CN102985558B - 用于肝细胞癌症的微rna表达谱分析的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肝细胞癌症的微RNA(miRNA)表达谱分析的组合物和方法。特别地，本发明涉及用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码miRNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞中及在一或多种对照细胞中差异表达，且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。本发明进一步涉及使用这种核酸表达特征鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞以及预防或治疗这种病症的相应方法。最后，本发明涉及预防和/或治疗肝细胞癌症的药物组合物。

Description

用于肝细胞癌症的微RNA表达谱分析的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于肝细胞癌症(hepatocellular cancer)的微RNA(microRNA)表达谱分析的组合物和方法。
发明背景
肝细胞癌症(也称作肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC))是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一。其代表了肝癌的主要组织学类型，可能占所有肝癌病例的70％-85％。世界每年有大约500000个新病例，和几乎相同数目的死亡病例，这反映出对这种疾病缺乏有效的早期检测和治疗选择(综述参见例如Thorgeirsson，S.S.and Grisham，J.W.(2002)Nat.Genet.31，339-346；Parkin，D.M.et al.(2005)CA Cancer J.Clin.55，74-108)。
因此，肝细胞肝癌是一类预后很差的癌症。结果不佳是由于肝细胞癌症的主要特点即肝内转移或手术后复发。新的肿瘤克隆(tumor colony)通常侵袭门静脉的主要分支及可能侵袭肝脏的其他部分(综述见例如Tang，Z.Y.(2001)World J Gastroenterol 7，445-454；Chambers，A.F.et al.(2002)Nat.Rev.Cancer 2，563-572)。切除和/或肝移植是可能治愈的最佳选择。然而，目前仅大约10％-20％的肝细胞癌症患者符合外科手术条件，所述肝细胞癌症的手术条件是通过可利用的临床分期系统根据相对正常的肝功能和可处理的肿瘤损害等参数而确定。此外，进行切除术的患者通常具有高频率的转移/复发，术后5年存活率仅为30％-40％。
肝细胞肿瘤包括不同的良性赘生物和恶性赘生物。尽管能大致地在组织学方面区分表型，这些肿瘤的临床表现和预后可以大大不同。因此，需要对这种肿瘤的早期检测以区别这些不同类型的肿瘤并使得可以对显示或怀疑具有(良性)癌前病变(pre-cancerous state)的患者的进行可靠的危险评估，即所述癌前状态是否将发展为癌症。癌症发展的预测可用于指导对显示肝细胞癌症类型的患者的治疗决定，并因此可明显有助于改善长期生存率。
尽管近年来早期检测和手术切除肝细胞肿瘤显著改善了患者的生存率，但是大多数肿瘤在肿瘤进展期间即在非致命期仍未被早期检测出。目前，仅有一种血清标记(α-甲胎蛋白，AFP)通常用于早期检测肝细胞癌症(参见例如Mizejewski，G.J.(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.2，709-735；Paul，S.B.et al.(2007)Oncology 72，Suppl.1，117-123)。然而这个标记具有低特异性，且通常由于假阳性结果而是不合适的。血清AFP检验仅在60％的患者中可易于检测出肝细胞肿瘤。另一方面，在大量的肝硬化患者中，在不存在癌症状态时AFP也可升高。
因此，发现新的生物标记将会有极大的临床重要性，特别是如果这些标记使得能够在肿瘤发展的早期进行诊断从而允许癌症的早期治疗。理想的是这些标记应该能使得在恶性细胞的存在尚不能由原位技术或活组织检查或切除材料的显微镜分析检测到的阶段就能鉴定癌症。
许多诊断测定也由如下事实妨碍，即它们通常是基于分析仅仅单个分子标记，这可能影响检测可靠性和/或准确度。另外，单个标记通常不能进行有关潜伏期、肿瘤发展等的详细预测。因此，仍然持续需要鉴定其它的分子标记和克服这些限制的其他测定形式。
一种解决这一问题的方法可以基于小调节RNA分子，特别是微RNA(miRNA)，它们是一类进化保守的内源表达的小的非编码RNA，大小为20-25个核苷酸(nt)，可以介导靶mRNA的表达。自从它们在大约10年前被发现就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。
miRNA是从初级转录物产生的，初级转录物被RNase III Drosha加工为茎-环结构前体(pre-miRNA)。在转运到细胞质后，另一种称为Dicer的RNase III切割pre-miRNA发夹的环以形成短双链(ds)RNA，其中一条链作为成熟miRNA掺入miRNA-蛋白质(miRNP)中。miRNA指导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥功能(综述参见例如Bartel，D.P.(2004)Cell23，281-292；He，L.and Hannon，G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5，522-531)。
根据miRNA与其靶之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异切割。因此，在这种情况中，miRNA的功能是作为短干扰RNA(siRNA)。与miRNA互补性较低的靶mRNA要么被指引进入细胞降解途径要么被阻遏翻译而不影响mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它们的靶mRNA的翻译的机制尚有争论。
可获得的现有数据表明miRNA表达的调节异常(dysregulation)可能与某些类型癌症的发生和/或发展相关。例如，已表明两种miRNA，miR-15及miR-16-1定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，并且发现在大约70％的CLL患者中，两种miRNA基因被缺失或下调。另外，在结肠直肠瘤形成中观察到miR-143及miR-145的下调，而miRNA let-7的表达在肺癌中经常降低(Michael，M.Z.et al.(2003)Mol.Cancer Res.1，882-891；Mayr，C.et al.(2007)Science 315，1576-1579)。事实上，基于miRNA表达中的癌症相关改变和miRNA通常位于参与癌症的基因组区域的观察推测miRNA可能既作为肿瘤阻抑基因也作为癌基因(综述参见例如Esquela-Kerscher，A.and Slack，F.J(2006)Nat.Rev.Cancer 6，259-269；Calin，G.A.and Croce，C.M.(2007)J.Clin.Invest.117，2059-2066；Blenkiron，C.and Miska，E.A.(2007)Hum.Mol.Genet.16，R106-R113)。
更多的系统性基于珠的流式细胞术miRNA表达分析已经揭示在肿瘤中的全局性miRNA调节，表明宿主细胞的miRNA谱分析可能确实适用于癌症诊断(综述参见例如Lu J.et al.(2005)Nature 435，834-838；Volinia，S.et al.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，2257-2261)并且已经鉴定了不同miRNA，它们的表达看起来对特定肿瘤是特征性的(Calin，G.A.and Croce，C.M.(2007)，supra)。但是，目前仅有极少数这些异常表达的miRNA与用于肿瘤发生和/或发展的临床相关的预后因子直接相关联。
一些研究报导了人肝细胞癌症中miRNA表达谱分析(参见例如Murakami，Y.et al.(2006)Oncogene 25，2537-2545；Li，W.et al.(2008)Int.J.Cancer 123，1616-1622；Huang，Y.S.et al.(2008)Hepatology 23，87-94；Ladeiro，Y.et al.(2008)Hepatology 47，1955-1963；Jiang，J.et al.(2008)Clin.Cancer Res.14，419-427)。同样地，这些研究示出与在非恶性肝细胞或组织相比，特异性miRNA在恶性细胞或组织中异常表达。因此，这种miRNA可提供关于涉及恶性转化的细胞过程的认识。然而，这些研究针对肿瘤组织，未分离恶性细胞。因此，40％报导的HCC相关miRNA在不同研究中示出不同(部分甚至相反的)调节模式。此外，未获得关于miRNA表达与HCC早期之间相关性的数据。
因此，仍需要(一组)诊断标记，特别是“表达特征(expressionsignature)”或“分子足迹(molecular footprint)”形式的诊断标记，以使得可以快速、可靠和便宜地鉴定和/或治疗显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的细胞。另外，还持续需要相应的方法以鉴定和治疗展示这种癌表型的靶细胞。
发明目的和发明概述
本发明的一个目的是提供通过确定多种核酸分子而诊断和/或治疗肝细胞癌症和/或发生这种病症的倾向的新方法，每种所述核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中与健康对照细胞相比，所述多种核酸分子的一或多种在所分析的靶细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。
更具体地，本发明的一个目的是提供用于区别不同类型的肝细胞癌症和/或肿瘤发展的不同期的组合物。
另外，本发明的一个目的是提供相应的方法用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞以及用于预防或治疗这种病症。
这些及其它目的从以下描述将变得清楚，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。
在第一方面，本发明涉及用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。
本文限定的核酸表达特征可包括至少五种核酸分子，优选地至少八种核酸分子，特别优选地至少十二种核酸分子。
在另一个实施方案中，本文限定的核酸表达特征可包括至少六种核酸分子，优选地至少十二种核酸分子，特别优选地至少二十种核酸分子。
在具体的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调的微RNA序列的核酸分子；以及包括至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调的微RNA序列的核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183、hsa-mir-551b、hsa-mir-139-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144*和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183和hsa-mir-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-mir-139-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144*和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在本发明另外的具体实施方案中，所述诊断试剂盒进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓(carcinoma embolus)中的肝细胞癌症。
在优选的实施方案中，所述肝细胞癌症是肝细胞癌，所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-451和hsa-miR-335的任一或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222和hsa-miR-501-3p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-375、hsa-miR-451和hsa-miR-335的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在其它优选的实施方案中，所述肝细胞癌症是癌栓，所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-23a、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103和hsa-miR-23a的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在另一个实施方案中，本文限定的核酸表达特征可包括至少六种核酸分子，优选地至少十二种核酸分子，特别优选地至少二十种核酸分子。
优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*的任一或多种核酸分子。
更优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*的任一或多种核酸分子。
在特别优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子。在另外特别优选的实施方案中，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，以及编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在另外的具体实施方案中，所述诊断试剂盒进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
在另外优选的实施方案，所述肝细胞癌症是癌栓，所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，以及编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在第二方面中，本发明涉及一种鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：(a)在一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴定在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。
在本发明的优选的实施方案中，所述方法进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
在第三方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肝细胞癌症的方法，所述方法包括：(a)用本文限定的方法在一或多种靶细胞中鉴定核酸表达特征；和(b)在所述一或多种细胞中修饰包含在所述核酸表达特征中的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，以使得其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调以及其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
在第四方面，本发明涉及用于在一或多种哺乳动物靶细胞中预防和/或治疗肝细胞癌症的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子编码一序列，所述序列与本文限定的其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列相应于本文限定的其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列。
最后，在第五方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌症的药物中的应用。
本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。
附图简述
图1示出包含在本发明的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征分别用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(即肝细胞癌和癌栓)倾向的一或多种靶细胞以及区别肝细胞癌和癌栓。图中还示出与(健康)对照组织相比，在癌组织中这些miRNA的表达水平(REG为调控)(即上调或下调)。
图2描绘了流程图，示意性示出用于确定本发明的表达特征的关键方法步骤，所述表达特征用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种靶细胞。
图3图示鉴定的miRNA在肝细胞肝癌(HCC)和癌栓(CE)发展过程中的表达水平。
图4示出无监督差异表达miRNA的聚类分析并显示聚类将31/31个正常-硬化样本置于一组，将29/32个肝细胞肝癌-癌栓置于另一组。
图5显示各个miRNA在芯片分析中的PAM分数，分数对应于各自的预测能力。最少2种miRNA(hsa-miR-139-5p和hsa-miR-101)可以区分正常-硬化和肝细胞肝癌-癌栓，准确率为89％。hsa-miR-139-5p是肝细胞肝癌中另一种鉴定的miRNA。
发明详细描述
本发明基于如下出乎意料的发现，即显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(HCC)的倾向的细胞可以基于特定的miRNA表达特征以高准确度、灵敏度和特异性被可靠地鉴定并区别不同类型的HCC，其中所述表达特征如本文定义通常包括被上调和下调的人类miRNA。更具体地，所述miRNA表达特征—通过分析整体miRNA表达模式和/或各个miRNA表达水平—使得能检测早期疾病状态下的HCC以及评价良性癌前状态转化为恶性癌症的风险。
以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。
本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一(a)”或“一(an)”，“所述(the)”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。
术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。
术语的进一步定义在以下使用术语时给出。
以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
在第一方面，本发明涉及鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。
本文所用术语“癌症”(也称为“癌(carcinoma)”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示癌特征或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文所用术语“肝细胞(hepatocellular)”(或肝的(hepatic))涉及肝脏。因此，术语“肝细胞癌症”是指在肝脏的癌性生长。
本文所用术语“具有发生癌症倾向”是指任何是癌前状态即正常细胞转化为肿瘤细胞过程中的中间状态的指征的细胞表型。换句话说，该术语是指发生癌症的风险的状态。
最常见类型的肝细胞(肝脏)癌症是肝细胞癌(也称作肝癌，通常缩写为HCC)。本文所用术语“肝细胞癌”是指原发的肝脏恶性肿瘤。大多数HCC继发于病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。在肝炎不是地方病的国家中，大多数肝脏恶性癌症不是原发HCC，而是从机体其它部位例如结肠的癌症转移(传播)。HCC的治疗选择和预后依赖于许多因素，但是特别依赖于肿瘤大小和分期。肿瘤级别(tumor grade)也是重要的。高级别(high-grade)肿瘤预后不佳，而低级别(low-grade)肿瘤也许可被忽视很多年。通常结果不佳是因为仅10％-20％的肝细胞癌通过手术可完全切除。如果癌症不能被完全切除，则该疾病通常在3-6个月内是致命的。
肝细胞癌与任何其它癌症一样，当存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的分子机制突变时而发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性病毒感染通过重复导致机体自身免疫系统攻击肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而可助于肝细胞癌的发生。而这种损伤之后修复的恒定循环可导致修复期间的错误，随之导致癌发生，但是目前这种假说更适用于丙型肝炎。然而，在乙型肝炎中，病毒基因组整合进感染的细胞中是恶性肿瘤中最一致相关的因素。另外，重复大量饮酒可具有相似作用。
因此，在本发明范围中，乙型肝炎和/或丙型肝炎感染或者肝硬化不仅被认为是肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中间期(即“癌前病变)，其与导致(通常为良性)非侵袭性赘生物的过度增殖性组织生长(随之可发展为恶性肿瘤如HCC)相关。
这种恶性肿瘤侵袭其它组织并在时间足够时经常发生转移。恶性细胞通常特征在于进展性(progressive)和不受控制的生长。肉眼观察HCC看起来是结节性或侵润性肿瘤。结节型肿瘤可以是单发性(具有大团)或多发性(当发展为硬化并发症时)。肿瘤结节为圆形至椭圆形，边界清楚但无包膜。弥漫型边界不清，且侵润门静脉，很少侵润肝静脉。
恶性肿瘤可以局部传播(以转移形式)或者通过血流和淋巴系统传播到机体其它部位。由于肝脏的双重血液供应(肝脏通过肝动脉和门静脉接受血液)，因此是转移的常见部位。因此，肿瘤组织(转移)可形成栓子，即从机体的一个部位迁移(通过循环)的物体并导致机体另一部位的血管阻塞(闭 塞)。这种得自肿瘤栓塞的继发肝细胞肿瘤在本文称作“癌栓”。
本发明中采用的哺乳动物靶细胞可以是人或非人类来源的。然而，本发明通常用人类细胞进行。本文所用术语“一或多种细胞”应被理解为不仅包括个体细胞，也包括组织、器官和生物体。本文所用术语“靶细胞”是指被至少认定是显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的细胞，而术语“对照细胞”典型地是指不具有这种癌表型特征的(健康)野生型细胞。但是在一些应用中，例如当比较显示不同癌或癌前状态的细胞时，具有不太严重的疾病特征的细胞典型地被认为是“对照细胞”。
通常，所用的靶细胞和对照细胞衍生自从待诊断是否存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的对象中收集的生物学样品。另外，为了确证获得的数据，“比较样品”也可以从患有给定已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括机体组织和液体，如血液、痰和尿。另外，生物学样品可含有衍生自肝细胞的细胞提取物或包括肝细胞的细胞群，所述肝细胞优选是癌性肝细胞或衍生自怀疑是癌性的组织的肝细胞。还更优选地，生物学样品包含衍生自肝组织的细胞群。另外，如果需要，细胞可以从获得的机体组织和液体中纯化，然后用作生物学样品。根据本发明，本发明的核酸标记的表达水平在对象衍生的生物学样品中确定。
在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品通常是肝活组织检查样品或切除物。另外，肝细胞癌细胞可迁移进其它组织。因此，血液及其它类型样品也可以使用。活组织检查样品或切除物可含有仅少部分的癌(前)细胞。为增加信号/背景比，切除物可以在分析之前分成不同的亚样品(例如，通过激光捕获显微切割)。即使活组织检查样品或切除物中的癌细胞总数有限，至少一个亚样品可含有增加的癌(前)对非癌细胞比率。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。
本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(综述参见例如Bartel，D.P.(2004)Cell 23，281-292；He，L.and Hannon，G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5，522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生通常折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA通常衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工出成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。通常，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子通常编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5′→3′)匹配或相应于所编码的miRNA(5′→3′)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5′→3′)序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3′→5′)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内，两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两种分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。
因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。当诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)时，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚组，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肝细胞癌症。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。
在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。
本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在靶细胞中的表达水平相比于健康对照细胞是改变的，其可以是上调(即在靶细胞中miRNA浓度增加)或下调(即在靶细胞中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在靶细胞中被激活至比在对照细胞中更高或更低的水平。
在本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5％或至少10％，优选地至少20％或至少25％，最优选地至少30％或至少50％。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。
本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析细胞中的浓度。
如上所述，术语“对照细胞”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)野生型细胞。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的细胞时，具有较不严重疾病特征的细胞通常被认为是“对照细胞”。
表达水平的确定通常遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley & Sons，Hoboken，NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半衰期短，通常仅测量成熟miRNA的浓度。
在特异的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群靶细胞或对照细胞内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。
所获得的一或多种靶细胞和一或多种对照细胞的表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在细胞的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。
但是，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定细胞表型(即疾病状态)的一或多个截断(cut-off)值，代替在任何实验中确定一或多种对照细胞的表达水平。在这种情况中，一或多种靶细胞的相应表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。
在本发明中，术语“鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区别不同类型的肝细胞肿瘤。
在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是在靶细胞中存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在(癌性)靶细胞和(非癌性)对照细胞之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定靶细胞的表型状态的miRNA序列。
在具体的实施方案中，核酸表达特征包含至少五种核酸分子，每种编码(不同的)miRNA序列。优选地，核酸表达特征包含至少八种或至少十种(不同的)核酸分子。特别优选地，核酸特征包含至少十二种或至少十五种(不同的)核酸分子。
通常，包含在核酸表达特征中的核酸分子是人类序列(以后称为“hsa”(Homo sapiens))。
在进一步优选的实施方案中，核酸表达特征包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调(即其浓度增加)的miRNA序列的核酸分子；以及包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调(即其浓度降低)的miRNA序列的核酸分子。
在本发明的优选的实施方案中，诊断试剂盒的核酸表达特征包含任何一或多种编码选自如下一组的微RNA序列的人类靶细胞衍生的核酸分子，所述的组由hsa-mir-221(SEQ ID NO：1)、hsa-mir-324-5p(SEQ IDNO：2)、hsa-mir-96(SEQ ID NO：3)、hsa-mir-18a(SEQ ID NO：4)、hsa-mir-18b(SEQ ID NO：5)、hsa-mir-30d(SEQ ID NO：6)、hsa-mir-331-3p(SEQ IDNO：7)、hsa-mir-183(SEQ ID NO：8)、hsa-mir-551b(SEQ ID NO：9)、hsa-mir-139-5p(SEQ ID NO：10)、hsa-mir-144(SEQ ID NO：11)、hsa-mir-144*(SEQID NO：12)和hsa-mir-450a(SEQ ID NO：13)组成。
上述miRNA的核酸序列列于表1。
表1
  miRNA   序列(5′→3′)
  hsa-miR-221   agcuacauugucugcuggguuuc
  hsa-miR-324-5p   cgcauccccuagggcauuggugu
  hsa-miR-96   uuuggcacuagcacauuuuugcu
  hsa-miR-18a   uaaggugcaucuagugcagauag
  hsa-miR-18b   uaaggugcaucuagugcaguuag
  hsa-miR-30d   uguaaacauccccgacuggaag
  hsa-miR-331-3p   gccccugggccuauccuagaa
  hsa-miR-183   uauggcacugguagaauucacu
  hsa-miR-551b   gcgacccauacuugguuucag
  hsa-miR-139-5p   ucuacagugcacgugucuccag
  hsa-miR-144   uacaguauagaugauguacu
  hsa-miR-144*   ggauaucaucauauacuguaag
  hsa-miR-450a   uuuugcgauguguuccuaauau
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36，D154-D158)。
特别优选地，与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183和hsa-mir-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-mir-139-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144*和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子的表达被下调。
如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任一或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚组，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
在本发明的另外的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少任一或多种编码上述miRNA的核酸分子，且还含有编码在靶细胞中与在一或多种分析的对照细胞中差异表达任何其它miRNA序列的一或多种其它核酸分子，特别是编码选自如下一组的微RNA序列的任一或多种人类靶细胞衍生的核酸分子：hsa-mir-100(SEQ ID NO：14)、hsa-mir-101(SEQ IDNO：15)、hsa-mir-10a(SEQ ID NO：16)、hsa-mir-139-3p(SEQ ID NO：17)、hsa-mir-148a(SEQ ID NO：18)、hsa-mir-30c(SEQ ID NO：19)、hsa-mir-122*(SEQ ID NO：20)、hsa-mir-152(SEQ ID NO：21)、hsa-mir-24-1*(SEQ IDNO：22)、hsa-mir-26b(SEQ ID NO：23)、hsa-mir-29c*(SEQ ID NO：24)、hsa-mir-30e(SEQ ID NO：25)、hsa-mir-30e*(SEQ ID NO：26)、hsa-mir-378(SEQID NO：27)、hsa-mir-378*(SEQ ID NO：28)、hsa-mir-424(SEQ ID NO：29)、hsa-mir-455-3p(SEQ ID NO：30)、hsa-mir-455-5p(SEQ ID NO：31)、hsa-mir-505(SEQ ID NO：32)、hsa-mir-542-3p(SEQ ID NO：33)、hsa-mir-99a(SEQID NO：34)、hsa-mir-29c(SEQ ID NO：35)和hsa-mir-338-3p(SEQ IDNO：36)。
优选地，与一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中任何这些核酸分子(SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：36)的表达被下调。
发现与在对照细胞中相比，上述miRNA(SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：36)在检验的某些类型的肝细胞癌症中差异表达，特别是在肝细胞癌(即原发性肝脏恶性肿瘤)和癌栓(即继发恶性肿瘤)中。因此，上述表达特征看起来是不依赖于肿瘤类型的“肝细胞肿瘤侵润性”的指征。
在本发明的其它具体实施方案中，所述诊断试剂盒进一步用于区别不同类型的肝细胞癌症，特别是区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
在优选的实施方案中，肝细胞癌症是肝细胞癌，所述核酸表达特征包含任一或多种编码如下序列的核酸分子：hsa-miR-224(SEQ ID NO：37)、hsa-miR-532-3p(SE ID NO：38)、hsa-miR-663(SEQ ID NO：39)、hsa-miR-99b(SEQ ID NO：40)、hsa-miR-362-5p(SEQ ID NO：41)、hsa-miR-652(SEQID NO：42)、hsa-miR-222(SEQ ID NO：43)、hsa-miR-501-3p(SEQ IDNO：44)、hsa-miR-375(SEQ ID NO：45)、hsa-miR-451(SEQ ID NO：46)和hsa-miR-335(SEQ ID NO：47)。
在本发明范围内，区别肝细胞癌的表达特征可包含经鉴定为SEQ IDNO：37至SEQ ID NO：47的任一或多种核酸分子，但是不包含经鉴定为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36的前述核酸分子。然而，也可能的是区别肝细胞癌的表达特征可包含经鉴定为SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：47的任一或多种核酸分子及此外经鉴定为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36的任一或多种前述核酸分子。
上文提及的miRNA的核酸序列列于表2中。
表2
  miRNA   序列(5′→3′)
  hsa-miR-224   caagucacuagugguuccguu
  hsa-miR-532-3p   ccucccacacccaaggcuugca
  hsa-miR-663   aggcggggcgccgcgggaccgc
  hsa-miR-99b   cacccguagaaccgaccuugcg
  hsa-miR-362-5p   aauccuuggaaccuaggugugagu
  hsa-miR-652   aauggcgccacuaggguugug
  hsa-miR-222   agcuacaucuggcuacugggu
  hsa-miR-501-3p   aaugcacccgggcaaggauucu
  hsa-miR-375   uuuguucguucggcucgcguga
  hsa-miR-451   aaaccguuaccauuacugaguu
  hsa-miR-335   ucaagagcaauaacgaaaaaugu
特别优选地，与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222和hsa-miR-501-3p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-375、hsa-miR-451和hsa-miR-335的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在本发明的其它实施方案中，区别肝细胞癌的核酸表达特征包括至少任一或多种编码上述miRNA(SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：47)的核酸分子，且也含有编码在靶细胞和在一或多种分析的对照细胞中差异表达的任何其它miRNA序列的一或多种其它核酸分子，特别是编码选自如下一组的微RNA序列的任一或多种人类靶细胞衍生的核酸分子：hsa-miR-130b(SEQ ID NO：48)、hsa-miR-132(SEQ ID NO：49)、hsa-miR-106b(SEQ IDNO：50)、hsa-miR-125a-5p(SEQ ID NO：51)、hsa-miR-151-3p(SEQ IDNO：52)、hsa-miR-17(SEQ ID NO：53)、hsa-miR-21*(SEQ ID NO：54)、hsa-miR-25(SEQ ID NO：55)、hsa-miR-301a(SEQ ID NO：56)、hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO：57)、hsa-miR-425(SEQ ID NO：58)、hsa-miR-484(SEQ IDNO：59)、hsa-miR-500*(SEQ ID NO：60)、hsa-miR-502-3p(SEQ IDNO：61)、hsa-miR-502-5p(SEQ ID NO：62)、hsa-miR-532-5p(SEQ IDNO：63)、hsa-miR-769-5p(SEQ ID NO：64)、hsa-miR-93(SEQ ID NO：65)、hsa-miR-181b(SEQ ID NO：66)、hsa-miR-501-5p(SEQ ID NO：67)、hsa-miR-194(SEQ ID NO：68)、hsa-miR-199b-3p(SEQ ID NO：69)、和hsa-miR-215(SEQ ID NO：70)。
优选地，与一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-130b、hsa-miR-132、hsa-miR-106b、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-17、hsa-miR-21*、hsa-miR-25、hsa-miR-301a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-500*、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-181b和hsa-miR-501-5p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-194、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-215的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在其它优选的实施方案中，所述肝细胞癌症是癌栓，所述核酸表达特征包含编码如下序列的任一或多种核酸分子：hsa-miR-199b-5p(SEQ IDNO：71)、hsa-miR-21(SEQ ID NO：72)、hsa-miR-19b(SEQ ID NO：73)、hsa-miR-103(SEQ ID NO：74)、hsa-miR-23a(SEQ ID NO：75)、hsa-miR-125b-2*(SEQ ID NO：76)、hsa-miR-30c-2*(SEQ ID NO：77)、hsa-miR-505*(SEQ IDNO：78)和hsa-miR-203(SEQ ID NO：79)。
上文提及的miRNA的核酸序列列于表3中。
表3
在本发明范围内，区别癌栓的表达特征可包含经鉴定为SEQ IDNO：71至SEQ ID NO：79的任一或多种核酸分子，但是不包含经鉴定为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36的前述核酸分子。然而，也可能的是区别癌栓的表达特征可包含经鉴定为SEQ ID NO：71至SEQ ID NO：79的任一或多种核酸分子以及另外包含经鉴定为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36的任一或多种前述核酸分子。
特别优选地，与一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103和hsa-miR-23a的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在本发明的其它实施方案中，区别癌栓的核酸表达特征包括至少任一或多种编码上述miRNA的核酸分子(SEQ ID NO：71至SEQ ID NO：79)，且也含有编码在靶细胞与在分析的一或多种对照细胞中差异表达的任何其它miRNA序列的一或多种其它核酸分子，特别是编码选自如下一组的微RNA序列的任一或多种人类靶细胞衍生的核酸分子：hsa-let-7c(SEQ IDNO：80)、hsa-miR-122(SEQ ID NO：81)、hsa-miR-125b(SEQ ID NO：82)、hsa-miR-130a(SEQ ID NO：83)、hsa-miR-195(SEQ ID NO：84)、hsa-miR-30a(SEQ ID NO：85)、hsa-miR-126*(SEQ ID NO：86)、hsa-miR-128(SEQ IDNO：87)、hsa-miR-192*(SEQ ID NO：88)、hsa-miR-28-5p(SEQ ID NO：89)、hsa-miR-30a*(SEQ ID NO：90)、hsa-miR-30b*(SEQ ID NO：91)、hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO：92)、hsa-miR-497(SEQ ID NO：93)、hsa-miR-542-5p(SEQ ID NO：94)、hsa-miR-564(SEQ ID NO：95)、hsa-miR-590-5p(SEQ IDNO：96)、hsa-miR-340(SEQ ID NO：97)、hsa-miR-582-5p(SEQ ID NO：98)和hsa-miR-194*(SEQ ID NO：99)。
优选地，与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中任意这些核酸分子(SEQ ID NO：80至SEQ ID NO：99)的表达被下调。
在本发明进一步优选的实施方案中，诊断试剂盒的核酸表达特征包含任何一或多种编码选自如下一组的微RNA序列的人类靶细胞衍生的核酸分子：hsa-miR-505(SEQ ID NO：32)、hsa-miR-139-5p(SEQ ID NO：10)、hsa-miR-122*(SEQ ID NO：20)、hsa-miR-30a*(SEQ ID NO：90)、hsa-miR-30e*(SEQ ID NO：26)、hsa-miR-378*(SEQ ID NO：28)、hsa-miR-144*(SEQID NO：12)、hsa-miR-378(SEQ ID NO：27)、hsa-miR-100(SEQ ID NO：14)、hsa-miR-10a(SEQ ID NO：16)、hsa-miR-192*(SEQ ID NO：88)、hsa-miR-29c*(SEQ ID NO：24)、hsa-miR-194*(SEQ ID NO：99)、hsa-miR-215(SEQID NO：70)、hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO：7)、hsa-miR-335(SEQ IDNO：47)、hsa-miR-451(SEQ ID NO：46)、hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO：92)、hsa-miR-505*(SEQ ID NO：78)、hsa-miR-542-5p(SEQ ID NO：94)和hsa-miR-551b(SEQ ID NO：9)。
优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*的任一或多种核酸分子。
更优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*的任一或多种核酸分子。
在特别优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子。
上文提及的miRNA的核酸序列列于表4中。
表4
  miRNA   序列(5′-＞3′)
  hsa-miR-505   cgucaacacu ugcugguuuc cu
  hsa-miR-139-5p   ucuacagugc acgugucucc ag
  hsa-miR-122*   aacgccauua ucacacuaaa ua
  hsa-miR-30a*   cuuucagucg gauguuugca gc
  hsa-miR-30e*   cuuucagucg gauguuuaca gc
  hsa-miR-378*   cuccugacuc cagguccugu gu
  hsa-miR-144*   ggauaucauc auauacugua ag
  hsa-miR-378   acuggacuug gagucagaag g
  hsa-miR-100   aacccguaga uccgaacuug ug
  hsa-miR-10a   uacccuguag auccgaauuu gug
  hsa-miR-192*   cugccaauuc cauaggucac ag
  hsa-miR-29c*   ugaccgauuu cuccuggugu uc
  hsa-miR-194*   ccaguggggc ugcuguuauc ug
  hsa-miR-215   augaccuaug aauugacaga c
  hsa-miR-331-3p   gccccugggc cuauccuaga a
  hsa-miR-335   ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu
  hsa-miR-451   aaaccguuac cauuacugag uu
  hsa-miR-486-5p   uccuguacug agcugccccg ag
  hsa-miR-505*   gggagccagg aaguauugau gu
  hsa-miR-542-5p   ucggggauca ucaugucacg aga
  hsa-miR-551b   gcgacccaua cuugguuuca g
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36，D154-D158)。
特别优选地，与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在另外的具体实施方案中，诊断试剂盒进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
在进一步优选的实施方案中，肝细胞癌症是肝细胞癌，所述核酸表达特征包含任一或多种编码如下序列的核酸分子：hsa-miR-505(SEQ IDNO：32)、hsa-miR-139-5p(SEQ ID NO：10)、hsa-miR-122*(SEQ IDNO：20)、hsa-miR-30a*(SEQ ID NO：90)、hsa-miR-30e*(SEQ ID NO：26)、hsa-miR-378*(SEQ ID NO：28)、hsa-miR-144*(SEQ ID NO：12)、hsa-miR-378(SEQ ID NO：27)、hsa-miR-100(SEQ ID NO：14)、hsa-miR-10a(SEQ IDNO：16)、hsa-miR-192*(SEQ ID NO：88)、hsa-miR-29c*(SEQ ID NO：24)、hsa-miR-194*(SEQ ID NO：99)、hsa-miR-215(SEQ ID NO：70)、hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO：7)、hsa-miR-335(SEQ ID NO：47)、hsa-miR-451(SEQID NO：46)、hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO：92)、hsa-miR-505*(SEQ IDNO：78)、hsa-miR-542-5p(SEQ ID NO：94)和hsa-miR-551b(SEQ ID NO：9)。
特别优选地，与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在本发明的范围内，用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(即肝细胞癌和癌栓)倾向的一或多种靶细胞以及用于区别肝细胞癌和癌栓的表达特征分别可以包括表4中的任一或多种核酸分子。但是，也可能所述用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(即肝细胞癌和癌栓)倾向的一或多种靶细胞以及用于区别肝细胞癌和癌栓的表达特征分别可以包括本发明表1-3中的任一或多种核酸分子
第二方面，本发明涉及鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)在所述一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；
(b)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，
其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表如本文定义的核酸表达特征，其是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。
在本发明的优选实施方案中，所述方法进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
本发明的方法包括确定并对比在怀疑显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种靶细胞及在一或多种对照细胞中编码微RNA序列的多种核酸分子的表达水平，所述对照细胞通常是未示出这种癌表型特征的野生型细胞(参见上文所述)。
第三方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肝细胞癌症的方法，所述方法包括：
(a)通过使用如本文所述方法在一或多种靶细胞中鉴定核酸表达特征；及
(b)在所述一或多种细胞中修饰核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
如本文所用，术语“修饰编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未修饰的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未修饰的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。
在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被修饰，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一或多种癌靶细胞中的调节作用的反循环方式(anti-cyclical)的发生，以在所述一或多种靶细胞中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。
在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与待下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入一或多种靶细胞中。
如本文所用术语“导入细胞中”是指使得一或多种核酸分子转移进入细胞中的任何操纵。这种技术的例子包括本领域熟知的转染或转导技术(参见例如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular，Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley &Sons，Hoboken，NJ)。
如本文所用术语“互补序列”应理解为导入一或多种细胞中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。
两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。
“互补”核酸分子(即编码与待下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。
例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2′-O-甲基基团或者2′-O-甲氧基基团(也称作2′-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2′-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(参见例如Orom，U.A.et al.(2006)Gene 372，137-141)。
最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt，J.et al.(2005)Nature 438，685-689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为从转基因中产生的RNA的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert，M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4，721-726)。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达被下调的一或多种核酸分子编码选自如下组的微RNA序列：
(a)由hsa-miR-221、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-96、hsa-miR-18a、hsa-miR-18b、hsa-miR-30d、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-183及hsa-miR-551b组成的组，针对上述定义的假定是肿瘤侵袭性的指征的“一般(general)”表达特征；和/或
(b)由hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222及hsa-miR-501-3p组成的组，针对上述定义的用于区别肝细胞癌的表达特征；和/或
(c)由hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103及hsa-miR-23a组成的组，针对上述定义的用于区别癌栓的表达特征。
在本发明方法的另外特别优选的实施方案中，其表达待下调的一或多种核酸分子编码选自如下组的微RNA序列，所述组由hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b组成，针对上述定义的用于显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(由肝细胞癌和癌栓组成)倾向的表达特征
在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编码被上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入一或多种靶细胞中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。
在一个特别优选的实施方案中，其表达待上调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：
(a)由hsa-miR-139-5p、hsa-miR-144、hsa-miR-144*及hsa-miR-450a组成的组，针对上述定义的假定是肿瘤侵袭性的指征的“一般”表达特征；和/或
(b)由hsa-miR-375、hsa-miR-451及hsa-miR-335组成的组，针对上述定义的用于区别肝细胞癌的表达特征；和/或
(c)由hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*及hsa-miR-203组成的组，针对上述定义的用于区别癌栓的表达特征。
导入一或多种靶细胞中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达。
为了阐明癌或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的初步功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤抑制也可以参与肿瘤发生(综述参见例如Esquela-Kerscher，A.and Slack，F.J(2006)如前；Calin，G.A.and Croce，C.M.(2007)如前；Blenkiron，C.and Miska，E.A.(2007)如前)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤抑制基因以及癌基因。
如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。
为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5′非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或抑制子元件以及翻译信号和以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室的前导序列。另外，3′非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。
此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva，I.et al.(2006)Biomed.Pharmacother.60，633-638)。
因此，被导入提供的一或多种细胞中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。
第四方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防和/或治疗肝细胞癌症、优选表现为腺癌的肝细胞癌症的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码一种序列，该序列与如本文定义的其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补，和/或该序列相应于如本文定义的其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列。
在最后一方面中，本发明涉及这种药物组合物在制备预防和/或治疗肝细胞癌症、优选表现为腺癌的肝细胞癌症的药物中的应用。
在本发明范围内，合适的药物组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经含服和舌下)、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)施用的那些组合物，或者通过吸入(inhalation)或吹入(insufflation)施用的那些组合物。可以局部或全身性施用。优选通过口服或静脉内途径施用。所述制剂可以包装为独立剂量单位。
本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。
使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro，A.L.and Gennaro，A.R.(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.，LippincottWilliams & Wilkins，Philadelphia，PA；Crowder，T.M.et al.(2003) A Guide toPharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC，Boca Raton，FL；Niazi，S.K.(2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations，CRCPress，Boca Raton，FL)。
为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
所述药物组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。
为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。
一种方法包括将miRNA的过客链(passenger strand)(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek，J.et al.(2004)Nature 432，173-178)。或者，未缀合的PBS配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen，J.et al.(2008)Nature 452，896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包裹入特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(参见例如Zimmermann，T.S.et al.(2006)Nature 441，111-114所述))。近年来，描述了一类称作lipidoid的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc，A.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26，561-569)。
进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song，E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23，709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles，A.etal.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6，443-453；Kim，D.H.and Rossi，J.J.(2007)Nat.Genet.8，173-184)中。
本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。
实施例
实施例1：样品收集与制备
鉴别患者样品中显示结肠直肠癌或具有发生结肠直肠癌倾向的一或多种靶细胞的主要方法步骤示于图2。
如果发现异常区域，在手术(例如肝切除术)过程中取活组织检查样品。活组织检查样品通常直径大约0.5cm。将手术样本在收集时或收集后立即于液氮中速冻。样品也可以贮存于-80℃。
患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库用于匹配所收集的不同样品。病理学追踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(即对照、癌前期(例如肝硬化)、原发恶性肿瘤(例如肝细胞癌)或继发/转移恶性肿瘤(例如癌栓))以及保证样本的一致分级。
对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活显微镜光学器件集成的近红外激光二极管。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck，M.R.et al.(1996).Science 274，998-1001；Espina，V.et al.(2007)Expert Rev.Mol.Diagn.7，647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显微镜(Arcturus VeritasTM LaserCapture Microdissection Instrument(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA，USA)进行捕获步骤。
根据硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法(Chomczynski，P.and Sacchi，N.(1987)Anal.Biochem.162，156-159)使用TRIzol试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)根据厂商指导从样品中纯化总RNA。
使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)根据厂商指导分离miRNA群。
实施例2：样品中miRNA表达谱的分析
任选使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)根据厂商指导对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。通过应用Quantile方法及使用本领域已知的R软件将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。
在进行miRNA表达分析之前可以向样品中加入(“掺入(spiked-in)”)与总RNA浓度成一定比率的合成的异源miRNA，作为定量分析的内部阳性对照。这种“掺入”miRNA可以是植物miRNA，例如ath-miR168a、ath-miR162a、ppt-miR898b或者smo-miR1100，其与人基因或转录序列具有低同源性。或者，“掺入”miRNA可以是长度为18nt-30nt的任何序列，其与人基因或转录序列的同源性低于70％。
为验证(和/或定量)获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的实时定量RT-PCR，其采用TaqMan MicroRNA测定法(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)。
为了评估一特定miRNA在癌发生靶细胞中与在对照细胞中相比是否差异表达，使用如下标准：
(i)在至少30％的所测试肿瘤样品中差异表达≥2倍改变且p值(概率值)≤0.05；及
(ii)p值≤0.05/273(系数273归因于Bonferroni校正，因为在Agilent miRNA微阵列上273个人miRNA显示阳性信号)。
如果满足至少这些标准，则认为所述miRNA在靶细胞和对照细胞中分别差异表达。
通常，对于每个测量进行至少三个独立实验，确定的miRNA表达水平代表获得的各自的各个数据的平均值。
表达数据总结在下表4-6中。表4列出了显示在肝细胞癌(HCC)和癌栓(CE)中差异表达的miRNA。表5总结了显示仅在肝细胞癌中差异表达的miRNA，而表6列出了显示仅在癌栓中差异表达的miRNA。在“ID”栏中，缩写“k”表示在肝细胞癌症中已知的miRNA，“n”表示新鉴别的miRNA。差异表达的表达水平和程度列于“几何平均值”栏中。“SENS.”表示检测的灵敏度，即在HCC或CE样品中差异表达的miRNA的发生。特别优选的miRNA(表4中的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：13；表5中的SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：47；及表6中的SEQ ID NO：71至SEQ ID NO：79)以黑体示出。
表4
肝细胞癌及癌栓
表5
肝细胞癌
表6
癌栓
实施例3：样品收集和制备
鉴别患者样品中显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(即肝细胞癌和癌栓)倾向的一或多种靶细胞的主要方法步骤示于图2。
在外科手术(如肝切除术)中获取63个肝组织样本(13个正常组织、18个肝硬化、24个无栓HCC和8个癌栓)。将手术样品在收集后立即于液氮中速冻。样品可以贮存于-80℃。
患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库用于匹配所收集的各种样品。病理学跟踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(即对照、癌前期(例如肝硬化)、原发恶性肿瘤(例如肝细胞癌)或继发/转移恶性肿瘤(例如癌栓))以及保证样本的一致分级。
对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活显微镜光学器件集成的近红外激光二极管。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck，M.R.et al.(1996).Science 274，998-1001；Espina，V.et al.(2007)Expert Rev.Mol.Diagn.7，647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显微镜(Arcturus VeritasTM LaserCapture Microdissection Instrument(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA，USA)进行捕获步骤。
根据厂商(Ambion，Austin，TX)指导施用mirVana miRNA分离试剂盒从组织切片提取总RNA。通过NanoDrop 1000分光光度计(NanoDropTechnologies，Waltham，MA)定量浓度。RNA质量控制通过RNA 6000 PicoLabChip试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)进行。
实施例4：样品中miRNA表达谱的分析
任选使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)根据厂商指导对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。该微阵列含有来自Sanger数据库v.10.1的723种人miRNA的探针。来自63个经LCM选择的肝脏样品各自的总RNA(100ng)用作通过Cy3掺入标记的输入。微阵列片通过XDR Scan(PMT100，PMT5)扫描。标记和杂交按照Agilent miRNA微阵列系统中的方案进行。
针对单色(CY3)杂交获得的原始数据通过应用Quantile方法并使用本领域已知的GeneSpring GX10软件(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)进行归一化。
在用Bonferroni校正(q值＜/＝0.05)进行Fisher检验(F检验)后，使用非配对t-检验鉴定在正常肝脏分别和肝硬化、HCC或者癌栓之间差异表达的miRNA。从归一化的值计算正常和肿瘤样品之间的表达信号倍数变化。
进行p值＜0.001的单因素方差分析以决定正常-硬化组织(n＝31)和HCC-栓组织(n＝32)之间差异表达的miRNA。使用差异表达的miRNA用Pearson相关进行聚类分析
进行微阵列预测分析(PAM，Tibshirani et al.(2002).Proc Natl Acad Sci US A.99：6567-6572；http://www-stat.stanford.edu/～tibs/PAM)以从正常和硬化组织中预测肝细胞癌和癌栓。通过数据组中的10倍交叉验证精度选择阈值(以及由此选择基因亚组)。
为验证(和/或定量)获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的实时定量RT-PCR，其采用TaqMan MicroRNA测定法(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)。
为了评估一特定miRNA在癌发生靶细胞中与在对照细胞中相比是否差异表达，使用如下标准：
(i)q值＜0.05(q值＝p值×257，因子257是由于Bonferroni校正，因为在Agilent miRNA微阵列上257种人miRNA显示阳性信号)。
如果满足至少这些标准，则认为所述miRNA在靶细胞和对照细胞中分别差异表达。
通常，对于每个测量进行至少三个独立实验，确定的miRNA表达水平代表获得的各自的各个数据的平均值。
表达数据总结于如下的表7-8以及图3-5。表7列出在肝细胞癌(HCC)和癌栓(CE)差异表达的优选的miRNA。RUC＞0.900的特别优选的miRNA(分别是表7中的hsa-miR-505(SEQ ID NO：32)、hsa-miR-139-5p(SEQ ID NO：10)、hsa-miR-122*(SEQ ID NO：20)、hsa-miR-30a*(SEQ IDNO：90)、hsa-miR-30e*(SEQ ID NO：26)、hsa-miR-378*(SEQ ID NO：28)、hsa-miR-144*(SEQ ID NO：12)、hsa-miR-378(SEQ ID NO：27)、hsa-miR-100(SEQ ID NO：14)、hsa-miR-10a(SEQ ID NO：16)、hsa-miR-192*(SEQ IDNO：88)、hsa-miR-29c*(SEQ ID NO：24))以黑体示出。表8列出文献记载的肝细胞癌(HCC)中的miRNA。
表7
在肝细胞癌和癌栓发展中的miRNA
表8
文献记载的肝细胞癌(HCC)中的miRNA
所获得的结果证实在肝细胞癌症中miRNA表达的全局高特异性调节。因此，本文所述的miRNA的相应亚组代表独特的miRNA表达特征，用于肝细胞癌症的表达谱分析，其不仅使得可以鉴别癌发生状态(cancerogenous state)本身，而且使得可以区别不同类型的肿瘤，即肝细胞癌(原发恶性肿瘤)和癌栓(继发恶性肿瘤)。
因此，本文定义的miRNA表达特征不仅鉴别肝细胞癌症(HCC)，而且还使得可以对显示癌前状态或被认为具有癌前状态(例如肝硬化)的患者进行可靠的风险评估，而无论癌前状态是否发展为癌。换句话说，本文定义的miRNA表达特征使得可以预测具有发生HCC的倾向的患者的疾病发展。
这种癌症发展的风险评估在几个方面具有显著的临床重要性。本发明的miRNA表达特征的鉴别提供了独特的分子标记，使得可以在早期疾病期(即在恶性细胞的存在尚不能由原位技术或活组织检查样品或切除材料的显微镜分析检测到的阶段)就能检测HCC，由此HCC仍可以被显著地有效治疗。另外，癌症发展的预测可用于指导对显示HCC的癌前状态的患者的治疗决定。
在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。
本文广泛及上位地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。
其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。
本发明还涉及如下描述的进一步的实施方案：
1.用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，
其中所述多种核酸分子的一或多种在所述靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，及
其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。
2.1的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含至少五种核酸分子，优选至少八种核酸分子，特别优选至少十二种核酸分子。
3.1或2的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与在一或多种对照细胞中相比被上调的微RNA序列的核酸分子；及包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与在一或多种对照细胞中相比被下调的微RNA序列的核酸分子。
4.1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183、hsa-mir-551b、hsa-mir-139-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144*和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子。
5.4的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183和hsa-mir-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-mir-139-5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144*和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子的表达被下调。
6.1-5任一项的试剂盒，进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
7.6的试剂盒，其中所述肝细胞癌症是肝细胞癌，并且
其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-451和hsa-miR-335的任一或多种核酸分子。
8.7的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中，编码hsa-miR-224、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222和hsa-miR-501-3p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-375、hsa-miR-451和hsa-miR-335的任一或多种核酸分子的表达被下调。
9.6的试剂盒，其中所述肝细胞癌症是癌栓，并且
其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-23a、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子。
10.9的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-19b、hsa-miR-103和hsa-miR-23a的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子的表达被下调。
11.用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)在所述一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；
(b)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及
(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别在所述靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，
其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表如在1-10任一项定义的核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。
12.11的方法，其进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
13.用于在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肝细胞癌症的方法，所述方法包括：
(a)通过使用11或12的方法在一或多种靶细胞中鉴别核酸表达特征；及
(b)在所述一或多种细胞中修饰包含在核酸表达特征中的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，且其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
14.用于预防和/或治疗一或多种哺乳动物靶细胞中肝细胞癌症的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码与如1-10任一项所定义的其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补的序列，和/或相应于如1-10任一项所定义的其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列的序列。
15.14的药物组合物在制备预防和/或治疗肝细胞癌症的药物中的用途。

Claims (7)

1.用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，
其中所述多种核酸分子在所述靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，及
其中所述差异表达的多种核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征，
其中所述多种核酸分子包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*和hsa-miR-378*的核酸分子。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述多种核酸分子还包含编码hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*的任一或多种核酸分子。
3.权利要求1-2任一项的试剂盒，其中所述多种核酸分子还包含编码hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子。
4.权利要求3的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
5.权利要求1的试剂盒，其进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
6.权利要求3的试剂盒，其中所述肝细胞癌症是癌栓，并且
其中所述多种核酸分子包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542-5p和hsa-miR-551b的核酸分子。
7.权利要求6的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542-5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
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