CN104491878A - 一种含有miRNA-324的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

一种含有miRNA-324的药物组合物及其用途，药物组合物包括有效剂量的miRNA-324及其药学上可接受的载体、病毒或辅料；所述载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体或纳米颗粒，通过口服或注射，药物组合物的核苷酸序列为：5’-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3’；用于治疗心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化的心脏疾病。本发明的药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。

Description

一种含有miRNA-324的药物组合物及其用途

技术领域：

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种内源性非编码小RNAs的新药及其用途，尤其是一种含有miRNA-324的药物组合物及其预防或治疗心脏疾病的用途。

背景技术：

心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百多万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和；随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部近期公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡；由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的，所以寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，寻求提供一种含有miRNA-324的药物组合物及其预防或治疗心脏疾病的用途。

为了实现上述目的，本发明涉及的含有miRNA-324的药物组合物包括miRNA-324和药学上可接受的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-324的序列为5’-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选的，本发明中选择的病毒载体为腺病毒载体；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。

本发明中所述的药物组合物中过表达miRNA-324的病毒载体感染滴度为10¹⁶PFU。

药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种，优选的为注射用小水针剂或注射用冻干粉针。

本发明的含有miRNA-324的药物组合物，用于治疗心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化的心脏疾病。

本发明涉及的含有miRNA-324的核苷酸序列的药物组合物在心脏中高表达、心肌缺血损伤和缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中，miRNA-324表达显著下调；通过构建miRNA-324过表达腺病毒或miRNA-324转基因小鼠加强miRNA-324的表达能够抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少；心肌缺血再灌注损伤后，过表达miRNA-324能够减轻缺血再灌注损伤所致的凋亡，减小心肌梗死面积,过表达miRNA-324还能改善缺血再灌注损伤所致的心功能的损伤，抑制内源性的miRNA-324能够加重缺血再灌注损伤；miRNA-324通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-324对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值；给予miRNA-324反义核苷酸抑制miRNA-324的表达则能够诱导心肌细胞凋亡，心肌缺血损伤会加重。

本发明设计的药物组合物与现有技术相比，心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程miRNA-324表达显著下调，miRNA-324的下调能诱导心肌细胞凋亡的发生；miRNA-324在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达下调，过表达miRNA-324的心脏特异性转基因小鼠，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善。通过构建能够过表达miRNA-324的腺病毒从冠状动脉注射入小鼠心脏，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，动物模型证明miRNA-324对缺血性心脏病的治疗作用，将miRNA-324与载体包装形成药物分子，通过口服或注射用于防治心脏疾病和改善心脏功能，阻止心肌纤维化及心肌重构的发生；其药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。

附图说明：

图1为心肌缺血损伤及低氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-324表达水平的变化的试验结果示意图，图中A为原代心肌细胞缺氧处理miRNA-324表达水平的试验结果示意图；B为小鼠心肌缺血miRNA-324表达水平的试验结果示意图。

图2为miRNA-324抑制心肌细胞凋亡的实验结果示意图，图中A为原代心肌细胞感染miRNA-324腺病毒miRNA-324过量表达对细胞凋亡的作用实验结果示意图；图中B为原代心肌细胞感染miRNA-324腺病毒miRNA-324过量表达对细胞色素C的释放作用实验结果示意图。

图3为miRNA-324过表达抑制心肌缺血损伤实验结果示意图，图中A为小鼠经注射冠动脉miRNA-324病毒后，其心脏的左心室面积(LV)所占的百分比和危险区总面积(AAR)所占的百分比实验结果示意图；图中B为小鼠经注射冠动脉miRNA-324模拟物病毒后对缺血再灌注手术(I/R)引起的心肌凋亡的影响的实验结果示意图。

图4为小鼠静脉注射miRNA-324后再进行心肌缺血再灌注后24小时与野生型小鼠再灌24小时后的心功能状况比较，图中A为miRNA-324过量表达对小鼠的左室舒张末内径(LVIDd)的作用实验结果示意图；图中B为miRNA-324过量表达对左室收缩末内径(LVIDs)的作用实验结果示意图；图中C为miRNA-324过量表达对短轴截短率(FS)的作用实验结果示意图。

图5为小鼠静脉注射miRNA-324抑制剂抑制内源性miRNA-324及抑制剂阴性对照后缺血再灌注所致的比较实验结果示意图，图中A为心肌细胞凋亡的比较实验结果示意图，图中B为心肌梗死面积的比较实验结果示意图。

具体实施方式：

下面结合附图并通过实施例对本发明进一步说明，其实验小鼠均购自北京医科大学，品系均为C57。

实施例1、

心肌缺血及心肌细胞缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-324表达情况检测，本实施例对于心肌细胞凋亡实验模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Tan,etal,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase J Biol Chem.2008October 31；283(44):29730-29739)，低氧培养箱(氧浓度低于1％)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-324的表达水平，如图1A所示，miRNA-324表达水平在低氧处理10min～180min内显著下调。

本实施例以假手术处理的大鼠乳鼠原代心肌细胞作为对照组，采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-324的表达水平，如图1B所示，结果显示缺血10min～60min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组miRNA-324表达水平显著下降。

实施例2、

miRNA-324抑制心肌细胞凋亡的实验，本实施例涉及的miRNA-324腺病毒的构建采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒，具体方法如下：提取大鼠心脏的基因组，以其为模板，PCR扩增miRNA-324及其上下游两端各将近200个bp的序列(PCR体系50μL，PCR条件如下：95℃3min一个循环；95℃30s,56℃30s,72℃1min共28个循环；最后72℃延伸5min)，将该扩增片段用spe Ⅰ和xhoⅠ进行双酶切，再将腺病毒载体pSilencer Adeno CMV1.0穿梭载体(pSilencer AdenoCMV1.0shuttle vector载体)(购自Ambion公司)进行双酶切后与酶切后的片段进行连接，即将片段克隆入腺病毒载体中，PacⅠ酶切线性化该载体及腺病毒骨架(AdenovirusLacZ Backbone)，共转染HEK-293细胞(人胚肾细胞，购自上海研生生化试剂有限公司)，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。

本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。感染上述的miRNA-324腺病毒过表达miRNA-324，突变的miRNA-324腺病毒作为对照(即miRNA-对照)，病毒感染24小时后，在低氧培养箱中培养处理细胞3小时，诱导细胞凋亡；台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况，结果见图2A。同时又检测了细胞色素C的释放用来证明凋亡的发生(图2B)，其中线粒体部分以COXⅣ为阳性对照，细胞质部分以微管蛋白为阳性对照。结果显示过表达miRNA-324可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。

实施例3、

miRNA-324过表达抑制心肌缺血损伤实验验证，本实施例设计的小鼠经冠状动脉注射miRNA-324模拟物可显著抑制心肌缺血再灌注损伤，以C57小鼠为实验对象，按照如下方法注射miRNA-324模拟物(miRNA-324mimic)及miRNA-324模拟物阴性对照(miRNA-324mimic NC)，并以假手术处理小鼠为作为对照组，以C57小鼠为野生型。小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区；颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉,开胸,小心提起心包并剪开，充分暴露心脏；稀释2×10¹¹pfu(感染系数)腺病毒于PBS中，终体积为200μL，26号导管从心尖进入动脉根部，注射病毒时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒；监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔；等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中，心电图监测整个手术过程；注射病毒3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测，颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管；在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)，以ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志，缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注；以ST段下降为标志，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔，再灌注24h用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积；结果显示：注射miRNA-324mimic的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p<0.01)，见图3A；其心梗面积按如下方法计算：左心室面积(left ventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk，AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积；危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％，心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％；同时又检测了注射miRNA-324mimic对I/R的凋亡的影响，用细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)检测(图3B)，结果表明注射了miRNA-324mimic的组份与I/R组份相比凋亡率明显的减小，即miRNA-324对心肌具有保护作用。

实施例4、

miRNA-324过表达显著抑制心肌缺血再灌注引起的心功能的损伤，本实施例对实验小鼠分别进行假手术处理作为对照组，缺血再灌注手术处理作为为缺血再灌组，注射miRNA-324模拟物后进行缺血再灌注手术处理(作为miRNA-324模拟物)及注射miRNA-324模拟物阴性对照后再进行缺血再灌注手术处理(作为miRNA-324模拟物阴性对照)；以购自上海吉玛公司的一段无关序列为阴性对照序列，其不抑制现有已知的任何基因的表达，为了证明目标的小RNA即miRNA-324的有效性，在购买miRNA-324模拟物的时候公司都会配送一个目标小RNA的阴性对照以此来证明我们目标小RNA的有效性；对实验小鼠各组别进行超声心动的心功能检测，检测指标包括(图4A)左室舒张末内径(LVIDd)、(图4B)左室收缩末内径(LVIDs)和(图4C)短轴截短率(FS)，结果表明miRNA-324模拟物的注射可以改善缺血再灌手术造成的心功能的损伤。

实施例5、

抑制内源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死面积，本实施例对小鼠尾静脉30mg/kg注射miRNA-324抑制剂及阴性对照(功能同实施例4中相同的无序序列)，以假手术处理小鼠作为对照组；三天后进行缺血再灌注手术，再灌注3h监测心肌细胞凋亡，再灌注24小时用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积；与阴性对照注射组相比，miRNA-324抑制剂I/R组心肌细胞凋亡率明显增高(图5A)，心肌梗死面积显著增高(图5B)，说明抑制内源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死面积。

序列表

 

5’- CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3’

Claims (4)

1.一种含有miRNA-324的药物组合物，其特征在于药物组合物包括miRNA-324和药学上的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-324的序列为5’-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的一种含有miRNA-324的药物组合物，其特征在于药物组合物中过表达miRNA-324的病毒载体感染滴度为10¹⁶PFU。

3.根据权利要求1所述的一种含有miRNA-324的药物组合物，其特征在于药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、干粉剂型中的一种或多种。

4.一种含有miRNA-324的药物组合物的用途，其特征在于用于治疗心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化的心脏疾病。