CN102770560A - 用于早期检测结直肠癌的基于血浆的微rna生物标记及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了血液中分子标记物的诊断试剂盒，其用于诊断结直肠癌、监测治疗结直肠癌的疗效。所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子中的一或多种的在患者的血浆中和在健康对照中差异表达，且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在结直肠癌的指征。本发明还通过相应的方法，其使用这种核酸表达生物标记来鉴别结直肠癌以及预防或治疗此病症。最后，本发明提供了用于预防和/或治疗结直肠癌的药物组合物。

Description

用于早期检测结直肠癌的基于血浆的微RNA生物标记及方法

发明领域

本发明涉及结直肠癌(CRC)患者的血浆中经验证的生物标记以及相应的方法，用于通过筛选高风险个体来早期检测CRC、早期检测癌症复发以及监测结直肠癌患者的疗效。

发明背景

结直肠癌(CRC)是人类最为严重的恶性肿瘤，2009年全世界约有167,900例新发病例。它是世界第三大常见恶性肿瘤，病死率位于恶性肿瘤中的第四位(Gryfe,R.et al.(1997)Curr Probl Cancer 21,233-300;Petersen,G.M.et al.(1999)Cancer 86,2540-2550)。若能在病变进展的早期诊断，CRC是可治愈的。但在疾病早期，大部分患者没有疾病的表现症状，因此筛查对于早期发现CRC是有必要的。证据表明早期发现结直肠癌可以明显降低其发病率和致死率(Anwar,R.(2006)Digestive and Liver Disease 34,279–282)。

起初，CRC以肠上皮细胞出现过度增生(非典型增生)为特征，病变首先在结肠或直肠内膜形成炎性腺瘤状息肉，后变成异常的赘生物腺瘤(即良性肿瘤)。一般情况下，腺瘤形成后(60岁时发病率约为60-70%)仅有一小亚群细胞恶变成为恶性的腺癌，而超过95%的CRC病例已被证明是腺癌(Muto,T.et al.(1975)Cancer 36,2251-2270;Fearon,E.R.and Vogelstein,B.(1990)Cell 61,759-767)。

分子学研究显示，结肠癌发生的病因缘于多种表观遗传学和遗传学该变的积累，包括激活K-ras原癌基因的突变、激活APC和p53肿瘤移植基因和DNA修复基因的突变等(参见例如Forrester,K.et al.(1987)Nature 327,298-303;Baker,S.J.et al.(1989)Science 244,217-221)。

基因组不稳定是从腺瘤发展成腺癌的另一关键步骤，并且在CRC中以两种方式发生(Lengauer,C.et al.(1997)Nature 386,623-627)。DNA错配修复缺陷导致小随体不稳定,造成了从腺瘤发展成腺癌病历中的15%(Umar,A.et al.(2004)J.Natl.Cancer Inst.96,261-268;di Pietro,M.et al.(2005)Gastroenterology 129,1047-1059)。在其它85%中,基因组不稳定以染色体水平(CIN)发生,导致了非整倍性。CRC中经常报道的染色体异常有7pq、8q、13q、和20q的增加和4pq、5q、8p、15q、17p和18q的损失(Douglas,E.J.et al.(2004)Cancer Res.64,4817-4825)。

然而,迄今为止还没有找到特异性的分子标记物能被用于可靠地诊断CRC，特别是已被证实为腺癌的CRC，和/或正从良性腺瘤转变成为恶性肿瘤这一进程中的CRC,尽管cDNA微阵列分析揭示了一组明显与CRC发展有牵扯的差异表达的基因(Kitahara,O.et al.(2001)Cancer Res.61,3544-3549)

此种分子标记物的鉴别以及对配套的临床测试的开发将具有极大的临床重要性，特别是如果这些标记物能使得在肿瘤发展的早期进行诊断，从而允许癌症的早期治疗。理想的是这些标记物应该能使得在恶性细胞的存在尚不能由原位技术或活检或切除材料的显微镜分析检测到的阶段就能鉴定癌症。

现有的CRC标准筛查方法包括结肠镜和粪便隐血测试。但是这两项测试都有严重的缺陷。结肠镜检查是有效的，但是多数人因为其高费用、带来的很大不适以及潜在的更多副作用而不愿意接受这项检查。另一方面，粪便隐血测试简单且花费低却相对不够准确。然而，目前还没有使得能够可靠地诊断CRC的特异性的分子标记。

许多诊断试验也被限制了，它们是通常基于分析仅仅单个分子标记物，这可能影响检测可靠性和/或精确性。另外，单个标记物通常不能进行有关潜伏期、肿瘤发展等的详细预测。因此，仍然持续需要鉴定其它的分子标记物和克服这些限制的其他测定形式。

一个解决这个问题的方法可能基于小的调节性RNA分子尤其是微RNA(miRNA)，其组成了进化保守的内源性表达的小型非翻译性的长度为20-25核苷酸(nt)的RNA。从10年前发现以来，认为其可介导目标mRNA的表达并因此具有参与细胞发生、分化、增殖和凋亡的重要功能。(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature 431,350-355;He.L.etal.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。此外，作为25种癌症生物标记，miRNA由于在体外很稳定且在体内长寿而相较于mRNA更具有优势(Lu,J.etal.(2005)Nature 435,834-838;Lim,L.P.et al.(2005)Nature 433,769-773)。

miRNA来源于初级转录过程中由RNase III Drosha加工成的茎环结构前体(pre-miRNA)。运输到胞浆以后，另一种称为Dicer的RNaseIII将pre-miRNA发夹环切成短的双链RAN(dsRNA),其中一条链成为miRNA蛋白(miRNP)中的成熟miRNA。miRNA引导miRNP到其能发挥功能的目标mRNA(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292;He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。

根据miRNA和目标的互补程度，miRNA可引导不同的调控过程。与miRNA高度互补的目标mRNA被与干扰RNA(RNAi)相同的结构特异性地切割。因此，在这种情形下，miRNA的作为小干扰RNA(siRNA)发挥功能。与miRNA互补程度较低的目标mRNA同样被引导到细胞退化通路或者在不影响mRNA水平的的情况下被翻译抑制。但是，miRNA抑制目标mRNA的翻译的机制仍然具有争议。现有数据表明miRNA可作为肿瘤基因或者肿瘤抑制基因而在癌症中发挥作用，例如癌症中过度表达的mir-17-92可能作为肿瘤基因发挥功能并通过下调肿瘤抑制基因和/或控制细胞分化或凋亡的基因从而促进癌症的发展。同样，let-7a的低表达，其发挥肿瘤抑制基因功能，可能通过调控肿瘤基因和/或控制细胞分化或凋亡的基因从而抑制癌症(Zhang,B.(2007)Dev Biol 302,1-12)。表明它们在癌症发生和发展中发挥作用。

高通量miRNA定量技术例如miRNA微阵列，基于实时RT-PCR的TaqMan miRNA测定等等为研究整个癌基因组的整体miRNA谱提供了有力手段。越来越多的证据表明多种miRNA在人类癌症包括白血病、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌和卵巢癌中表现异常，且在正常组织和癌组织中表达情况不同。(Zhang,L.25(2008)Adv Exp Med Biol 622,69-78)。因此，miRNA谱被用作发现多种癌症的标志，表明其将有助于进一步确定分子诊断、预后和治疗。人类癌症中异常的miRNA表达表明这些miRNA作为生物标记和分子治疗目标的潜力。

在多种可能类型的样本中，血液被认为是筛查高风险个体的理想样本，由于其可以通过最小侵入方式收集到，可以早期发现、诊断、监测和有效治疗癌症。已经表明肿瘤来源的miRNA可通过内源性RNase的作用保护下以非常稳定的形式存在于人类血浆或者血清中。这些血浆或血清中肿瘤来源的miRNA可作为发现癌症的生物标记并达到可测的水平。此外，血浆和血清的miRNA水平相关性大，表明血浆或者血清样本都可以用来作为临床以miRNA作为癌症预后的生物标记的样本选择类型(Mitchell,P.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105,10513–10518;Gilad,S.et al.(2008)PLoSONE 3,e3148;Chen,X.et al.(2008)Cell Res 18,997-10 1006)。

一些研究报导了人类结直肠癌病例的血浆或血清中的miRNA表达谱(Chen,X.(2008)Cell Res 18,997-1006;Ng,E.K.O.(2009)Gut 58,1375–1381;Huang,Z.2009,Int J Cancer，published on line)。在健康个体中发现超过100种循环miRNA(Mitchell,P.S.(2008)Proc Natl Acad Sci USA105,10513–10518)，并且此谱与具有多种肿瘤特异性miRNA的结直肠癌病人的miRNA谱有很大不同。Chen等人证明了存在于结直肠癌病人血清中而不存在于正常对照组血清中的69种miRNA(Chen,X.(2008)Cell Res18,997-1006)。此外，他们发现了存在于结直肠癌而不存在于另外的癌症组(肺癌)血清中的14种miRNA的独特表达谱。Ng等人的研究表明miR-92在CRC病例的血浆中显著升高，并且具有作为CRC筛查的非侵入性分子标记的潜力(E.K.O.(2009)Gut 58,1375–1381)。此外，Huang等人发现血浆miR-29a具有作为早期发现CRC的新的非侵入性生物标记的很大潜力(Huang,Z.2009,Int J Cancer.published on line)。但是，另一项研究发现has-miR-92a在急性白血病病人血浆中显著下降，并且血浆中miR-92a/miR-638比例具有作为检测白血病的新生物标记的很大潜力(Tanaka,M.et al.(2009)PLoS ONE 4,e5532)。但是，由于缺乏足够的敏感性和特异性，单一的miRNA不适于作为准确的诊断生物标记用于临床应用。

因此，仍然有必要发现一组结直肠癌病人血浆中或者血清中诊断miRNA标记。结合多种miRNA生物标记的基于血液的miRNA谱(特征)的确定会使非侵入性、快速的、精确的且经济的确定结直肠癌病人的方法成为可能。此外，还一直需要在高风险个体中针对早期阶段的相应方法即结直肠癌筛查、癌症复发的早期检测、和/或监测癌症治疗。

发明目的和发明概述

本发明的目的是经验证的miRNA生物标记，用于通过筛选高风险个体来早期检测CRC、早期检测癌症复发以及监测结直肠癌患者的疗效，其中通过确定血液中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中与健康对照相比，结直肠癌患者血浆中一种或多种多核酸分子差异表达，其中损失一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是结直肠癌的存在以及治疗效果的指征。

此外，本发明的目的是提供相应的方法，用于鉴定展现出结直肠癌的血液标本中一或多种核酸表达生物标记。

这些及其它将从以下描述变得清楚的目的，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。

在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在结直肠癌的指征。

本文限定的核酸表达生物标记可包括至少8种核酸分子，优选至少4组核酸分子组。

在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。

在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7、hsa-miR-93、hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p和hsa-miR-331-3p的任意一或多种核酸分子。

为了将编码微RNA序列的核酸表达生物标记中所获得的表达水平归一化，可使用编码hsa-miR-1238的核酸表达分子，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

特别优选地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7和hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而hsa-miR-1238的表达不变。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-345/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-345、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-331-3p和hsa-miR-16-2*/hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸组合。

特别优选地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-345、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-331-3p    和hsa-miR-16-2*/hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子组合的表达被上调；而编码hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*,、hsa-miR-345/hsa-miR-16-2*和hsa-miR-25/hsa-miR-16-2*的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。

在进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码组1(hsa-miR-25/hsa-miR-1228、hsa-miR-93/hsa-miR-1228和hsa-miR-331-3p/hsa-miR-1228)、组2(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-1228、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345和hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*)、组3(hsa-miR-345/hsa-miR-1228、hsa-miR-7/hsa-miR-345和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25)和组4(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-7/hsa-miR-93和hsa-miR-93/hsa-miR-1228)的任意一或多种核酸分子组合。

在第二方面，本发明涉及用于将腺瘤(癌症前损伤)和结直肠癌患者的所有阶段与健康个体进行区分的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆和在一或多个健康个体中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠腺瘤、Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌存在的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少一种核酸分子组合。

在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多个健康个体中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多个健康个体中相比被下调。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-7/hsa-miR-25的一种核酸分子组合。

特别优选地，与一或多个健康个体相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-7/hsa-miR-25的核酸分子组合的表达被上调。

在第三方面，本发明涉及用于将结直肠癌患者的所有阶段与健康个体进行区分的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆和在一或多个健康个体中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌存在的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少三种核酸分子组合。

在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多个健康个体中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多个健康个体中相比被下调。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93/hsa-miR-1228、hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*和hsa-miR-7/hsa-miR-93的一或多种核酸分子组合。

特别优选地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-7/hsa-miR-93的核酸分子组合的表达被上调；而编码hsa-miR-93/hsa-miR-1228和hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。

在第四方面，本发明涉及用于监测结直肠癌患者治疗效果的分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子在治疗前和治疗后的的一或多种目标血浆中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠癌患者治疗效果的的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少三种核酸分子。

在优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在治疗后的一或多种目标血浆中与治疗前的对照血浆相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在治疗后的一或多种目标血浆中与治疗前的对照血浆相比被下调。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-345、hsa-miR-25和hsa-miR-93的一或多种核酸分子。

特别优选地，与治疗前的一或多个对照血浆相比，在治疗后的所述一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-345、hsa-miR-25和hsa-miR-93的一或多种核酸分子的表达被上调。

在第五方面，本发明涉及鉴别展现结直肠癌的一或多种目标血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是结直肠癌存在的指征。

在第六方面，本发明涉及用于监测结直肠癌患者治疗效果的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达生物标记；及(b)在血液中监测所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

在第七方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在血液中鉴别核酸表达生物标记；及(b)在血液中改变所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

在第八方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中结直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

最后，在第九方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途。

本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。

附图简述

图1：示出流程图，其系统地阐明了参照本发明的方法来确定表达生物标记的基本方法步骤，用于用于通过筛选高风险个体来早期检测CRC、早期检测癌症复发以及监测结直肠癌患者的疗效。

图2A：示出在本发明第一方面的微阵列上获得的特别优选的miRNA生物标记中所包含的人类miRNA，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。各个数据针对内部稳定对照has-miR-1238进行了归一化。图中还示出与健康对照相比，结直肠癌患者的这些miRNA的表达水平(即上调或下调)和准确性(RUC)。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开。

图2B：逐步描述了在本发明第一方面的微阵列上获得的miRNA生物标记组1(hsa-miR-25/hsa-miR-1228,hsa-miR-331-3p/hsa-miR-1228和has-miR-93/hsa-miR-1228)的逻辑回归分析，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开(AUC=0.888)。

图3A：示出在本发明第一方面通过定量RT-PCR所验证的特别优选的miRNA生物标记中所包含的人类miRNA，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。各个数据针对内部稳定对照has-miR-1238进行了归一化。图中还示出与健康对照相比，结直肠癌患者的这些miRNA的表达水平(即上调或下调)和准确性(RUC)。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开。

图3B：逐步描述了在本发明第一方面通过定量RT-PCR所验证的miRNA生物标记组2(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-1228,hsa-miR-7/hsa-miR-25,hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345和hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*)的逻辑回归分析，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开(AUC=0.905)。

图3C：逐步描述了在本发明第一方面通过定量RT-PCR所验证的miRNA生物标记组3(hsa-miR-345/hsa-miR-1228,hsa-miR-7/hsa-miR-345和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25)的逻辑回归分析，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开(AUC=0.903)。

图3D：逐步描述了在本发明第一方面通过定量RT-PCR所验证的miRNA生物标记组4(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25,hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345,hsa-miR-7/hsa-miR-93和hsa-miR-93/hsa-miR-1228)的逻辑回归分析，用于鉴定展现出结直肠癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将结直肠癌患者与健康个体区别开(AUC=0.892)

图4A：示出在本发明第二方面通过定量RT-PCR所验证的特别优选的miRNA生物标记组合(hsa-miR-7/hsa-miR-25)中所包含的人类miRNA，用于鉴定展现出结直肠腺瘤、Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将腺瘤和结直肠癌患者的所有阶段与健康个体区别开。

图4B：示出患有结直肠腺瘤、Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的患者和健康个体中hsa-miR-7/hsa-miR-25组合各自的表达水平。数据表明，借助本发明提供的miRNA生物标记，可以在很早期(癌症前损伤和Dukes'A癌)就检测出结直肠癌。

图5A：示出在本发明第三方面通过定量RT-PCR所验证的特别优选的miRNA生物标记组合(hsa-miR-93/hsa-miR-1228,hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*和hsa-miR-7/hsa-miR-93)中所包含的人类miRNA，用于鉴定展现出Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的一或多个目标血浆。数据表明在血液样本中可以可靠地将腺瘤和结直肠癌患者的所有阶段与健康个体区别开。

图5B：示出患有Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的结直肠癌患者和健康个体中hsa-miR-93/hsa-miR-1228组合各自的表达水平。数据表明，借助本发明提供的miRNA生物标记，可以在结直肠癌早期(Dukes'A癌)就检测出结直肠癌。

图5C：示出患有Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的结直肠癌患者和健康个体中hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*组合各自的表达水平。数据表明，借助本发明提供的miRNA生物标记，可以在结直肠癌早期(Dukes'A癌)就检测出结直肠癌。

图5D：示出患有Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的结直肠癌患者和健康个体中hsa-miR-7/hsa-miR-93组合各自的表达水平。数据表明，借助本发明提供的miRNA生物标记，可以在结直肠癌早期(Dukes'A癌)就检测出结直肠癌。

图6：示出在本发明第四方面通过定量RT-PCR所验证的特别优选的三种miRNA生物标记(hsa-miR-345、hsa-miR-25和hsa-miR-93)中所包含的人类miRNA，用于监测结直肠癌患者的治疗效果。数据表明，借助本发明提供的miRNA生物标记，可以在可靠的监测结直肠癌患者的治疗效果。

发明详细描述

本发明基于如下出乎意料的发现，即结直肠癌能可靠地通过血浆中特定miRNA表达生物标记以高准确性和灵敏性来鉴定，其中所述表达生物标记如本文定义典型地包括被上调和下调的人类miRNA。更特别地，所述miRNA表达生物标记—通过分析血浆中整体miRNA表达模式和/或各个miRNA各自的表达水平—使得能通过筛选高风险个体来早期检测CRC、早期检测癌症复发以及监测CRC患者的疗效。

以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。

本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。

当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。

当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。

术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10%，优选±5%。

另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。

术语的进一步定义在以下使用术语时给出。

以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。

本发明的目的是经验证的miRNA生物标记，用于通过筛选高风险个体来早期检测CRC、早期检测癌症复发以及监测结直肠癌患者的疗效，其中通过确定血液中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中与健康对照相比，结直肠癌患者血浆中一种或多种多核酸分子差异表达，其中损失一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是结直肠癌的存在以及治疗效果的指征。

本文的术语“结直肠”指的是结肠、直肠和/或阑尾，即整个大肠。

本文术语“癌症”(也称为癌)通常指任何类型的恶性新生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此，术语“结直肠癌”指的是结肠、直肠和阑尾的癌性生长。

最常见的结直肠癌(CRC)细胞类型是腺癌，大约占95%。其他类型的CRC包括尤其是淋巴瘤和鳞癌。

结直肠癌可根据Dukes系统分类(Dukes，C.E.(1932)J.Pathol.Bacteriol.35,323-325)。包括以下分期：Dukes A-肿瘤局限于肠壁；Dukes B-肿瘤侵犯穿过肠壁；Dukes C-肿瘤涉入淋巴结;Dukes D-肿瘤有远处转移。

本文术语“血浆”指的是血液的黄色液体成分，其中全血的血细胞通常会悬浮。大约占整个血液体积的55%。绝大部分是水(90%体积)并含有溶解的蛋白、葡萄糖、凝集因子、矿物质离子、激素和二氧化碳(血浆是分泌产物运输的主要介质)。血浆通过将新鲜血液在离心机中离心直到血细胞沉降到离心管底部而制备。然后血浆被纯化和转移。血浆的密度大约是1025kg/m3,或1.025kg/l。现今的研究表明miRNA在血浆中是稳定的。术语“血浆样本”指的是从被检测的个体或者健康对照获得的血浆。

本文所用术语“患者”，是指至少应该被认为是患有肝细胞癌的人；本文所用术语“目标血浆”是指从患者获取的血浆；术语“健康个体”或“健康对照”特指不具有任一癌症表现的健康个体。并且这里“对照血浆”是指从这些健康个体获取的血浆。但是，在一些应用里，例如，当比较不同的癌症类型时，这些个人有其他的癌症类型，这些从这些个体中获取的血浆也被特指为“对照”。

通常，所用的血浆样本来源于被诊断为结直肠癌的研究对象的生物学样本。另外，为了更确定从“对比样本”获得数据，可从已知疾病状态的研究对象中收集。生物学样本可包括身体组织和液体，例如结直肠组织、血清、血细胞、痰液和尿液。此外，生物学样本可从具有结直肠癌特征或者疑似病例中获得。此外，如有有必要，样本可从得到的身体组织和液体中纯化得到，然和作为生物学样本。根据本发明，核酸分子标记的表达水平通过研究对象来源的生物学样本测定得到。

在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品典型地是血液。另外，肝组织及其它类型样品也可以使用。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。

本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。

miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。

本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相应于所编码的miRNA(5'→3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5'→3')序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3'→5')的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。

在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。

因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是结直肠癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。

在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。

本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在目标血浆中的表达水平相比于健康对照血浆是改变的，其可以是上调(即在目标血浆中miRNA浓度增加)或下调(即在目标血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在目标血浆中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。

本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。

本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析血浆中的浓度。

如上所述，术语“对照血浆”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)血浆。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的血浆时，具有较不严重疾病特征的血浆典型地被认为是“对照血浆”。

表达水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.et al.(2001)Current Pro-cols in Molecular Biology.Wiley&Sons,Hoboken,NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半衰期短，典型地仅测量成熟miRNA的浓度。

在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群目标血浆或对照血浆内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。

所获得的疾病或对照血浆表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据获得样本的个体的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在收集样本的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。

但是，代替在任何实验中测定血浆样本表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，血浆样本的格子表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA测定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。

在本发明的背景下中，术语“鉴定结直肠癌和/或区分其他类型癌”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以进行诊断。

在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是通过血浆样本鉴定结直肠癌存在的指征。本文所用术语“表达生物标记”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在结直肠癌血浆和健康对照之间不同。本文中，核酸表达生物标记也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定个体的表型状态的miRNA序列。

在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在结直肠癌的指征。

本文限定的核酸表达生物标记可包括至少8种核酸分子，优选至少13种核酸分子组合，优选至少4组核酸分子组。

在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。

通常，包含在核酸表达生物标记中的核酸分子是人类序列(以后称为“has”(智人(Homo sapiens)))。

在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3),hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:6),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)和hsa-miR-331-3p(SEQ IDNO:8)的任意一或多种核酸分子。

为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用hsa-miR-1228(SEQ IDNO:9)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

上述miRNA的核酸序列列于表1。

表1

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;也可参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

特别优选地，与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7和hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而hsa-miR-1238的表达不变。

如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任意一种或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)/hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1),hsa-miR-345(SEQ IDNO:5)/hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1),hsa-miR-25(SEQ IDNO:2)/hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1),hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3)/hsa-miR-25(SEQ IDNO:2),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-7(SEQ IDNO:3)/hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3)/hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:6)/hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-409-3p(SEQ IDNO:6)/hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO:8)和hsa-miR-16-2*(SEQ IDNO:1)/hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO:8)的任意一种或多种核酸组合。

在进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码组1((hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9),hsa-miR-93(SEQID  NO:4)/hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9)和hsa-miR-331-3p(SEQ IDNO:8)/hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9))、组2((hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3)/hsa-miR-25(SEQID NO:2),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)/hsa-miR-345(SEQ ID NO:5)和hsa-miR-93(SEQ ID N0:4)/hsa-miR-16-2*(SEQ ID N0:1))、组3((hsa-miR-345(SEQ ID NO:5)/hsa-miR-1228(SEQ ID N0:9),hsa-miR-7(SEQID NO:3)/hsa-miR-345(SEQ ID N0:5)和hsa-miR-671-3p  (SEQ IDNO:7)/hsa-miR-25(SEQ ID N0:2))和组4((hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)/hsa-miR-25(SEQ ID N0:2),hsa-miR-409-3p(SEQ ID N0:6)/hsa-miR-345(SEQ ID N0:5),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3)/hsa-miR-93(SEQ ID N0:4)和hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)/hsa-miR-1228(SEQ ID N0:9))的任意一或多种核酸分子组合。

本文所用术语“核酸组合”指的是整体上应用至少两种核酸表达水平。优选地可整体通过一个公式利用相对变化或计算结果。

在第二方面，本发明涉及用于将腺瘤(癌症前损伤)和结直肠癌患者的所有阶段与健康个体进行区分的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆和在一或多个健康个体中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠腺瘤、Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌存在的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少一种核酸分子组合。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-7(SEQID NO:3)/hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)的一种核酸分子组合。

上述miRNA的核酸序列列于表2。

表2

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;也可参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

在第三方面，本发明涉及用于将结直肠癌患者的所有阶段与健康个体进行区分的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆和在一或多个健康个体中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌存在的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少三种核酸分子组合。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)/hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9),hsa-miR-93(SEQ IDNO:4)/hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1)和hsa-miR-7(SEQ ID NO:3)/hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)的一或多种核酸分子组合。

上述miRNA的核酸序列列于表3。

表3

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;也可参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

在第四方面，本发明涉及用于监测结直肠癌患者治疗效果的分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子在治疗前和治疗后的的一或多种目标血浆中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是结直肠癌患者治疗效果的的指征。

本文所定义的核酸表达生物标记可包含至少三种核酸分子。

在更加优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)的一或多种核酸分子。

为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

上述miRNA的核酸序列列于表4。

表4

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;也可参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

在第五方面，本发明涉及鉴别展现结直肠癌的一或多种目标血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是结直肠癌存在的指征。

为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列，并用特定的公式计算；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并用特定的公式计算；及(c)通过比较在(a)和(b)步骤中所获得的各自的表达水平来鉴别所述组合在所述一或多种目标血浆中的差异,其中一或多种差异表达的组合一起代表生物标记，所述生物标记是结直肠癌存在的指征。

为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用hsa-miR-1228(SEQ ID NO:9)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

在第六方面，本发明涉及用于监测结直肠癌患者治疗效果的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达生物标记；及(b)在血液中监测所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

在第七方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在血液中鉴别核酸表达生物标记；及(b)在血液中改变所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

如本文所用，术语“改变编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未改变的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未改变的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。

在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被改变，即其表达在所述一或多种目标血浆中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一或多种目标血浆中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一或多种癌目标血浆中的调节作用的反方式(anti-cyclical)的发生，以在所述一或多种目标血浆中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。

在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入病人体内。

如本文所用术语“导入血液中”是指使得一或多种核酸分子转移进入血液中的任何操纵。这种技术的例子包括本领域熟知的注射、消化和其他技术。

如本文所用术语“互补序列”是指导入一或多种细胞中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。

两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。

“互补”核酸分子(即编码与下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。

例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2'-O-甲基基团或者2'-O-甲氧基基团(也称作2'-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2'-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(Orom,U.A.et al.(2006)Gene 372,137-141)。

最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt,J.et al.(2005)Nature 438,685–689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4,721-726)。

在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达要被下调的一或多种核酸分子编码选自如下的微RNA序列：hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7和hsa-miR-93(相对于表达生物标记)，假定是上文定义的结直肠癌的指征。

在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编码被上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入血液中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。

在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达要被下调的一或多种核酸分子编码选自如下的微RNA序列：hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p和hsa-miR-331-3p(相对于表达生物标记)，假定是上文定义的结直肠癌的指征。

导入血液中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达。

为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)如前文;Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)如前文;Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)如前文)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。

如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。

为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5'非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5'-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3'非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。

此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva,I.et al.(2006)Biomed.Pharmacother.60,633–638)。

因此，被导入提供的血液中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。

本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。

在第八方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中结直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

最后，在第九方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途。

在本发明范围内，合适的药物成分包括适用于口腔、直肠、鼻腔、整体的(包括颊、和下颚)、腹膜的和胃肠外的(包括肌内、皮下和静脉)操作，或者通过吸入或吹入实施。操作可以是局部的或者系统的。优选地，操作通过口腔或者静脉注射途径实现。配方可包装成不同的剂量单位。

本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。

使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.and Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA;Crowder,T.M.et al.(2003)AGuide to Pharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC,Boca Raton,FL;Niazi,S.K.(2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRC Press,Boca Raton,FL)。

为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。

所述药物成分也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。

为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。

一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.et al.(2004)Nature 432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen,J.et al.(2008)Nature 452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(Zimmermann,T.S.et al.(2006)Nature 441,111-114所述))。近年来，描述了一类称作lipidoids的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc,A.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。

进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles,A.et al.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6,443-453;Kim,D.H.and Rossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184)中。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。

实施例

实施例1：患者材料

在发现研究中，2008-2009年期间收集了上海中山医院和华山医院的CRC患者和健康个体的血液样本79例。所有患者对参与科学研究都有知情同意。组织样本的收集依照协议由医院协会评论委员会批准所有样本在外科手术前获取。

在验证研究中，收集了上海华山医院的CRC患者和健康个体的血液样本166例。在122例CRC患者中，44例是在外科手术后收集。在发现和验证研究中的血液样本的基础特征详见表-5。

表5：血液样本的基础特征

患者数据(年龄，性别，影像资料，治疗方法，其他医疗状况，家族史等等)来自医院数据库。肿瘤病理学是根据世界卫生组织肿瘤分类系统由三个病理学家独立进行的。病理追踪(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(即,健康对照,腺瘤,腺癌或中间状态)以及确保样本分类的一致性。

实施例2：样品制备

将外周血(2ml)置入EDTA管。在两小时内,以820g将管离心10min。接着,将1-ml的血浆等分试样转移至1.5-ml管并在16,000g离心10使任何参与的细胞碎片沉淀。随后,将上清转移至新的管并将其储存在-80°C。

使用mirVana PARIS miRNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)根据厂商指导分离总RNA。用NanoDrop 1000 Spectrophotometer (NanoDropTechnologies,Waltham,MA)测定总RNA浓度。对RNA的质量监控则通过RNA 6000Pico LabChip kit由2100Bioanalyzer来完成。

实施例3：微阵列数据

在发现研究中，任选使用Agilent miRNA微阵列平台(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)来对特定样品中差异表达的miRNA进行定性分析。该微阵列含有针对取自Sanger v.10.1数据库的723个人类miRNA的探针。将79个血浆样本中所得的总RNA(100ng)用作输入以通过Cy3标记。用XDR Scan(PMT100,PMT5)扫描微阵列的载玻片。标记和杂交的操作方法均参照Agilent miRNA微阵列系统的说明书。通过一种内部稳定对照hsa-miR-1228而将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。

未配对t检验在费歇尔检验(F-test)之后用于鉴定在腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌或小细胞肺癌中最优的候选miRNA标记物。MedCalc软件被用于执行受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC)分析以确定作为诊断价值的生物标记物的候选miRNA的特异性和敏感性。95%可信区间被用来确定显著性。进行逐步的Logistic回归分析以确定组合的miRAN作为诊断生物标记的特异性和敏感性。

第一方面中用于区别CRC患者和健康个体的8个关键候选miRNA在阵列上的实验数据在表6中示出。

表6：用于区别CRC患者和健康个体的微阵列上的候选miRNA生物标记

实施例4：在石蜡包埋的手术组织中微阵列数据的验证

为验证微阵列上所获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的实时定量RT-PCR，其采用TaqMan微RNA测定法(Applied Biosystems,Foster City，CA,USA)。使用166个血浆样本来测定hsa-miR-16-2*(SEQ IDNO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3),hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:6)and hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)。使用内部稳定对照hsa-miR-1228的表达水平作为归一化对照。每个实验重复三次。

简言之，根据Applied Biosystem指导，采用Taqman微RNA RT试剂盒进行反转录测定。将100ng的总RNA在包含1X逆转录缓冲液,1X RT引物,1nM dNTP，4U RNase抑制剂和50U MultiScribe逆转录酶的15微升RT混合液中进行反转录。然后将这些RT溶液置于PCR仪(Thermal cycleralpha engine,Bio-rad)上反应，执行程序如下：16°C,30分钟;42°C,30分钟;85°C,5分钟。并根据Applied Biosystem的指导采用TaqMan Universal PCRMaster Mix试剂盒和Taqman微RNA测定试剂盒进行定量PCR的测定。将2微升的RT产物在1X TaqMan Universal PCR Master Mix,No AmpEraseUNG，1X TaqMan MicroRNA Assay mix中扩增。在Roch Light Cycling 480仪上进行实时PCR，执行程序如下：96°C,5分钟，开始加热;然后40或50个循环的95°C,15秒;60°C,60秒。Cp值由LC480软件经过二次衍生法计算而得。最后根据标准样品的Cp值对miRNA进行绝对定量。

未配对t检验在费歇尔检验(F-test)之后用于鉴定miRNA的差异表达。MedCalc软件被用于执行受试者工作特征曲线(receive operatingcharacteristic curve,ROC)分析以确定作为诊断价值的生物标记物的候选miRNA的特异性和敏感性。95%可信区间被用于确定显著性。

在第一方面中用于区别CRC患者和健康个体的8个经验证的miRNA生物标记的实验数据在表7中示出。特别优选的hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)和hsa-miR-93(SEQ ID NO:4)显示为粗体。

表7:用于区分结直肠癌患者与健康个体的验证的miRNA生物标记

对第一方面中用于区别CRC患者和健康个体的三组经验证的miRNA生物标记进行逐步的Logistic回归分析，数据在表8中示出。

表8:用于区分结直肠癌患者与健康个体的验证的miRNA生物标记的组合 逐步logistic回归分析

在第二方面中用于将腺瘤及各期的结直肠癌患者与健康个体区别开的miRNA生物标记的实验数据在表9中示出。

表9:用于将腺瘤和所有阶段的结直肠癌患者与健康个体区分的经验证的miRNA生物标记

在第三方面中用于将各期的结直肠癌患者与健康个体区别开的miRNA生物标记的实验数据在表10中示出。

表10：用于将所有阶段的结直肠癌患者与健康个体区分的经验证的miRNA生物标记

在第四方面中用于监测结直肠癌患者在手术前后对治疗的应答的miRNA生物标记的实验数据在表11中示出。

表11：用于监测手术前和手术后的结直肠癌患者的治疗应答的经验证的miRNA生物标记

实施例5：量化miRNA生物标记的方法

通过使用TaqMan微RNA测定(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的实时定量RT-PCR,根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA标记物进行定量分析。

或者,可以通过实时定量RT-PCR来对miRNA进行定量,其中使用SYBR Green I(Sigma Aldrich Corporation,St.Louis,MO,USA),也即结合双链DNA的不对称青色燃料。所得的DNA-燃料-复合物吸收蓝光(λ_max=488nm)发射绿光(λ_max=522nm)。

为了定性确定，选择了标1所列的8种miRNA生物标记：hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:1),hsa-miR-25(SEQ ID NO:2),hsa-miR-7(SEQ ID NO:3),hsa-miR-93(SEQ ID NO:4),hsa-miR-345(SEQ ID NO:5),hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:6),hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:7)和hsa-miR-331-3p(SEQ IDNO:8)。

为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可使用hsa-miR-1228(SEQ IDNO:9)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

作为第一步，使用表12所列的寡核苷酸引物根据标准程序来将miRNA逆转录。引物的3'端与相应miRNA 3'端的10-13个末端核苷酸(小写字母粗体显示)互补。引物的5'端具有共同的序列(大写字母显示)以用于随后进行实时PCR。

表12

用于进行逆转录的反应混合物(每个样品)包括：

逆转录在PCR热循环仪(例如7500 Real-Time PCR System,AppliedBiosystems,Inc.,Foster City，CA,USA)中进行，使用如下参数：

在根据已建立的标准程序合成第二条cDNA链之后，进行实时PCR。用于PCR扩增的5'(上游)寡核苷酸引物在表13中列出。通用的3'(下游)引物具有序列：5'-ACGGTCCTATATGGCTCCAC-3'，其与用于逆转录的引物的5'-端互补(表12)。

用于进行实时PCR的反应混合物(每个样品)包括：

表13

实时PCR在PCR热循环仪(例如7500Real-Time PCR System,AppliedBiosystems,Inc.,Foster City，CA,USA)中进行，使用如下参数：

在60°C和490nm的吸收波长和530nm的发射波长收集各自的数据。对每个PCR反应的Ct值的计算以及随后的miRNA的定量按照厂商指导进行。

典型地来说,对每个测量进行了至少三个独立的实验，并且所确定的miRNA表达水平代表各单独获得的数据的平均值。将所选的8个miRNA的平均表达水平针对稳定表达的对照miRNA hsa-mir-1228(SEQ ID NO:9)进行归一化，使用如下公式：

log₂([miRNA表达水平]-[hsa-miR-1228表达水平])。

本发明miRNA表达生物标记的确定提供一个独特的分子标记，其使得可以对血液中的结直肠癌进行为筛查、检测和诊断。此外，该表达生物标记可被用于监测结直肠癌患者的治疗反应及引导做出治疗决策。另外，该表达是无比还可用于开发抗结直肠癌的药物。

在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。

本文广泛及概括地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。

其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。

Claims (26)

1.用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，

其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，

其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是存在结直肠癌的指征。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少8种核酸分子，优选地至少4组种核酸分子组合。

3.权利要求1或2试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与在一或多种健康对照中相比被下调。

4.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7、hsa-miR-93、hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p和hsa-miR-331-3p的任意一或多种核酸分子。

5.权利要求4试剂盒，其中与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-7和hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而hsa-miR-1238的表达不变。

6.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-345/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-25/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-345、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-331-3p    和hsa-miR-16-2*/hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子组合。

7.权利要求1-3和6任一项的试剂盒，其中与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-93、hsa-miR-7/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-16-2*/hsa-miR-345、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-331-3p    和hsa-miR-16-2*/hsa-miR-331-3p的任意一种或多种核酸分子组合的表达被上调；而编码hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*,、hsa-miR-345/hsa-miR-16-2*和hsa-miR-25/hsa-miR-16-2*的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。

8.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码组1(hsa-miR-25/hsa-miR-1228、hsa-miR-93/hsa-miR-1228和hsa-miR-331-3p/hsa-miR-1228)、组2(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-1228、hsa-miR-7/hsa-miR-25、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345和hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*)、组3(hsa-miR-345/hsa-miR-1228、hsa-miR-7/hsa-miR-345和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25)和组4(hsa-miR-16-2*/hsa-miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-7/hsa-miR-93和hsa-miR-93/hsa-miR-1228)的任意一或多种核酸分子组合。

9.权利要求1-3任一项的试剂盒，进一步用于将结直肠腺瘤、Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的结直肠肿瘤患者与健康个体区分开，特别优选通过筛选高风险个体来早期检测结直肠癌以及早期检测癌症复发。

10.权利要求9试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少一种核酸分子组合。

11.权利要求10的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-7/hsa-miR-25的一种核酸分子组合。

12.权利要求11的试剂盒，其中与一或多个健康个体相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-7/hsa-miR-25的核酸分子组合的表达被上调。

13.权利要求1-3任一项的试剂盒，进一步用于将结肠癌Dukes'A癌、Dukes'B癌、Dukes'C癌或Dukes'D癌的结直肠肿瘤患者与健康个体区分开，特别优选通过筛选高风险个体来早期检测结直肠癌以及早期检测癌症复发。

14.权利要求1-3和13任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少三种核酸分子组合。

15.权利要求1-3和14任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-93/hsa-miR-1228、hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*和hsa-miR-7/hsa-miR-93的一或多种核酸分子组合。

16.权利要求15的试剂盒，其中与一或多个健康对照相比，在一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-7/hsa-miR-93的核酸分子组合的表达被上调；而编码hsa-miR-93/hsa-miR-1228和hsa-miR-93/hsa-miR-16-2*的任意一种或多种核酸分子组合的表达被下调。

17.权利要求1-3任一项的试剂盒，进一步用于检测结直肠癌患者的治疗效果。

18.权利要求1-3和13任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含至少三种核酸分子。

19.权利要求1-3和18任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-345、hsa-miR-25和hsa-miR-93的一或多种核酸分子。

20.权利要求19的试剂盒，其中与治疗前的一或多个对照血浆相比，在治疗后的所述一或多个目标血浆中，编码hsa-miR-345、hsa-miR-25和hsa-miR-93的任意一或多种核酸分子的表达被上调。

21.用于鉴别展现结直肠癌的一或多种目标血浆的方法，所述方法包括：

(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；

(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及

(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表如权利要求1-20任一项所定义的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是结直肠癌存在的指征。

22.权利要求21的方法，进一步用于通过筛选高风险个体来早期检测结直肠癌以及早期检测癌症复发。

23.用于监测结直肠癌患者治疗效果的方法，所述方法包括：

(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达生物标记；及

(b)在血液中监测所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

24.用于预防或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：

(a)通过使用权利要求1-20的方法在血液中鉴别核酸表达生物标记；及

(b)在血液中改变所述核酸表达生物标记所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

25.用于预防和/或治疗血液中结直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，

所述序列与如权利要求1-20任一项所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

26.权利要求25的药物组合物在制备用于预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途。

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