CN105194651B

CN105194651B - Creg蛋白用于保护心肌缺血再灌注损伤的医药用途

Info

Publication number: CN105194651B
Application number: CN201510460110.0A
Authority: CN
Inventors: 韩雅玲; 闫承慧; 宋海旭; 田孝祥; 李洋
Original assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Current assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-07-30
Also published as: CN105194651A

Abstract

本发明涉及CREG蛋白的用途，具体涉及CREG蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。本发明还涉及表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。本发明还涉及含有CREG蛋白或其活性片段、表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞、或者能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调或促进CREG蛋白或其活性片段表达上调的制剂的组合物。

Description

CREG蛋白用于保护心肌缺血再灌注损伤的医药用途

技术领域

本发明涉及E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白的医药用途，具体涉及CREG蛋白或其活性片段用于制备对心肌缺血再灌注损伤具有明确保护作用的药物的用途。

背景技术

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)损伤是指心肌组织在较长时间缺血后恢复血液灌流，反而出现比再灌注前更明显更严重的损伤和功能障碍，包括收缩功能降低，冠状动脉血流量下降及血管反应性改变等。当前，对于急性冠状动脉梗死性疾病主要采取内科用药、介入治疗和冠脉搭桥等方法使冠脉再通，同时也可能发生心肌再灌注损伤。研究表明MIR损伤的发生机制主要包括氧自由基、中性粒细胞浸润、一氧化氮的产生、钙超载等，针对其发生机制采取清除自由基,“缺血后适应”处理,抑制Na⁺/Ca²⁺离子间的交换等处理手段，但是每种治疗方法都存在缺点和不足，所以如何更好地预防和治疗再灌注损伤是亟待解决的问题。

CREG是1998年美国哈佛大学医学院Gill从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆的一个转录相关调控因子，是一个在成熟组织细胞中广泛表达的小分子量分泌型糖蛋白，具有维持组织和细胞成熟分化的重要生理功能。近年发现CREG是一种溶酶体蛋白，但其对细胞的具体作用及其机制，以及与心肌缺血再灌注损伤的关系，目前尚不清楚。

发明内容

本发明通过大量实验证明，在小鼠心肌缺血再灌注时，CREG蛋白水平的表达水平下降。与野生小鼠相比,CREG杂合子小鼠心肌缺血再灌注28天后的心功能明显下降，当给予外源性重组CREG蛋白后心功能得到改善。并且进一步发现，在心肌缺血再灌注时CREG杂合子小鼠心肌中自噬体堆积，自噬溶酶体数量减少，自噬功能发生障碍，导致心肌细胞死亡增加，心功能下降。而给予外源性重组CREG蛋白后，自噬功能得到明显改善，心肌细胞死亡减少。可见，外源性重组CREG蛋白能够通过调控自噬溶酶体通路来对抗心肌缺血再灌注引起的心功能受损，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及CREG蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。

本发明还涉及表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途；其中所述重组细胞含有表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体，所述重组载体含有编码CREG蛋白或其活性片段的核苷酸序列。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

本发明还涉及能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调或促进CREG蛋白或其活性片段表达上调的制剂在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。

本发明还涉及CREG蛋白或其活性片段用于筛选预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。

本发明还涉及组合物，其含有CREG蛋白或其活性片段、表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞、能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调或促进CREG蛋白或其活性片段表达上调的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤。

本发明还涉及CREG蛋白或其活性片段用于在体内或体外对抗心肌缺血再灌注中心肌细胞损伤的用途。

以下对本发明做进一步描述。

在本发明中，所述CREG蛋白(即E1A激活基因阻遏子，cellular repressor ofE1A-stimulated gene)来源于哺乳动物，特别是来源于人。在本发明的实施方案中，所述CREG蛋白为重组CREG蛋白，其序列的GenBank号为NP_003842.1。在本发明的实施方案中，所述CREG基因的Genbank号为NM003851。

在本发明中，所述CREG蛋白的活性片段是指具有CREG蛋白功能的片段，其可以为CREG蛋白的一部分，也可以为CREG蛋白的氨基酸序列经过缺失、添加或替换后得到的片段；制备或得到CREG蛋白活性片段的方法为本领域所公知，例如该活性片段为包含CREG蛋白与配体或受体结合的部分的片段，或者经过氨基酸的缺失、添加或替换后仍保留CREG蛋白功能的片段。本领域技术人员公知，CREG蛋白上有一些关键的氨基酸和活性密切相关，突变后会影响蛋白的活性，例如，CREG蛋白第136及137位赖氨酸突变为丙氨酸，或者CREG蛋白第141-144位氨基酸缺失突变后，都会影响蛋白的活性和功能(Sacher M,PNAS,2005；102(51):18326-18331)。本领域技术人员可以根据需要避开上述这些可能影响活性的位点，对其它位点进行缺失、添加或替换等改造，使得改造后的CREG蛋白仍具有CREG蛋白的活性或功能。

在本发明中，所述心肌缺血再灌注损伤是指缺血心肌恢复再灌注后，病情反而恶化，引起超微结构、功能、代谢及电生理方面发生进一步的损伤，是在缺血损伤的基础上再次引起的损伤,如心脏手术、冠脉搭桥、脏器血供梗塞后再通(例如心肌梗死后再通)、器官移植(例如心脏移植)以及休克脏器(例如心脏)低灌流纠正后都可能发生再灌注损伤。

在本发明中，其中所述预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤是指抑制或减缓心肌缺血再灌注的发生、进展、和/或逆转其病理改变，例如包括缩小心肌坏死面积、减少心功能的下降、减少心肌细胞的凋亡、激活心肌自噬功能等。

在本发明中，获得重组CREG蛋白或其活性片段的方法为本领域所公知，例如可以通过将CREG蛋白或其活性片段的基因构建于表达载体中，然后将表达载体转入细胞中表达、纯化获得。

在本发明中，所述载体例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λB，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型Ad5-CREG，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉,武汉大学)，保藏号为CCTCC－V200801。该保藏信息已在中国专利CN 101475961A中公开。

在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入重组载体而得到。

在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌DH5α、JM109、Top10等，所述真核细胞例如可以为CHO细胞、293T细胞、血管平滑肌细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。

在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞，例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如FuGENE 6、X-tremeGENE和LipofectAmine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。

在本发明中，可以通过本领域公知的方法检测CREG蛋白或其活性片段的表达水平，例如通过扩增CREG蛋白或其活性片段的mRNA并进行定量或者Western blot来检测CREG蛋白或其活性片段的表达水平。

在本发明中，所述蛋白的表达水平是指mRNA的水平或者蛋白的水平。

在本发明中，所述CREG蛋白或其活性片段表达下调或上调是指CREG蛋白或其活性片段的表达水平与未经处理的细胞或组织相比，提高或降低至少25％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者提高大于100％。

在本发明的实施方案中，其中所述能够抑制CREG蛋白或其活性片段表达下调或促进CREG蛋白或其活性片段表达上调的制剂为本领域所公知，例如为能够与CREG蛋白或其活性片段结合的配体，或者能够提高CREG蛋白或其活性片段表达水平的调控分子，如启动子、增强子等。

在本发明中，CREG蛋白或其活性片段可以作为靶蛋白，用于筛选能够预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物。

附图说明

图1.心肌缺血再灌注时，CREG蛋白水平表达下降。

(A)未给予心肌缺血再灌注处理时，CREG的mRNA在野生型和给予外源性CREG蛋白的小鼠心肌中无差别，在杂合子心肌中表达最少。

(B)未给予小鼠心肌缺血再灌注处理时，CREG蛋白在CREG杂合子(CREG^+/-)小鼠的心肌中表达最少，在给予外源性重组CREG蛋白的小鼠(re-CREG^+/+)心肌中表达最多。

(C-D)小鼠心肌缺血再灌注时，CREG蛋白表达逐渐下降，杂合子小鼠下降更为明显。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图2.心肌缺血再灌注后，野生型(CREG^+/+)、给予外源性重组CREG蛋白的CREG^+/+和CREG^+/-三类小鼠心功能的比较。

(A-C)心肌缺血再灌注28天后野生型(CREG^+/+)、给予外源性重组CREG蛋白的CREG^+/+和CREG^+/-小鼠的心功能比较。其中EF是指左室射血分数，FS是指左室短轴缩短率。

(D-E)心肌缺血再灌注24h后野生型(CREG^+/+)、给予外源性重组CREG蛋白的CREG^+/+和CREG^+/-三类小鼠心肌TTC染色比较。(IS/AAR指心肌坏死面积比心肌缺血面积)

图3.心肌缺血再灌注后CREG^+/+、给予外源性重组CREG蛋白的CREG^+/+和CREG^+/-三类小鼠心肌凋亡和自噬蛋白的表达变化

(A-B)Tunel染色检测三类小鼠心肌细胞凋亡情况。

(C-D)western blot检测三种小鼠心肌细胞凋亡蛋白cleaved caspase3的表达情况。

(E)免疫荧光染色检测三种小鼠心肌中自噬蛋白LC3B的表达。

(F)western blot检测三种小鼠心肌中自噬蛋白的表达情况。

图4.心肌缺血再灌注后给予小鼠自噬抑制剂氯喹，观察心肌凋亡和自噬的表达情况

(A)免疫荧光染色检测两种小鼠心肌中自噬蛋白LC3B的表达。

(B)western blot检测两种小鼠心肌中自噬指标蛋白的表达情况。

(C-D)Tunel染色检测心肌缺血再灌注后给予外源性重组CREG蛋白CREG^+/+小鼠和同时给予重组蛋白、氯喹小鼠的心肌凋亡。

(E-F)western blot检测上述两种小鼠心肌凋亡蛋白cleaved caspase3的表达。

图5.在H9C2心肌细胞系上检测CREG调控自噬对抗凋亡保护心肌细胞的作用

(A-C)建立CREG低表达和过表达模型，即应用siRNA和腺病毒转染H9C2细胞，并在RNA和蛋白水平检测转染的效率。

(D-E)应用去血清饥饿处理，诱导不同组别的细胞，western blot检测凋亡蛋白cleaved caspase3的表达。

(F-G)western blot检测上述细胞中自噬指标蛋白的表达情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS 17.0软件包处理。P<0.05为有统计学差异。

实施例1.给予小鼠心肌缺血再灌注处理能够使心肌中CREG蛋白的表达下调

①小鼠心肌缺血再灌注模型的建立

术前准备好各种器械、材料和药品；开胸结扎冠脉左前降支的步骤和方法：胸骨左侧2mm切开皮肤，钝性分离肌肉见肋骨，在第四肋间隙用眼科剪轻轻向下分离肋间肌，向上伸入血管钳反复夹闭两根肋骨以减少出血。剪断3、4肋骨，用拉钩拉开胸壁，在两侧胸壁肌肉分别穿一双线留小圈在内侧。小心剪开心包膜，用棉签轻压住心脏。在左心耳下缘2mm左右进针，进针深约1.5mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向出针，针距约2-3mm，分别将线两端穿入小圈内。留线暂不结扎。稳定10分钟后再收紧结扎线，连同小段聚已烯管结扎(起压迫血管作用)。立即观察心电图，以出现QRS波高大增宽为结扎成功标志(S-T段不一定可见改变，见文献)，记时缺血时间。30min后轻拉松结线，打开血管再灌注，立即观察心电图，数分钟后应该出现QRS波回落变窄。

②心肌缺血再灌注后CREG的mRNA水平检测

分别以C57BL/6来源的野生型(CREG^+/+)小鼠、CREG杂合子(CREG^+/-)小鼠和给予外源性重组CREG蛋白(以皮下埋微渗透泵的方式给药，300μg/kg·d，Abcam公司购买)的野生型小鼠为研究对象，观察心肌缺血再灌注后CREG的表达变化。

采用RT-PCR的方法检测小鼠心肌中CREG表达情况。取CREG^+/+、CREG^+/-和以皮下埋微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌组织，加Trizol裂解液1ml，提取心肌组织总RNA。根据GenBank中小鼠CREG mRNA序列(NM_011804.2)，设计并合成的小鼠CREG基因RT-PCR引物如下：

小鼠CREG上游引物：5’-GAGGAAGAGAGGTGCAGGTG-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物：5’-CATTGCTGTCCTCGACTGAA-3’(SEQ ID NO：2)；内参GAPDH上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO：3)，下游引物：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

将提取的RNA合成cDNA后(TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是：37℃，15min；85℃，5s)，通过下列反应体系和反应条件扩增出小鼠CREG编码序列共250个碱基。

具体条件：

dH₂O 9.5μl

2×Taq Master Mix(康为公司) 12.5μl

上游引物 1μl

下游引物 1μl

模板cDNA 1μl

95℃，3min

94℃，30s；59℃，30s；72℃，1min，30个循环

72℃，10min

扩增产物经2％的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。CREG^+/-和CREG^+/+小鼠心肌组织裂解产物，可检测到大小约为250bp的cDNA表达条带。结果提示：CREG^+/-小鼠心肌中CREG表达量较CREG^+/+和给予外源性重组CREG蛋白的小鼠明显减少(结果见图1)。

③应用western blot检测心肌缺血再灌注后心肌中CREG蛋白的表达

采用western blot的方法检测小鼠心肌中CREG蛋白的表达情况。取CREG^+/+、CREG^+/-和以皮下埋微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌组织，裂解心肌组织后采用BCA比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度，将45μg蛋白加入4×Loading buffer,95℃煮沸5min后，经10％分离胶行SDS-PAGE电泳，判断电泳终止时间。以350mA的电流将样品转到纤维素膜上，时间为80min；在TBS-T稀释的5％脱脂奶粉中常温封闭1.5h后加入一抗(抗CREG抗体，1:1000，抗β-actin抗体，1:2000)4℃孵育过夜；第二天放置摇床上摇晃30min后TBS-T洗膜3次，每次15min；加入兔抗鼠的二抗(1:1000稀释)，常温孵育2h，TBS-T洗膜4次，每次20min；ECL化学发光显影。

结果提示：心肌缺血再灌注后，CREG蛋白的表达随着再灌注时间的延长而逐渐下降，杂合子小鼠下降更加明显(结果见图1)。

实施例2.小鼠心肌中CREG蛋白的表达变化能够影响小鼠的心功能

①心肌缺血再灌注28天时CREG^+/+和CREG^+/-心功能的比较。采用加拿大VisualSonics公司的Vevo2100超声生物显微镜成像系统，探头中心频率30MHz。2％异氟烷对小鼠进行麻醉后，剔除胸腹部毛发。将小鼠仰卧位固定于恒温检查台，温度保持37℃，同步记录小鼠心电、呼吸等生理参数，心率维持在450次/min左右，心率稳定1min后前胸涂抹耦合剂行超声生物显微镜检查。结果显示，心肌缺血再灌注28天后，CREG^+/-小鼠较CREG^+/+小鼠的心功能明显下降，而给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心功能明显改善(结果见图2)。

②心肌缺血再灌注24h时CREG^+/+、CREG^+/-和给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌缺血坏死的比较

TTC染色结果提示：CREG^+/-较CREG^+/+小鼠的心肌坏死面积明显增多。

上述研究结果显示：心肌缺血再灌注时CREG蛋白的表达与小鼠心功能呈正相关，CREG^+/-小鼠心肌中CREG蛋白的表达最少，心功能最差，而给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌中CREG蛋白表达最多，心功能最好(结果见图1，2)。

实施例3.在心肌缺血再灌注时给予外源性重组CREG蛋白能够减少小鼠心肌细胞的凋亡，并进一步激活自噬的发生

①采用Tunel染色的方法检测三种小鼠心肌中心肌细胞的凋亡情况。Tunel染色时配制染色所需试剂后，将冰冻组织切片置4％的多聚甲醛中室温固定10min，PBS洗2次，每次10min。3％过氧化氢甲醇溶液20min后，PBS洗3次，每次5min，0.1％枸橼酸钠冰上2min，Tunel染色配制液加入样本表面后37℃温箱孵育1h，避光；PBS浸洗，DAPI染色细胞核。结果提示：在心肌缺血再灌注后CREG^+/-小鼠的心肌细胞凋亡最多，而给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌凋亡的数目最少(结果见图3)，说明CREG具有对抗心肌细胞凋亡的作用。

②应用western blot检测心肌中凋亡蛋白的表达。采用western blot的技术方法检测小鼠心肌缺血再灌注后心肌中凋亡指标蛋白cleaved caspase3的表达情况，结果发现CREG^+/-小鼠心肌中cleaved caspase3的表达最多，而给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌中表达最少(结果见图3)，结果验证了Tunel染色的结果，再次说明了CREG蛋白对抗心肌凋亡的作用。

③免疫荧光染色观察心肌中自噬蛋白LC3B的表达

a.冰冻切片室温晾干15min；

b.用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10min，以去除OCT；

c.用含10％正常血清的PBS室温封闭切片1h，此步不洗涤，把封闭液吸干即可；

d.加入兔抗小鼠自噬微管相关蛋白轻链3(LC3B)单抗(1:100)(购自英国cellsignaling公司)，4℃孵育过夜；

e. PBS洗3次，每次10min；

f.加入荧光标记二抗(1:100)(驴抗兔Alex488标记，美国Invitrogen公司)，室温孵育2h；

g. PBS洗3次，每次15min；

h.封片后，荧光显微镜观察结果并拍照。

结果显示，心肌缺血再灌注不同时相，给予外源性重组CREG蛋白的小鼠心肌中LC3B表达量较CREG^+/+小鼠明显增多(结果见图3E)。

④western blot检测三种小鼠心肌中自噬蛋白的表达情况

采用western blot的技术方法，检测在心肌缺血再灌注不同时相中三种小鼠心肌自噬蛋白的表达，结果发现CREG^+/-小鼠的心肌中自噬底物蛋白P62发生堆积(结果见图3F)，提示自噬功能存在障碍，而给予外源性重组CREG蛋白的小鼠自噬功能进一步激活，提示CREG促进小鼠缺血再灌注损伤过程中心肌组织自噬的发生。

实施例4.给予溶酶体抑制剂氯喹，观察心肌中凋亡和自噬的表达

①Tunel染色观察心肌中心肌细胞的凋亡情况。

应用Tunel染色的技术方法发现同时予氯喹组和重组CREG蛋白的小鼠，在心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡数量较只给予重组CREG蛋白的小鼠明显增多(结果见图4)。

②western blot检测三种小鼠心肌中自噬蛋白的表达情况。

结果表明凋亡蛋白cleaved caspase3在同时予氯喹组和重组蛋白的小鼠心肌中表达增多。

③免疫荧光染色观察心肌中自噬蛋白LC3B的表达。

应用免疫荧光染色发现给予氯喹组的小鼠在心肌缺血再灌注后自噬蛋白LC3B的表达较对照组明显增多，该结果提示氯喹抑制了自噬过程，导致了LC3B的堆积。

④western blot检测两种小鼠心肌中自噬蛋白的表达情况

采用western blot的技术方法，检测在心肌缺血再灌注不同时相中两种小鼠心肌自噬蛋白的表达。结果发现，给予外源性重组CREG蛋白的小鼠其自噬功能进一步激活，提示CREG促进了自噬的发生(结果见图4)。

以上结果提示，CREG可能通过上调自噬通路来抑制凋亡，从而起到保护心肌的作用。

实施例5.在H9C2心肌细胞系上检测CREG调控自噬对抗凋亡保护心肌细胞的作用

①为了研究CREG基因过表达对H9C2中CREG mRNA和蛋白表达的影响，我们首先建立CREG基因过表达的细胞模型。携带人CREG基因的重组腺病毒(Ad5-CREG)的制备参见中国专利200810000053.8(公开号CN101475961A)，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉,武汉大学)，保藏号为CCTCC－V200801。该保藏信息已在中国专利CN101475961A中公开。只表达GFP蛋白的腺病毒(Ad-GFP)作为对照。将H9C2接种于培养瓶中，次日，以感染倍数(MOI)为300的浓度分别感染Ad-CREG-GFP和Ad-GFP，培养48h后收集细胞，进行CREG基因表达的检测。

收集Ad-CREG-GFP和Ad-GFP转染的细胞，提取mRNA进行逆转录后，RT-PCR检测CREG基因的表达情况，方法同实施例1。结果显示，Ad-CREG-GFP组细胞中hCREG mRNA表达水平显著升高，提示CREG基因过表达的H9C2细胞模型建立成功。

②研究CREG基因低表达对H9C2中CREG mRNA和蛋白表达的影响。首先建立CREG低表达的模型。使用CREG small interfering(siRNA)(SANTA CRUZ)和FuGENE HDTransfection Reagent(Promega)3天，通过RT-PCR和western blot检测模型是否建立成功。

③给予细胞模型和对照组细胞去血清饥饿处理，并应用Tunel染色和westernblot检测不同组细胞凋亡和自噬情况。

Tunel染色和western blot检测表明，CREG低表达组细胞凋亡数量最多，凋亡蛋白cleaved caspase3表达最高，而CREG过表达组细胞凋亡数量最少，凋亡蛋白cleavedcaspase3表达最低。

western blot检测发现CREG低表达组自噬蛋白LC3A和P62明显堆积，提示自噬功能受到抑制，而CREG过表达组自噬进一步激活；在去血清处理细胞的基础上给予溶酶体抑制剂氯喹时，CREG过表达组凋亡和自噬蛋白表达与对照组无明显区别(以上各实验结果见图5)。

上述研究结果提示，重组CREG蛋白有望成为预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的有效药物。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.CREG蛋白在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。

2.表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途；其中所述重组细胞含有表达CREG蛋白的重组载体，所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤是指抑制或减缓心肌缺血再灌注的发生、进展、和/或逆转其病理改变。