WO2018194423A1 - Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2018194423A1
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seq
amino acid
terminal
terminus
pharmaceutical composition
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PCT/KR2018/004635
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김대원
정다운
엄영나
류희영
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아이씨엠 주식회사
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • composition for the treatment of retinal disease containing Nkx3.2 and fragments thereof as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, comprising Nkx3.2 and fragments thereof as an active ingredient.
  • macular degeneration which is a representative senile eye disease, is a disease in which vision disorder occurs due to degeneration of the macula located in the central retina of the eye.
  • Macular degeneration a disease in which macular function is degraded due to aging of the body and the vision is reduced or lost, is a major cause of vision loss in old age. Macular degeneration usually occurs in the 50s and 60s, but rarely occurs in younger age groups. The causes of the disease are aging of the body, cardiovascular disease, smoking, high blood cholesterol, environmental pollution, exposure to sunlight and the like.
  • Dry macular degeneration is a type of aging deposit called drusen or atrophy of the retinal pigment epithelium in the retina. And about 90% of patients with macular degeneration have dry macular degeneration. Dry macular degeneration can gradually develop in the macular form, with shrinkage of the cells in the macula, causing the visual acuity to gradually decrease over time, and not to cause severe visual loss. Wet macular degeneration tends to result in abnormal neovascularization of the choroid, causing severe visual impairment due to bleeding or exudation from the vessel itself or the vessel. Wet macular degeneration can lead to blindness due to disc atrophy and severe bleeding between months and years (Oh, M. J. & Lee, S. Y., 2012).
  • the present invention has been found to have an excellent effect on the prevention or treatment of retinal diseases such as choroidal neovascularization and retinal edema.
  • Nkx3.2 and / or fragments thereof as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of retinal diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of retinal diseases, including Nkx3.2 or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a polypeptide wherein the Nkx3.2 fragment is represented by the following formula (I):
  • the core domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the N-terminal extension domain is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 3 and continuously deleting 1 to 42 amino acids from the N-terminus to the C-terminal direction.
  • the C-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, starting from the amino acid at position 24 of SEQ ID NO: 5, and continuously deleting 1 to 23 amino acids from the C-terminus to the N-terminal direction. Can be.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating retinal disease, which comprises administering to a subject a polypeptide which is the Nkx3.2 and / or fragment thereof.
  • Nkx3.2 and / or fragments thereof according to the present invention are produced by oxidative stress It suppresses retinal degeneration and preserves visual function.
  • the Nkx3.2 and / or fragments thereof inhibit cell death by oxidative stress of retinal pigment epithelial cells, and inhibit choroidal neovascularization and retinal edema. Therefore, the composition containing the Nkx3.2 and / or fragments thereof as an active ingredient can be usefully used for the prevention or treatment of retinal diseases.
  • OS is an abbreviation for oxidative stress (oxi dat i ve st ress).
  • Figure 2 shows Nkx3.2 protein expression in human retinal pigment epithelial cells through immunohistochemical staining.
  • FIG. 3 shows Nkx3.2 protein expression in human retinal pigment epithelial cells using Western blot analysis.
  • WB abs is an abbreviation for western ern blot ant i bodi es.
  • Figure 4 shows the retinal pigment epithelial lesion in the retinal degeneration mouse model by oxidative stress.
  • Figure 5 shows Nkx3.2 protein expression in retinal degeneration mouse model via immunohistochemical staining.
  • FIG. 6 shows expression of Nkx3.2 protein in retinal degeneration mouse model using Western blot analysis.
  • Figure 7 shows a schematic diagram of a method for preparing retinal pigment epithelial cell specific Nkx3.2 overexpressing mice. The meanings of the abbreviations shown in FIG. 7 are as follows: ci-Nkx3.2, Cre-inducible Nkx3.2; ciTg-Nkx3.2, Cre-incluciMe Nkx3.2 transgenic; tpA, Transcription Stop.
  • Figure 8 shows the expression of Nkx3.2 protein in retinal pigment epithelium of retinal pigment epithelial cell specific Nkx3.2 overexpressing mouse through immunohistochemical staining.
  • Figure 9 shows the degree of retinal degeneration according to the expression level of the Nkx3.2 protein through the retinal flat plate (Flat mount).
  • Figure 10 shows the degree of retinal degeneration of the mouse according to the expression level of Nkx3.2 through the Fundus image imaging technique.
  • Figure 11 shows the degree of retinal degeneration of the mouse according to Nkx3.2 expression level through optical coherence tomography (OCT).
  • OCT optical coherence tomography
  • Figure 12 shows the degree of retinal degeneration of the mouse according to Nkx3.2 protein expression level through histopathology.
  • Figure 13 shows the effect of preserving the visual function of the mouse according to Nkx3.2 protein expression level through electroretinography (ERG).
  • Figure 14 shows the cell viability according to 3 ⁇ 40 2 concentration inducing oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells.
  • Figure 15 shows the cell death rate according to 3 ⁇ 40 2 concentration inducing oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells.
  • FIG. 16 shows the expression level of Cl eaved PARP protein and Nkx3.2 protein, which are cell death markers, according to 3 ⁇ 40 2 concentration, which induces oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells, by Western blot analysis.
  • Figure 17 shows the degree of cell death by oxidative stress in the treatment of Nkx3.2 expressing virus (Lent i-Nkx3.2) in human retinal pigment epithelial cells.
  • Figure 18 shows the degree of cell death due to oxidative stress in the treatment of Nkx3.2 expression inhibitory virus (sh-Nkx3.2) in human retinal pigment epithelial cells.
  • FIG. 19A shows that Nkx3.2 overexpressing mice are irradiated with laser to induce choroidal neovascularization, and then retinal vessels are taken by fundus angiography.
  • 19B is a comparison of choroidal neovascular lesion size between wild type mice and Nkx3.2 overexpressing mice based on the image taken by fundus angiography.
  • FIG. 20A shows that the Nkx3.2 overexpressing mouse was irradiated with a laser to induce choroidal neovascularization, and the retinal region was photographed by optical coherence tomography.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, including Nkx3.2 or a fragment thereof as an active ingredient.
  • Nkx3.2 is also called NK3 homeobox 2, NK It is one of the proteins that contains homeoboxes of the family. Nkx3.2 plays an important role in skeletal development and organ differentiation. In particular, Nkx3.2 is known to promote differentiation into chondrocytes, delay chondrocyte hypertrophy and inhibit chondrocyte apoptosis.
  • the Nkx3.2 may be a protein of human origin. At this time, the Nkx3.2 protein may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the Nkx3.2 protein may comprise an amino acid sequence showing substantial identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • Nkx3.2 protein with substantial identity above means an amino acid sequence exhibiting homology of 80%, 90%, 95%, 98% or 99%.
  • the Nkx3.2 protein used in the present invention may be included in the scope of the present invention as well as a protein having its native amino acid sequence as well as its amino acid sequence variants.
  • the ' variant ' of the Nkx3.2 protein means a protein having a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination of the natural amino acid sequence of the Nkx3.2 protein and one or more amino acid residues.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neuroath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / He, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the Nkx3.2 protein is phosphorylated, sulfided, acrylated, glycosylated, methylated or farnesylation (farnesylation) Or the like.
  • Nkx3.2 protein or variant thereof may be extracted from nature or synthesized (Merri field, J. 1 ⁇ 2er. Chem. Soc .. 85: 2149-2156, 1963) or prepared by recombinant methods based on DNA sequences. (Sambrook, J. et al., 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press).
  • the term "Nkx3.2 fragment” as used herein may be a polypeptide represented by the following formula (I):
  • N-terminal extension domain core domain
  • C terminal extension domain (I).
  • the core domain is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 3, and continuously from 1 to 42 amino acids in the C-terminal direction from the N- terminal Can be deleted.
  • the C-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, starting from the amino acid at position 24 of SEQ ID NO: 5, consecutively from 1 to 23 amino acids from the C-terminal to the N-terminal direction Can be deleted.
  • core domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence from No. 166 to No. 309 of the full-length Nkx3.2 protein.
  • the full-length Nkx3.2 protein refers to the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • the core domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is of SEQ ID NO: 2 Can be encoded by a nucleotide sequence.
  • N ⁇ terminal extension domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence from No. 123 to No. 165 of the full-length Nkx3.2 protein as a domain bound to the N-terminus of the core domain described above. do.
  • the N-terminal extension domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the N-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or 1, 2, 3, 4 from the N-terminal to the C-terminal direction starting from the amino acid at position 1 of the polypeptide 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 127) 1, 13, 14, 15 , 16, ⁇ 7 '18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41 or 42 amino acid residues may be deleted.
  • C—terminal extension domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence of Nos. 310 to 333 of the full-length Nkx3.2 protein as a domain bound to the C1 terminus of the core domain described above. do.
  • the C-terminal extension domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, which may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the C-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or 1, 2, 3, 4 from the C- terminal to the N-terminal direction starting from the amino acid at position 24 of the polypeptide Dog, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven,. 12, 13, 14, 15 ⁇ 16, 17, 18, 19, 20 ⁇ 21, 22 or 23
  • the amino acid residue may be deleted.
  • the polypeptide may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 or 28.
  • the polypeptide is a fragment of the Nkx3.2 protein and does not exist in vivo. However, the polypeptide has the same activity as that of the native Nkx3.2 protein, but is not easily degraded in vivo, so that the polypeptide is present in the body for a long time as compared to the native Nkx3.2 protein, thereby exhibiting better activity.
  • the present invention provides a polypeptide having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or a fragment thereof.
  • the fragment may be one that is consecutively deleted from 1 to 87 amino acids from the N-terminal to the C-terminal direction starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 20.
  • the fragment may be one from the amino acid at position 320 of SEQ ID NO: 20 to be continuously deleted from 1 to 39 amino acids in the N-terminal direction from the end of C '.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease, including a recombinant virus containing a polynucleotide encoding Nkx3.2 or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the Nkx3.2 fragment may be a polypeptide represented by the following formula (I): N-terminal extension domain-core domain-C-terminal extension domain (I).
  • the core domain is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 3, and from 1 to 42 amino acids consecutively from the N-terminal direction to the C-terminal direction.
  • the C ⁇ terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, starting from the amino acid at position 24 of SEQ ID NO: 5, and from 1 to 23 amino acids consecutively from the C-terminal to the N-terminal direction. Can be deleted.
  • the polynucleotide is an amino acid of SEQ ID NO: 14, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, or 28 It may be a nucleotide sequence encoding the sequence.
  • the virus may be any one selected from the group consisting of adenoviruses, Adeno-associated viruses (AAV), retroviruses, lentiviruses, herpes simplex virus and vaccinia virus.
  • the virus may be adeno-associated virus (AAV).
  • AAV adeno-associated virus
  • the adeno appendage virus is not limited to a specific serotype, and may preferably be any of MV1 to MV9.
  • the adeno-associated virus is capable of infecting non-dividing cells and is suitable as a gene delivery system of the present invention because it has the ability to infect various kinds of cells. Details of the manufacture and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368.
  • MV viruses can be prepared by co-transfection of a plasmid comprising the gene sequence of interest with two MV terminal repeats flanked by and an expression plasmid comprising a wild type MV coding sequence without terminal repeats.
  • the term "retinal disease” refers to a disease caused by damage to the retina due to aging, disease, etc., any one selected from the group consisting of macular degeneration, diabetic retinopathy, choroidal neoangiopathy and retinal edema Can be.
  • the macular degeneration is a disease in which the macular function is degraded due to aging and the vision is reduced or lost, and when the vision begins to fall due to the disease, it cannot be restored to the previous vision.
  • the disease is called senile macular degeneration and is a major cause of old age vision loss.
  • the macular degeneration is divided into two types: dry macular degeneration and wet macular degeneration.
  • Diabetic retinopathy is a complication occurring in the retina of the eye due to peripheral circulation disorder caused by diabetes.
  • the disease may be asymptomatic at first, but may cause symptoms of decreased vision as the macula invasion occurs.
  • the diabetic retinopathy progresses Depending on the stage, it can be divided into simple retinopathy, proliferative retinopathy and proliferative retinopathy.
  • the choroidal neovascular disease is a disease in which the choroid is damaged due to the generation of abnormal blood vessels, thereby causing visual impairment.
  • Choroidal neoangiopathy is one of the leading causes of irreversible vision loss worldwide, and despite many treatment attempts, vision prognosis is poor in most patients.
  • the retinal edema means that the retina is swollen. For various reasons, bleeding may occur as a result of degeneration or abnormality in minute blood vessels such as capillaries in the retina or macula, resulting in retinal edema. Edema in the retina can cause a variety of symptoms, including decreased vision.
  • the pharmaceutical composition comprising Nkx3.2 or a fragment thereof may include 10 to 95% by weight of a polypeptide, which is a fragment of Nkx3.2 according to the present invention, which is an active ingredient based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above active ingredients.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • the dose of the pharmaceutical composition is a recombinant virus containing a polynucleotide encoding Nkx3.2 or a fragment thereof as an active ingredient, and the dosage of the pharmaceutical composition may include the type of disease, the severity of the disease, the active ingredients contained in the pharmaceutical composition, and the type and content of other ingredients.
  • the type of formulation and age, body weight, general health, sex and diet, time of administration, route of administration It may be adjusted according to various factors, including the duration of treatment and the drug to be used simultaneously.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is l.OxlO 5 to l.OxlO 15 , l.OxlO 7 to l.OxlO 13 , l.OxlO 8 to l.OxlO 12 or l.OxlO per adult day. It may be administered in an amount of 9 to l.OxlO 10 .
  • the present invention provides Nkx3.2 or a fragment thereof; Or it provides a method for preventing or treating retinal disease comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a recombinant virus comprising a polynucleotide encoding Nkx3.2 or a fragment thereof as an active ingredient.
  • Polypeptides that are Nkx3.2 or fragments thereof according to the present invention may include the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the pharmaceutical composition, the type of formulation, and the like. It can be adjusted according to various factors including age, body weight, general state of health, sex and diet, time of administration, route of administration, duration of treatment, and drugs used simultaneously.
  • the effective amount of the polypeptide which is a fragment of Nkx3.2 contained in the pharmaceutical composition for preventing or treating retinal disease comprising Nkx3.2 or a fragment thereof according to the present invention is 0.0001 to 100 mg / may be kg.
  • the administration may be administered once a day or may be divided into several times.
  • the adult standard of the recombinant virus contained in the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of retinal diseases comprising a recombinant virus containing a polynucleotide encoding Nkx3.2 or a fragment thereof according to the present invention as an active ingredient 1 It can be administered in an amount of one lOxlO 5 to lOxlO 15 viral genome.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is l.OxlO 5 to l.OxlO 15 , l.OxlO 7 to l.OxlO 13 , l.OxlO 8 to l.OxlO 12 or l.OxlO 9 per adult.
  • l.OxlO 10 is l.OxlO 5 to l.OxlO 15 , l.OxlO 7 to l.OxlO 13 , l.OxlO 8 to l.OxlO 12 or l.OxlO 9 per adult.
  • compositions of the present invention can be administered to a subject in need thereof in a variety of ways known in the art.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the route of administration may be appropriately selected by a person skilled in the art in consideration of the method of administration, volume of body fluid, viscosity, etc.
  • the administration may be intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, nasal, It can be carried out via any one route selected from the group consisting of inhalation, topical, rectal, oral, intraocular and intradermal.
  • the present invention includes the step of deleting any one selected from the group consisting of N-terminal site, C-terminal site, and combinations thereof of the polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 It provides a method for producing a Nkx3.2 fragment with increased stability in the body.
  • Deletion of the N-terminal region, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 7 may be one to 199 amino acids consecutively deleted from the N-terminal to the C-terminal direction.
  • the deletion of the N-terminal region is Starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 7, 41, 98, 111 or 122 amino acids may be continuously deleted from the N-terminal to the C-terminal direction.
  • the Nkx3.2 fragment in which the N-terminal portion of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is deleted may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14.
  • the deletion may be one in which 1 to 99 amino acids are continuously deleted from the N—terminal to the C-terminal direction starting from the amino acid at position 100 of SEQ ID NO.
  • Deletion of the C-terminal region, starting with the amino acid at position 333 of SEQ ID NO: 7 may be one to 52 amino acids consecutively deleted from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • the deletion of the C-terminal region may be a sequence of 13 or 26 amino acids consecutively deleted starting from the amino acid at position 333 of SEQ ID NO: 7 from the X-terminal to the N-terminal direction.
  • the Nkx3.2 fragment having the C-terminal portion of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10.
  • the deletion may be one from the amino acid at position 320 of SEQ ID NO: 7 to 1 to 39 amino acids in a row from the C-terminal to the N_ terminal in a continuous deletion.
  • Deletion of the amino acid may occur at either or both of the N′-terminal site and the C-terminal site.
  • the amino acid deletion is 98 to 164711, specifically 98, 104, 109, 111, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 7 from the N-terminal direction to the C-terminal direction, 122, 129, 149, 152, 155, 158, 161 or 164 amino acids are deleted in succession, and at the same time 3 to 23, specifically 3, 6, 9, 13, 15, 17, 19, 21 or 23 from the C-terminus to the N-terminus, starting with the amino acid at position 333; Dog amino acids may be deleted consecutively.
  • the Nkx3.2 fragment having an amino acid deletion in both the N-terminal region and the C-terminal region may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 28. Deletion of these amino acid residues at both the N-terminal site and the C-terminal site can be performed by a person of ordinary skill in the appropriate manner.
  • C57BL / 6 mice were purchased and stored in a specific sterile state at an approved animal facility. Tissues were isolated by extracting the eyes of normal C57BL / 6 mice according to a predetermined experimental protocol.
  • Nkx3.2 protein expression was confirmed in C57BL / 6 mouse eye tissue and human eye tissue prepared in Preparation Example 1 using an immunohistochemical staining technique. The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Nkx3.2 protein expression was confirmed in C57BL / 6 mice and human eye tissues with RPE65 protein specifically expressed in retinal pigment epithelial cells.
  • RPE65 protein specifically expressed in retinal pigment epithelial cells.
  • Figure 3 it was confirmed that the Nkx3.2 protein is expressed higher in the rear (hind, H) of the eye with a higher expression of RPE65 than the frontal (F).
  • Experimental Example 2 Confirmation of Nkx3.2 Expression in Retinal Degeneration Model by Oxidative Stress Immunohistochemical Staining Staining, IHC staining) and Western blot analysis were used to confirm Nkx3.2 protein expression in retinal degeneration models by oxidative stress.
  • Retinal degeneration mouse model was constructed by inducing oxidative stress in the C57BL / 6 mouse eye prepared in Preparation Example 1 using sodium iodide (NaI0 3 ). The lesions were then observed in a retinal degeneration mouse model using a microscope. In addition, Nkx3.2 protein expression in the retinal degeneration mouse model was confirmed using an immunohistochemical staining technique. The results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • retinal pigment epithelial lesions were identified in a retinal degeneration mouse model by inducing oxidative stress using NaI0 3 .
  • the Nkx3.2 protein is reduced in the retinal degeneration mouse model confirmed the retinal pigment epithelial lesions.
  • Nkx3.2 protein expression is significantly reduced in the retinal degeneration model by oxidative stress, which is an early change preceding the reduction of RPE65, a marker of retinal pigment epithelium.
  • Experimental Example 3 Construction of mice overexpressing Nkx3.2 in retinal pigment epithelial cells The team presented Cre-dependent Nkx3.2 overexpressing mice in previous papers (Jeong, Da-Un, Je-Yong Choi, and Dae-Won Won). Kim.
  • Nkx3.2 in the retinal pigment epithelial cells of the Nkx3.2 overexpressed mice was confirmed by immunohistochemical staining, and the results are shown in FIG. 8.
  • overexpression of Nkx3.2 protein was verified in retinal pigment epithelial cells of mice, in which Nkx3.2 overexpression by Cre recombinase occurs only in retinal pigment epithelial cells.
  • Experimental Example 4 Confirmation of retinal pigment epithelial cell inhibitory effect by Nkx3.2 overexpression
  • Retinal pigment epithelial cell-specific Nkx3.2 overexpression mouse prepared in Experiment 3 was used to induce retinal degeneration due to oxidative stress using NaI0 3 .
  • Retinal degeneration lesions were identified by dissecting hemispheric retinas of mice induced by oxidative stress with a plate. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, retinal degeneration was clearly observed by oxidative stress in Nkx3.2 protein non-expressed (ci-Nkx3.2) mice. In contrast, no retinal degeneration was observed in oxidative stress in Nkx3.2 overexpression (ciTg-Nkx3.2) mice.
  • the normal control group (Norm) showed a uniform and even retinal curved surface around the optic nerve and showed normal retinal reflection.
  • the retinal degeneration (AMD) of Nkx3.2 non-overexpressing mice showed a diminished retinal pigment epithelium and a low reflection pattern.
  • the retinal degeneration group (AMD + Nkx3.2) of Nkx3.2 overexpressing mice showed a retinal structure similar to that of the normal control group.
  • mice induced by oxidative stress was analyzed by optical coherence tomography. The results are shown in FIG.
  • the retinal degeneration group (AMD + Nkx3.2) of Nkx3.2 overexpressing mice showed a retinal structure similar to that of the normal control group.
  • the control group is the normal structure of the membrane of the retina and the retinal pigment epithelial layer normal structure was observed.
  • Nkx3.2 non-expressed mice The retinal degeneration group (AMD) severely damaged and lost the retinal pigment epithelium.
  • the retinal degeneration group (AMD + Nkx3.2) of Nkx3.2 overexpressing mice showed retinal structure and retinal pigment epithelial pattern similar to the normal control group.
  • Experimental Example 5 Confirmation of visual function preservation effect by overexpression of Nkx3.2
  • Electroretinography confirmed the effect of visual function preservation by Nkx3.2 overexpression.
  • the normal control group showed normal retinal potential changes with respect to external light stimulation of the retina.
  • the retinal degeneration group (AMD) of Nkx3.2 non-overexpressing mice completely lost retinal potential changes with respect to external light stimulation.
  • the retinal degeneration group (AMD + Nkx3.2) of Nkx3.2 overexpressing mice showed similar changes in retinal potential.
  • annexin V-FITC apoptosis kit annexin V-FITC apoptosi s kima Sigma-Aldr i ch
  • concentration of 3 ⁇ 40 2 by the oxidative stress of human retinal pigment epithelial cells was measured.
  • change of Nkx3.2 protein expression level with increasing cell death rate was measured by Western blot analysis. The results are shown in FIGS. 15 and 16.
  • Apoptosis rate due to oxidative stress of human retinal pigment epithelial cells following each virus administration was measured using the V-FITC acetosis kit. Help the results 17 and FIG. 18.
  • mice Retinal pigment epithelial cell specific Nkx3.2 overexpressing mice were irradiated with laser to induce choroidal neovascularization (CNV). After 9 tablets, mice were intraperitoneally injected with fundus fluorescence angiography (FAA) for retinal vessels. The CTF of choroidal neovascular lesions was measured based on the images obtained from the fundus angiography, and the difference in choroidal neovascular lesion size between wild type mice and Nkx3.2 overexpressing mice was compared. The results are shown in FIGS. 19A and 19B.
  • FFAA fundus fluorescence angiography
  • CTF values (29414.8 ⁇ 43200.47) for choroidal neovascular lesions in Nkx3.2 overexpressing mice (G2) were significantly higher than CTF values (124942.3 ⁇ 91743.74) in wild type mice (G1). Decreased (PO .05). This suggests that Nkx3.2 plays an important role in suppressing choroidal neovascularization.
  • Retinal pigment epithelial cell-specific Nkx3.2 overexpressing mice were irradiated with laser to induce choroidal neovascularization, and on day 9, optical coherence tomography for choroidal neovascularization-induced retinal site was performed.
  • Figs. 20a and 20b Based on the images obtained from the optical coherence tomography, the difference of retinal edema in choroidal neovascular lesions between wild type mice and Nkx3.2 overexpressing mice was compared. The results are shown in Figs. 20a and 20b.
  • the retinal thickness (220.6 ⁇ 10.47 mi crons) of choroidal neovascular lesions in Nkx3.2 overexpressing mice was increased in retinal thickness (259.8 ⁇ 13.08 mi crons) in wild type mice (G1). Decreased significantly)

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Abstract

본 발명은 Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 명에 따른 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편은 산화 스트레스에 의한 망막변성을 억제하고, 시각기능을 보존한다. 또한, 상기 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편은 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제하며, 맥락막 신생혈관 및 망막 부종을 억제한다. 따라서, 상기 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환 또는 황반변성의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
Nkx3.2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 치료용 약학적 조성물 【기술분야】
본 발명은 Nkx3 .2 및 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 .약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
우리 사회가 고령화 사회로 진입하면서 노화와 관련된 질병 및 이의 치료법에 대해 관심이 높아지고 있다. 다양한 노인성 질환 중, 대표적인 노인성 안구 질환인 황반변성은 눈 안쪽 망막 중심부에 위치한 황반부에 변성이 일어나 시력장애가 생기는 질환이다.
신체의 노화에 의해 황반 기능이 저하되어 시력이 떨어지거나 상실하는 질환인 황반변성은 노년기 시력상실의 주요 원인이다. 황반변성은 보통 50— 60대에 나타나는 질병이지만, 드물게 젊은 연령층에서 발병하기도 한다. 상기 질병의 원인으로는 신체의 노화， 심혈관계 질병， 흡연， 높은 혈중 콜레스테를， 환경오염， 햇빛 노출 등이 알려져 있다.
황반변성의 종류는 건성 황반변성과 습성 황반변성이 있다. 건성 황반변성은 망막에 드루젠이라는 일종의 노화 퇴적물이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우이며， 황반변성 환자의 약 90%는 건성 형태의 황반변성을 가지고 있다. 건성 황반변성은 황반에 있는 시세포가 서서히 위축되어 시간이 지날수록 시력이 점차 감소하게 되고, 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 습성 황반변성은 맥락막에 비정상적으로 신생혈관이 생겨， 이 혈관 자체 또는 혈관으로부터의 출혈， 삼출 등에 의해 심한 시력 손상이 발생하기 쉽다. 습성 황반변성은 발병 후 수개월ᅳ수년 사이에 원반형 위축， 심한 출혈 등으로 실명을 초래할 수 있다 (Oh , M . J . & Lee , S . Y . , 2012) .
한편 , 황반변성으로 인해 시력장애가 시작되면 이전의 시력으로 회복할 수 없기 때문에 조기에 발견하여 치료하는 것이 증요하다. 황반변성은 황반변성 자가검진표인 암슬러 그리드를 이용하면 조기에 발견할 수 있다. 이와 같이'， 황반변성은 조기에 발견하여 치료하면 시력상실을 최소화할 수 있지만， 아직까지 확실한 치료법이 없는 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에, 본 발명자들은 황반변성 (macul ar degenerat i on) 치료제를 연구하던 중， Nkx3.2 및 /또는 이의 단편이 산화 스트레스에 의한 망막색소상피세포의 사멸 및 망막변성의 억제， 시각기능의 보존, 맥락막 신생혈관 및 망막 부종의 억제 등 망막질환의 예방 또는 치료에 탁월한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 ( I )로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 ( I )
상기 식 ( I )에서， 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산에서 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며，
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서 , 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산에서 시작하여 C—말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편인 폴리펩타이드를 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
【발명의 효과]
본 발명에 따른 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편은 산화 스트레스에 의한 망막변성을 억제하고， 시각기능을 보존한다. 또한， 상기 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편은 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 억제하며， 맥락막 신생혈관 및 망막 부종을 억제한다. 따라서, 상기 Nkx3.2 및 /또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물은 망막질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 면역조직화학염색을 통해 C57BL/6 마우스의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다. 이때， OS는 산화 스트레스 (oxi dat i ve st ress )의 약어이다.
도 2는 면역조직화학염색을 통해 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 3은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 인간의 망막색소상피세포에서의 Nkx3 .2 단백질 발현을 나타낸 것이다. 이때， WB abs는 웨스턴 블롯 항체 (west ern bl ot ant i bodi es )의 약어이다.
도 4는 산화 스트레스에 의한 망막변성 마우스 모델에서의 망막색소상피 병변을 나타낸 것이다.
도 5는 면역조직화학염색을 통해 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 웨스턴 블롯 분석기법을 사용하여 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다. 도 7은 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스를 제작하기 위한 방법을 도식화하여 나타낸 것이다. 도 7에 나타나는 약어의 의미는 다음과 같다: ci-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2(Cre-inducible Nkx3.2); ciTg-Nkx3.2, Cre 유도 Nkx3.2 트랜스제닉 (Cre-incluciMe Nkx3.2 transgenic); tpA, 전사 정지 (Transcription Stop) .
도 8은 면역조직화학염색을 통해 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스의 망막색소상피에서 Nkx3.2 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 망막 평판 절개 (Flat mount)를 통해 Nkx3.2 단백질의 발현 수준에 따른 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 안구 기저부 (Fundus image) 촬영기법을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 광 간섭성 단층 촬영기법 (optical coherence tomography, OCT)을 통해 Nkx3.2 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 조직병리 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 망막변성 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 망막전위도검사 (electroretinography, ERG)를 통해 Nkx3.2 단백질 발현 수준에 따른 마우스의 시각기능 보존 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 ¾02 농도에 따른 세포 생존도를 나타낸 것이다.
도 15는 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 ¾02 농도에 따른 세포 사멸율을 나타낸 것이다. 도 16은 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 인간 망막색소상피세포에서 산화 스트레스를 유도하는 ¾02 농도에 따른 세포 사멸 표지 인자인 Cl eaved PARP 단백질의 발현 수준 및 Nkx3.2 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 17은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 바이러스 (Lent i-Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 18은 인간 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 억제 바이러스 ( sh— Nkx3.2) 처리시 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 19a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후， 망막 혈관을 안저조영술로 촬영한 것이다.
도 19b는 안저조영술로 촬영 이미지를 바탕으로 wi ld type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변 크기의 차이를 비교한 것이다.
도 20a는 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후， 망막부위를 광간섭단층촬영법으로 촬영한 것이다.
도 20b는 광간섭단층촬영 이미지를 바탕으로 wi ld type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 망막 부종의 차이를 비교한 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 측면으로， Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Nkx3.2"는 NK3 homeobox 2라고도 불리우며， NK 속 (family)의 호메오박스를 포함하는 단백질 중 하나이다. Nkx3.2는 골격 발달 및 기관 분화에 중요한 역할을 한다. 특히， Nkx3.2는 연골세포로의 분화를 촉진시키고， 연골세포의 비대를 지연시키며， 연골 세포의 자멸을 억제시킨다고 알려져 있다. 상기 Nkx3.2는 인간 유래의 단백질일 수 있다. 이때， Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 서열번호 8의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서 사용된 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기의 실질적인 동일성을 갖는 Nkx3.2 단백질은 80%， 90%, 95%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 Nkx3.2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이때， Nkx3.2 단백질의 '변이체란 Nkx3.2 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실， 삽입， 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York , 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser , Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/ He, Leu/Val , Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다. 또한， 상기 Nkx3.2 단백질은 인산화， 황화， 아크릴화， 당화， 메틸화 또는 파르네실화 (farnesylation) 등으로 수식될 수 있다.
상기 Nkx3.2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merri field, J. ½er . chem. Soc.. 85:2149-2156， 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook, J. et al. , 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press) . 본 명세서에서 사용된 용어， "Nkx3.2 단편"은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:
N-말단 확장 도메인 ― 코어 도메인 ― C—말단 확장 도메인 (I).
상기 식 (I)에서， 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 또한， N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산에서 시작하여 Nᅳ말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 또한， C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산에서 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "코어 도메인 은, 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으며， 이는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Nᅳ말단 확장 도메인 "은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서， 전장의 Nkx3.2 단백질의 123번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있고， 이는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나， 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개， 2개， 3개， 4개， 5개， 6개 , 7개， 8개， 9개， 10개 , 11개， 127)1 , 13개， 14개， 15개ᅳ 16개， Γ7개 ' 18개， 19개， 20개 , 21개， 22개， 23개， 24개， 25개 , 26개， 27개， 28개， 29개， 30개， 31개， 32개， 33개， 34개， 35개， 36개， 37개， 38개 , 39개, 40개， 41개 또는 42개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "C—말단 확장 도메인 "은 상술한 코어 도메인의 C一말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 서열번호 6의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나， 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개， 2개， 3개 , 4개， 5개， 6개， 7개， 8개， 9개， 10개， 11개 ,. 12개， 13개， 14개 , 15개ᅳ 16개， 17개 , 18개 , 19개， 20개ᅳ 21개， 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은， N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14， 21 , 22， 23， 24 , 25 , 26 , 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 Nkx3 .2 단백질의 단편으로서， 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나， 상기 폴리펩타이드는 천연형의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도， 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 천연형의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써， 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
다른 일 측면에서， 본 발명은 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 단편은 서열번호 20의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 87개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한， 상기 단편은 서열번호 20의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 Cᅳ말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 39개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산의 결실은 서열번호 20의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 양쪽 전부에서 발생할 수 있다. 본 발명은 또 다른 측면으로， Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 ( I )로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다: N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 (I).
상기 식 (I)에서， 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 또한， N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 Nᅳ말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 또한， Cᅳ말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N—말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다. 이때, 상기 코어 도메인， N—말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인은 앞서 기술한 바와 같으며， 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14， 21， 22, 23, 24， 25， 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다.
상기 바이러스는 아데노바이러스， 아데노 -부속 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스， 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로， 상기 바이러스는 아데노 -부속 바이러스 (AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형 (serotype)에 한정되지 않으며 , 바람직하게는 MV1 내지 MV9 증 어느 하나일 수 있다.
. 상기 아데노 -부속 바이러스 (MV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고， 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 백터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797, 368호에 상세하게 개시되어 있다. 전형적으로， MV 바이러스는 두 개의 MV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 MV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "망막질환"은 노화， 질병 등의 이유로 망막에 발생한 손상에 따른 질병을 의미하며， 황반변성, 당뇨병성 망막병증， 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 황반변성은 노화가 진행함에 따라 황반 기능이 저하되어 시력이 떨어지거나 상실되는 질병으로서， 이 질병으로 인해 시력이 떨어지기 시작하면 이전의 시력으로 회복할 수 없다. 상기 질병은 노인성 황반변성으로 불리우며 노년기 시력상실의 주요 원인이다. 상기 황반변성은 건성 황반변성 및 습성 황반변성 두 종류로 구분된다. 황반변성을 앓고 있는 환자의 약 90%는 건성 황반변성이며， 이는 노화 퇴적물이 망막 아래에 쌓이거나 망막색소상피 위축과 같은 병변이 생긴 경우이다. 황반에 있는 시세포가 서서히 파괴되므로 시간이 지나면서 황반 기능이 떨어지고 중심부 시력이 감소하게 된다. 습성 황반변성은 황반부의 아래층을 구성하는 맥락막에 비정상적으로 새로운 혈관이 많이 생성되어 증상이 발생한다. 습성 황반변성은 건성 황반변성에 비해 진행이 빨라 시력이 급격히 떨어질 수 있고， 2개월 내지 3년 사이에 실명할 수 있다.
상기 당뇨병성 망막병증은 당뇨병에 의한 말초 순환 장애로 인해 눈의 망막에 발생한 합병증이다. 상기 질병은 초기에는 증상이 없다가 황반부의 침범이 일어나면서 시력저하의 증상을 나타낼 수 있다. 상기 당뇨병성 망막병증은 진행 단계에 따라 단순망막증, 증식전망막증 및 증식망막증으로 나뉠 수 있다. 상기 맥락막 신생혈관증은 정상적이지 않은 혈관이 생겨남으로 인해 맥락막이 손상되어 시력장애가 발생하는 질병이다. 상기 맥락막 신생혈관증은 전세계적으로 비가역적인 시력 손실의 주된 원인 중의 하나이며， 여러 가지의 치료 시도에도 불구하고 시력 예후는 대부분의 환자에서 좋지 않다.
상기 망막부종은 망막이 부었음을 의미한다. 여러가지 이유로 인해 망막 또는 황반 내에 모세혈관과 같은 미세한 혈관에 변성 또는 이상이 발생함에 따라 출혈이 나타나게 되고 그 결과 망막부종이 발생할 수 있다. 망막에 부종이 발생하게 되면， 시력저하를 비롯한 다양한 증상이 나타날 수 있다. 상기 Nkx3.2 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 Nkx3.2의 단편인 폴리펩타이드를 10 내지 95 중량 %로 포함할.수 있다ᅳ 또한， 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 또한， Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류， 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량， 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중， 일반 건강 상태， 성별 및 식이， 투여 시간， 투여 경로， 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나， 바람직한 효과를 위해서， 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 Ι.ΟχΚ)5 내지 l.OxlO15 바이러스 유전체 (viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로， 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 l.OxlO5 내지 l.OxlO15, l.OxlO7 내지 l.OxlO13, l.OxlO8 내지 l.OxlO12 또는 l.OxlO9 내지 l.OxlO10의 양으로 투여할 수 있다. 또한， 본 발명은 Nkx3.2 또는 이의 단편; 또는 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 망막질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의의 단편인 폴리펩타이드; 또는 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코당하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량， 제형의 종류 및.환자의 연령， 체중， 일반 건강 상태， 성별 및 식이， 투여 시간, 투여 경로， 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나， 바람직한 효과를 위해서， 본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 Nkx3.2의 단편인 폴리펩타이드의 유효량은 0.0001 내지 100 mg/kg일 수 있다. 이때， 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 또한， 바람직한 효과를 위해서， 본 발명에 따른 Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 l.OxlO5내지 l.OxlO15 바이러스 유전체 (viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로， 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 l.OxlO5 내지 l.OxlO15, l.OxlO7 내지 l.OxlO13, l.OxlO8 내지 l.OxlO12 또는 l.OxlO9 내지 l.OxlO10의 양으로 투여할 수 있다.
또한， 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 이를 필요로 하는 개체에 투여될 있다. 상기 개체는 포유동물， 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법， 체액의 부피， 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며， 구체적으로 상기 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내， 근육내， 흉골내， 경피， 비측내， 흡입, 국소， 직장, 경구， 안구내 및 피내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로， 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 N-말단 부위， C-말단 부위 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 부위를 결실시키는 단계를 포함하는， 체내 안정성이 증가된 Nkx3.2 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 N-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 199개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로， 상기 N-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 41개， 98개， 111개 또는 122개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 N-말단 부위가 결실된 Nkx3.2 단편은 서열번호 11， 서열번호 12 , 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 결실은 서열번호 7의 100번 위치의 아미노산부터 시작하여 N—말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 99개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 52개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로， 상기 C-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 X—말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 26개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 C—말단 부위가 결실된 Nkx3.2 단편은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로， 상기 결실은 서열번호 7의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N_말단 방향으로 1개 내지 39개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산의 결실은 Nᅳ말단 부위 및 C-말단 부위 중 어느 하나 또는 양쪽에서 발생할 수 있다. 일 구체예로， 상기 아미노산 결실은 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N—말단 방향으로부터 C-말단 방향으로 98개 내지 164711 , 구체적으로 98개， 104개 , 109개， 111개 , 122개， 129개， 149개， 152개， 155개， 158개， 161개 또는 164개의 아미노산이 연속적으로 결실되고， 동시에 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 Cᅳ말단으로부터 N-말단 방향으로 3개 내지 23개， 구체적으로 3개， 6개, 9개， 13개， 15개， 17개， 19개， 21개 또는 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 N-말단 부위 및 C-말단 부위 양쪽 모두에서 아미노산 결실이 발생한 Nkx3.2 단편은 서열번호 15 내지 서열번호 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다. N-말단 부위 및 C-말단 부위 양쪽에서 상기 아미노산 잔기의 결실은 통상의 기술자에 의해 적절한 방법으로 수행될 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다. 준비예 1. 실험 안구 조직의 준비
C57BL/6 마우스를 구입하여， 승인된 동물시설에서 특정한 무균상태로 보관하였다ᅳ 소정의 실험 프로토콜에 따라 정상 C57BL/6 마우스의 안구를 적출하여 조직을 분리하였다.
또한， 인체 안구 조직을 구입하여, 승인한 시설에서 특정한 무균상태로 보관하였다. 실험예 1. 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 발현 확인
안구 망막색소상피층에서 Nkx3.2 단백질의 발현이 보고된 적이 없기 때문에， 면역조직화학적 염색기법 (immunohistochemistry staining, IHC staining) 및 웨스턴 블롯 분석기법 (western blot analysis)을 사용하여 이에 대한 검증을 수행하였다. 면역조직화학 염색기법을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비된 C57BL/6 마우스 안구 조직 및 인체 안구 조직에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
또한， 상기 준비예 1에서 준비된 인간 안구 조직으로부터 각막 (cornea)과 망막색소상피 (retinal pigment epithelium, RPE)를 분리하고 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이， 망막색소상피세포에서 특이적으로 발현을 보이는 RPE65 단백질과 함께 C57BL/6 마우스 및 인간의 안구조직에서 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 또한， 도 3에 나타난 바와 같이, 만구 앞쪽 (frontal, F)에 비하여 RPE65의 발현이 높은 안구의 뒤쪽 (hind, H)에서 Nkx3.2 단백질이 더 높게 발현함을 확인하였다. 실험예 2. 산화스트레스에 의한 망막변성 모델에서 Nkx3.2 발현 확인 면역조직화학적 염색기법
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staining, IHC staining) 및 웨스턴 블롯 분석기법 (western blot analysis)을 사용하여 산화 스트레스에 의한 망막변성 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다.
요오드산나트륨 (NaI03)을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비한 C57BL/6 마우스 안구에 산화 스트레스를 유도함으로써 망막변성 마우스 모델을 구축하였다. 이후， 현미경을 이용하여 망막변성 마우스 모델에서의 병변을 관찰하였다. 또한, 면역조직화학 염색기법을 이용하여 상기 망막변성 마우스 모델에서의 Nkx3.2 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
또한， 상기 망막변성 마우스 모델의 조직으로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석기법을 통해 Nkx3.2 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, NaI03를 이용하여 산화 스트레스를 유도함으로써 망막변성 마우스 모델에서 망막색소상피 병변을 확인하였다. 또한， 도 5에 나타난 바와 같이， 망막색소상피 병변이 확인된 망막변성 마우스 모델에서 Nkx3.2 단백질이 감소함을 확인하였다.
또한， 도 6에 나타난 바와 같이， 산화스트레스에 의한 망막변성 모델에서 Nkx3.2 단백질 발현이 확연히 감소함을 확인하였고， 이는 망막색소상피의 표지인자인 RPE65의 감소보다 선행하는 초기적 변화임을 확인하였다. 실험예 3. 망막색소상피세포에서 Nkx3.2를 과발현하는 마우스의 제작 본 연구팀은 선행 논문에서 Cre 의존적 Nkx3.2 과발현 마우스를 발표하였다 (Jeong, Da-Un , Je-Yong Choi , and Daeᅳ Won Kim. "Cart i lage-Speci fic and Cre-Dependent Nkx3. 2 Overexpression In Vivo Causes Skeletal Dwarfism by Delaying Cartilage Hypertrophy. " Journal of eel hilar physiology 232.1 (2017)： 78-90.). 이를 토대로 망막색소상피세포 특이적 Cre 발현을 나타내는 BESTl-Cre 마우스를 이용하여， Cre 유전자 재조합효소에 의한 Nkx3.2 과발현이 오직 망막색소상피세포에서만 일어나도록 하였다. 해당 마우스 제작 전략을 도식화하여 도 7에.나타내었다.
또한， 상기 제작된 Nkx3.2 과발현 마우스의 망막색소상피세포에서 Nkx3.2의 발현을 면역조직화학 염색기법을 통해 확인하였고， 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이， Cre 유전자 재조합효소에 의한 Nkx3.2 과발현이 오직 망막색소상피세포에서만 일어나도록 제작된 마우스의 망막색소상피세포에서 Nkx3.2 단백질의 과발현이 검증되었다. 실험예 4. Nkx3.2 과발현에 의한 망막색소상피세포 억제 효과 확인
상기 실험예 3에서 제작된 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에서 NaI03를 이용하여 산화 스트레스에 의한 망막변성을 유도하였다.
4.1. 망막 평판 절개 (Flat mount)
산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 반구 형태의 망막을 평판으로 절개하여 망막변성 병변을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이， Nkx3.2 단백질 비과발현 (ci-Nkx3.2) 마우스에서 산화 스트레스에 의해 망막변성이 뚜렷하게 관찰되었다. 반면, Nkx3.2 과발현 (ciTg-Nkx3.2) 마우스에서는 산화 스트레스에 의해 망막변성이 관찰되지 않았다 ·
4.2. 안구 기저부 촬영 (Fundus image) 산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 안구 기저부 활영기법을 통하여 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이， 정상 대조군 (Norm)은 시신경을 중심으로 균일하고 고른 형태의 망막곡면을 보이며 정상적인 망막반사를 나타내었다. 반면 Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군 (AMD)은 갈라지는 망막색소상피를 보이며 저반사 양상을 나타내었다. 이에 반해， Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군 (AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조를 보였다.
4.3. 광간섭단층촬영
산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 광 간섭성 단층 촬영기법을 통하여 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 '같이 정상 대조군 (Norm)은 망막의 다층적 구조를 잘 나타내는 반면， Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군 (AMD)은 망막변성이 심하여 망막의 다층 구조가 심각하게 손상되었다. 이에 반해， Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군 (AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조를 보였다.
4.4. 조직 병리학적 분석
산화스트레스에 의해 망막변성이 유도된 마우스의 안구 망막구조를 조직학적으로 분석한 것이다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
'도 12에 나타난 바와 같이， 정상 대조군 (Norm)은 망막의 정상 구조와 망막색소상피층의 정상적인 막구조가 관찰되었다. 반면， Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군 (AMD)은 망막색소상피층이 심각하게 손상되고 소실되었다. 이에 반해， Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군 (AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막 구조 및 망막색소상피층 양상이 관찰되었다. 실험예 5. Nkx3.2과발현에 의한시각기능보존효과 확인
망막전위도검사 (electroretinography, ERG)를 통해 Nkx3.2 과발현에 의한 시각기능 보존 효과를 확인하였다.
상기 실험예 4에서 산화 스트레스에 의해 망막변성이 유도된 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스의 시각기능을 ERG를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이， 정상 대조군 (Normal)은 망막의 외부 빛 자극에 대하여 정상적인 망막전위도 변화를 보였다. 반면， Nkx3.2 비과발현 마우스의 망막변성군 (AMD)은 외부 빛 자극에 대한 망막전위도 변화가 완전히 소실되었다. 이에 반해， Nkx3.2 과발현 마우스의 망막변성군 (AMD+Nkx3.2)은 정상 대조군과 유사한 망막전위도 변화를 나타내었다. 실험예 6. 산화 스트레스를 유도하는 ¾02 농도에 따른 세포 생존력， 세포 사멸률, Nkx3.2단백질 발현 확인
인간 망막색소상피세포에 400 μΜ, 600 μΜ, 800 μΜ, 1 mM의 과산화수소 (¾ )를 각각 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. 이후， WST 분석기법 (water-soluble tetrazolium salt assay)을 사용하여 산화 스트레스를 유도하는 ¾02 농도에 따른 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
또한, 아넥신 V— FITC 아폼토시스 키트 (annexin V-FITC apoptosi s ki t Sigma-Aldr i ch)를 이용하여 상기와 같이 농도별로 ¾02를 처리하여 산화 스트레스가 유도된 인간 망막색소상피세포의 세포 사멸률을 측정하였다. 또한， 웨스턴 블롯 분석기법을 통하여 세포 사멸률 증가에 따른 Nkx3.2 단백질 발현 수준의 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이， ¾02 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하였다. 또한， 도 15에 나타난 바와 같이， ¾02 농도가 증가할수록 세포 사멸률이 증가하였다. 도 16에 나타난 바와 같이， Η202농도가 증가할수록 세포 사멸 표지인자인 c leaved PARP 단백질의 발현이 증가하였다. 즉， 세포 사멸 표지인자인 c leaved PARP 단백질의 발현 증가가 세포 사멸을 발생시킴을 단백질 수준에서 검증하였다. 또한， 상기 c leaved PARP 단백질의 발현이 증가할수록 Nkx3.2 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다. 실험예 7. Nkx3.2 단백질 발현 바이러스투여 후세포사멸률측정
인간 망막색소상피세포에 800 μΜ의 ¾02를 처리하여 산화 스트레스를 유도하였고, 상기 산화 스트레스가 유도된 세포를 두 그룹으로 나누었다. 한 그룹에는 Nkx3.2 발현 바이러스 (Lent i-Nkx3.2)를 투여하였고， 나머지 다른 그룹에는 Nkx3.2 발현 억제 바이러스 (sh-Nkx3.2)를 투여하였다. 이후， 아넥신
V-FITC 아픕토시스 키트를 사용하여 각 바이러스 투여에 따른 인간 망막색소상피세포의 산화 스트레스에 의한 세포사멸률을 측정하였다. 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이， 인간 망막색소상피세포에 Nkx3.2 발현 바이러스 (Lenti-Nkx3.2) 투여시 ¾02에 의한 세포 사멸를이 대조군 바이러스 (Lenti-Ctrl) 투여군에 비해 감소하였다. 또한， 도 18에 나타난 바와 같이 인간 망막색소상피세포에 Nkx3.2 발현 억제 바이러스 (sh-Nkx3.2) 투여시 ¾02에 의한 세포 사멸률이 대조군 바이러스 (sh— Ctrl) 투여군에 비해 증가하였다. 실험예 8. Nkx3.2 과발현에 의한 맥락막신생혈관 억제 효과 확인
망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)을 유도하였다. 9알 후， 마우스에 조영제를 복강 주사하여 망막혈관에 대한 안저조영술 (fundus fluorescence angiography, FAA)을 시행하였다. 상기 안저조영술로부터 확보한 이미지를 바탕으로 맥락막 신생혈관 병변의 CTF를 측정하였고， wild type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변 크기의 차이를 비교하였다. 그 결과를 도 19a 및 도 19b에 나타내었다.
도 19a 및 도 19b에 나타난 바와 같이， Nkx3.2 과발현 마우스 (G2)의 맥락막 신생혈관 병변에 대한 CTF 수치 (29414.8 ± 43200.47)가 wild type 마우스 (G1)의 CTF 수치 (124942.3 ± 91743.74)보다 유의성 있게 감소하였다 (PO .05) . 이를 통해 , Nkx3.2는 맥락막 신생혈관을 억제하는 데에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 망막색소상피세포 특이적인 Nkx3.2 과발현 마우스에서 레이저를 조사하여 맥락막 신생혈관을 유도한 후， 9일 째에 맥락막 신생혈관을 유도한 망막부위에 대한 광 간섭성 단층촬영기술을 실시하였다. 상기 광 간섭성 단층촬영으로부터 확보한 이미지를 바탕으로 wi l d type 마우스와 Nkx3.2 과발현 마우스 간의 맥락막 신생혈관 병변에서 야기된 망막 부종 양상의 차이를 비교하였다. 그 결과를 도 20a 및 도 20b에 나타내었다.
도 20a 및 도 20b에 나타난 바와 같이， Nkx3.2 과발현 마우스 (G2)에서 맥락막 신생혈관 병변의 망막 두께 (220.6 ± 10.47 mi crons)가 wi ld type 마우스 (G1)의 망막 두께 (259.8 ± 13.08 mi crons)보다 유의성 있게 감소하였다
(PO .01 ) . 이를 통해, 맥락막 신생혈관을 유도하는 과정에서 파괴된 혈액망막장벽으로 인하여 2차적으로 야기된 망막 부종은 Nkx3.2 과발현 마우스에서 wi l d type 마우스보다 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
Nkx3.2 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 2】
저 U항에 있어서，
상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 ( I )로 표시되는 폴리펩타이드인， 약학 조성물: N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 ( I ) .
【청구항 3】
제 2항에 있어서,
상기 식 ( I )에서，
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서， 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있는， 약학 조성물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서，
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 7개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 5]
제 2항에 있어서,
상기 N—말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 27개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 약학 조성물.
【청구항 6】
제 2항에 있어서，
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 30개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 7】
제 2항에 있어세
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 33개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 8】
제 2항에 있어서，
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 36개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 9]
제 2항에 있어서，
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 39개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 10】
제 2항에 있어서，
상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 42개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 약학 조성물.
【청구항 11】
제 2항에 있어서 ᅳ
상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 약학 조성물.
【청구항 12】
제 2항에 있어서，
상기 C—말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C—말단으로부터 N-말단 방향으로 15개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 약학 조성물.
【청구항 13]
제 2항에 있어서，
상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 17개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 14]
제 2항에 있어서,
상기 Cᅳ말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 19개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 15]
제 2항에 있어서，
상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 21개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 16】
저 12항에 있어서，
상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된， 약학 조성물.
【청구항 17】
제 2항에 있어서，
상기 폴리펩타이드가 서열번호 14， 21 , 22 , 23， 24 , 25 , 26， 27 또는 28의 아미노산 서열을 갖는， 약학 조성물.
【청구항 18】 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 망막질환이 황반변성 , 당뇨병성 망막병증， 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
【청구항 191
제 18항에 있어서，
상기 황반변성이 건성 황반변성 또는 습성 황반변성인， 약학 조성물.
【청구항 20】
Nkx3.2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 21】
제 20항에 있어서，
상기 Nkx3.2 단편이 하기 식 ( I )로 표시되는 폴리펩타이드인， 약학 조성물:
N-말단 확장 도메인 - 코어 도메인 - C-말단 확장 도메인 ( I ) .
【청구항 22】
제 21항에 있어서，
상기 식 ( I )에서，
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고; Nᅳ말단 확장 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서 서열번호 3의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 42개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있는， 약학 조성물.
【청구항 23]
제 20항에 있어서，
상기 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 14ᅳ 21， 22 , 23， 24， 25， 26， 27또는 28의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것인， 약학 조성물.
【청구항 24]
제 20항에 있어서,
상기 바이러스가 아데노바이러스, 아데노 -부속 바이러스 (Adeno-assoc i ated vi ruses : AAV) , 레트로바이러스， 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것인， 약학 조성물.
【청구항 25】
제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 망막질환이 황반변성， 당뇨병성 망막병증， 맥락막 신생혈관증 및 망막부종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인， 약학 조성물.
【청구항 26]
제 25항에 있어서,
상기 황반변성이 건성 황반변성 또는 습성 황반변성인， 약학 조성물.
【청구항 27】
제 1항 또는 제 20항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는
망막질환 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 28】
제 27항에 있어서，
상기 투여는 정맥내， 동맥내， 복강내， 근육내， 흉골내， 경피， 비측내， 흡입， 국소， 직장， 경구， 안구내 및 피내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것인 예방 또는 치료 방법.
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