通达科技有限公司)
凝胶成像分析仪:GDS-7600(UPV产品)
超净工作台(Memert公司产品)
实时荧光PCR仪:ABIPRISM7500(美国)
1.3主要实验试剂
Trizol、糖原(Invitrogen公司);T4RNA连接酶(NEB公司);ControlRNA(Capitalbio公司);5P’-C-U-Cy3-3’5P’-C-U-Cy5-3’(Dharmacon公司);Ambion’smiRNAIsolationKit(Ambion公司);EDPC、甲酞胺、澳酚蓝(Sigma公司);20×SSC、10%SDS(PIERCE公司);50×Dhardt’s(鼎国);MOPS(Bocherigmer公司);5×RTBuffer(美国Promega公司)、M-MLV逆转录酶:200u/μl(美国Promega公司);4×dNTP:10mMeach(上海生工生物工程有限公司);RNase抑制剂40u/μl(大连宝生物工程有限公司)。
1.4组织标本总RNA的提取
Trizol一步法提取组织标本中的总RNA。具体步骤如下:
(1)准备研钵、匀聚器、勺子、剪刀、镊子、液氮等器材和试剂;
(2)研钵预冷:往研钵内反复加入液氮,至少4-5次,使研钵充分预冷;
(3)带上手套,口罩,迅速从液氮罐中用镊子取出样本,在分析天平中称重,一次提取的组织块重量在0.3-0.5g之间。组织块放入用液氮预冷的研钵中进行研磨,边研磨边加液氮,整个过程都不要使组织块融化。
(4)粗研磨后,在超净工作台中,用小勺迅速将研碎的组织移入装有Trizol试剂的勾装器中,按100mg组织加入1mlTrizol,匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。
(5)用滴管将匀浆液转移到1.5ml离心管中,每管放入约,室温放置以上,保存至-80℃冰箱中直至分析。
(6)匀浆标本常温解冻,按0.2ml氯仿/1mlTrizol的比例加入氯仿,vortex30秒,室温放置3min,然后4℃,12000rpm离心15min。
(7)离心后溶液分层,分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相。RNA仅存在水相中,用加样器将上清转移到另一新的1.5ml离心管中,不要吸取中间层。按0.5ml异丙醇/1mlTrizol的比例加入异丙醇,混匀,室温放置10min以上,12000rpm4℃离心15min。
(8)弃去上清,异丙醇不要回流过多,可再短暂离心,用加样器将剩余的异丙醇吸出,加入1ml75%乙醇,vortex,7500rpm4℃离心5min。
(9)弃去75%乙醇,通风橱中自然干燥30min,不要真空离心干燥,RNA不要完全干透,以防不能完全溶解,用DEPC水溶解RNA,每管溶于30μl,60-65℃助溶5min。
(10)RNA定量,吸取1μl的RNA样品,加入49μlDEPC水中,用加样器上下吹打混匀,稀释50倍。用溶解RNA的DEPC水标记空白,吸取50μl加入比色杯中。用紫外分光光度计DU-640测量OD值,计算比值OD260/OD280比值和RNA浓度。
RNA浓度=OD260×40μg/ml×稀释倍数。
1.5总RNA中miRNA的分离提取
取50-100μg总RNA用Ambion’smiRNAIsolationKit分离miRNA,具体步骤如下:
(1)取50-100μg总RNA加入EP管,定容至适量体积。加入5倍体积的Lysis/BindingBuffer,混匀。
(2)加十分之一体积的miRNAHomogenateAdditive,振荡混匀,置于冰上孵育10分钟。
(3)加三分之一体积的100%乙醇,充分混勾。
(4)将上述混合液加入滤管中,5000rpm离心1分钟,收集滤液(小RNA在滤液中)。
(5)在滤液中加入三分之二体积的100%乙醇,充分混匀。
(6)更换滤管,将步骤(5)的混合物进行过滤,5000rpm离心1分钟,弃去滤液,收集管继续使用。
(7)将滤管放在收集管中,用700μl的miRNAwashingsolution1洗滤管,5000rpm离心1分钟,弃去滤液。
(8)用500μl的miRNAwashingsolution2洗滤管,5000rpm离心1分钟,弃去滤液;再用miRNAwashingsolution2洗一遍;将滤管连同收集管10000rpm离心1分钟,除去滤管中残留的液体。
(9)将elutionsolution加热到95℃;更换一个新的收集管,将50μl95℃的elutionsolution加入滤器,合上盖子,室温孵育2分钟;10000rpm离心1分钟,收集滤液,小RNA在滤液中。重复步骤(9)。
1.6miRNA芯片筛选
1.6.1miRNA芯片
哺乳动物miRNA芯片V3.0针对人677、大鼠292、小鼠461个成熟microRNA,由于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列,取三者的并集,一共设计了924条探针(sangermiRNA数据库:miRNABase10.0)。把这些探针用芯片点样仪Smart-ArrayTM(CapitalbioCorp,Beijing,China)点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括人的U6、tRNA作为内标;8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的外标(Zip5、Zip13、Zip15、Zip21、Zip23、Zip25、Y2、Y3),Hex作为点样阳性对照,,50%DMSO作为杂交阴性对照。
1.6.2miRNA样品的荧光标记
具体步骤如下:
(1)miRNA的荧光标记:取2-5μg癌组织miRNA经聚乙二醇沉淀,用0.1mgATP、50mMHEPES、3.5mMDDT、20mMMgCl2、10mg/mlBSA、10%DMSO、500ngCy3标记的5P’-C-U-Cy3-3’(来自Dharmacon公司)和20单位的T4RNA连接酶,用枪头吹打,轻轻混匀。锡纸包裹样品管,在0℃标记反应2小时。同理用Cy5标记癌旁组织miRNA。两种标记后的miRNA混匀。
(2)miRNA的纯化:在上述荧光标记后的样品内加入DEPC水,补齐至100μl,加入十分之一体积-20℃预冷的3mmol/L醋酸钠(pH5.2)10μl、糖原10μg、2.5倍体积无水乙醇,于-20℃静置1小时。
(3)miRNA沉淀的漂洗:弃去上清,加入-20℃预冷的75%乙醇800μl,充分混匀后4℃下12000rpm离心5分钟。重复2次。弃去上清,在空气中干燥10min,吹干后用于芯片杂交。
1.6.3miRNA芯片杂交
具体步骤如下:
(1)将RNA溶于16μl杂交液中(15%甲酰胺2.4μl;0.2%SDS3.2μl;3×SSC2.4μl;50×Denhardt’s1.6μl,DEPC处理水6.4μl)。
(2)恒温金属浴加温,溶解,振荡,混匀。
(3)取出,放置-20℃冰箱内10分钟,使之降温。
(4)95℃变形3min。
(5)冰上迅速冷却,全部滴加到哺乳动物microRNA芯片V3.0上,加盖硅化盖玻片。
(6)杂交盒内消毒后经双蒸水湿润的滤纸保持湿度,42℃杂交过夜,通常16小时以上。
(7)杂交结束后,先在42℃左右含0.2%SDS、2×SSC的液体摇床中漂洗4分钟,而后在室温中含有0.2×SSC液体摇床中室温洗4分钟,玻片置于管中,1600rpm离心1分钟甩干后即可用于扫描。
1.6.4芯体扫描及数据处理
芯片用Luxscan10K/A双通道激光扫描仪(Capitalbio公司)进行扫描。数据提取采用Luxscan3.0图像分析软件(Capitalbio公司)对芯片图像分析,把图像信号转化为数字信号。
1.7miRNA芯片结果realtimeRT-PCR验证
1.7.1miRNArealtimeRT-PCR引物设计
特异的茎环引物(反转录引物序列)约56个核苷酸,其5’端的48个核苷酸序列是固定的,形成一个茎环的结构,其3’端的8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物(PCR前引物)长约30-31个核苷酸,在3’端有约16-17个核苷酸与对应的microRNA互补,而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物(PCR后引物)约为23nt,其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构,而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
1.7.2miRNArealtimeRT-PCR
1.7.2.1cDNA逆转录合成
组织标本总RNA逆转录合成cDNA,反应体系如下:
组分 | 体积(单位:μl) |
总RNA模板 | 1μg(根据浓度计算体积) |
Stem-loop RT primer(500nM) | 1 |
5×RT Buffer | 2 |
100mM DTT | 1 |
dNTPs(10mMeach) | 0.5 |
RNase抑制剂(40U/μl) | 0.1 |
M-MLV(200U/μl) | 1 |
加DEPC水 | 至10μl |
反应条件:16℃,30min;42℃,60min;85℃,5min;4℃,hold。
1.7.2.1miRNArealtimeRT-PCR反应
miRNArealtimeRT-PCR反应体系如下:
组分 | 体积(单位:μl) |
SYBRR Premix Ex TaqTM(2×) | 12.5 |
正向引物10μM | 0.5 |
反向通用引物μM | 0.5 |
ROX Reference Dye Ⅱ(50×) | 0.5 |
DNA模板(稀释10倍) | 2 |
DEPC处理水 | 至25 |
反应条件:95℃预变性10min;95℃5s、60℃34s×40。
1.8统计学分析
基因芯片筛选的结果采用Cluster3.0和SignificanceAnalysisofMicroarrys(SAM,version2.1)进行分析。数据以(±表示,组间比较采用检验,采用软件进行分析处理,为差异有统计学意义。RealtimeRT-PCR数据以(x±s)表示,组间比较采用t检验,采用SPSS17.0软件进行分析处理,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1miRNA基因芯片筛选结果
利用miRNA芯片对8对结肠癌组织及配对的癌旁组织中924种miRNA表达情况进行分析,共筛选出18种差异性表达的miRNA,其中hsa-miR-19b-3p、has-miR-193b、hsa-miR-26a-5p表达上调,has-miR-145、has-miR-381-3p、has-miR-132、hsa-miR-30a-3p、has-miR-199b-5p、hsa-miR-126-5p、has-miR-335、has-miR-497、has-miR-99a、has-miR-125b、has-let-7b、has-miR-10a、has-miR-143、has-miR-125a-5p、rno-miR-324-3p表达下调。
2.2miRNA基因芯片筛选结果的realtimeRT-PCR验证
用miRNArealtimeRT-PCR对芯片筛查的结果进行验证,共筛选出8种差异性表达的miRNA,其中,has-miR-19b-3p、has-miR-193b和has-miR-26a-5p表达上调,hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、has-miR-381-3p、has-miR-132、has-miR-99a表达下调。对其中表达差异性明显的5种miRNA,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-30a-3p及hsa-miR-26a-5p进行进一步的血清学表达分析。
实施例2:结肠癌组织中差异性miRNA的血清学分析
1对象和方法
1.1标本来源
在取得患者知情同意后,收集南京鼓楼医院2013年5月至2014年3月165例经病理诊断明确的结肠癌患者和120例健康人清晨空腹静脉血6ml作为对照。所有结肠癌患者均为初次确诊患者,取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗。120例健康对照组为未患有恶性肿瘤及其他疾病,同时年龄匹配的健康人群。
1.2血清样本采集及处理
抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中,静置30分钟,于4℃1300g(或4000rpm)离心15分钟,取上层血清每300μl分装至RNase-freeEP管置于-80℃冰箱储存。
1.3主要仪器设备
Eppendorfcentrifuge(美国);水平层流洁净工作台(memert公司);紫外分光光度计nano(Thermo科技);水浴锅(memert公司);定时定量PCR仪CFX96(德国BIO-RAD);Vortex漩涡震荡仪(美国SI);超低温冰箱(Thermo科技);MilliQ纯水器(Synthesis公司)。
1.4主要实验试剂
血液总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克公司);裂解液RLS;去蛋白液RE;漂洗液RW;RNase-freeH2O;70%乙醇;RNase-free吸附性RA;miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN);E.coliPoly(A)Polymerase(5U/ml);10×Poly(A)PolymeraseBuffer;5×rATPSolution;10×RTPrime;10×RTBuffer;SuperPuredNTPMixture;Rnasin;QuantRTase;RNase–FreeddH2O;miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN);2×miRNApremix(SYBRROX);Reverseprimer;50×ROXReferenceDye;Chloroform(Sigma公司)。
1.5引物设计
1.6实验方法
1.6.1血清样本总RNA提取
(1)每250μl血清加入750μl裂解液RLS,用加样枪吹打样品几次,裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3:1。
(2)将样品剧烈震荡混匀,室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)4℃条件下12000rpm离心10分钟,小心取上清转入新的RNasefree的离心管中。
(4)每毫升RLS加0.2ml氯仿,盖紧样品管盖,剧烈震荡15秒并室温下放置3分钟。
(5)于4℃12000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70%乙醇,颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入RA柱中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10000rpm离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45秒,弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW,12000rpm离心60秒,弃掉废液。
(10)加入700μl漂洗液RW,12000rpm离心60秒,弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中,12000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA,放入一个RNasefree离心管中,在吸附膜的中间部位加30μl事先在65℃水浴中加热的RNasefreewater,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟,将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。
1.6.2cDNA转录
在血清样品总RNA提取后,采用在miRNA3’末端加多聚A尾Poly(A),再使用oligo(dT)-universaltag通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成miRNA对应的cDNA第一链。
1.6.2.1miRNA3’末端进行Poly(A)处理
(1)在冰上预冷RNasefree的反应管内加入以下试剂至总体积20μl(最后加入E.coliPoly(A)Polymerase)。
组分 | 体积(μl) | 终浓度 |
总RNA | 可达2μg | |
E.coli Poly(A)Polymerase | 0.4 | 2U |
10×Poly(A)Polymerase Buffer | 2 | 1× |
10×rATP solution | 4 | 1× |
RNase free ddH2O | - | - |
总体积 | 20 | - |
(2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在37℃反应60分钟,继续实验。
1.6.2.1Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应
按照下表组分进行反应液的配制
组分 | 体积(μl) |
Poly(A)反应液 | 2 |
10×stem-loop RT Prime | 2 |
10×RT Buffer | 2 |
Super Pure dNTP Mixture | 1 |
Rnasin | 1 |
Quant RTase | 0.5 |
RNase-Free ddH2O | 11.5 |
总体积 | 20 |
1.6.3realtimeRT-PCR
(1)室温融化2×miRNApremix(SYBR)和Reverseprimer。
(2)将2×miRNApremix(SYBR)上下颠倒轻轻混匀,避免起泡,轻轻微离心后使用。
(3)将试剂置于冰上,并按照下表配制反应体积。
组分 | 50μl体系 | 终浓度 |
2×miRNApremix(SYBR) | 25 | 1× |
Forward primer | - | 200nM |
Reverse primer | 1 | 200nM |
miRNA第一链cDNA | - | - |
ddH2O | 至50μl | - |
PCR反应程序按照下表设置
循环 | 温度(℃) | 时间 | 内容 |
1× | 94 | 2min | 起始模板变性 |
40-45× | 94 | 20s | PCR循环中模板变性 |
60 | 34s | 退火、延伸 |
1.6.4PCR数据处理
PCR扩增结果用CT值来表示,CT值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△△CT方法计算,RQ=2-△△CT(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数,△CTsample=CTsample–CTU6sample,△CTcontrol=CTcontrol–CTU6control,△△CT=△CTsample-△CTcontrol)。
1.7统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行数据处理,计量资料以(x±s)表示,组间比较采用t检验,血清miRNA相对表达量与结肠癌临床病理特征的关系采用MannWhiney检验及KruskalWallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1血清目标miRNA的realtimeRT-PCR检测
本研究对165例结肠癌患者和120例健康对照组血清中目标miRNA表达情况进行了定量分析,采用U6作为内标,结果表明miRNA在血清中稳定表达,用U6作为内参稳定可靠。
2.2结肠癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况
对照组与结肠癌组hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-26a-5p及hsa-miR-381-3p相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
数据见下表。
组别 | 例数 | hsa-miR-26a-5p | hsa-miR-126-5p | hsa-miR-19b-3p | hsa-miR-30a-3p | hsa-miR-381-3p |
对照组 | 120 | 1.13±0.22 | 1.03±0.29 | 1.18±0.26 | 0.90±0.12 | 0.94±0.17 |
结肠癌 | 165 | 2.86±0.25 | 0.58±0.32 | 2.88±0.23 | 0.75±0.14 | 0.76±0.21 |
t组值 | - | 2.552 | 2.694 | 2.548 | 2.371 | 2.395 |
P值 | - | 0.011 | 0.012 | 0.01 | 0.010 | 0.011 |
本发明利用miRNA芯片对8对结肠癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行了分析,共筛选出18种差异性表达的miRNA,实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证,共筛选出8种差异性表达的miRNA,其中,has-miR-19b-3p、has-miR-193b和has-miR-26a-5p表达上调,hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、has-miR-381-3p、has-miR-132、has-miR-99a表达下调。肿瘤的发生是一系列分子生物学行为改变累计的结果,涉及到细胞周期、细胞凋亡、增殖分化等各个方面,因此应该有一系列miRNA表达的改变参与肿瘤的发生,基因芯片的结果验证了这一假设,多种miRNA的表达发生了改变。
表达差异明显(差异表达量大于2个fold,RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-30a-3p及hsa-miR-26a-5p进行进一步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达,血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-30a-3p表达下调,hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p表达上调。该结果表明,这5种miRNA可作为结肠癌诊断的生物标志物。
实施例3:受试者工作特征曲线(ROC)分析
构建ROC曲线来比较5个血清miRNA区分结肠癌病人和健康对照的诊断能力。5个miRNAROC曲线下面积(AUC)分别为:hsa-miR-381-3p,0.840(95%置信区间:0.760-0.920);hsa-miR-126-5p,0.819(95%置信区间:0.736-0.902);hsa-miR-30a-3p,0.814(95%置信区间:0.734-0.894);hsa-miR-19b-3p,0.843(95%置信区间:0.765-0.920);hsa-miR-26a-5p,0.738(95%置信区间:0.644-0.832)。在最佳的cutoff值下,miRNA的灵敏度和特异性如下:hsa-miR-381-3p,分别为83.3%和82.7%;hsa-miR-126-5p,分别为64.8%和94.2%;hsa-miR-30a-3p,分别为90.7%和61.5%;hsa-miR-19b-3p,分别为70.4%和82.5%;hsa-miR-26a-5p,分别为67.3%和74.1%。这5个miRNA联合起来的AUC可以达到0.973,灵敏度和特异性分别为92.3%和90.7%,明显优于单个miRNA。该结果表明,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p联合起来对结肠癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。
实施例4:人结肠癌诊断用试剂盒
上述实施例表明,hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p联合起来对结肠癌检测具有非常高的灵敏度和特异性,因此,可基于hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p制作用于人结肠癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括hsa-miR-381-3p引物、探针;hsa-miR-126-5p引物、探针;hsa-miR-30a-3p引物、探针;hsa-miR-19b-3p引物、探针;hsa-miR-26a-5p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然,该试剂盒中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。下表为引物和探针的一种设计。
引物和探针的设计是本领域常规技术手段,可以设计成其他序列。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (9)
1.一组用于人结肠癌诊断的microRNA生物标志物,其特征在于,所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成:hsa-miR-381-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-26a-5p;所述hsa-miR-381-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述hsa-miR-126-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;所述hsa-miR-30a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;所述hsa-miR-19b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;所述hsa-miR-26a-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的用于人结肠癌诊断的microRNA生物标志物,其特征在于:所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
3.权利要求1或2所述的microRNA生物标志物在筛选人结肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。
4.一组人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合,其特征在于,所述microRNA引物、探针的组合包括:hsa-miR-381-3p引物、探针;hsa-miR-126-5p引物、探针;hsa-miR-30a-3p引物、探针;hsa-miR-19b-3p引物、探针;hsa-miR-26a-5p引物、探针。
5.根据权利要求4所述的人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合,其特征在于:所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。
6.根据权利要求5所述的人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合,其特征在于:hsa-miR-381-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.6所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.7所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-126-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-30a-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.10所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.11所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-19b-3p的反转录引物序列如SEQIDNO.12所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.13所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;hsa-miR-26a-5p的反转录引物序列如SEQIDNO.14所示,定量PCR前引物序列如SEQIDNO.15所示,定量PCR后引物序列如SEQIDNO.16所示;各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。
7.权利要求4-6任一所述的人结肠癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人结肠癌的肿瘤诊断药物中的用途。
8.一种人结肠癌的肿瘤诊断试剂盒,其特征在于:包括权利要求4-6任一所述的miRNA引物、探针的组合。
9.根据权利要求8所述的人结肠癌的肿瘤诊断试剂盒,其特征在于:还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
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