KR102044530B1 - Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Nkx3.2 및/또는 이의 단편은 산화 스트레스에 의한 망막변성을 억제하고, 시각기능을 보존한다. 또한, 상기 Nkx3.2 및/또는 이의 단편은 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제하며, 맥락막 신생혈관 및 망막 부종을 억제한다. 따라서, 상기 Nkx3.2 및/또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환 또는 황반변성의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
우리 사회가 고령화 사회로 진입하면서 노화와 관련된 질병 및 이의 치료법에 대해 관심이 높아지고 있다. 다양한 노인성 질환 중, 대표적인 노인성 안구 질환인 황반변성은 눈 안쪽 망막 중심부에 위치한 황반부에 변성이 일어나 시력장애가 생기는 질환이다.
신체의 노화에 의해 황반 기능이 저하되어 시력이 떨어지거나 상실하는 질환인 황반변성은 노년기 시력상실의 주요 원인이다. 황반변성은 보통 50-60대에 나타나는 질병이지만, 드물게 젊은 연령층에서 발병하기도 한다. 상기 질병의 원인으로는 신체의 노화, 심혈관계 질병, 흡연, 높은 혈중 콜레스테롤, 환경오염, 햇빛 노출 등이 알려져 있다.
황반변성의 종류는 건성 황반변성과 습성 황반변성이 있다. 건성 황반변성은 망막에 드루젠이라는 일종의 노화 퇴적물이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우이며, 황반변성 환자의 약 90%는 건성 형태의 황반변성을 가지고 있다. 건성 황반변성은 황반에 있는 시세포가 서서히 위축되어 시간이 지날수록 시력이 점차 감소하게 되고, 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 습성 황반변성은 맥락막에 비정상적으로 신생혈관이 생겨, 이 혈관 자체 또는 혈관으로부터의 출혈, 삼출 등에 의해 심한 시력 손상이 발생하기 쉽다. 습성 황반변성은 발병 후 수개월-수년 사이에 원반형 위축, 심한 출혈 등으로 실명을 초래할 수 있다(Oh, M.J. & Lee, S.Y., 2012).
한편, 황반변성으로 인해 시력장애가 시작되면 이전의 시력으로 회복할 수 없기 때문에 조기에 발견하여 치료하는 것이 중요하다. 황반변성은 황반변성 자가검진표인 암슬러 그리드를 이용하면 조기에 발견할 수 있다. 이와 같이, 황반변성은 조기에 발견하여 치료하면 시력상실을 최소화할 수 있지만, 아직까지 확실한 치료법이 없는 실정이다.
Oh, M.J., & Lee, S.Y. (2012). Ocular Diseases and Hypertension. Korean Journal of Medicine, 83(5), 591-595. doi:10.3904/kjm.2012.83.5.591
이에, 본 발명자들은 황반변성(macular degeneration) 치료제를 연구하던 중, Nkx3.2 및/또는 이의 단편이 산화 스트레스에 의한 망막색소상피세포의 사멸 및 망막변성의 억제, 시각기능의 보존, 맥락막 신생혈관 및 망막 부종의 억제 등 망막질환의 예방 또는 치료에 탁월한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Nkx3.2 및/또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서, 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산에서 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며,
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산에서 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 Nkx3.2 및/또는 이의 단편인 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 Nkx3.2 및/또는 이의 단편은 산화 스트레스에 의한 망막변성을 억제하고, 시각기능을 보존한다. 또한, 상기 Nkx3.2 및/또는 이의 단편은 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제하며, 맥락막 신생혈관 및 망막 부종을 억제한다. 따라서, 상기 Nkx3.2 및/또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 면역조직화학염색을 통해 C57BL/6 마우스의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다. 이때, OS는 산화 스트레스(oxidative stress)의 약어이다.
도 2는 면역조직화학염색을 통해 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 3은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다. 이때, WB abs는 웨스턴 블롯 항체(western blot antibodies)의 약어이다.
도 4는 산화 스트레스에 의한 망막변성 마우스 모델에서의 망막색소상피 병변을 나타낸 것이다.
도 5는 면역조직화학염색을 통해 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스를 제작하기 위한 방법을 도식화하여 나타낸 것이다. 도 7에 나타나는 약어의 의미는 다음과 같다: ci-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2(Cre-inducible Nkx3.2); ciTg-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2 트랜스제닉(Cre-inducible Nkx3.2 transgenic); tpA, 전사 정지(Transcription Stop).
도 8은 면역조직화학염색을 통해 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스의 망막색소상피에서 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 망막 평판 절개(Flat mount)를 통해 Nkx3.2 단백질의 발현 수준에 따른 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 안구 기저부(Fundus image) 촬영기법을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 광 간섭성 단층 촬영기법(optical coherence tomography, OCT)을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 조직병리 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 망막전위도검사(electroretinography, ERG)를 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 시각기능 보존 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 생존도를 나타낸 것이다.
도 15는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 사멸율을 나타낸 것이다.
도 16은 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 사멸 표지 인자인 Cleaved PARP 단백질의 발현 수준 및 Nkx3.2 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 17은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 바이러스(Lenti-Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 18은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 억제 바이러스(sh-Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 19a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후, 망막 혈관을 안저조영술로 촬영한 것이다.
도 19b는 안저조영술로 촬영 이미지를 바탕으로 wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변 크기의 차이를 비교한 것이다.
도 20a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후, 망막부위를 광간섭단층촬영법으로 촬영한 것이다.
도 20b는 광간섭단층촬영 이미지를 바탕으로 wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 망막 부종의 차이를 비교한 것이다.
도 2는 면역조직화학염색을 통해 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 3은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다. 이때, WB abs는 웨스턴 블롯 항체(western blot antibodies)의 약어이다.
도 4는 산화 스트레스에 의한 망막변성 마우스 모델에서의 망막색소상피 병변을 나타낸 것이다.
도 5는 면역조직화학염색을 통해 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스를 제작하기 위한 방법을 도식화하여 나타낸 것이다. 도 7에 나타나는 약어의 의미는 다음과 같다: ci-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2(Cre-inducible Nkx3.2); ciTg-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2 트랜스제닉(Cre-inducible Nkx3.2 transgenic); tpA, 전사 정지(Transcription Stop).
도 8은 면역조직화학염색을 통해 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스의 망막색소상피에서 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 망막 평판 절개(Flat mount)를 통해 Nkx3.2 단백질의 발현 수준에 따른 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 안구 기저부(Fundus image) 촬영기법을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 광 간섭성 단층 촬영기법(optical coherence tomography, OCT)을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 조직병리 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 망막전위도검사(electroretinography, ERG)를 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 시각기능 보존 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 생존도를 나타낸 것이다.
도 15는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 사멸율을 나타낸 것이다.
도 16은 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 사멸 표지 인자인 Cleaved PARP 단백질의 발현 수준 및 Nkx3.2 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 17은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 바이러스(Lenti-Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 18은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 억제 바이러스(sh-Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 19a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후, 망막 혈관을 안저조영술로 촬영한 것이다.
도 19b는 안저조영술로 촬영 이미지를 바탕으로 wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변 크기의 차이를 비교한 것이다.
도 20a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후, 망막부위를 광간섭단층촬영법으로 촬영한 것이다.
도 20b는 광간섭단층촬영 이미지를 바탕으로 wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 망막 부종의 차이를 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 측면으로, Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Nkx3.2"는 NK3 homeobox 2라고도 불리우며, NK 속(family)의 호메오박스를 포함하는 단백질 중 하나이다. Nkx3.2는 골격 발달 및 기관 분화에 중요한 역할을 한다. 특히, Nkx3.2는 연골세포로의 분화를 촉진시키고, 연골세포의 비대를 지연시키며, 연골 세포의 자멸을 억제시킨다고 알려져 있다. 상기 Nkx3.2는 인간 유래의 단백질일 수 있다. 이때, Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 서열번호 8의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서 사용된 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기의 실질적인 동일성을 갖는 Nkx3.2 단백질은 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 Nkx3.2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이때, Nkx3.2 단백질의 변이체란 Nkx3.2 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 상기 Nkx3.2 단백질은 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화 또는 파르네실화(farnesylation) 등으로 수식될 수 있다.
상기 Nkx3.2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook, J. et al., 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press).
본 명세서에서 사용된 용어, "Nkx3.2 단편"은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 (I).
상기 식 (I)에서, 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 또한, N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산에서 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 또한, C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산에서 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "코어 도메인"은, 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "N-말단 확장 도메인"은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 123번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개 또는 42개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "C-말단 확장 도메인"은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 서열번호 6의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 Nkx3.2 단백질의 단편으로서, 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 천연형의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도, 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 천연형의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써, 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 단편은 서열번호 20의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 87개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 단편은 서열번호 20의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 39개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산의 결실은 서열번호 20의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 양쪽 전부에서 발생할 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 (I).
상기 식 (I)에서, 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 또한, N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 또한, C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 이때, 상기 코어 도메인, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인은 앞서 기술한 바와 같으며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다.
상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노-부속 바이러스(AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형(serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1 내지 AAV9 중 어느 하나일 수 있다.
상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "망막질환"은 노화, 질병 등의 이유로 망막에 발생한 손상에 따른 질병을 의미하며, 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 황반변성은 노화가 진행함에 따라 황반 기능이 저하되어 시력이 떨어지거나 상실되는 질병으로서, 이 질병으로 인해 시력이 떨어지기 시작하면 이전의 시력으로 회복할 수 없다. 상기 질병은 노인성 황반변성으로 불리우며 노년기 시력상실의 주요 원인이다. 상기 황반변성은 건성 황반변성 및 습성 황반변성 두 종류로 구분된다. 황반변성을 앓고 있는 환자의 약 90%는 건성 황반변성이며, 이는 노화 퇴적물이 망막 아래에 쌓이거나 망막색소상피 위축과 같은 병변이 생긴 경우이다. 황반에 있는 시세포가 서서히 파괴되므로 시간이 지나면서 황반 기능이 떨어지고 중심부 시력이 감소하게 된다. 습성 황반변성은 황반부의 아래층을 구성하는 맥락막에 비정상적으로 새로운 혈관이 많이 생성되어 증상이 발생한다. 습성 황반변성은 건성 황반변성에 비해 진행이 빨라 시력이 급격히 떨어질 수 있고, 2개월 내지 3년 사이에 실명할 수 있다.
상기 당뇨병성 망막병증은 당뇨병에 의한 말초 순환 장애로 인해 눈의 망막에 발생한 합병증이다. 상기 질병은 초기에는 증상이 없다가 황반부의 침범이 일어나면서 시력저하의 증상을 나타낼 수 있다. 상기 당뇨병성 망막병증은 진행 단계에 따라 단순망막증, 증식전망막증 및 증식망막증으로 나뉠 수 있다.
상기 맥락막 신생혈관증은 정상적이지 않은 혈관이 생겨남으로 인해 맥락막이 손상되어 시력장애가 발생하는 질병이다. 상기 맥락막 신생혈관증은 전세계적으로 비가역적인 시력 손실의 주된 원인 중의 하나이며, 여러 가지의 치료 시도에도 불구하고 시력 예후는 대부분의 환자에서 좋지 않다.
상기 망막부종은 망막이 부었음을 의미한다. 여러가지 이유로 인해 망막 또는 황반 내에 모세혈관과 같은 미세한 혈관에 변성 또는 이상이 발생함에 따라 출혈이 나타나게 되고 그 결과 망막부종이 발생할 수 있다. 망막에 부종이 발생하게 되면, 시력저하를 비롯한 다양한 증상이 나타날 수 있다.
상기 Nkx3.2 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 Nkx3.2의 단편인 폴리펩타이드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015, 1.0x107 내지 1.0x1013, 1.0x108 내지 1.0x1012 또는 1.0x109 내지 1.0x1010의 양으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 Nkx3.2 또는 이의 단편; 또는 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의의 단편인 폴리펩타이드; 또는 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 Nkx3.2의 단편인 폴리펩타이드의 유효량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015, 1.0x107 내지 1.0x1013, 1.0x108 내지 1.0x1012 또는 1.0x109 내지 1.0x1010의 양으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 이를 필요로 하는 개체에 투여될 있다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 구체적으로 상기 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 및 피내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 N-말단 부위, C-말단 부위 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 부위를 결실시키는 단계를 포함하는, 체내 안정성이 증가된 Nkx3.2 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 N-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 199개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 N-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 41개, 98개, 111개 또는 122개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 N-말단 부위가 결실된 Nkx3.2 단편은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 결실은 서열번호 7의 100번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 99개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 52개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 C-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 26개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 C-말단 부위가 결실된 Nkx3.2 단편은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 결실은 서열번호 7의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 39개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산의 결실은 N-말단 부위 및 C-말단 부위 중 어느 하나 또는 양쪽에서 발생할 수 있다. 일 구체예로, 상기 아미노산 결실은 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단 방향으로부터 C-말단 방향으로 98개 내지 164개, 구체적으로 98개, 104개, 109개, 111개, 122개, 129개, 149개, 152개, 155개, 158개, 161개 또는 164개의 아미노산이 연속적으로 결실되고, 동시에 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개 내지 23개, 구체적으로 3개, 6개, 9개, 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 N-말단 부위 및 C-말단 부위 양쪽 모두에서 아미노산 결실이 발생한 Nkx3.2 단편은 서열번호 15 내지 서열번호 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다. N-말단 부위 및 C-말단 부위 양쪽에서 상기 아미노산 잔기의 결실은 통상의 기술자에 의해 적절한 방법으로 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
준비예
1. 실험 안구 조직의 준비
C57BL/6 마우스를 구입하여, 승인된 동물시설에서 특정한 무균상태로 보관하였다. 소정의 실험 프로토콜에 따라 정상 C57BL/6 마우스의 안구를 적출하여 조직을 분리하였다.
또한, 인체 안구 조직을 구입하여, 승인한 시설에서 특정한 무균상태로 보관하였다.
실험예
1.
망막색소상피세포에서
Nkx3
.2 발현 확인
안구 망막색소상피층에서 Nkx3.2 단백질의 발현이 보고된 적이 없기 때문에, 면역조직화학적 염색기법(immunohistochemistry staining, IHC staining) 및 웨스턴 블롯 분석기법(western blot analysis)을 사용하여 이에 대한 검증을 수행하였다.
면역조직화학 염색기법을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비된 C57BL/6 마우스 안구 조직 및 인체 안구 조직에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
또한, 상기 준비예 1에서 준비된 인간 안구 조직으로부터 각막(cornea)과 망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE)를 분리하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 망막색소상피세포에서 특이적으로 발현을 보이는 RPE65 단백질과 함께 C57BL/6 마우스 및 인간의 안구조직에서 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 안구 앞쪽(frontal, F)에 비하여 RPE65의 발현이 높은 안구의 뒤쪽(hind, H)에서 Nkx3.2 단백질이 더 높게 발현함을 확인하였다.
실험예
2. 산화 스트레스에 의한 망막변성 모델에서
Nkx3
.2 발현 확인
면역조직화학적 염색기법(immunohistochemistry staining, IHC staining) 및 웨스턴 블롯 분석기법(western blot analysis)을 사용하여 산화 스트레스에 의한 망막변성 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다.
요오드산나트륨(NaIO3)을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비한 C57BL/6 마우스 안구에 산화 스트레스를 유도함으로써 망막변성 마우스 모델을 구축하였다. 이후, 현미경을 이용하여 망막변성 마우스 모델에서의 병변을 관찰하였다. 또한, 면역조직화학 염색기법을 이용하여 상기 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
또한, 상기 망막변성 마우스 모델의 조직으로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, NaIO3를 이용하여 산화 스트레스를 유도함으로써 망막변성 마우스 모델에서 망막색소상피 병변을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 망막색소상피 병변이 확인된 망막변성 마우스 모델에서 Nkx3.2 단백질이 감소함을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 산화스트레스에 의한 망막변성 모델에서 Nkx3.2 단백질 발현이 확연히 감소함을 확인하였고, 이는 망막색소상피의 표지인자인 RPE65의 감소보다 선행하는 초기적 변화임을 확인하였다.
실험예
3.
망막색소상피세포에서
Nkx3
.2를 과발현하는 마우스의 제작
본 연구팀은 선행 논문에서 Cre 의존적 Nkx3.2 과발현 마우스를 발표하였다(Jeong, Da-Un, Je-Yong Choi, and Dae-Won Kim. "Cartilage-Specific and Cre-Dependent Nkx3. 2 Overexpression In Vivo Causes Skeletal Dwarfism by Delaying Cartilage Hypertrophy." Journal of cellular physiology 232.1 (2017): 78-90.). 이를 토대로 망막색소상피세포 특이적 Cre 발현을 나타내는 BEST1-Cre 마우스를 이용하여, Cre 유전자 재조합효소에 의한 Nkx3.2 과발현이 오직 망막색소상피세포에서만 일어나도록 하였다. 해당 마우스 제작 전략을 도식화하여 도 7에 나타내었다.
또한, 상기 제작된 Nkx3.2 과발현 마우스의 망막색소상피세포에서 Nkx3.2의 발현을 면역조직화학 염색기법을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Cre 유전자 재조합효소에 의한 Nkx3.2 과발현이 오직 망막색소상피세포에서만 일어나도록 제작된 마우스의 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 단백질의 과발현이 검증되었다.
실험예
4.
Nkx3
.2 과발현에 의한
망막색소상피세포
억제 효과 확인
상기 실험예 3에서 제작된 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에서 NaIO3를 이용하여 산화 스트레스에 의한 망막변성을 유도하였다.
4.1. 망막 평판 절개(Flat mount)
산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 반구 형태의 망막을 평판으로 절개하여 망막변성 병변을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, Nkx3.2 단백질 비과발현(ci-Nkx3.2) 마우스에서 산화 스트레스에 의해 망막변성이 뚜렷하게 관찰되었다. 반면, Nkx3.2 과발현(ciTg-Nkx3.2) 마우스에서는 산화 스트레스에 의해 망막변성이 관찰되지 않았다.
4.2. 안구 기저부 촬영(
Fundus
image)
산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 안구 기저부 활영기법을 통하여 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 정상 대조군(Norm)은 시신경을 중심으로 균일하고 고른 형태의 망막곡면을 보이며 정상적인 망막반사를 나타내었다. 반면 Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군(AMD)은 갈라지는 망막색소상피를 보이며 저반사 양상을 나타내었다. 이에 반해, Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군(AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조를 보였다.
4.3.
광간섭단층촬영
산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 광 간섭성 단층 촬영기법을 통하여 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 정상 대조군(Norm)은 망막의 다층적 구조를 잘 나타내는 반면, Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군(AMD)은 망막변성이 심하여 망막의 다층 구조가 심각하게 손상되었다. 이에 반해, Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군(AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조를 보였다.
4.4. 조직 병리학적 분석
산화스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 조직학적으로 분석한 것이다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 정상 대조군(Norm)은 망막의 정상 구조와 망막색소상피층의 정상적인 막구조가 관찰되었다. 반면, Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군(AMD)은 망막색소상피층이 심각하게 손상되고 소실되었다. 이에 반해, Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군(AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조 및 망막색소상피층 양상이 관찰되었다.
실험예
5.
Nkx3
.2 과발현에 의한 시각기능 보존 효과 확인
망막전위도검사(electroretinography, ERG)를 통해 Nkx3.2 과발현에 의한 시각기능 보존 효과를 확인하였다.
상기 실험예 4에서 산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스의 시각기능을 ERG를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 정상 대조군(Normal)은 망막의 외부 빛 자극에 대하여 정상적인 망막전위도 변화를 보였다. 반면, Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군(AMD)은 외부 빛 자극에 대한 망막전위도 변화가 완전히 소실되었다. 이에 반해, Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군(AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막전위도 변화를 나타내었다.
실험예
6. 산화 스트레스를 유도하는
H
2
O
2
농도에 따른 세포 생존력, 세포 사멸률,
Nkx3
.2 단백질 발현 확인
인간 망막색소상피세포에 400 μM, 600 μM, 800 μM, 1 mM의 과산화수소(H2O2)를 각각 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. 이후, WST 분석기법(water-soluble tetrazolium salt assay)을 사용하여 산화 스트레스를 유도하는 H2O2 농도에 따른 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
또한, 아넥신 V-FITC 아폽토시스 키트(annexin V-FITC apoptosis kit)(Sigma-Aldrich)를 이용하여 상기와 같이 농도별로 H2O2를 처리하여 산화 스트레스가 유도된 인간 망막색소상피세포의 세포 사멸률을 측정하였다. 또한, 웨스턴 블롯 분석기법을 통하여 세포 사멸률 증가에 따른 Nkx3.2 단백질 발현 수준의 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, H2O2 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하였다. 또한, 도 15에 나타난 바와 같이, H2O2 농도가 증가할수록 세포 사멸률이 증가하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, H2O2 농도가 증가할수록 세포 사멸 표지인자인 cleaved PARP 단백질의 발현이 증가하였다. 즉, 세포 사멸 표지인자인 cleaved PARP 단백질의 발현 증가가 세포 사멸을 발생시킴을 단백질 수준에서 검증하였다. 또한, 상기 cleaved PARP 단백질의 발현이 증가할수록 Nkx3.2 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다.
실험예
7.
Nkx3
.2 단백질 발현 바이러스 투여 후 세포 사멸률 측정
인간 망막색소상피세포에 800 μM의 H2O2를 처리하여 산화 스트레스를 유도하였고, 상기 산화 스트레스가 유도된 세포를 두 그룹으로 나누었다. 한 그룹에는 Nkx3.2 발현 바이러스(Lenti-Nkx3.2)를 투여하였고, 나머지 다른 그룹에는 Nkx3.2 발현 억제 바이러스(sh-Nkx3.2)를 투여하였다. 이후, 아넥신 V-FITC 아폽토시스 키트를 사용하여 각 바이러스 투여에 따른 인간 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포사멸률을 측정하였다. 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 인간 망막색소상피세포에 Nkx3.2 발현 바이러스(Lenti-Nkx3.2) 투여시 H2O2에 의한 세포 사멸률이 대조군 바이러스(Lenti-Ctrl) 투여군에 비해 감소하였다. 또한, 도 18에 나타난 바와 같이, 인간 망막색소상피세포에 Nkx3.2 발현 억제 바이러스(sh-Nkx3.2) 투여시 H2O2에 의한 세포 사멸률이 대조군 바이러스(sh-Ctrl) 투여군에 비해 증가하였다.
실험예
8.
Nkx3
.2 과발현에 의한 맥락막 신생혈관 억제 효과 확인
망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization, CNV)을 유도하였다. 9일 후, 마우스에 조영제를 복강 주사하여 망막혈관에 대한 안저조영술(fundus fluorescence angiography, FAA)을 시행하였다. 상기 안저조영술로부터 확보한 이미지를 바탕으로 맥락막 신생혈관 병변의 CTF를 측정하였고, wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변 크기의 차이를 비교하였다. 그 결과를 도 19a 및 도 19b에 나타내었다.
도 19a 및 도 19b에 나타난 바와 같이, Nkx3.2 과발현 마우스(G2)의 맥락막 신생혈관 병변에 대한 CTF 수치(29414.8 ± 43200.47)가 wild type 마우스(G1)의 CTF 수치(124942.3 ± 91743.74)보다 유의성 있게 감소하였다(P<0.05). 이를 통해, Nkx3.2는 맥락막 신생혈관을 억제하는 데에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
실험예
9.
Nkx3
.2 과발현에 의한 망막 부종 억제 효과 확인
망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에서 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후, 9일 째에 맥락막 신생혈관을 유도한 망막부위에 대한 광 간섭성 단층촬영기술을 실시하였다. 상기 광 간섭성 단층촬영으로부터 확보한 이미지를 바탕으로 wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변에서 야기된 망막 부종 양상의 차이를 비교하였다. 그 결과를 도 20a 및 도 20b에 나타내었다.
도 20a 및 도 20b에 나타난 바와 같이, Nkx3.2 과발현 마우스(G2)에서 맥락막 신생혈관 병변의 망막 두께(220.6 ± 10.47 microns)가 wild type 마우스(G1)의 망막 두께(259.8 ± 13.08 microns)보다 유의성 있게 감소하였다 (P<0.01). 이를 통해, 맥락막 신생혈관을 유도하는 과정에서 파괴된 혈액망막장벽으로 인하여 2차적으로 야기된 망막 부종은 Nkx3.2 과발현 마우스에서 wild type 마우스보다 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다.
<110> ICM Co., Ltd
<120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING RETINAL DISEASES
COMPRISING Nkx3.2 AND FRAGMENT THEREOF
<130> FPD/201803-0020
<150> KR 10-2017-0051757
<151> 2017-04-21
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 166-309 aa fragment of Nkx3.2
<400> 1
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
35 40 45
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
50 55 60
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
65 70 75 80
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
85 90 95
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
115 120 125
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
130 135 140
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding 166-309 aa fragment of Nkx3.2
<400> 2
ggtgttggcc ccagaggtgc acacgtgtcc gcgctgtgca gcggggccgg cggcgggggc 60
ggcagcgggc cggcaggcgt cgcggaggag gaggaggagc cggcggcgcc caagccacgc 120
aagaagcgct cgcgggccgc tttctcccac gcgcaggtct tcgagctgga gcgccgcttt 180
aaccaccagc gctacctgtc cgggcccgag cgcgcagacc tggccgcgtc gctgaagctc 240
accgagacgc aggtgaaaat ctggttccag aaccgtcgct acaagacaaa gcgccggcag 300
atggcagccg acctgctggc ctcggcgccc gccgccaaga aggtggccgt aaaggtgctg 360
gtgcgcgacg accagagaca atacctgccc ggcgaagtgc tgcggccacc ctcgcttctg 420
ccactgcagc cc 432
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 123-165 aa fragment of Nkx3.2
<400> 3
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
35 40
<210> 4
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding 123-165 aa fragment of Nkx3.2
<400> 4
ttgagcctcg gccagccggt ctgtgagctg gccgcttcca aagacctaga ggaggaagcc 60
gcgggccgga gcgacagcga gatgtccgcc agcgtctcag gcgaccgcag cccaaggacc 120
gaggacgac 129
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 310-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 5
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
20
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding 310-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 6
tcctactatt acccgtacta ctgcctccca ggctgggcgc tctccacctg cgcagctgcc 60
gcaggcaccc ag 72
<210> 7
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nkx3.2
<400> 7
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
325 330
<210> 8
<211> 1002
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nkx3.2
<400> 8
atggctgtgc gcggcgccaa caccttgacg tccttctcca tccaggcgat cctcaacaag 60
aaagaggagc gcggcgggct ggccgcgcca gaggggcgcc cggcgcccgg gggcacagcg 120
gcatcggtgg ccgcggctcc cgctgtctgc tgttggcggc tctttgggga gagggacgcg 180
ggcgcgttgg ggggcgccga ggactctctg ctggcgtctc ctgccggtac cagaacagct 240
gcggggcgga ctgcggagag cccggaaggc tgggactcgg actccgcgct cagcgaggag 300
aacgagagca ggcggcgctg cgcggacgcg cggggggcca gcggggccgg ccttgcgggg 360
ggatccttga gcctcggcca gccggtctgt gagctggccg cttccaaaga cctagaggag 420
gaagccgcgg gccggagcga cagcgagatg tccgccagcg tctcaggcga ccgcagccca 480
aggaccgagg acgacggtgt tggccccaga ggtgcacacg tgtccgcgct gtgcagcggg 540
gccggcggcg ggggcggcag cgggccggca ggcgtcgcgg aggaggagga ggagccggcg 600
gcgcccaagc cacgcaagaa gcgctcgcgg gccgctttct cccacgcgca ggtcttcgag 660
ctggagcgcc gctttaacca ccagcgctac ctgtccgggc ccgagcgcgc agacctggcc 720
gcgtcgctga agctcaccga gacgcaggtg aaaatctggt tccagaaccg tcgctacaag 780
acaaagcgcc ggcagatggc agccgacctg ctggcctcgg cgcccgccgc caagaaggtg 840
gccgtaaagg tgctggtgcg cgacgaccag agacaatacc tgcccggcga agtgctgcgg 900
ccaccctcgc ttctgccact gcagccctcc tactattacc cgtactactg cctcccaggc 960
tgggcgctct ccacctgcgc agctgccgca ggcacccagt ga 1002
<210> 9
<211> 320
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1-320 aa fragment of Nkx3.2
<400> 9
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
<210> 10
<211> 307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1-307 aa fragment of Nkx3.2
<400> 10
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu
305
<210> 11
<211> 292
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 42-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 11
Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu
1 5 10 15
Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu
35 40 45
Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg
50 55 60
Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp
85 90 95
Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser
100 105 110
Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro
115 120 125
Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln
165 170 175
Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly
180 185 190
Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln
195 200 205
Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln
210 215 220
Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala
225 230 235 240
Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu
245 250 255
Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr
260 265 270
Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Gly Thr Gln
290
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 99-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 12
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
225 230 235
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 112-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 13
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
210 215 220
<210> 14
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 123-333 aa fragment of Nkx3.2
<400> 14
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Gly Thr Gln
210
<210> 15
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 99-330 aa fragment of Nkx3.2
<400> 15
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
225 230
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 99-327 aa fragment of Nkx3.2
<400> 16
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala
225
<210> 17
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 99-320 aa fragment of Nkx3.2
<400> 17
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
210 215 220
<210> 18
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 105-327 aa fragment of Nkx3.2
<400> 18
Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys
20 25 30
Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala
35 40 45
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
50 55 60
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
100 105 110
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
130 135 140
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
145 150 155 160
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
165 170 175
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
180 185 190
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
195 200 205
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala
210 215 220
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<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 110-324 aa fragment of Nkx3.2
<400> 19
Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp
35 40 45
Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His
50 55 60
Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
65 70 75 80
Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg
85 90 95
Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu
100 105 110
Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala
115 120 125
Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp
130 135 140
Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp
145 150 155 160
Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu
165 170 175
Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 112-320 aa fragment of Nkx3.2
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Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
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145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly
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Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
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Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
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100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
195
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<400> 22
Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg
1 5 10 15
Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg
20 25 30
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
35 40 45
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
50 55 60
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
65 70 75 80
Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe
85 90 95
Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
115 120 125
Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp
145 150 155 160
Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu
165 170 175
Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
180 185 190
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 150-320 aa fragment of Nkx3.2
<400> 23
Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
1 5 10 15
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
35 40 45
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
50 55 60
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
100 105 110
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
130 135 140
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
165 170
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<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 153-318 aa fragment of Nkx3.2
<400> 24
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
50 55 60
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
85 90 95
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
100 105 110
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
115 120 125
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
130 135 140
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu
165
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 156-316 aa fragment of Nkx3.2
<400> 25
Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe
50 55 60
Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu
65 70 75 80
Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys
85 90 95
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala
100 105 110
Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys
115 120 125
Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu
130 135 140
Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr
145 150 155 160
Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 159-314 aa fragment of Nkx3.2
<400> 26
Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala
20 25 30
Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys
35 40 45
Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu
50 55 60
Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp
65 70 75 80
Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe
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100 105 110
Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val
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Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 162-312 polypeptide fragment of Nkx3.2
<400> 27
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
1 5 10 15
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
35 40 45
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50 55 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 165-310 polypeptide fragment of Nkx3.2
<400> 28
Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala
35 40 45
Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln
50 55 60
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Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala
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Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln
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Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Ser
145
Claims (28)
- Nkx3.2를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 Nkx3.2가 서열번호 7의 아미노산 서열인, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 망막질환이 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물. - 제18항에 있어서,
상기 황반변성이 건성 황반변성 또는 습성 황반변성인, 약학 조성물. - Nkx3.2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제20항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것인, 약학 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 망막질환이 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물. - 제25항에 있어서,
상기 황반변성이 건성 황반변성 또는 습성 황반변성인, 약학 조성물. - 삭제
- 삭제
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