KR20160023669A - 다양한 질병의 치료를 위한 jnk 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩타이드 억제자의 새로운 용도 - Google Patents

다양한 질병의 치료를 위한 jnk 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩타이드 억제자의 새로운 용도 Download PDF

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쟝-마크 콩베트
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자이겐 인플라메이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 단백질 키나아제 억제자의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 JNK 시그널링과 강하게 관련된 다양한 질병 또는 질환의 치료를 위해, 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제의 억제자, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드 또는 동일한 것을 코딩하는 핵산뿐만 아니라 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

다양한 질병의 치료를 위한 JNK 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩타이드 억제자의 새로운 용도{New use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of various diseases}
본 발명은 JNK 시그널링(signaling)과 매우 관련된 다양한 새로운 질병 또는 질환의 치료를 위해, 단백질 키나아제 억제자의 용도 및 보다 구체적으로 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제 억제자, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 이를 코딩하는 핵산의 용도 뿐만 아니라 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
c-Jun 아미노 말단 키나아제(JNK)는 미토겐(mitogen) 활성화된 단백질(MAP) 키나아제의 스트레스 활성화된 그룹의 구성원이다. 이들 키나아제는 세포 생장 및 분화의 조절, 및 보다 일반적으로, 환경적 자극에 대한 세포의 반응에 관여되어 있다. JNK 신호 전달 경로는 환경적 스트레스에 대한 반응에서 및 세포 표면 수용체의 몇몇 종류의 관여에 의해 활성화된다. 이들 수용체는 사이토카인 수용체, 세르펜틴(serpentine) 수용체 및 수용체 티로신 키나아제를 포함할 수 있다. 포유동물 세포에서, JNK는 종양 형성 및 환경 스트레스에 대한 적응 반응의 조절과 같은 생물학적 공정에 관여된다. JNK는 또한 면역 세포의 성숙 및 분화를 포함하는 면역 반응을 조절할 뿐만 아니라, 면역계에 의해 파괴되는 것으로 식별된 세포 내 예정된(programmed) 세포 사멸에 영향을 미치는 것과 관련된다. 이러한 고유의 특징은 JNK 시그널링을 약학적 개입(intervention)의 개발을 위한 유망한 목적으로 만든다. 몇몇 신경 질환들 가운데, JNK 시그널링은 특히 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 및 파킨슨 병 뿐만 아니라, 하기 언급된 다른 질병에 관여된다. 게다가, 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) p38알파는 JNK-cJun-경로를 길항(antagonizing)함으로써 세포 성장을 음성적으로 조절하는 것으로 나타났다. 미토겐 활성화된 단백질 키나아제 (MAPK) p38알파는 따라서 정상 및 암 세포 성장의 억제에 활성화되는 것으로 나타나고, 나아가, 암 질병에 JNK의 관여를 설명한다 (예를 들어 Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, June 2007 참조). 또한, c-Jun N-말단 키나아제 (JNK)는 척추 신경 결찰 (spinal nerve ligation, SNL)에 의해 생성되는 신경성 동통에 포함되고, 상기 SNL은 JNK, 특히 JNK1의 느리고 지속적인 활성화를 유도하며, 반면 p38 미토겐 활성화된 단백질 키나아제 활성화는 SNL 이후 척추 소교 세포(spinal microglia)에서 발견되며, 21일까지 기저 수준에 가깝게 떨어진다(Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, March 29, 2006, 26(13):3551-3560)).
JNK 시그널링 경로의 억제 또는 방해, 특히 JNK 시그널링 경로의 억제자의 제공은, 따라서 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질환과 싸우는 것에 유망한 접근 방법으로 나타난다. 그러나, 지금까지 알려진 단지 몇가지 JNK 시그널링 경로의 억제자가 존재한다.
선행기술에서 이미 알려진 JNK 시그널링 경로의 억제자는, 특히 예를 들어 업스트림 키나아제 억제자 (예를 들어, CEP-1347), 예를 들어 단백질 카나아제의 ATP 결합 부위에 경쟁함으로써 키나아제 활성에 직접적으로 영향을 미치는, JNK의 작은 화학적 억제자(small chemical inhibitors) (SP600125 및 AS601245), 및 JNK 및 이의 기질 (D-JNK1 및 I-JIP) 간 상호작용의 펩타이드 억제자를 포함한다 (예를 들어, Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, February 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5) 참조).
업스트림 키나아제 억제자 CEP-1347 (KT7515)는 혼합된 혈통(mixed lineage) 키나아제 패밀리의 반합성 억제자이다. CEP-1347 (KT7515)는 영양 회수(trophic withdrawal) 이후 일차 배아 배양물(primary embryonic cultures) 및 분화된 PC12 세포에서 및 및 1-메틸-4-페닐 테트라하이드로피리딘으로 처리된 쥐에서, c-Jun 아미노-말단 키나아제(JNKs)의 활성화를 억제하는 투여량에서 신경 세포 생존(neuronal survival)을 촉진한다. 게다가, CEP-1347 (KT7515)는 배양된 병아리 배아 후근 신경절(chick embryonic dorsal root ganglion), 교감 신경, 섬모 및 모터 뉴런의 장기 생존을 촉진할 수 있다 (예를 들어 Borasio et al., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, May 11th 1998. 참조).
작은 화학적 JNK 억제자 SP600125는 c-Jun 인산화의 수준을 감소시키고, 세포 사멸로부터 도파민 뉴런(dopaminergic neurons)을 보호하고, 및 C57BL/6N 쥐 내 MPTP-유도된 PD 내 도파민 수준을 부분적으로 회복하는 것으로 밝혀졌다 (Wang et al., Neurosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). 이러한 결과들은 나아가 JNK 경로가 인비보(in vivo) MPTP의 신경 독성 효과의 주요 중재자임을 가리키며 JNK 활성을 억제하는 것은 PD 처리하기 위해 새롭고 효과적인 전략을 나타낼 수 있다.
작은 화학적 억제자의 추가적인 예시는 상기 언급된 JNK-억제자 AS601245이다. AS601245는 JNK 시그널링 경로를 억제하고 뇌 허혈(cerebral ischemia) 이후 세포 생존을 촉진시킨다. 인 비보(In vivo), AS601245는 일시적인 전뇌 허혈(transient global ischemia)의 게르빌루스쥐 모델(gerbil model) 내 해마회(hippocampal) CA1 뉴런의 지연된 손실에 대한 현저한 보호를 제공한다. 이러한 효과는 JNK 억제에 의해 및 그에 따라 c-Jun 발현 및 인산화에 의해 조절된다 (예를 들어 Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1):25-32. Epub 2004 Feb 26th 참조).
JNK 시그널링 경로의 억제자의 세번째 클래스는 상기 언급된 것처럼 JNK 및 이의 기질 사이의 상호작용의 펩타이드 억제자를 나타낸다. 이러한 JNK 억제자 펩타이드의 구성을 위한 시작점으로 자연 발생 JNK 단백질의 서열 정렬이 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들 단백질은 JNK 결합 도메인 (JBDs)을 포함하며 IB1 또는 IB2와 같은 다양한 인슐린 결합(IB) 단백질에서 발생한다. 이러한 예시적인 서열 정렬의 결과는 예를 들어 IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] 및 ATF2 [SEQ ID NO: 16]의 JNK 결합 도메인 사이에 서열 정렬이다 (예를 들어 FIGS. 1A-1C 참조). 이러한 정렬은 부분적으로 보존된 8 아미노산 서열을 나타낸다 (예를 들어 도 1A 참조). IB1 및 IB2의 JBDs의 비교는 나아가 두 서열 사이에 매우 보존된 일곱개 및 세개 아미노산의 두 블록을 나타낸다.
이러한 정렬에 기초하여 이루어진 서열은 예를 들어 WO 01/27268 또는 WO 2007/031280에서 개시되었다. WO 2007/031280 및 WO 01/27268은 HIV-TAT 단백질 및 IB1의 최소 20개 아미노산 억제 서열의 기초 트래피킹(trafficking) 서열로부터 유래된 소위 TAT 세포 투과 서열을 포함하는, 작은 세포 투과성 융합 펩타이드를 개시한다. 두 구성요소는 서로 공유 결합되어 있다. WO 2007/031280 및 WO 01/27268 모두에 개시된 MAPK-JNK 시그널링 경로의 예시적인 (및 현재 유일한) 억제자는 예를 들어 L-JNKI1 (L 아미노산으로 이루어진 JNK 억제자 펩타이드) 또는 프로테아제 저항성 D-JNKI1 펩타이드 (비 자연적 D 아미노산으로 이루어진 JNK 억제자 펩타이드)이다. 이들 JNK 억제자 (JNKI) 펩타이드는 JNK (JNK1, JNK2 및 JNK3)에 특이적이다. 상기 언급된 이들 작은 화합물 억제자와 반대로, WO 2007/031280 또는 WO　01/27268 내 억제자 서열, 예를 들어 JNKI1은 JNK 및 이의 기질 사이 상호작용을 보다 억제한다. TAT로부터 유래된 이의 트래피킹 서열에 의해, 융합 펩타이드는 세포로 효율적으로 전송된다. 트래피킹 구성요소에 의해 수득된 신규 특성에 의해 융합 단백질은 세포로 활동적으로 전송되고, 그들은 단백질 분해될 때까지 효과적으로 남아 있다.
그러나, WO 2007/031280 또는 WO 01/27268에 따르는 펩타이드는 오직 특히 제한된 질병의 종류, 특히 세포 증식과 관련된 비 악성 또는 면역학적 질병에서 활성으로 나타난다.
본 발명의 하나의 목적은 따라서, JNK 억제자 펩타이드와 싸울 수 있는, 추가적인 질병을 식별하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이들 질병 및 JNK 시그널링과 강하게 관련된 것으로 아직 알려지지 않거나 이미 알려진 질병의 치료를 위해 새로운 JNK 억제자 펩타이드 및 이의 유도체(의 용도)를 제공하는 것이다.
상기 목적은 개체 내 JNK 시그널링과 강하게 관련된 다양한 염증성 또는 비염증성 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위해 바람직하게 본 발명에 정의된, 전형적으로 150개 아미노산 길이 미만을 포함하는 JNK 억제자 서열의 사용에 의해 해결되며, 상기 질병 또는 질환은 하기 그룹으로부터 선택된다:
(a) 뇌척수염(encephalomyelitis), 특히 급성 산재성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 척추염(spondylitis), 특히 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항합성효소 증후군(antisynthetase syndrome), 피부염(dermatitis), 특히 아토피 피부염(atopic dermatitis) 또는 접촉성 피부염(contact dermatitis), 간염(hepatitis), 특히 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 말초신경 병증(autoimmune peripheral neuropathy), 췌장염(pancreatitis), 특히 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 베체트 병(Behcet's disease), 비커스테프(Bickerstaff's), 뇌염(encephalitis), 블라우 증후군(Blau syndrome), 만성 소화 장애증(Coeliac disease), 샤가스 병(Chagas disease), 다발성 신경장애(polyneuropathy), 특히 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경장애(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 골수염(osteomyelitis), 특히 만성 순환성 다초점 골수염(chronic recurrent multifocal osteomyelitis), 처그 스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 코간 증후군(Cogan syndrome), 거대 세포 동맥염(giant-cell arteritis), CREST 증후군, 맥관염(vasculitis), 특히 피부 소형 도관 맥관염(cutaneous small-vessel vasculitis) 및 두드러기 맥관염(urticarial vasculitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 피부근염(dermatomyositis), 전신성 공피증(systemic scleroderma), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 약물 유발성 홍반성 낭창(drug-induced lupus erythematosus), 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 골부착 부위염(enthesitis), 호산성 근막염(eosinophilic fasciitis), 호산구성 위장염(eosinophilic gastroenteritis), 결절성 홍반(erythema nodosum), 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis), 위염(gastritis), 그레이브 질병(Grave's disease), 기엥 바레 증후군(Guillain-barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa), 특발성 염증 탈수병(Idiopathic inflammatory demyelinating diseases), 근염(myositis), 특히 봉입체 근염(inclusion body myositis), 방광염(cystitis), 특히 간질성 방광염(interstitial cystitis), 가와사키병(Kawasaki disease), 편평태선(Lichen planus), 루포이드 간염(lupoid hepatitis), 마지드 증후군(Majeed syndrome), 메니에르 질병(Meniere's disease), 미세다발성 맥관염(microscopic polyangiitis), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 척수염(myelitis), 특히 시속신경수염(neuromyelitis optica), 갑상선염(thyroiditis), 특히 오드 갑상선염(Ord's thyroiditis), 류머티즘(rheumatism), 특히 재발성 류마티즘(palindromic rheumatism), 파서니즈-터너 증후군(Parsonage-Turner syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 정맥주위 뇌척수염(perivenous encephalomyelitis), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 다발성 근육통(polymyalgia), 특히 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatic), 다발성근염(polymyositis), 간경변(cirrhosis), 특히 원발담즙성 간경병(primary biliary cirrhosis), 담관염(cholangitis), 특히 원발 경화 쓸개관염(primary sclerosing cholangitis), 점진성 염증 신경장해(progressive inflammatory neuropathy), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 재발성 다발 연골염(relapsing polychondritis), 관절염(arthritis), 특히 반응성 관절염(reactive arthritis) (라이터 증후군(Reiter disease)) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 류마티스성 열(rheumatic fever), 유육종증(sarcoidosis), 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome), 혈청병(serum sickness), 척추관절증(spondyloarthropathy), 타까야수동맥염(Takayasu's arteritis), 톨로사 헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단성 척수염(transverse myelitis), 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis),
(b) 안 염증성 질병(eye inflammatory diseases), 특히 포도막염(uveitis), 공막염(scleritis), 각막 수술(corneal surgery), 결막염(conjunctivitis), 비전염성 각막염(non-infectious keratitis), 홍채염(iritis), 맥락막 염증(chorioretinal inflammation), 눈의 망막을 손상시키는 염증성 질병(망막증(retinopathy)), 특히 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 동맥성 고혈압 유발성 고혈압 망막증(arterial hypertension induced hypertensive retinopathy), 방사선 유발성 망막증(radiation induced retinopathy), 태양 유발성 태양 망막증(sun-induced solar retinopathy), 트라우마 유발성 망막증(trauma-induced retinopathy), 예를 들어 퍼쳐 망막증(Purtscher's retinopathy), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity, ROP) 및 과점도 관련 망막증(hyperviscosity-related retinopathy)으로부터 선택된 것,
(c) 에디슨병(Addison's disease), 무감마글로불린혈증(Agammaglobulinemia), 원형탈모(Alopecia areata), 근위축성 측삭 경화증(Amytrophic lateral sclerosis), 항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome), 아토피성 알러지(Atopic allergy), 자가면역성 무형성 빈혈(Autoimmune aplastic anemia), 자가면역성 심근증(Autoimmune cardiomyopathy), 자가면역성 장질환(Autoimmune enteropathy), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 내이병(Autoimmune inner ear disease), 자가면역성 림프증식 증후군(Autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역성 다발내분비성 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome), 자가면역성 프로게스테론 피부염(Autoimmune progesterone dermatitis), 특발 혈소판감소 자색반증(Idiopathic thrombocytopenic purpura), 자가면역성 두드러기(Autoimmune urticarial), 발로 동심성 경화증(Balo concentric sclerosis), 수포성 류천포창(Bullous pemphigoid), 캐슬만병(Castleman's disease), 반흔성 유천포창(Cicatricial pemphigoid), 한랭 응집소병(Cold agglutinin disease), 보체 성분 2 결핍 관련 질병(Complement component 2 deficiency associated disease), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 다고스병(Dagos disease), 동통성 지방증(Adiposis dolorosa), 호산구성 폐렴(Eosinophilic pneumonia), 후천성 표피 수포증(Epidermolysis bullosa acquisita), 신생아 용혈성 질환(Hemolytic disease of the newborn), 한성글로불린혈증(Cryoglobulinemia), 에반스 증후군(Evans syndrome), 진행성 골화성 섬유이형성(Fibrodysplasia ossificans progressive), 위장성 유천포창(Gastrointestinal pemphigoid), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 하시모토 뇌병증(Hashimoto's encephalopathy), 임신 유천포창(Gestational pemphigoid), 휴-스토빈 증후군(Hughes-stovin syndrome), 저감마글로불린혈증(Hypogammaglobulinemia), 램버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-eaton myasthenic syndrome), 경화성 태선(Lichen sclerosus), 반상경피증(Morphea), 급성태선상두진상비강진(Pityriasis lichenoides et varioliformis acuta), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 기면증(Narcolepsy), 신경근 긴장증(Neuromyotonia), 안구간대경련 근간대경련 증후군(Opsoclonus myoclonus syndrome), 방종양성 소뇌 변성(Paraneoplastic cerebellar degeneration), 발작성야간혈색소뇨증(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 안면편측 위축증(Parry-romberg syndrome), 악성 빈혈(Pernicious anemia), POEMS 증후군, 괴저성 농피증(Pyoderma gangrenosum), 순수 적혈구 무형성증(Pure red cell aplasia), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 하지불안증후군(Restless legs syndrome), 후복막 섬유증(Retroperitoneal fibrosis), 제2형 자가면역성 다발성내분비 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome type 2), 스티프 퍼슨 증후군(Stiff person syndrome), 수삭 증후군(Susac's syndrome), 열성 호중구 피부병(Febrile neutrophilic dermatosis), 시드남 무도병(Sydenham's chorea), 혈소판 감소(Thrombocytopenia), 및 백반(vitiligo),
(d) 관절염(arthritis) 특히 청소년 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 건선 관절염(psoriastic arthritis) 및 류마티스성 관절염, 및 관절증(arthrosis), 및 골관절염(osteoarthritis),
(e) 피부 질환 특히 건선(psoriasis), 습진(eczema), 피부염(dermatitis), 여드름(acne), 구강염(mouth ulcers), 홍반(erythema), 편평 태선(lichen plan), 유육종증(sarcoidose), 혈관염(vascularitis), 성인 성형 IgA 질병(adult linear IgA disease)으로부터 선택된 것,
(f) 타우증(tauopathies), 아밀로이드증(amyloidosis) 및 프리온 질병(prion diseases),
(g) 용종(polypes).
(h) 구강 또는 턱뼈 염증성 질병, 특히 치수염(pulpitis), 임플란트 주위염(periimplantitis), 치주염(periodontitis), 치은염(gingivitis), 구내염(stomatitis), 점막염(mucositis), 낙설성 질환(desquamative disorders), 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder),
(i) 골괴사(osteonecrosis)
(j) 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD) 특히 연령 관련 황반 변성의 젖은 또는 건조 형태, 및 백내장(cataract)
(k) 섬유증 질병 및/또는 질환 특히 폐, 심장, 간, 골수, 종격, 복막후강, 피부, 창자, 관절, 및 어깨 섬유증으로부터 선택된 것,
(l) 신장 질병 및/또는 질환 특히 일반적인 사구체신염(glomerulonephritis), 특히 막성증식성사구체신염(membrano-proliferative glomerulonephritis), 메산지오증식성사구체신염(mesangio-proliferative glomerulonephritis), 급속진행성사구체신염(rapidly progressive glomerulonephritis), 일반적인 신증(nephrophathies), 특히 막성신증(membranous nephropathy) 또는 당뇨병성신증(diabetic nephropathy), 일반적인 신염(nephritis), 특히 홍반성신염(lupus nephritis), 신우신염(pyelonephritis), 간질성신염(interstitial nephritis), 세뇨관간질성 신염(tubulointerstitial nephritis), 만성 신장염(chronic nephritis) 또는 급성 신장염(acute nephritis), 및 미세변화질병(minimal change disease) 및 국소분절사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis)으로부터 선택된 것,
(m) 교감성 안염(sympathetic ophthalmia)
(n) 신장, 심장, 폐, 췌장, 간, 혈액 세포, 골수, 각막, 사고로 절단된 사지(accidental severed limb), 특히 손가락, 손, 발, 얼굴, 코, 뼈, 분문판(cardiac valve), 혈관 또는 장기 이식 거부 반응,
(o) 피질기저 퇴행(Corticobasal degeneration), 점진성 핵상 마비(progresive supranuclear palsy), 정신 분열증(schizophrenia), 유전 크로이츠펠트 야곱병(inherited Kreutzfeld Jacob), 운동 뉴런증(motor neurone disease), 척수소뇌실조증/위축증(spinocerebellar ataxia/atrophie), 치매(dementia), 특히 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with lewy bodies), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 유전적 경련성 하반신 마비(hereditary spastic paraparesis), 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxiea), 샤르코 마리투스(Charcot Marie toot), 및
(p) 유전성 또는 비 유전성 대사성 질병인 질병, 특히 탄수화물 대사의 대사성 질환의 그룹, 예를 들어, 당원저장증(glycogen storage disease), 아미노산 대사 질환, 예를 들어, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 단풍나무시럽뇨병(maple syrup urine disease), 제1형 글루타린산혈증(glutaric acidemia type 1), 요소회로질환(urea Cycle Disorder) 또는 요소회로결핍(urea Cycle Defects), 예를 들어, 카바모일 인산 합성효소 I 결핍증(carbamoyl phosphate synthetase I deficiency), 유기산 대사의 질환(유기성 산성뇨(organic acidurias)), 예를 들어, 알캅톤요증(alcaptonuria), 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사의 질환, 예를 들어, 중쇄 아실-코엔자임 A 디하이드로게나아제 결핍(medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency) (종종 MCADD로 축약), 포르피린 대사의 질환, 예를 들어 급성간헐성포르피린증(acute intermittent porphyria), 퓨린 또는 피리미딘 대사의 질환, 예를 들어, 레쉬니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 스테로이드 대사의 질환, 예를 들어, 선천 지질 부신 과다형성(lipoid congenital adrenal hyperplasia), 또는 선천성 부신 과형성(congenital adrenal hyperplasia), 미토콘드리아 기능의 질환, 예를 들어, 컨즈-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 퍼옥시좀 기능의 질환. 예를 들어, 젤 웨거 증후군(Zellweger syndrome), 또는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders), 예를 들어, 고셰병(Gaucher's disease) 또는 니만피크병(Niemann Pick disease)으로부터 선택된 것.
바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 치료되는 질환/질병은 AMD, 젖은 또는 건조 형태, 및 백내장(cataract)이다.
바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 치료되는 질환/질병은 망막증(retinopathy), 특히 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)이다.
바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 치료되는 질환/질병은 건선(psoriasis)이다.
또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 치료되는 질환/질병은 이식편 거부 또는 이식 거부 반응, 특히 간, 폐, 신장, 췌장, 피부 또는 심장 이식편 거부 (heart transplant graft rejection), 예를 들어 이식편 대 수용자(host) 또는 수용자 대 이식편이다.
또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 치료되는 질환/질병은 사구체신염이다.
나아가, 하기에 치료되는 추가 질병이 개시된다:
본 발명의 JNK 억제자는 예를 들어 급성 염증 뿐만 아니라 만성 염증을 포함하는 염증성 질병의 치료를 위해 예시적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 JNK 억제자는 조직 염증의 어느 타입, 예를 들어 안 내 염증, 구강 내 염증, 특히 폐를 포함하는 호흡계의 염증, 피부의 염증, 심장혈관계 내 염증, 뇌의 염증, 귀 내 염증 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 염증성 질병 증상에 대한 일부 비 제한정 예시는 점막염(mucositis), 구내염(stomatitis), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 망막염(retinitis), 맥락막염(chorioiditis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 포도막염(uveitis) (예를 들어 전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 후방 포도막염(posterior uveitis)), 치주염(periodontitis), COPD, 천식(asthma), 치수염(pulpitis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 크론병(Crohn's disease), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 맥관염(vasculitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis); 감염 또는 상처 부위에 급성 염증, 수막염(meningitis), 뇌염(encephalitis), 폐렴(pneumonia), 인두염(pharyngitis), 편도염(tonsillitis), 이염(otitis) (중이염 포함), 맥관염(vasculitis), 활액막염(synovitis), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 이식편 거부(graft rejection) 등이다.
본 발명에 개시된 JNK 억제자는 예를 들어 귀 질병(특히 내이 병), 청력 감소(특히 급성 청력 감소), 손상된 유모세포 부동섬모(damaged hair cell stereocilia), 유모세포 사멸, 소음 외상, 이염, 중이염 등의 치료 방법에 사용될 수 있다. 청력 감소 및 관련된 유모 세포 사멸은 JNK 억제가 스트레스 반응 및 예를 들어 세포 사멸 억제를 조절할 수 있는 세포에 대한 스트레스 환경으로부터 초래된 질환에 대한 비 제한적 예시이다.
본 발명의 JNK 억제자는 또한 대사성 질환의 치료를 위해, 예를 들어 당뇨병(제1형 또는 제2형, 특히 제1형), 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher disease), 저체온증(hypothermia), 이상 고열 저산소증(hyperthermia hypoxia), 지질 조직구증(lipid histiocytosis), 지방증(lipidoses), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 뮤코다당침착증(mucopolysaccharidosis), 니만피크병(Niemann Pick disease), 비만, 및 울만병(Wolman's disease)의 치료를 위해 사용될 수 있다. 저체온증(Hypothermia), 고체온(hyperthermia) 및 저산소증(hypoxia)은 다시 JNK 억제자가 스트레스 반응 및 예를 들어 세포 사멸 억제를 조절할 수 있는 세포에 대한 스트레스 환경에 대한 비제한적 예시이다.
마찬가지로, 본 발명의 JNK 억제자는 각각 신경의, 뉴런의 및/또는 신경병성 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
이러한 질병들의 예시는 예를 들어 알렉산더병(Alexander disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 뇌졸중(apoplexy), 모세혈관확장성운동실조증(Ataxia Telangiectasia), 절단 또는 분쇄된 축색(cut or otherwise disrupted axons), 축색 절단(axotomy), 뇌병변장애(brain lesions), CMT (샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth)), 피질기저변성(corticobasal degeneration), 치매(dementia), 신경계의 질병 또는 질환, 긴장 이상(dystonia), 간질(epilepsy), 파버 증후군(Farber's disease), 프레드리히 운동실조(Friedreich ataxia, SCA), 갱글리오사이드증(gangliosidoses), 기엥 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia), 히르츠프룽병(Hirschsprung's disease), 인간면역결핍바이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 뇌경색(infarct of the brain), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 크라베병(Krabbe disease), 레녹스가스토 증후군(Lennox Gastaut Syndrome), 뇌회결손(lissencephaly), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수증(myelopathy), AIDS 관련된 신경퇴행성 질병, 제2형 신경 섬유종증(neurofibromatosis type 2, NF-2), 뉴로라티어리즘(neurolatyerism), 신경 세포 자멸(neuronal apoptosis), 신경세포 사멸(neuronal death), 신경성 동통(neuropathic pain), 신경병증(neuropathy), 화학요법 유발성 신경병증, 당뇨병 유발성 신경병증, NMDA 유발성 신경독성, 통증, 파킨슨 질병(Parkinson's disease), 파킨슨병(parkinsonism), 피크병(Pick's Disease), 다발성신경장애(polyneuropathy), 점진성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy), 샌드호프 병(Sandhoff disease), 척추 피열(spina bifida), 뇌졸중(stroke), 테이삭스병(Tay Sachs), TBI (다발성 신경손상(diffuse axonal injury)), 예를 들어 염증성 통증에 의해 유발된 어두운 뉴런(dark neurone)의 치료, 웨스트 증후군(West Syndrome), 척수성 근위축(spinal muscular atrophy) 등이다.
자가면역 질환에 관하여, 본 발명의 JNK 억제자 펩타이드는 예를 들어 CNS의 자가면역 질병, 자가염증성 질병, 소아 지방변증(Celiac disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus) 등의 치료 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 골 질병에 대한 예시들은 예를 들어 관절염, 추간판 탈출증(disc herniation), 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressive, FOP), 골관절염(osteoarthritis), 골석화증(osteopetrosis), 골다공증(osteoporosis), 특히 당뇨병 유발성 골다공증, 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 관절염 등이다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 피부 질병의 예시는 예를 들어 건선 및 홍반성 낭창이다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 안 질병은 예를 들어 연령 관련 황반 퇴화(age-related macular degeneration, AMD); 망막색소선조(angioid streaks); 전방 허혈성 시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy); 전방 포도막염(anterior uveitis); 백내장(cataract), 특히 연령 관련 백내장; 중앙 삼출성 맥락망막병증(central exudative chorioretinopathy); 중심 장액성 맥락망막병증(central serous chorioretinopathy); 선립종안검맥립종(chalazion); 맥락막 결여(chorioderemia); 맥락막염(chorioiditis); 맥락막 경화증(choroidal sclerosis); 결막염(conjunctivitis); 모양체염(cyclitis); 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy); 안구건조증(dry eye syndrome); 내안구염(endophthalmitis); 상공막염(episcleritis); 눈 감염(eye infection); 백색점상안저(fundus albipunctatus); 맥락막 및 망막의 우곡상 위축(gyrate atrophy of choroid and retina); 맥립종(hordeolum); 안검(blephara)의 염증성 질병; 맥락막의 염증성 질병; 섬모체체(ciliary body)의 염증성 질병; 결막(conjunctiva)의 염증성 질병; 각막(cornea)의 염증성 질병; 홍채(iris)의 염증성 질병; 눈물샘(lacrimal gland)의 염증성 질병; 궤도 뼈(orbital bone)의 염증성 질병; 공막(sclera)의 염증성 질병; 유리체(vitreous body)의 염증성 질병; 포도막(uvea)의 염증성 질병; 망막(retina)의 염증성 질병; 중간 포도막염(intermediate uveitis); 홍채염(irititis); 각막염(keratitis); 레베르병(Leber's disease); 다소성 맥락막염(multifocal choroiditis); 안 근육의 근염(myositis); 신생혈관 황반병증(neovascular maculopathy) (예를 들어 고도 근시(high myopia), 측만된 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 또는 맥락막 골종(choroidal osteoma) 등에 의해 유발됨); NMDA 유발성 망막 독성(retinotoxicity); 비-만성 또는 만성 염증성 안 질병; 오구치병(Oguchi's disease); 시신경 질병(optic nerve disease); 궤도 결합조직염(orbital phlegmon); 전안구염(panophtalmitis); 전포도막염(panuveitis); 후 캡슐 혼탁화(post caspule opacification); 후방 캡슐 혼탁화(posterior capsule opacification, PCO) (백내장 수술후 합병증); 후방 포도막염(posterior uveitis); 증식유리체 망막병증(proliferative vitreoretinopathy); 망막 동맥 폐색(retinal artery occlusion); 망막 박리(retinal detachment), 망막 질병(retinal diseases); 망막 손상(retinal injuries); 망막 대혈관류(retinal macroaneurysm); 망막 색소 상피 분리(retinal pigment epithelium detachment); 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion); 망막염(retinitis); 색소성 망막염(retinitis pigmentosa); 백점망막염(retinitis punctata albescens); 망막증(retinopathy), 특히 조숙 및 당뇨병성 망막증의 망막증(retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy); 공막염(scleritis); 스타르가르트병(Stargardt's disease); 염증이 생긴 안구 상처(ocular wounds) 및/또는 안구 상처 가장자리의 치료; 안구 수술 또는 트라우마 이후 안 내 염증의 치료; 포도막염(uveitis); 난황상 황반 이영양증(vitelliform macular dystrophy); 등을 포함한다.
본 발명에 개시된 JNK 억제자로 치료될 수 있는 구강 질병의 예시는 치주염(periodontitis), 특히 만성 치주염; 점막염(mucositis), 구강 낙설성 질환(oral desquamative disorders), 구강 편평 태선(oral liquen planus), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 치수염(pulpitis); 구내염(stomatitis); 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder), 임플란트 주위염 등이다.
본 발명은 또한 방광 기능의 상실(예를 들어, 요실금(urinary incontinence), 과민성 방광(overactive bladder), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 또는 방광암(bladder cancer))을 초래하는 질병의 치료에 사용되기에 적절하다.
용도의 다른 분야는 통증, 특히 신경병질(neuropathic), 사고성(incident), 돌파성(breakthrough), 심인성(psychogenic), 또는 환상 통증(phantom pain), 급성 또는 만성 형태의 이들 통증의 모든 타입의 치료이다.
마찬가지로 본 발명의 JNK 억제자는 - 다른 JNK 억제자에 대하여 이미 상기 제안된 것처럼 - 암 및 종양 질병과 같은, 청신경초종(acusticus neurinoma) 폐암종(lung carcinomas); 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia) (L1, L2, L3); 급성 림프성 백혈병(acute lymphoid leukaemia, ALL); 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML); 선암(adenocarcinomas); 항문암(anal carcinoma); 기관지 암종(bronchial carcinoma); 경부암(cervix carcinoma); 자궁경부암(cervical cancer); 성상 세포종(astrocytoma); 기저세포종(basalioma); Bcr-Abl 변형을 갖는 암; 방광암; 아세포종(blastomas); 골암; 뇌 전이(brain metastases); 뇌 종양(brain tumours); 유방암; 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma); 암양종(carcinoids); 자궁경부암(cervical cancer); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL); 만성 골수 백혈병(chronic myeloid leukaemia, CML); 대장암(colon cancer); 결장암(colon carcinoma); 자궁체부암(corpus carcinoma); 두개인두종(craniopharyngeomas); CUP 증후군; 바이러스 유발성 종양; EBV-유발성 B 세포 림프종; 자궁내막 상피성암(endometrium carcinoma); 적백혈병(erytholeukemia) (M6); 식도암(esophagus cancer); 담낭암(gallbladder cancer); 위장암(gastrointestinal cancer); 위장관 간질 종양(gastrointestinal stromal tumors); 위장 종양(gastrointestinal tumours); 비뇨 생식기암(genitourinary cancer); 녹내장(glaucoma); 교아종(glioblastoma); 신경교종(gliomas); 머리/목 종양; B형 간염 유발성 종양; 간세포 또는 간세포성 상피성암; 간종양(hepatomas); 헤르페스 바이러스 유발성 종양(herpes virus-induced tumours); 호지킨 증후군(Hodgkin's syndrome); HTLV-1-유발성 림프종; HTLV-2-유발성 림프종; 인슐린종(insulinomas); 장암(intestinal cancer); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 신장암(kidney cancer); 신장 상피성암(kidney carcinomas); 후두암(laryngeal cancer); 백혈병(leukemia); 눈꺼풀 종양(lid tumour); 간암; 간 전이; 폐암; 림프성 암(lymphoid cancer); 림프종(lymphomas); 악성 흑색종(malignant melanomas); 유방암(mammary carcinomas); 외투세포림프종(mantle cell lymphoma); 수모세포종(medulloblastoma); 거핵아세포 백혈병(megakaryoblastic leukemia) (M7); 흑색종(melanoma), 특히 악성 흑색종(malignant melanoma); 수막종(meningioma); 중피종(mesothelioma); 단구성 백혈병(monocytic leukemia, MS); 다발성 골수종(multiple myeloma); 균상식육종(mycosis fungoides); 골수아구성백혈병(myeloblastic leukemia) (M1); 골수아구성백혈병 (M2); 골수단구성백혈병(myelomonocytic leukemia) (M4); 신경초종(neurinoma); 비호지킨림프종(non-Hodgkin's lymphomas); 비소 세포 암종(non-small cell carcinoma); 비소 세포 폐암종(non-small cell carcinoma of the lung); 식도암(oesophageal cancer); 식도암종(oesophageal carcinoma); 희돌기교종(oligodendroglioma); 난소암; 난소암종; 췌장암; 췌장암종; 유두종 바이러스 유발성 암종; 음경암(penis cancer); 점액 종양(pituitary tumour); 플라스마세포종(plasmocytoma); 전골수성백혈병(promyelocytic leukemia) (M3); 전립선암(prostate cancer); 전립성 종양(prostate tumours); 직장암(rectal tumours); 직장 암종(rectum carcinoma); 신세포암(renal-cell carcinoma); 망막아종(retinoblastoma); 육종(sarcomas); 스니버거병(Schneeberger's disease); 소세포 폐 암종(small cell lung carcinomas); 소장암(small intestine cancer); 소장 종양; 연성 조직 종양(soft tissue tumours); 척수종(spinalioma); 편평상피암(squamous cell carcinoma); 위암; 고환암; 식도암; 흉선종(thymoma); 갑상선암; 갑상선암종; 설암; 비분화된 AML (MO); 요도암; 자궁암; 질암; 본 힙펠 린다우병(Von Hippel Lindau disease); 외음부암(vulval cancer); 윌름즈 종양(Wilms' Tumor); 색소성 건피증(Xeroderma pigmentosum); 등과 같은 증식성 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
JNK 시그널링은 또한 많은 심혈관 질병 및 질환에 포함되기 때문에, 이러한 질병의 치료에 JNK 억제자의 사용은 이미 과거에 제안되었다. 본 발명의 억제자는 따라서, 예를 들어 동맥성 고혈압(arterial hypertension); 동맥 경화증(arteriosclerosis); 동맥 경화증 병변(arteriosclerotic lesions); 베체트 증후군(Behcet's syndrome); 혈관 분기(bifurcations of blood vessels); 심장 비대(cardiac hypertrophy); 심혈관 비대(cardiavascular hypertrophy); 심근증(cardiomyopathies), 특히 화학요법 유발성 심근증; 뇌 빈혈; 관동맥성 심장병(coronary heart diseases); 복대동맥(abdominal aorta) 팽창; 병소 뇌허혈(focal cerebral ischemia); 전뇌허혈(global cerebral ischemia); 심장 비대증(heart hypertrophy); 콩팥하 동맥류 고혈압(infrarenal aneurism hypertension); 국소빈혈(ischemia); 심근 경색(myocardial infarct), 특히 급성 심근 경색(acute myocardial infarction); 심근염(myocarditis); 재관류(reperfusion); 레스테노시스(restenosis); 맥관염(vasculitis); 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis); 등과 같은 심혈관 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자는 심혈관 질병의 맥락에서 또한 관동맥 우회로 이식술(coronary artery bypass graft surgery, CABG 수술); 경피적 경혈관 관상동맥 확장술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA); 및/또는 스텐트(stent) 치료에, 예를 들어 상기 (수술) 치료로부터 초래되는 내막과다증식(intimal hyperplasia)을 예방 또는 치료하기 위해 상보적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자로 효과적으로 치료될 수 있는 호흡계의 질병 및 특히 폐 질병은 예를 들어 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS); 천식(asthma); 호흡계에 포함된 만성 질병; 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis); 염증성 폐 질병(inflammatory lung diseases); 폐렴(pneumonia); 폐섬유증(pulmonary fibrosis); 등이다.
선행기술의 억제자와 같이 본 발명의 억제자들은 또한 장관의 질병, 예를 들어 대장염(colitis) (예를 들어 비정형 대장염(atypical colitis), 화학적 대장염(chemical colitis); 교원성 대장염(collagenous colitis), 말단 대장염(distal colitis), 전환 대장염(diversion colitis); 전격성 대장염(fulminant colitis), 부정성 대장염(indeterminate colitis), 전염성 대장염(infectious colitis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 림프구성 대장염(lymphocytic colitis), 또는 미세 장염(microscopic colitis)), 크론병(Crohn's disease), 위장염(gastroenteritis), 히르츠프룽병(Hirschsprung's disease), 염증성 소화질병(inflammatory digestive diseases); 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 크론 질환(Morbus Crohn), 비-만성 또는 만성 소화 질병, 비-만성 또는 만성 염증성 소화 질병; 지방성 장염(regional enteritis); 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 등의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자는 또한 박테리아 또는 바이러스 감염을오부터 초래되는 감염성 질병의 치료를 위한 치료제로서 제공될 수 있다. 본 발명에 개시된 JNK 억제자는 예를 들어 상기 감염에 의해 유발된 염증성 반응을 예방 또는 개선할 수 있다. 제한되는 것으로 고려되지 않는, 이러한 질병 증상에 대한 예시는 바이러스성 뇌염(viral encephalitis); 바이러스 유발성 암(viral induced cancers) (예를 들어 상기 언급된 것과 같음), 인간 면역결핍 바이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 수막염(meningitis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 편도염(tonsillitis) 등이다.
본 발명의 JNK 억제자가 치료로 사용될 수 있는 많은 다른 질병, 질병 증상 및 질환, 예를 들어 아스코그 증후군(Aarskog syndrome), 아세트아미노펜 간독성(acetaminophen hepatotoxicity); 알더-레일리 이상(Alder-Reilly anomaly); 원형 탈모(alopecia areata); 알파-1-안티트립신 결핍(alpha-1-antitrypsin deficiency); 과민증(anaphylaxis); 세포자멸(apoptosis); 세포 자멸 세포 치사(apoptotic cell death); 비정형적 용혈성 요독성 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome); 바소페니아(basopenia); 호염기구 이상증가(basophilia); 조울증(bipolar disorders); 화상; 세포 전단응력(cellular shear stress); 체디아크 히가시 증후군(Chedial-Higashi syndrome); 화학요법 약물에 의한 DNA 손상; 담즙 분비 중지(cholestasis); 염색체 11, 부분 일염색체성(Partial Monosomy) 11q; 염색체 22, 삼염색체성 모자이크(Trisomy Mosaic); 만성육아종증(chronic granulomatous disease); 만성 또는 전격성 간염과 같은 간염; 임상 우울증(clinical depression); 공통 가변성 저감마글로불린혈증(common variable hypogammaglobulinemia); 선천적 C3 결핍; 활성화 유발성 세포 사멸(AICD)로부터 CTL 보호; 난청(deafness); 우울증 및 우울 장애(depressive disorders) (특히 사이토카인 유발성 질병 양태의 배경에 발달된 우울 장애의 예방), 흉선 무형성(DiGeorge's syndrome); 결함이 있는 세포자멸에 의한 질병; 간 질병; 척추 질병; 자궁 질병; DNA 손상제재 및/또는 이온화 방사선에 노출됨에 따른 질병 상태 및 증상과 초래된 세포 스트레스; 다운 증후군; 듀켄씨 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy); 외배엽 형성장애(ectodermal dysplasias); 자궁내막증(endometriosis); 호산구 감소증(eosinopenia); 호산 백혈구 증가증(eosinophilia); 흥분 독성 세포 사멸(exocitoxic cell death); 태아기 알코올 증후군(fetal alcohol syndrome); 섬유증(fibrosis); 섬유증 질병(fibrotic disease); 섬유 조직(fibrous tissue)의 형성; 자유 라디칼(세포 스트레스를 유발); 이식편 거부; 수용자에 대한 이식편 질병(Graft versus host Disease), 특히 수용자에 대한 피부 이식편; 탈모; 용혈성 요독성 증후군(hemolytic uremic syndrome); 간독성(hepatotoxicity); 당뇨병 유발성 통각 과민증과 같은, 통각 과민증(hyperalgesia); 이상 고열(hyperthermia); 저혈당(hypoglycaemia); 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism); 특발성 과호산구 증후군(idiopathic hypereosinophilic syndrome); IgA 신장해(nephropathy); 유아 반성 무감마글로불린혈증(infantile sex-linked agammaglobulinemia); 염증성 통증; 콩팥하 동맥증(infrarenal aneyrism); 섬 재생(islet regeneration); 섬 이식(islet transplantation); 잡스 증후군(Job's syndrome) (과다-IgE(hyper-lgE)); 게으른 백혈구 증후군(lazy leukocyte syndrome); 백혈구 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency); 백질이영양증(leukodystrophy); 백혈구 감소(leukopenia); 백혈구 증가(lymphocytic leucocytosis); 림프구 감소증(lymphocytopenia); 림프구 증가증(lymphocytosis); 주우울증(major depression); 조병(mania); 조울증(maniac depression); 마르판 증후군(Marfan syndrome); 비만 세포증(mastocytosis); 메이 헤글린 이상(May Hegglin Anomaly); 제2형 막성증식성사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis Type II); 단구감소증(monocytopenia); 단구증(monocytosis); 미엘로페록시다제 결핍 양성(myeloperoxidase deficiency-benign); 근질환(myopathies); 호중구감소증(neutropenia); 호중구증가증(neutrophilia); 네젤로프 증후군(Nezelof's syndrome); 장기 이식; 산화 스트레스 부상; 펠거호이트 기형(Pelger-Huet anomaly); 다발성낭포신증(polycystic kidney diseases); 투석-후 증후군(post-dialysis syndrome); 방사선 증후군(radiation syndromes); 방사선 요법(radiotherapy); 신장병(renal diseases); 신부전증(renal failure); 활성화 유발성 세포 사멸로부터 구조(rescuing) CTL; 중증 복합형 면역 부전증(severe combined immunodeficiency disease); 이식 거부(transplant rejection); 이식(transplantation); 삼염색체성(trisomy); 단극성 우울증(unipolar depression); UV-유발성 부상; 위스코트알드릭 증후군(Wiskott Aldrich syndrome); 상처 치유(wound healing); 등이 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 JNK 억제자로 치료를 위해 특히 유용한 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder), 점막염(mucositis), 구내염(stomatitis), 구강 편평태선(oral liquen planus) (낙설성 질환(desquamative disorder)), 심상성천포창(Pemphigus vulgaris) (낙설성 질환), 치주염(periodontitis), 만성 치주염(chronic periodontitis), 치수염(pulpitis), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 포도막염(uveitis) (전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 후방 포도막염(posterior uveitis)), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca) (안 건조 증후군(dry eye syndrome)), 관동맥 우회로 이식술(coronary artery bypass graft surgery, CABG surgery), 급성 심근경색(acute myocardial infarction), 경피적경혈관관상동맥확장술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA) 이후 내막과다증식(intimal hyperplasia)의 예방, 스텐트 설치(stent placement) 이후 내막과다증식의 예방, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), COPD, 천식(asthma), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 크론병(Crohn's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 건선(psoriasis), 당뇨(diabetes), 뇌졸중(stroke), 파킨슨병, 알츠하이머병, 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 및 맥관염(vasculitis), 특히 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 고려한다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 조직 또는 장기 이식의 (인비트로(in vitro)) 치료를 위해 150 아미노산 길이 미만을 포함하는 억제자 서열을 이의 이식(transplantation) 전에 이식(transplant)한다. 보통, 뇌사 기증자(donors)로부터 유래하는 이식은 전형적으로 CIT의 8-12시간(조달 병원(procurement hospital)에서 격리 실험실(isolation lab)까지 운송에 필요한 시간)을 갖는 WIT의 대상이 아니다. 이러한 이식은 수용자에 이식될 때까지 그들의 생존력 및 기능성을 향상시키기 위해, 본 발명에 따르는 JNK 억제자에 의해 사전-치료(pre-treated)될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 관점에 대하여, 이식은 신장, 심장, 폐, 췌장, 간, 혈액 세포, 골수, 각막, 사고로 절단된 사지, 특히 손가락, 손, 발, 얼굴, 코, 뼈, 심장 판막, 혈관 또는 장 이식(intestine transplant), 바람직하게 신장, 심장, 췌장 또는 피부 이식이다.
기술분야에 알려진 JNK 억제자 서열은 질병의 제한된 수를 위해 유용성을 제공하기 때문에, 본 발명에 정의된 JNK 억제자가 상기 언급된 JNK 시그널링과 매우 관련된 질병 또는 질환의 치료에 사용되고 적절한 것은 놀라운 발견이다. 일반적인 JNK 억제자 서열이 기술분야에 알려져 있더라도, 이는 선행 기술에 의해 명백하거나 제안되지 않았다.
전형적으로, 본 상기 정의된 JNK 억제자 서열은 인간 또는 랫(rat) IB1 서열, 바람직하게 SEQ ID NO: 102(랫으로부터 IB1 cDNA 서열 및 이의 예견된 아미노산 서열을 나타냄), 바람직하게 SEQ ID NO: 103(rIB1 유전자-스플라이스 공여자(donor)의 엑손-인트론 경계에 의해 코딩된 랫으로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄), SEQ ID NO: 104(호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄), 또는 SEQ ID NO: 105(호모 사피엔스(Homo sapiens )로부터 IB1 cDNA 서열을 나타냄)에 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 코딩된 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 SEQ ID NO: 104(호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄) 또는 SEQ ID NO: 105(호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 IB1 cDNA 서열을 나타냄)에 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 코딩된 아미노산 서열로부터, 또는 이의 어느 절편 또는 변이체로부터 유래될 수 있다. 다시 말해, JNK 억제자 서열은 인간 또는 랫 IB1 서열의 절편, 변이체, 또는 이러한 절편의 변이체를 포함한다. 인간 또는 랫 IB 서열은, 각각, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 또는 SEQ ID NO: 105에 따르는 서열에 의해, 정의되고 코딩된다.
바람직하게, 본 발명에 사용된 이러한 JNK 억제자 서열은 총 길이가 150 아미노산 잔기 미만, 바람직하게 5 내지 150 아미노산 잔기의 범위, 더욱 바람직하게 10 내지 100 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게 10 내지 75 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게 10 내지 50 아미노산 잔기, 예를 들어 10 내지 30, 10 내지 20, 또는 10 내지 15 아미노산 잔기를 포함한다.
더욱 바람직하게, 이러한 JNK 억제자 서열 및 상기 범위는 상기 언급된 어느 서열로부터, 더욱 바람직하게 SEQ ID NO: 104에 따라 정의된 또는 SEQ ID NO: 105에 의해 코딩된 아미노산 서열, 더욱 바람직하게 SEQ ID NO: 105의 420 내지 980 사이 뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 104의 105 내지 291 사이 아미노산 영역, 및 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 105의 561 내지 647 사이 뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 104의 152 내지 180 사이 아미노산 영역으로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시예에 따르면, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 전형적으로 JNK에 결합하고/또는 적어도 하나의 JNK 활성화된 전사 인자, 예를 들어 c-Jun 또는 ATF2(예를 들어 각각 SEQ ID NOs: 15 및 16 참조) 또는 Elk1의 활성화를 억제한다.
마찬가지로, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 바람직하게 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100의 어느 하나에 따르는 적어도 하나의 아미노산 서열, 또는 절편, 유도체 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100에 따르는 아미노산 서열, 또는 변이체, 절편 또는 이의 유도체의 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 카피(copies)를 포함할 수 있다. 만약, 하나 이상의 카피가 존재한다면, 본 발명에 사용된 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100에 따르는 이들 아미노산 서열, 또는 변이체, 절편, 또는 이의 유도체에 따르는 이들 아미노산 서열은 연결자(linker) 서열 없이 또는 1 내지 10개, 바람직하게 1 내지 5개 아미노산을 포함하는 연결자 서열을 통해 직접적으로 서로 연결될 수 있다. 연결자 서열을 형성하는 아미노산은 바람직하게 아미노산 잔기로 글리신 또는 프롤린으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100, 또는 절편, 변이체 또는 이의 유도체에 따르는 이들 아미노산 서열은 둘, 셋 또는 그 이상의 프롤린 잔기의 힌지(hinge)에 의해 각각 분리될 수 있다.
본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 적어도 1 또는 2, 바람직하게 적어도 3, 4 또는 5, 더욱 바람직하게 적어도 6, 7, 8 또는 9 및 더욱 더 바람직하게 적어도 10 또는 그 이상의 D-및/또는 L-아미노산을 포함하며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록단위(blockwise), 비-블록단위 또는다른 방식으로 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열 내에 정렬될 수 있다.
바람직한 일 실시예에 따라 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 L-아미노산 서열로 독점적으로 구성될 수 있다. 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 이후 SEQ ID NO: 1 또는 3에 따르는 적어도 하나의 "천연(native) JNK 억제자 서열"을 포함 또는 이로 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "천연" 또는 "천연 JNK 억제자 서열(들)"은 전적으로 L-아미노산으로 이루어진, 본 발명에서 사용된 SEQ ID Nos: 1 또는 3의 어느 것에 따르는 비 변형된 JNK 억제자 서열을 말한다.
따라서, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열 NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH (L-IB 제네릭(generic)(s))[SEQ ID NO:3] 및/또는 IB1 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX (L-IB (제네릭)) [SEQ ID NO: 19]의 JNK 결합 도메인 (JBDs)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 각각 X는 전형적으로 아미노산 잔기, 바람직하게 어느 (천연)아미노산 잔기로부터 선택된 것을 나타낸다. Xn a는 전형적으로 하나의 아미노산 잔기, 바람직하게 세린 또는 트레오닌을 제외한 어느 아미노산 잔기로부터 선택된 것을 나타내며, 상기 n(X의 반복 수)은 0 또는 1이다. 게다가, 각 Xn b는 어느 아미노산 잔기로부터 선택될 수 있으며, 상기 n(X의 반복 수)는 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 또는 그 이상이며, 이러한 위치에 세린 또는 트레오닌을 회피하기 위하여, n(X의 반복 수)이 Xn a에 대하여 0일 경우, Xn b는 바람직하게 이의 C-말단에 세린 또는 트레오닌을 포함하지 않는다. 바람직하게, Xn b은 SEQ ID NO: 1 또는 3으로부터 유도된 펩타이드 잔기의 인접한 스트레치(stretch)를 나타낸다. Xn a 및 Xn b는 D 또는 L 아미노산을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 IB1 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (L-IB1) [SEQ ID NO: 17]의 JNK 결합 도메인을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 추가로 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열 NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-IB1(s)) [SEQ ID NO: 1]를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 게다가, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 IB1 L-IB1(s1) (NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 33); L-IB1(s2) (NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 34); L-IB1(s3) (NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 35); L-IB1(s4) (NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 36); L-IB1(s5) (NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 37); L-IB1(s6) (NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 38); L-IB1(s7) (NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 39); L-IB1(s8) (NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 40); L-IB1(s9) (NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 41); L-IB1(s10) (NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 42); L-IB1(s11) (NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 43); L-IB1(s12) (NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 44); L-IB1(s13) (NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 45); L-IB1(s14) (NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 46); L-IB1(s15) (NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 47); L-IB1(s16) (NH2-NLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 48); L-IB1(s17) (NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 49); L-IB1(s18) (NH2-TLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 50); L-IB1(s19) (NH2-TTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 51); L-IB1(s20) (NH2-PTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 52); L-IB1(s21) (NH2-RPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 53); L-IB1(s22) (NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 54); L-IB1(s23) (NH2-PKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 55); L-IB1(s24) (NH2-RPKRPTTLNLF-COOH, SEQ ID NO: 56); L-IB1(s25) (NH2-LFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 57); L-IB1(s26) (NH2-NLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 58); L-IB1(s27) (NH2-LNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 59); L-IB1(s28) (NH2-TLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 60); L-IB1(s29) (NH2-TTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 61); L-IB1(s30) (NH2-PTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 62); L-IB1(s31) (NH2-RPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 63); L-IB1(s32) (NH2-KRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 64); L-IB1(s33) (NH2-PKRPTTLNLF-COOH, SEQ ID NO: 65); 및 L-IB1(s34) (NH2-RPKRPTTLNL-COOH, SEQ ID NO: 66)의 JNK 결합 도메인을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열은 IB1 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (IB1-long) [SEQ ID NO: 13]의 (long) JNK 결합 도메인 (JBDs) , IB2 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS (IB2-long) [SEQ ID NO: 14]의 (long) JNK 결합 도메인, c-Jun GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH (c-Jun) [SEQ ID NO: 15]의 JNK 결합 도메인, ATF2 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV (ATF2) [SEQ ID NO: 16]의 JNK 결합 도메인 (예를 들어 Figure 1A-1C 참조)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 정렬은 부분적으로 보존된 8개 아미노산 서열 (예를 들어 도 1A 참조)을 나타내며, IB1 및 IB2의 JBDs의 추가적인 비교는 두 서열 사이에 매우 보존된 일곱개 및 세개 아미노산의 두 블록을 나타낸다.
다른 바람직한 실시예에 따르면 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열은 상기 정의된 D-아미노산으로 일부 또는 독점적으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, D-아미노산으로 이루어진 이들 JNK 억제자 서열은 상기 (천연) JNK 억제자 서열의 비-천연 D-레트로 인버스(retro-inverso) 서열이다. 용어 "레트로-인버소 서열"은 서열의 방향이 역전되고 각 아미노산 잔기의 키랄성(chirality)이 반대인 선형 펩타이드 서열의 이성질체(isomer)를 말한다(예를 들어 Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994) 참조). D-거울상 이성질체(enantiomers) 및 역합성의 조합의 장점은, 각 알파 탄소에 곁사슬 그룹의 위치는 보존된 반면, 각 아미드 결합 내 카보닐 및 아미노기의 위치가 교환된 점이다. 다른 구체적인 언급이 없으면, 본 발명에 따라 사용된 어느 주어진 L-아미노산 서열 또는 펩타이드가 상응하는 천연 L-아미노산 서열 또는 펩타이드에 대한 서열 또는 펩타이드의 반전(reverse)을 합성함으로써 D 레트로-인버소 서열 또는 펩타이드로 변환될 수 있는 것으로 간주된다.
본 발명에 사용되고 상기 정의된 D 레트로-인버소 서열은 다양한 유용한 특징들을 가진다. 예를 들어, 본 발명에 사용된 D 레트로-인버소 서열은 본 발명에 사용된 L-아미노산 서열만큼 세포로 효과적으로 들어가는 반면, 본 발명에 사용된 D 레트로-인버소 서열은 상응하는 L-아미노산 서열에 비해 보다 안정하다.
따라서, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 아미노산 서열 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH (D-IB1 generic (s)) [SEQ ID NO: 4] 및/또는 XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX (D-IB (generic)) [SEQ ID NO: 20]에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용된 것처럼, X, Xn a 및 Xn b는 상기 정의된 것(바람직하게, D 아미노산을 나타냄)과 같으며, 상기 Xn b는 바람직하게 SEQ ID NO: 2 또는 4로부터 유도된 잔기의 인접한 스트레치를 나타낸다. 추가적으로, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 IB1 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (D-IB1) [SEQ ID NO: 18]의 JNK 결합 도메인(JBDs)를 포함하는 아미노산 서열에 따라 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 아미노산 서열 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID NO: 2]에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 게다가, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열은 IB1 D-IB1(s1) (NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 67); D-IB1(s2) (NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 68); D-IB1(s3) (NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 69); D-IB1(s4) (NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 70); D-IB1(s5) (NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 71); D-IB1(s6) (NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 72); D-IB1(s7) (NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 73); D-IB1(s8) (NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 74); D-IB1(s9) (NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 75); D-IB1(s10) (NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 76); D-IB1(s11) (NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 77); D-IB1(s12) (NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 78); D-IB1(s13) (NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 79); D-IB1(s14) (NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 80); D-IB1(s15) (NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 81); D-IB1(s16) (NH2-FLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 82); D-IB1(s17) (NH2-PFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 83); D-IB1(s18) (NH2-QPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 84); D-IB1(s19) (NH2-VQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 85); D-IB1(s20) (NH2-PVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 86); D-IB1(s21) (NH2-RPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 87); D-IB1(s22) (NH2-SRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 88); D-IB1(s23) (NH2-QSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 89); D-IB1(s24) (NH2-DQSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID NO: 90); D-IB1(s25) (NH2-DQSRPVQPFL-COOH, SEQ ID NO: 91); D-IB1(s26) (NH2-QSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID NO: 92); D-IB1(s27) (NH2-SRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 93); D-IB1(s28) (NH2-RPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 94); D-IB1(s29) (NH2-PVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 95); D-IB1(s30) (NH2-VQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 96); D-IB1(s31) (NH2-QPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 97); D-IB1(s32) (NH2-PFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 98); D-IB1(s33) (NH2-FLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 99); 및 D-IB1(s34) (NH2-LNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 100)의 JNK 결합 도메인(JBDs)을 포함하는 아미노산 서열에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에서 사용되고 상기 개시된 JNK 억제자 서열은 표 1에 나타내었다 (SEQ ID NO:s 1-4, 13-20 및 33-100). 표는 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열의 명칭 뿐만 아니라, 그들의 서열 식별 번호, 그들의 길이, 및 아미노산 서열을 나타낸다. 게다가, 표 1은 서열 뿐만 아니라 그들의 일반식(generic formulas)을, 예를 들어 SEQ ID NO's: 1, 2, 5, 6, 9 및 11 및 SEQ ID NO's: 3, 4, 7, 8, 10 및 12 각각에 대하여, 보여준다. 표 1은 나아가 키메라 서열(chimeric sequences) SEQ ID NOs: 9-12 및 23-32 (하기 참조), L-IB1 서열 SEQ ID NOs: 33 내지 66 및 D-IB1 서열 SEQ ID NOs: 67 내지 100를 개시한다.
서열/ 펩타이드 명칭 SEQ ID NO AA 서열
L-IB1(s) 1 19 RPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-IB1(s) 2 19 DQSRPVQPFLNLTTPRKPR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)
L-IB (generic) (s) 3 19 NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH
D-IB (generic) (s) 4 19 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH
L-TAT 5 10 GRKKRRQRRR
(NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
D-TAT 6 10 RRRQRRKKRG
(NH2-RRRQRRKKRG-COOH)
L-generic-TAT (s) 7 11 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH
D-generic-TAT (s) 8 11 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
L-TAT-IB1(s) 9 31 GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB (generic) (s) 10 29 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH
D-TAT-IB1(s) 11 31 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB (generic) (s) 12 29 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
IB1-long 13 29 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
IB2-long 14 27 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS
(NH2- IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS -COOH)
c-Jun 15 29 GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH
(NH2- GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH -COOH)
ATF2 16 29 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV
(NH2- TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV -COOH)
L-IB1 17 23 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
D-IB1 18 23 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD
(NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD -COOH)
L-IB (generic) 19 19 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX
(NH2- XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX -COOH)
D-IB (generic) 20 19 XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX
(NH2- XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX -COOH)
L-generic-TAT 21 17 XXXXRKKRRQRRRXXXX
(NH2- XXXXRKKRRQRRRXXXX -COOH)
D-generic-TAT 22 17 XXXXRRRQRRKKRXXXX
(NH2- XXXXRRRQRRKKRXXXX -COOH)
L-TAT-IB1 23 35 GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
L-TAT-IB (generic) 24 42 XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX
(NH2- XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX -COOH)
D-TAT-IB1 25 35 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG
(NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG -COOH)
D-TAT-IB (generic) 26 42 XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX
(NH2- XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX -COOH)
L-TAT-IB1(s1) 27 30 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s2) 28 30 GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s3) 29 29 RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-TAT-IB1(s1) 30 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR-COOH)
D-TAT-IB1(s2) 31 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB1(s3) 32 29 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR-COOH)
L-IB1(s1) 33 13 TLNLFPQVPRSQD
(NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s2) 34 13 TTLNLFPQVPRSQ
(NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s3) 35 13 PTTLNLFPQVPRS
(NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s4) 36 13 RPTTLNLFPQVPR
(NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s5) 37 13 KRPTTLNLFPQVP
(NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s6) 38 13 PKRPTTLNLFPQV
(NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s7) 39 13 RPKRPTTLNLFPQ
(NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s8) 40 12 LNLFPQVPRSQD
(NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s9) 41 12 TLNLFPQVPRSQ
(NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s10) 42 12 TTLNLFPQVPRS
(NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s11) 43 12 PTTLNLFPQVPR
(NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s12) 44 12 RPTTLNLFPQVP
(NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s13) 45 12 KRPTTLNLFPQV
(NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s14) 46 12 PKRPTTLNLFPQ
(NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s15) 47 12 RPKRPTTLNLFP
(NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s16) 48 11 NLFPQVPRSQD
(NH2-NLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s17) 49 11 LNLFPQVPRSQ
(NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s18) 50 11 TLNLFPQVPRS
(NH2-TLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s19) 51 11 TTLNLFPQVPR
(NH2-TTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s20) 52 11 PTTLNLFPQVP
(NH2-PTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s21) 53 11 RPTTLNLFPQV
(NH2-RPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s22) 54 11 KRPTTLNLFPQ
(NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s23) 55 11 PKRPTTLNLFP
(NH2-PKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s24) 56 11 RPKRPTTLNLF
(NH2-RPKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s25) 57 10 LFPQVPRSQD
(NH2-LFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s26) 58 10 NLFPQVPRSQ
(NH2-NLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s27) 59 10 LNLFPQVPRS
(NH2-LNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s28) 60 10 TLNLFPQVPR
(NH2-TLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s29) 61 10 TTLNLFPQVP
(NH2-TTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s30) 62 10 PTTLNLFPQV
(NH2-PTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s31) 63 10 RPTTLNLFPQ
(NH2-RPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s32) 64 10 KRPTTLNLFP
(NH2-KRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s33) 65 10 PKRPTTLNLF
(NH2-PKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s34) 66 10 RPKRPTTLNL
(NH2-RPKRPTTLNL-COOH)
D-IB1(s1) 67 13 QPFLNLTTPRKPR
(NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s2) 68 13 VQPFLNLTTPRKP
(NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s3) 69 13 PVQPFLNLTTPRK
(NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s4) 70 13 RPVQPFLNLTTPR
(NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s5) 71 13 SRPVQPFLNLTTP
(NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s6) 72 13 QSRPVQPFLNLTT
(NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s7) 73 13 DQSRPVQPFLNLT
(NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s8) 74 12 PFLNLTTPRKPR
(NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s9) 75 12 QPFLNLTTPRKP
(NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s10) 76 12 VQPFLNLTTPRK
(NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s11) 77 12 PVQPFLNLTTPR
(NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s12) 78 12 RPVQPFLNLTTP
(NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s13) 79 12 SRPVQPFLNLTT
(NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s14) 80 12 QSRPVQPFLNLT
(NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s15) 81 12 DQSRPVQPFLNL
(NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s16) 82 11 FLNLTTPRKPR
(NH2-FLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s17) 83 11 PFLNLTTPRKP
(NH2-PFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s18) 84 11 QPFLNLTTPRK
(NH2-QPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s19) 85 11 VQPFLNLTTPR
(NH2-VQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s20) 86 11 PVQPFLNLTTP
(NH2-PVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s21) 87 11 RPVQPFLNLTT
(NH2-RPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s22) 88 11 SRPVQPFLNLT
(NH2-SRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s23) 89 11 QSRPVQPFLNL
(NH2-QSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s24) 90 11 DQSRPVQPFLN
(NH2-DQSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s25) 91 10 DQSRPVQPFL
(NH2-DQSRPVQPFL-COOH)
D-IB1(s26) 92 10 QSRPVQPFLN
(NH2-QSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s27) 93 10 SRPVQPFLNL
(NH2-SRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s28) 94 10 RPVQPFLNLT
(NH2-RPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s29) 95 10 PVQPFLNLTT
(NH2-PVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s30) 96 10 VQPFLNLTTP
(NH2-VQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s31) 97 10 QPFLNLTTPR
(NH2-QPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s32) 98 10 PFLNLTTPRK
(NH2-PFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s33) 99 10 FLNLTTPRKP
(NH2-FLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s34) 100 10 LNLTTPRKPR
(NH2-LNLTTPRKPR-COOH)
다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열은 상기 정의된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 천연 또는 비-천연 아미노산 서열의 적어도 하나의 변이체, 절편 및/또는 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게, 이들 변이체, 절편 및/또는 유도체는 상기 개시된 본 발명에서 사용된 천연 또는 비-천연 JNK 억제자 서열의, 특히 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 천연 또는 비-천연 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유하며, 즉 JNK를 결합 및/또는 적어도 하나의 JNK 활성화된 전사 인자, 예를 들어 c-Jun, ATF2 또는 Elk1의 활성화를 억제한다. 기능성은 다양한 실험에 의해, 예를 들어 이의 타겟 분자에 펩타이드의 결합 테스트 또는 생물물리학적 방법, 예를 들어 분광학, 컴퓨터 모델링, 구조 분석 등에 의해 실험될 수 있다. 특히, 상기 정의된 것처럼 JNK 억제자 서열 또는 이의 변이체, 절편 및/또는 유도체는 펩타이드의 소수성 및 친수성 영역을 식별하는데 활용될 수 있는 친수성 분석에 의해 분석될 수 있으며(예를 들어 Hopp and Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828 참조), 따라서 결합 실험과 같은 실험적 조작(experimental manipulation)을 위한, 또는 항체 합성을 위한 기질의 설계를 돕는다. 이차 구조 분석은 또한 특정한 구조적 모티프(motifs)를 추정하는 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열 또는 이의 변이체, 절편 및/또는 유도체의 영역을 식별하는데 수행될 수 있다 (예를 들어 Chou and Fasman, 1974, Biochem 13: 222-223 참조). 조작(Manipulation), 번역(translation), 이차 구조 예상, 친수성 및 소수성 특징, 오픈 리딩 프레임 예상 및 구성(plotting), 및 서열 상동성(homologies)의 결정은 기술 분야에서 활용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 구조 분석의 다른 방법은 예를 들어 X-레이 결정학(예를 들어 Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13 참조), 질량 분광법 및 기체 크로마토그래피(예를 들어 METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY 참조)를 포함하며 컴퓨터 모델링(예를 들어 Fletterick and Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조) 또한 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 적어도 하나의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 변이체"는 바람직하게 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열로부터 유도된 서열이며, 상기 변이체는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 아미노산 서열의 아미노산 변형(alterations)을 포함한다. 이러한 변형은 전형적으로 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 아미노산의 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 10개 및 더욱 바람직하게 1 내지 5개 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하며, 상기 변이체는 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%까지의 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열과 서열 동일성(sequence identity)을 보인다.
만약 상기 정의되고 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 변이체가 특정한 아미노산의 치환에 의해 수득된다면, 이러한 치환은 바람직하게 보존적(conservative) 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 충분히 유사한 물리화학적 특징을 갖는 그룹 내에 유사(synonymous) 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 그룹 구성원 사이의 치환은 분자의 생물학적 활성을 보존할 것이다 (예를 들어 Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864 참조). 특히 만약 삽입 및/또는 결실이 오직 일부 아미노산을 포함하고, 예를 들어 20개 미만, 및 바람직하게 10개 미만, 기능적 활성에 주요한 아미노산을 제거 또는 교체하지 않을 경우, 아미노산이 또한 그들의 기능이 변화됨이 없이 상기 정의된 서열 내 삽입 및/또는 결실될 수 있음은, 통상의 기술자에게 명확하다. 게다가, 치환은 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열 또는 인비보(in vivo) 또는 인비트로(in vitro) 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 비활성화를 회피하기 위해, 포스포릴라아제(phosphorylase), 바람직하게 키나아제에 접근할 수 있는, 아미노산 위치에 추가적인 트레오닌을 유도하는, 본 발명에 사용된 변이체 내에 회피된다.
바람직하게, 동일한 그룹으로 분류되고 전형적으로 보존적 아미노산 치환에 의해 교환가능한, 유사(synonymous) 아미노산 잔기는 표 2에 정의되었다.
Figure pct00001
본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 변이체의 특정한 형태는 SEQ ID NOs: 1, 1-4, 13-20 및 33-100"에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 절편이며, 이는 전형적으로 SEQ ID NOs 1-4, 13-20 및 33-100에 비하여 적어도 하나의 결실에 의해 변형된다. 바람직하게, 절편은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 어느 것의 적어도 4개 인접한 아미노산, 이들 어느 서열로부터 에피토프의 특이적 인식을 위해 전형적으로 충분한 길이를 포함한다. 더욱 더 바람직하게, 절편은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 어느 것의 4 내지 18개, 4 내지 15개, 또는 가장 바람직하게 4 내지 10개 인접한 아미노산을 포함하며, 상기 범위의 하한은 4, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다. 결실된 아미노산은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 어느 위치, 바람직하게 N- 또는 C-말단에 발생할 수 있다.
나아가, 상기 설명된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 절편은 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%까지의 본 발명에 사용된 것처럼 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열과 서열 동일성을 공유하는 서열로 정의될 수 있다.
본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 추가로 적어도 하나의 상기 정의된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 유도체를 포함하거나 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, "SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 유도체"는 바람직하게 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열로부터 유도된 아미노산 서열이며, 상기 유도체는 적어도 하나의 변형된 L- 또는 D-아미노산(비-천연 아미노산(들)을 형성), 바람직하게 1 내지 20개, 더욱 바람직하게 1 내지 10, 및 더욱 더 바람직하게 1 내지 5개 변형된 L- 또는 D-아미노산을 포함한다. 변이체 또는 절편의 유도체 또한 본 발명의 범위에 속한다.
이러한 관점에서 "변형된 아미노산"은 다양한 유기체 내 예를 들어 다른 글리코실화에 의해, 인산화에 의해 또는 특정한 아미노산 표지(labeling)에 의해 변형된 어느 아미노산일 수 있다. 이러한 표지는 그 다음 전형적으로 하기를 포함하는 표지의 그룹으로부터 선택된다:
(i) 방사성 표지, 즉 방사성 인산화 또는 황, 수소, 탄소, 질소 등으로 방사성 표지;
(ii) 색염료(colored dyes) (예를 들어 디곡시게닌(digoxygenin) 등);
(iii) 형광 그룹 (예를 들어 플루오레세인(fluorescein) 등);
(iv) 화학발광 그룹;
(v) 고체상에 고정화를 위한 그룹 (예를 들어 His-태그, 비오틴, 스트렙(strep)-태그, 플래그(flag)-태그, 항체, 항원 등); 및
(vi) (i) 내지 (v)에 언급된 라벨의 둘 또는 그 이상의 라벨의 조합.
상기 맥락에서, 적어도, 예를 들어, 본 발명의 쿼리(query) 아미노산 서열과 95%의 "서열 동일성을 공유하는" 서열을 갖는 아미노산 서열은, 개체(subject) 아미노산 서열의 서열이, 개체 아미노산 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각 100 아미노산 당 다섯개까지 아미노산 변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 쿼리 서열과 동일한 것을 의미한다. 다시 말해, 쿼리 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 수득하기 위해, 개체 서열 내 아미노산 잔기의 5% (100의 5)까지는 다른 아미노산으로 삽입 또는 치환되거나 결실될 수 있다.
정확한 일치를 제외한 서열에 대하여, 첫번째 서열의 "% 동일성"은 두번째 서열에 관하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 이들 비교되는 두 서열은 서열 사이의 최대 상관관계(correlation)를 주기 위해 정렬된다. 이는 정렬의 정도를 향상시키기 위해, 하나 또는 두 서열 내 "갭"을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. % 동일성은 그 이후 비교되는 서열의 각각 전체 길이에 대하여 결정될 수 있으며(소위 글로벌 정렬(global alignment)), 이는 동일하거나 유사한 길이, 또는 보다 짧은, 정의된 길이의 서열에 특히 적절하며(소위 로컬 정렬(local alignment)), 이는 비 동일한 길이의 서열에 보다 적절하다.
특히 본 발명에 사용된, 둘 또는 그 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 기술분야에 잘 알려져있다. 따라서 예를 들어, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.)에서 가능한 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP은 두 폴리뉴클레오티드 사이의 % 동일성 및 두 폴리펩타이드 서열 사이의 % 동일성 및 % 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. BESTFIT은 (Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.)의 "로컬 상동성" 알고리즘을 사용하며 두 서열 사이의 유사성의 최적의 단일 영역을 발견한다. 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 다른 프로그램, 예를 들어 프로그램의 BLAST 패밀리(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), 월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통해 접근 가능한) 및 FASTA(Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.)는 또한 기술분야에 알려져 있다.
본 발명에 따라 사용되고 상기 정의된 JNK 억제자 서열은 기술분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 하기 논의된 화학적 합성에 의해 또는 유전자 조직법에 의해 수득되거나 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 JNK 억제자 서열의 원하는 영역을 포함하는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열의 일부에 상응하는 펩타이드, 또는 인비트로 또는 인비보에서 원하는 활성을 중재하는 것은, 펩타이드 합성기의 사용에 의해 합성될 수 있다. 본 발명에 사용되고 상기 정의된 JNK 억제자 서열은 나아가 본 발명에 사용되고 상기 정의된 JNK 억제자 서열이 세포 내로 효과적으로 수송되도록 하기 위해, 트래피킹 서열(trafficking sequence)에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형된 JNK 억제자 서열은 바람직하게 키메라 서열로써 제공되고 사용된다.
두번째 양태에 따라 본 발명은 따라서 개체 내 상기 정의된 것처럼 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위해, 적어도 하나의 첫번째 도메인 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하는 키메라 펩타이드의 사용을 제공하며, 상기 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인은 트래피킹 서열을 포함하는 반면, 상기 키메라 펩타이드의 두번째 도메인은 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 바람직하게 SEQ ID NO: 1-4, 13-20 및 33-100 에 따르는 어느 서열 또는 이의 유도체 또는 절편을 포함한다.
전형적으로, 본 발명에 따라 사용된 키메라 펩타이드는 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 25 내지 250개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게 25 내지 200개 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게 25 내지 150개 아미노산 잔기, 25 내지 100개 및 가장 바람직하게 아미노산 25 내지 50개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인은 바람직하게 트래피킹 서열을 포함하는 것과 같이, 이는 원하는 세포 도착지에 펩타이드(이것이 존재하는)를 지시하는 어느 아미노산의 서열로부터 전형적으로 선택된다. 따라서, 본 발명에 사용된 트래피킹 서열은 전형적으로 원형질막을 가로지르는, 예를 들어 세포 밖으로부터, 원형질막을 통해, 및 세포질 내로, 펩타이드를 지시한다. 그렇지 않으면, 또는 추가로, 트래피킹 서열은 예를 들어 두 구성요소(예를 들어 세포 투과성을 위한 구성요소 및 핵 위치를 위한 구성요소)의 조합에 의해, 또는 예를 들어 세포막 수송 및 목적된 예를 들어 핵내 전송의 특징을 갖는 단일 구성요소에 의해, 세포 내 원하는 위치, 예를 들어 핵, 리보좀, 소포체(ER), 리소좀, 또는 퍼옥시좀에 펩타이드를 지시할 수 있다. 트래피킹 서열은 추가적으로 세포질 구성요소 또는 세포의 어느 다른 구성요소 또는 구획(예를 들어 소포체, 미토콘드리아, 글룸 기구(gloom apparatus), 리소좀 소포)에 결합할 수 있는, 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 첫번째 도메인의 트래피킹 서열 및 두번째 도메인의 JNK 억제자 서열은 세포질 또는 세포의 다른 구획 내에 국소화(localized)될 수 있다. 이는 흡수시 세포 내 키메라 펩타이드의 국소화(localization)를 결정하게 한다.
바람직하게, 트래피킹 서열(본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는)은 5 내지 150개 아미노산 서열의 길이, 더욱 바람직하게 5 내지 100개의 길이 및 가장 바람직하게 5 내지 50개, 5 내지 30개 또는 5 내지 15개 아미노산의 길이를 갖는다.
더욱 바람직하게, 트래피킹 서열(본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함됨)은 첫번째 도메인 내 연속적인 아미노산 서열 스트레치로서 발생할 수 있다. 그렇지 않으면, 첫번째 도메인 내 트래피킹 서열은, 트래피킹 서열이 상기 개시된 것처럼 이의 담체 특성을 이처럼 유지하는 경우에, 둘 또는 그 이상의 절편으로 분열될 수 있으며, 상기 이들 모든 절편은 전체 트래피킹 서열과 유사하며 1 내지 10개, 바람직하게 1 내지 5개 아미노산에 의해 각각으로부터 분리될 수 있다. 트래피킹 서열의 절편을 분리하는 이들 아미노산은, 예를 들어 트래피킹 서열과 다른 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다. 그렇지 않으면, 첫번째 도메인은 하나 이상의 구성요소, 예를 들어 특정한 세포 구획에 두번째 도메인의 카고 JNK 억제자 서열의 전송을 위해 이의 고유의 기능을 갖는 각 구성요소로 이루어진 트래피킹 서열을 포함할 수 있다.
상기 정의된 트래피킹 서열은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 바람직하게, 트래피킹 서열(본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된)은 적어도 1 또는 2개까지, 바람직하게 적어도 3, 4 또는 5개, 더욱 바람직하게 적어도 6, 7, 8 또는 9개 및 더욱 더 바람직하게 적어도 10개 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 단위, 비-블록단위로 또는 다른 방법으로 JNK 트래피킹 서열 내 정렬될 수 있다.
하나의 대안적인 실시예에 따라, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 트래피킹 서열은 독점적으로 L-아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 트래피킹 서열은 상기 정의된 적어도 하나의 "천연" 트래피킹 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 맥락에서, 용어 "천연"은 비-변형된 트래피킹 서열을 말하며, 전체적으로 L-아미노산으로 이루어진다.
다른 대안적인 실시예에 따라 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 트래피킹 서열은 독점적으로 D-아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 트래피킹 서열은 상기 개시된 서열의 D 레트로-인버소 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인의 트래피킹 서열은 자연 발생 원천(sources)로부터 수득될 수 있거나 유전자 조작 기술 또는 화학적 합성을 사용하여 생산될 수 있다 (예를 들어 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
첫번째 도메인의 트래피킹 서열에 대한 원천은 예를 들어 TAT 단백질과 같은 천연 단백질(예를 들어 U.S. 특허 번호 5,804,604 및 5,674,980에서 설명된 것, 이들 문헌 각각은 참조로 본 발명에 병합됨), VP22(예를 들어 WO 97/05265; Elliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)에 설명된 것), 비-바이러스 단백질(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10691-10695 (1992)), 안테나페디아(Antennapedia)로부터(예를 들어 안테나페디아 담체 서열) 또는 염기성 펩타이드로부터 유래된 트래피킹 서열, 예를 들어 5 내지 15 아미노산, 바람직하게 10 내지 12개 아미노산의 길이를 가지며, 적어도 80%, 더욱 바람직하게 85% 또는90% 까지, 예를 들어 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘과 같은 염기성 아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함하여 이용될 수 있다. 게다가, 트래피킹 서열로 사용된 천연 단백질의 하나의 변이체, 절편 및 유도체는 본 발명에 개시된다. 변이체, 절편 및 유도체에 관하여, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열에 대하여 상기 주어진 정의에 언급되어 있다. 변이체, 절편 뿐만 아니라 유도체는 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열에 대하여 상기 제시된 것과 같이 상응하여 정의된다. 특히, 트래피킹 서열의 맥락에서, 변이체 또는 절편 또는 유도체는 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%까지의 상기 정의된 트래피킹 서열로 사용된 천연 단백질의 하나와 서열 동일성을 공유하는 서열로 정의될 수 있다.
본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 바람직한 실시예에서, 첫번째 도메인의 트래피킹 서열은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1 TAT 단백질, 특히 TAT 단백질을 이루는 86개 아미노산의 일부 또는 전부로부터 유도된 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
트래피킹 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된)에 대하여, 전장 TAT 단백질의 부분 서열은 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 절편, 즉 세포 내로 입장 및 흡수를 조절하는 영역을 포함하는 TAT 펩타이드를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 서열이 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 절편인지는 알려진 기술을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어 Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86 : 7397-7401 (1989) 참조). 따라서, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인 내 트래피킹 서열은 86개 아미노산 미만을 포함하며, 세포 내로 흡수됨을 보이며, 선택적으로 세포 핵 내로 흡수되는, TAT 단백질 서열의 기능적으로 효과적인 절편 또는 일부로부터 유도될 수 있다. 더욱 바람직하게, 세포막을 가로지르는 키메라 펩타이드의 투과를 조절하기 위한 담체로 사용되는 TAT의 일부 서열(절편)은, 전장 TAT의 염기성 영역(아미노산 48 내지 57개 또는 49 내지 57개)을 포함하기 위한 것이다.
더욱 바람직한 실시예에 따라, 트래피킹 서열(본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인 내 포함됨)은 48-57개 또는 49 내지 57개 TAT 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 및 가장 바람직하게 제네릭 TAT 서열 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH (L-generic-TAT (s)) [SEQ ID NO: 7] 및/또는 XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L-generic-TAT) [SEQ ID NO: 21], 상기 X 또는 Xn b는 상기 정의된 것을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 게다가, SEQ ID NOs :8 내 "Xn b"　잔기의 수는 일 묘사예(one depicted)에 한정되지 않으며, 상기 정의된 것처럼 다양할 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된 트래피킹 서열은 예를 들어 아미노산 서열 NH2-GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT) [SEQ ID NO: 5]을 포함하는 펩타이드를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
다른 더욱 바람직한 실시예에 따르면 트래피킹 서열(본 발명에서 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함됨)은 상기 제시된 서열의 D 레트로-인버소 펩타이드, 즉 서열 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH (D-generic-TAT (s)) [SEQ　ID　NO　:　8] 및/또는 XXXXRRRQRRKKRXXXX (D-generic-TAT) [SEQ ID NO: 22]을 갖는 제네릭 TAT 서열의 D 레트로-인버소 서열을 포함할 수 있다. 또한 여기에, Xn b는 상기(바람직하게 D 아미노산을 나타냄) 정의된 바와 같다. 게다가, SEQ ID NOs :8 내 "Xn b"　잔기의 수는 일 묘사예(one depicted)에 제한되지 않으며, 상기 설명된 바와 같이 다양할 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명에 사용된 트래피킹 서열은 D 레트로-인버소 서열 NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ　ID　NO:　6]를 포함할 수 있다.
다른 실시예에 따르면 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인 내 포함된 트래피킹 서열은 상기 정의된 트래피킹 서열의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. "트래피킹 서열의 변이체"는 바람직하게 상기 정의된 트래피킹 서열로부터 유도된 서열이며, 상기 변이체는 변이, 예를 들어, 상기 정의된 트래피킹 서열 내 존재하는 적어도 하나의 아미노산의 추가, (내부)결실(절편을 유도하는) 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 변형(들)은 전형적으로 아미노산의 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 10개 및 더욱 바람직하게 1 내지 5개 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 게다가, 변이체는 바람직하게 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% 또는 99%까지의, 상기 정의된 트래피킹 서열, 더욱 바람직하게 SEQ ID NOs: 5 내지 8 또는 21-22의 어느 것과, 서열 동일성을 보인다.
바람직하게, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된 트래피킹 서열의 이러한 변형은 증가 또는 감소된 안정성을 갖는 트래피킹 서열을 유도한다. 그렇지 않으면, 트래피킹 서열의 변이체는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 세포내 국재화(localization)를 조절하기 위해 설계될 수 있다. 외적으로(exogenously) 추가될 때, 상기 정의된 이러한 변이체는 전형적으로, 세포로 들어가는 트래피킹 서열의 안정성이 유지되도록 설계된다 (즉 세포 내로 트래피킹 서열의 변이체의 흡수가 천연 단백질 사용된 트래피킹 서열과 상당히 유사함). 예를 들어, 핵 국재화에 중요한 것으로 생각되는 기초(basic) 영역의 변형(예를 들어 Dang and Lee, J. Biol. Chem. 264 : 18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63 : 1181-1187 (1989) ; et al., J. Virol. 63 : 1-8 (1989) 참조)은 트래피킹 서열의, 및 따라서, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 구성요소로서 JNK 억제자 서열의, 세포질 위치(location) 또는 부분적인 세포질 위치(location)를 초래할 수 있다. 상기에 추가하여, 추가적인 변형은 증가된 막 용해성을 갖는 트래피킹 서열을 생산하기 위해, 예를 들어 트래피킹 서열에 예를 들어 콜레스테롤 또는 다른 지질 부분(moieties)을 연결(linking)함에 의해 변이체에 도입될 수 있다. 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인 내 포함된 트래피킹 서열의 상기 개시된 변이체의 어느 것은 통상의 기술자에게 전형적으로 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
두번째 도메인으로서 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 전형적으로 이들 JNK 억제자 서열의 변이체, 절편 및/또는 유도체를 포함하는, 상기 정의된 어느 JNK 억제자 서열로부터 선택된, JNK 억제자 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 양 도메인, 즉 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 기능적 단위를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 기술분야에 일반적으로 알려진 첫번째 및 두번째 도메인(들)을 연결하는 어느 방법은 적용될 수 있다.
일 실시예에 따라, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 바람직하게 공유 결합에 의해 연결된다. 본 발명에 정의된 공유 결합은, 융합 단백질로써 상기 정의된 키메라 펩타이드를 발현함으로써 수득될 수 있는, 예를 들어 펩티드 결합일 수 있다. 본 발명의 정의된, 융합 단백질은 하기 설명된, 일반적인 재조합 DNA 기술과 유사하거나 이로부터 쉽게 적응가능한 방법으로 형성 및 사용될 수 있다. 그러나, 두 도메인은 또한 곁사슬을 통해 연결될 수 있거나 화학적 연결자 일부에 의해 연결될 수 있다.
본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및/또는 두번째 도메인은 상기 키메라 펩타이드의 하나 또는 그 이상의 카피(copy)에 발생할 수 있다. 만약 양쪽 도메인이 단일한 카피에 존재한다면, 첫번째 도메인은 두번째 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 만약 복수의 카피들 내 존재한다면, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 어느 가능한 순서로 정렬될 수 있다. 예를 들어 첫번째 도메인은 바람직하게 연속적인 순서로 정렬된, 복수의 카피 수, 예를 들어 둘, 셋 또는 그 이상의 카피 수로, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드에 존재할 수 있다. 이후, 두번째 도메인은 첫번째 도메인을 포함하는 서열의 N- 또는 C- 말단에 발생하는 단일 카피에 존재할 수 있다. 그렇지 않으면, 두번째 도메인은 복수의 카피 수, 예를 들어 둘, 셋 또는 그 이상의 카피로 존재할 수 있으며, 첫번째 도메인은 단일 카피에 존재할 수 있다. 양쪽 대안(alternatives)에 따라, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 연속적인 정렬로 어느 장소에도 있을 수 있다. 예시적인 정렬은 하기에서 나타난다: 예를 들어 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번? 도메인 - 두번째 도메인; 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 두번째 도메인 - 첫번째 도메인; 첫번째 도메인 - 두번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인; 또는 예를 들어 두번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인. 이들 예시들은 오직 설명의 목적을 위한 것이며, 이에 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로, 통상의 기술자에게 잘 이해될 것이다. 따라서, 카피 및 정렬의 수는 처음에 정의된 것과 같이 다양할 수 있다.
바람직하게, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 어느 연결자 없이 서로 직접적으로 연결된다. 그렇지 않으면, 그들은 1 내지 10개, 바람직하게 1 내지 5개 아미노산을 포함하는 연결자 서열을 통해 서로 연결될 수 있다. 링커 서열을 형성하는 아미노산은 바람직하게 아미노산 잔기로 글리신 또는 프롤린으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 첫번째 및 두번째 도메인(들) 사이의 둘, 셋 또는 그 이상의 프롤린 잔기에 의해 서로 분리될 수 있다.
적어도 하나의 첫번째 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하는 본 발명에 사용된 상기 정의된 키메라 펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 그 안에, 각 도메인(사용된 연결자 뿐만 아니라)은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합(예를 들어 D-TAT 및 L-IB1(s) 또는 L-TAT 및 D-IB1(s) 등)으로 구성될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 적어도 1 또는 2개까지, 바람직하게 적어도 3, 4 또는 5개, 더욱 바람직하게 적어도 6, 7, 8 또는 9개, 및 더욱 더 바람직하게 적어도 10개 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록단위, 비-블록단위 또는 다른 방식으로 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드에 정렬될 수 있다.
특정한 실시예에 따라 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 제네릭 L-TAT-IB 펩타이드 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH (L-TAT-IB (generic) (s)) [SEQ ID NO: 10]에 따르는 L-아미노산 키메라 펩타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 상기 X, Xn a 및 Xn b는 바람직하게 상기 정의된 바와 같다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-TAT-IB1 (s)) [SEQ ID NO: 9]를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 그렇지 않으면 또는 추가적으로, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 서열 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT (L-TAT-IB1) [SEQ ID NO: 23], 또는 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX (L-TAT-IB generic) [SEQ ID NO: 24]을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 상기 X는 바람직하게 또한 상기 정의된 바와 같거나, 또는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 서열 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s1)) [SEQ ID NO: 27], GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID NO: 28], 또는 RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID NO: 29]를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 각 X는 전형적으로 상기 정의된 아미노산 잔기를 나타내며, 더욱 바람직하게 Xn c는 펩타이드 잔기의 인접한 스트레치를 나타내며, 각 X는 독립적으로 글리신 또는 프롤린으로부터 각각 선택되며, 예를 들어 모노토닉(monotonic) 글리신 스트레치 또는 모노토닉 프롤린 스트레치, 상기 n(Xn c의 반복 수)은 전형적으로 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 또는 그 이상, 바람직하게 0-5 또는 5-10이다. Xn c는 D 또는 L 아미노산을 나타낼 수 있다.
대안적인 특정한 실시예에 따르면, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 상기 개시된 L-아미노산 키메라 펩타이드의 D-아미노산 키메라 펩타이드를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 본 발명에 따르는 예시적인 D 레트로-인버소 키메라 펩타이드는 예를 들어 제네릭 D-TAT-IB 펩타이드 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH (D-TAT-IB (generic) (s)) [SEQ ID NO: 12]이다. 본 발명에서, X, Xn a 및 Xn b은 바람직하게 상기 정의된 것(바람직하게 D 아미노산을 나타냄)과 같다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 TAT-IB1 펩타이드 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (D-TAT-IB1(s)) [SEQ ID NO: 11]에 따르는 D-아미노산 키메라 펩타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 그렇지 않으면 또는 추가적으로, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 D-아미노산 키메라 펩타에드 서열 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1) [SEQ ID NO: 25], 또는 XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX (D-TAT-IB generic) [SEQ ID NO: 26]를 포함하거나 또는 이로 구성되며, 상기 X는 바람직하게 또한 상기 정의된 것과 같으며, 또는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 D-아미노산 키메라 펩타이드 서열 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s1)) [SEQ ID NO: 30], DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID NO: 31], 또는 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID NO: 32]를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. Xn c는 상기 정의된 것과 같을 수 있다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 기술분야에 알려진 어느 적절한 방법으로 수행되는 화학적 또는 생화학적 커플링을 통해, 예를 들어 첫번째 및 두번째 도메인(들) 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써, 예를 들어 융합 단백질로써 첫번째 및 두번째 도메인(들)을 발현시킴으로써, 또는 예를 들어 상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)을 가교결합시킴으로써, 서로 연결될 수 있다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 화학적 가교결합에 적절한 많은 알려진 방법은 비특이적이며, 즉 그들은 수송 폴리펩타이드 또는 화물 거대분자(cargo macromolecule)에 어느 특정한 자리에 결합하는 지점을 지정하지 않는다. 결과적으로, 비 특이적 가교결합제의 사용은 생물학적으로 비활성인 복합(conjugated) 단백질을 만드는, 기능적 자리 또는 입체적 블록 활성 자리(sterically block active site)를 공격할 수 있다. 따라서, 바람직하게, 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 보다 특이적인 커플링을 허용하는, 이러한 가교결합 방법이 사용된다.
이러한 맥락에서, 커플링 특이성을 높이는 하나의 방법은 가교결합되는 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 하나 또는 양쪽에 오직 일회 또는 수회 존재하는 기능성 그룹에 직접 화학적 커플링이다. 예를 들어, 티올 기를 포함하는 유일한 단백질 아미노산인 시스테인은 오직 수회 많은 단백질에 발생한다. 또한, 예를 들어, 만약 폴리펩타이드가 리신 잔기를 포함하지 않으면, 일차 아민에 특이적인 가교결합제는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 대해 선택적일 수 있다. 커플링 특이성을 높이는 이러한 접근의 성공적인 활용은 폴리펩타이드가, 분자의 생물학적 활성의 손실 없이 변형될 수 있는, 분자의 구역 내 적절하게 드문 및 반응성 잔기를 갖는 것을 필요로 한다. 시스테인 잔기는 그들이 폴리펩타이드 서열의 일부에 발생될 때, 가교결합 반응에 그들의 참여가 그렇지 않으면 생물학적 활성을 방해하는 곳에서 대체될 수 있다. 시스테인 잔기가 교체될 때, 이는 전형적으로 폴리펩타이드 폴딩에 초래되는 변화를 최소화하는데 바람직하다. 폴리펩타이드 폴딩에 변화는 교체가 화학적 및 입체적으로 시스테인과 유사할 때 최소화된다. 이러한 이유로, 세린은 시스테인에 대한 교체(replacement)로 바람직하다. 하기 실시예에 설명된 것처럼, 시스테인 잔기는 가교결합 목적을 위해 폴리펩타이드 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다. 시스테인 잔기가 도입될 때, 아미노 또는 카르복시 말단에 또는 근처에 도입이 바람직하다. 통상적인 방법은 이러한 아미노산 서열 변형을 위해 활용 가능하며, 상기 잔여 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 또는 재조합 DNA의 발현을 통해 생산될 수 있다.
상기 정의되고 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 커플링은 또한 커플링 또는 복합제(conjugating agent)를 통해 수행될 수 있다. 활용될 수 있는 몇몇 분자내 가교결합제가 있다 (예를 들어, Means and Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43 참조). 이들 제제 가운데, 예를 들어 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드(이들 모두는 설프하이드릴기에 대하여 매우 특이적이며 비가역적인 결합을 형성함); N, N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아미드) 또는 6 내지 11개 탄소 메틸렌 브릿지를 갖는 다른 이러한 시약 (설프하이드릴기에 상대적으로 특이적임); 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(아미노 및 티로신기와 비가역적 결합을 형성)이다. 이러한 목적에 유용한 다른 가교결합제는 하기를 포함한다: p,p'-디플루오로-m, m'-디니트로디페닐설폰(아미노 및 페놀기와 비가역적 가교결합을 형성함); 페놀-1,4 디설포닐클로라이드(아미노기와 주로 반응); 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트, 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(아미노기와 주로 반응); 글루타알데하이드(몇몇 다른 곁사슬과 반응) 및 디스디아조벤지딘(티로신 및 히스티딘과 주로 반응).
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교결합을 위한 가교결합제는 동종이작용성(homobifunctional), 즉 동일한 반응을 수행하는 두 작용기를 가질 수 있다. 바람직한 동종이작용성 가교결합제는 비스말레이미도헥산("BMH")이다. BMH는, 온화한 조건 (pH 6.5-7.7) 하에 설프하이드릴 함유 화합물과 특이적으로 반응하는, 두 말레이미드 기능기를 포함한다. 두 말레이미드기는 탄화수소 사슬에 의해 연결된다. 따라서, BMH는 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드의 비가역적 가교결합에 유용하다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)을 가교결합하기 위해 사용된 가교결합제는 또한 이종이작용성(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이작용성 가교결합제는 각각 자유 아민 및 티올을 갖는 두 단백질을 가교결합하는, 두가지 다른 기능기, 예를 들어 아민-반응기 및 티올 반응기를 가진다. 이종이작용성 가교결합제의 예시는 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르보헥실레이트("SMCC"), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스터("MBS"), 및 숙시니미드 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트("SMPB"), MBS의 확장된 체인 유사체(analog)이다. 이들 가교연결자의 숙시니미딜기는 일차 아민과 반응하며, 티올 반응성 말레이미드는 시스테인 잔기의 티올과 공유 결합을 형성한다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교결합에 적절한 가교결합제는 보통 낮은 수용해성을 갖는다. 설포네이트 기와 같은, 친수성 일부는 따라서 이의 수용해성을 증가시키기 위해 가교결합제에 추가될 수 있다. 이러한 관점에서, 설포-MBS 및 설포-SMCC는 본 발명에 따라 사용될 수 있는, 수용해성을 위해 수정된 가교결합제의 예시이다.
마찬가지로, 많은 가교결합제는 세포 환경 하에 필수적으로 쪼개지지 않는(non-cleavable) 컨쥬게이트(conjugate)를 생산한다. 그러나, 상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)을 가교결합하기 위해 특히 적절한 일부 가교결합제는 세포 조건 하에 쪼개질 수 있는, 이황화물과 같은 공유 결합을 포함한다. 예를 들어, 트라우트 시약(Traut's reagent), 디티오비스(dithiobis)(숙신이미딜프로피오네이트(succinimidylpropionate)) ("DSP"), 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트("SPDP")는 잘 알려진 쪼개지는 가교연결자이다. 쪼개지는 가교결합제의 사용은 타겟 세포 내로 전달 이후 전송 폴리펩타이드로부터 분리하기 위한 화물 일부를 허용한다. 직접 이황화물 결합은 또한 유용할 수 있다.
상기 언급된 것들을 포함하는 수많은 가교결합제는 시판중이다. 그들의 사용을 위한 구체적인 지침은 상업적 공급자로부터 용이하게 이용 가능하다. 단백질 가교결합 및 컨쥬게이트 제조에 대한 일반적인 참조는 하기임: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 화학적 가교결합은 스페이서 암(spacer arms)의 사용을 포함할 수 있다. 스페이서 암은 세포 내 유연성을 제공하거나 컨쥬게이트된 일부들 사이에 분자 내 거리를 조절하며, 그에 따라 생물학적 활성을 보존하는 것을 도울 수 있다. 스페이서 암은 스페이서 아미노산, 예를 들어 프롤린을 포함하는 폴리펩타이드 일부의 형태일 수 있다. 그렇지 않으면, 스페이서 암은 "긴-사슬 SPDP" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H) 내와 같이, 가교결합제의 일부일 수 있다.
게다가, 상기 개시된 키메라 펩타이드의 하나의 변이체, 절편 또는 유도체는 본 발명에서 사용될 수 있다. 절편 및 변이체에 관하여, 이는 일반적으로 JNK 억제자 서열에 대하여 상기 주어진 정의를 의미한다.
특히, 본 발명의 맥락에서, "키메라 펩타이드의 변이체"는 바람직하게 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 어느 서열로부터 유도된 서열이며, 상기 키메라 변이체는 본 발명에 사용된 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 키메라 펩타이드의 아미노산 변이를 포함한다. 이러한 변이는 전형적으로 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 아미노산의 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 10개 및 더욱 바람직하게 1 내지 5개 치환, 삽입 및/또는 결실(절편을 유도)을 포함하며, 상기 본 발명에 사용된 변형된 키메라 펩타이드는 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 또는 95%, 98% 또는 99%까지의 SEQ ID Nos: 9-12 및 23 내지 32에 따르는 어느 서열과 서열 동일성을 보인다. 바람직하게, 이들 변이체는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드 내 포함된 첫번째 및 두번째 도메인의 생물학적 활성, 즉 상기 정의된 첫번째 도메인의 트래피킹 활성 및 JNK에 결합 및/또는 적어도 하나의 JNK 활성화된 전사 인자의 활성화를 억제하기 위한 두번째 도메인의 활성을 보유한다.
따라서, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 또한 앞서 개시된 키메라 펩타이드, 특히 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 키메라 펩타이드 서열의 절편을 포함한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "키메라 펩타이드의 절편"은 바람직하게 SEQ ID Nos: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 어느 서열 유도된 서열이며, 상기 절편은 SEQ ID Nos: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것의 적어도 4개 인접한 아미노산을 포함한다. 이러한 절편은 바람직하게 이들 어느 서열로부터 에피토프의 특정한 인식을 허용하고 세포, 핵 또는 보다 바람직한 장소로 서열을 수송하기에 충분한 길이를 포함한다. 더욱 더 바람직하게, 상기 절편은 SEQ ID Nos: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것의 4 내지 18개, 4 내지 15개, 또는 가장 바람직하게 4 내지 10개 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명에 추가로 사용된 키메라 펩타이드의 절편은 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 또는 95%, 98%, 또는 99%까지의 SEQ ID Nos: 99 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것에 따르는 어느 서열과 서열 동일성을 공유하는 서열로 정의될 수 있다.
최종적으로, 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 또한 앞서 개시된 키메라 펩타이드, 특히 SEQ ID Nos: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것에 따르는 키메라 펩타이드 서열의 유도체를 포함한다.
본 발명은 추가적으로, 개체 내 상기 정의된 JNK 시그널링에 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위하여, 상기 정의된 JNK 억제자 서열을 코딩하는 핵산 서열, 키메라 펩타이드 또는 그들의 절편, 변이체 또는 유도체, 상기 정의된 모든 것의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열을 코딩하는 바람직한 적절한 핵산은 전형적으로 인간 IB1 핵산 (GenBank Accession No. (AF074091), 랫 IB1 핵산 (GenBank Accession No. AF 108959), 또는 인간 IB2(GenBank Accession No AF218778)로부터 선택되거나, 상기 정의된 어느 서열을 코딩하는 어느 핵산 서열, 즉 SEQ ID NO: 1-26에 따르는 어느 서열로부터 선택된다.
본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열을 코딩하는 핵산 또는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드는 기술분야에 알려진 어느 방법을 통해 (예를 들어 서열의 3'- 및 5'- 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 및/또는 주어진 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 사용하여 cDNA 또는 유전체 라이브러리로부터 클로닝을 통해) 수득될 수 있다.
추가적으로, 핵산 서열은 또한, 상기 정의된 (천연) JNK 억제자 서열 또는 키메라 펩타이드를 코딩하는 적절한 가닥(strand)과 엄격한 조건 하에 혼성화 할 수 있는 것으로, 본 발명에 개시되었다. 바람직하게, 이러한 핵산 서열은 특정한 혼성화를 위해 충분한 길이를 갖는, 적어도 6개(인접한) 핵산을 포함한다. 더욱 바람직하게, 이러한 핵산 서열은 6 내지 38개, 더욱 더 바람직하게 6 내지 30개, 및 가장 바람직하게 6 내지 20개 또는 6 내지 10개 (인접한) 핵산을 포함한다.
"엄격한 조건"은 의존적인 서열이며 다른 환경 하에 달라질 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열을 위하여 열적인 녹는점(TM)에 비해 약 5°C 낮도록 선택될 수 있다. TM은 완전하게 매치된 프로브에 혼성화하는 타겟 서열의 50%에 (정해진 이온 강도 및 pH 하에) 온도이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7에서 적어도 약 0.02 몰(molar)이며 온도가 적어도 약 60°C일 것이다. 다른 요소들이 혼성화(다른 것들 가운데, 염기 조성 및 상보적 가닥의 크기를 포함)의 엄격성에 영향을 미치는 것과 같이, 유기 용매의 존재 및 염기 미스매칭(mismatching)의 규모, 파라미터의 조합은 다른 어느 것의 절대적인 측정에 비해 보다 중요하다.
"높은 엄격성 조건"은 하기 단계를 포함할 수 있다, 예를 들어 단계 1: DNA를 포함하는 필터를 6*SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 및 변성된 연어 정자 DNA의 500 μg/ml로 이루어진 버퍼 내 65°C에서 밤새 8시간 동안 전처리함. 단계 2: 필터를 48시간 동안 65°C에서 혼성화함. 상기 전혼성화 혼합물에 100 mg/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 32P-표지된 프로브의 5-20*106 cpm 첨가됨. 단계 3: 필터를 2*SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll, 및 0.01% BSA를 포함하는 용액 내 37°C에서 1시간 동안 세척함. 이에 45분 동안 50°C에서 0.1*SSC 내 세척이 뒤따름. 단계 4: 필터를 방사능 촬영함(autoradiographed). 사용될 수 있는 높은 엄격성의 다른 조건은 기술분야에 잘 알려진 것이다(예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조).
"보통 엄격성 조건"은 하기 단계를 포함할 수 있음: 단계 1: DNA를 포함하는 필터를 6*SSC, 5*덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 변성된 연어 정자 DNA 100 mg/ml를 포함하는 용액 내 6시간 동안 55°C에서 전처리시킴. 단계 2: 필터를 32P-표지된 프로브가 첨가된 5-20*106 cpm를 갖는 동일한 용액 내 55°C에서 18-20시간 동안 혼성화시킴. 단계 3: 필터를 2*SSC, 0.1% SDS 포함하는 용액 내 1시간 동안 37°C에서 세척한 후, 1*SSC 및 0.1% SDS 포함하는 용액 내 60°C에서 30분 동안 두번 세척함. 단계 4: 단계 4: 필터를 건조 도말하고 방사선 사진촬영에 노출시킴. 사용될 수 있는 보통 엄격성의 다른 조건은 기술분야에 잘 알려짐 (예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조).
마지막으로, "낮은 엄격성 조건"은 하기를 포함할 수 있음: 단계 1: DNA를 포함하는 필터를 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA, 및 500 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내 6시간 동안 40°C에서 전처리함. 단계 2: 필터를 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 μg/ml의 연어 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 및 5-20 x 106 cpm 32P-표지된 프로브가 첨가된 동일한 용액 내 18-20시간 동안 40°C에서 혼성화함. 단계 3: 필터를 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS 포함하는 용액 내 1.5 시간 동안 55 C에서 세척함. 상기 세척 용액은 새로운 용액으로 교체하고 1.5 시간 동안 60°C에서 배양함.
단계 4: 필터를 건조 도말하고 방사선 사진촬영에 노출함. 필요한 경우, 필터를 65-68°C에서 3회 세척하고 필름에 재노출시킴. 사용될 수 있는 낮은 엄격성의 다른 조건은 기술분야에 잘 알려져 있음 (예를 들어 종간 혼성화를 위해 이용될 수 있는 것과 같음). 예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY 참조.
본 발명에 따라 상기 정의된 핵산 서열은 펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있으며, 즉 분석, 특성화 또는 치료적 용도를 위하여, 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열 또는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드; 조직을 위한 마커로써 상응하는 펩타이드(본 발명에 사용된)는 우선적으로 발현된다(본질적으로 또는 조직 분화 또는 발달 또는 질병 상태 내의 특정한 단계에서). 이들 핵산을 위한 다른 용도는 예를 들어 핵산의 겔 전기영동 기초의 분석 내 분자량 마커를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시예에 따르면, 발현 벡터는 상기 정의된 하나 또는 그 이상의 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 재조합 발현을 위한 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 이중 가닥 또는 단일 가닥인, 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA를 지정하는 것으로 본 발명에 사용된다. 이는 추가적으로 숙주 세포로 또는 단세포 또는 다세포 숙주 유기체로 수송되기 위해 본 발명에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 본 발명에 사용된 발현 벡터는 바람직하게 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열 또는 이의 절편 또는 변이체, 또는 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드, 또는 이의 절편 또는 변이체를 코딩하는 상기 정의된 핵산을 포함한다. 추가적으로, 본 발명에 따르는 발현 벡터는 바람직하게 인슐레이터(insulators), 경계 요소(boundary elements), LCRs(예를 들어 Blackwood and Kadonaga (1998), Science 281, 61-63에 설명됨) 또는 매트릭스/스캐폴드(scaffold) 접착 영역(예를 들어 Li, Harju and Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408에 설명됨)과 같은, 숙주 세포 내 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유발하는, 바이러스, 박테리아, 식물, 포유동물, 및 다른 진핵 원천으로부터 인헨서/프로모터와 같은 다양한 조절 요소를 포함하는 발현을 지지하기 위한 적절한 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 조절 요소는 이종 기원성(heterologous)이다(즉 천연 유전자 프로모터가 아님). 그렇지 않으면, 필수적인 전사 및 번역 신호는 또한 유전자 및/또는 그들의 측면(flanking) 영역을 위한 천연 프로모터에 의해 공급될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터는 상기 정의된 하나 또는 그 이상의 핵산 서열의 전사를 조절하는 기능을 하며, DNA 의존적 RNA 중합효소를 위한 결합 부위 및 프로모터 기능을 조절하기 위해 상호작용하는 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 식별되는, DNA의 영역을 의미한다. 프로모터의 절편을 촉진하는 기능적 발현은 프로모터로서 활성을 보유하는 짧거나 끝이 절단된(truncated) 프로모터 서열이다. 프로모터 활성은 기술분야에 알려진 어느 분석 방법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어 Wood, de Wet, Dewji, and DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) 또는 Promega® 로부터 시판중인 것 참조).
본 발명에 정의된 발현 벡터 내 사용되는 "인헨서 영역"은, 전형적으로 하나 또는 그 이상의 유전자의 전사를 증가시키기는 기능을 하는 DNA의 영역을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 사용된 용어 "인헨서"는 이의 위치 및 발현되는 유전자의 vis-a-vis 방향과 관계 없는 유전자의 발현을 증진(enhances), 증가(augments), 향상(improves), 또는 개선(ameliorates)하는 DNA 조절 요소이다.
본 발명에 정의된 발현 벡터 내 사용된 프로모터/인헨서 서열은, 식물, 동물, 곤충, 또는 진균류(fungus) 조절 서열을 활용할 수 있다. 예를 들어, 프로모터/인헨서 요소는 효모 및 다른 곰팡이로부터 사용될 수 있다 (예를 들어 GAL4 프로모터, 알코올 디하이드로게나제 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터). 그렇지 않으면, 또는 추가로, 그들은 동물 전사 조절 영역, 예를 들어 (i) 췌장 베타 세포 내 인슐린 유전자 조절 영역 활성화 (예를 들어 Hanahan, et al., 1985. Nature 315: 115-122 참조); (ii) 림프구양세포(lymphoid cells) 내 면역글로불린 유전자 조절 영역 활성화 (예를 들어 Grosschedl, et al., 1984, Cell 38 : 647-658 참조); (iii) 간 내 알부민 유전자 조절 영역 활성화 (예를 들어 Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276 참조; (iv) 뇌 희소돌기아교세포(oligodendrocyte cells) 내 미엘린 기초 단백질 유전자 조절 영역 활성화 (예를 들어 Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703-712 참조); 및 (v) 시상하부(hypothalamus) 내 성선 자극 호르몬(gonadotropin) 방출 호르몬 유전자 조절 영역 활성화(예를 들어 Mason, et al., 1986, Science 234: 1372-1378 참조) 등을 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 정의된 발현 벡터는 증폭 마커를 포함할 수 있다. 이러한 증폭 마커는 예를 들어 아데노신 디아미나제(ADA), 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR), 다중 약물 저항성 유전자(MDR), 오르니틴 디카르복실라제(ODC) 및 N-(포스포나세틸)-L-아스파테이트 저항성(CAD)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 적절한 예시적인 발현 벡터 또는 그들의 유도체는 특히, 예를 들어 인간 또는 동물 바이러스(예를 들어 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스); 곤충 바이러스(예를 들어 배큘로바이러스(baculovirus)); 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들어 람다 파지); 플라스미드 벡터 및 코스미드 벡터를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 상기 정의된 핵산의 서열(들)을 코딩하는 펩타이드를 발현할 수 있는 호스트-벡터 시스템의 다양성을 활용할 수 있다. 이들은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: (i) 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등으로 감염된 포유동물 세포 시스템; (ii) 배큘로바이러스 등으로 감염된 곤충 세포 시스템; (iii) 효모 벡터를 포함하는 효모 또는 (iv) 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아. 호스트-벡터 시스템이 활용되는 것에 의존하여, 적절한 전사 및 번역 요소의 수의 어느 하나가 사용될 수 있다.
바람직하게, 이러한 호스트-벡터 시스템에 적절한, 호스트 세포 균주는 삽입된 관심 서열의 발현을 조절하거나, 바람직한 특정한 방법 내 서열에 의해 코딩된 발현된 펩타이드를 변형 또는 가공시켜 선택될 수 있다. 추가로, 특정한 프로모터로부터 발현은 선택된 숙주 균주 내 특정한 유도자(inducers)의 존재 하에 증진될 수 있어; 따라서 유전적으로 조작된 펩타이드의 발현의 조절을 촉진한다. 게다가, 다른 숙주 세포는 발현된 펩타이드의 번역 및 번역-후 가공 및 번형을 위한 특징 및 특이적 메커니즘(예를 들어 글리코실화, 인산화 등)을 보유한다. 적절한 세포 라인 또는 숙주 시스템은 따라서 원하는 변형을 보증하기 위해 선택될 수 있으며 외부 펩타이드의 가공이 수행된다. 예를 들어, 박테리아 시스템 내 펩타이드 발현은 비-글리코실화된 코어 펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 반면; 포유동물 세포 내 발현은 이종 기원(heterologous) 펩타이드의 "천연" 글리코실화를 보증한다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위하여 약학적 조성물을 제조하기 위한, 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드에 대한 항체의 용도를 제공한다. 게다가, 본 발명에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 이러한 억제자 서열을 포함하는 키메라 펩타이드에 특이적인 항체의 생산을 위한 효과적인 방법은 개시되고 이러한 목적을 위해 활용될 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드 뿐만 아니라, 이의 절편, 변이체 또는 유도체는 이들 펩타이드 구성 요소에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 면역원으로 활용될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 절편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함한다. 특정한 실시예에서 본 발명은 상기 정의된 키메라 펩타이드 또는 JNK 억제자 서열에 항체를 제공한다. 기술 분야에 알려진 다양한 절차는 이들 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
예로써, 다양한 숙주 동물은 상기 정의된 어느 키메라 펩타이드 또는 JNK 억제자 서열로 주사함으로써 다중 클론 항체의 생산을 위해 면역화(immunized)될 수 있다. 다양한 어쥬번트(adjuvants)는 그에 따라 면역학적 반응을 증가시키는데 사용될 수 있으며, 프로이드(Freund's) (완전 및 불완전) 어쥬번트, 광물 겔(예를 들어 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide)), 계면활성물질(surface active substances) (예를 들어 리소레시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 다가 음이온, 펩타이드, 오일 에멀전, 디니트로페놀 등), CpG, 폴리머, 플루로닉(Pluronics), 및 바실 칼메테 궤린(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리아(Corynebacterium parvum)와 같은 인간 어쥬번트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 정의된 키메라 펩타이드 또는 JNK 억제자 서열에 직접적으로 대한 단일클론 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포 라인 배양에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 어떠한 기술은 활용될 수 있다. 이러한 기술은 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, 1975. Nature 256: 495-497 참조); 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4: 72 참조) 및 인간 단일클론 항체를 생산하는 EBV 하이브리도마 기술 (Cole, et al., 1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 단일클론 항체는 본 발명의 실행에서 활용될 수 있으며 인간 하이브리도마의 사용(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030 참조) 또는 인비트로 엡스테인 바 바이러스로 인간 B-세포를 형질전환에 의해 생산될 수 있다(Cole, et al.,1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조).
본 발명에 따르면, 기술은 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드(예를 들어 U. S. 특허 번호 4,946,778 참조)에 특이적인 단일 사슬 항체의 생산을 위해 조정될 수 있다. 추가로, 방법은 이들 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드에 바람직한 특이성을 갖는 단일클론 Fab 절편의 빠르고 효과적인 식별을 위해 Fab 발현 라이브러리(예를 들어 Huse et al., 1989. Science 246: 1275-1281 참조)의 구성을 위하여 조정될 수 있다. 비-인간 항체는 기술 분야에 잘 알려진 기술을 통해 "인간화(humanized)"될 수 있다 (예를 들어 U. S. 특허 번호 5,225,539 참조). 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드에 유전자형(idiotypes)을 포함하는 항체 절편은 예를 들어 (i) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산된 F(ab')2 절편; (ii) F(ab')2 절편의 이황화 브릿지를 감소시킴에 의해 발생된 Fab 절편; (iii) 파파인(papain) 및 감소제(reducing agent)로 항체 분자의 치료를 통해 생산된 Fab 절편 및 (iv) Fv 절편을 포함하는 기술 분야 내 알려진 기술을 통해 생산될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항체의 스크리닝을 위해 활용될 수 있고 원하는 특이성을 갖는 방법은 효소연결면역흡착분석법(ELISA) 및 기술 분야에서 알려진 면역학적으로 중재된 다른 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시예에서, 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드(예를 들어 5 내지 20개, 바람직하게 8 내지 18개 및 가장 바람직하게 8 내지 11개 아미노산의 길이를 전형적으로 포함하는 이의 절편) 의 특정한 에피토프에 특이적인 항체의 선택은 이러한 에피토프를 보유하는 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 절편에 결합하는 하이브리도마의 생산에 의해 촉진된다. 상기 정의된 에피토프에 특이적인 이들 항체는 또한 본 발명에서 제공된다.
본 발명에서 정의된 항체는 JNK 억제자 서열(및/또는 상기 정의된 키메라 펩타이드에 상응하는)의 국재화(localization) 및/또는 정량을 나타내는 기술 분야에서 알려진 방법, 예를 들어 적절한 생리학적 샘플 내 펩타이드의 측정 수준 내 사용을 위해, 진단 방법에서 사용을 위해, 또는 펩타이드의 이미지화(imaging)에 사용을 위하는, 등에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 항체는 본 발명에 정의된 어느 질병의 예방 또는 치료, 특히 본 발명에 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 적용 될 수 있는, 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따라 사용된 이러한 약학적 조성물은 활성 구성요소, 예를 들어: (i) 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 어느 하나 또는 그 이상, 및/또는 이의 변이체, 절편 또는 유도체, 특히 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편; 및/또는 (ii) 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드를 코딩하는 핵산 및/또는 이의 변이체 또는 절편, 및/또는 (iii) JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드, 및/또는 상기 정의된 이의 변이체, 절편 또는 유도체의 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 세포 및/또는 (iv) 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드 및/또는 이의 변이체 또는 절편을 코딩하는 벡터 및/또는 핵산으로 감염된 세포를 포함한다.
바람직한 실시예에 따라, 본 발명에 따라 사용된 이러한 약학적 조성물은 전형적으로 상기 정의된 구성 요소, 바람직하게 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5-8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열, 또는 이를 코딩하는 적어도 하나의 핵산, 또는 적어도 하나의 벡터, 상기 정의된 숙주 세포 또는 항체의 안전하고 효과적인 양을 포함한다.
본 발명의 발명자들은 추가적으로, 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및 키메라 펩타이드 각각은 본 발명의 질병에 포함된 세포 내에 특히 우수한 흡수 속도를 보임을 발견하였다. 따라서, 개체에 투여되는 약학적 조성물 내, JNK 억제자 서열 및 키메라 펩타이드의 양은 각각 - 이에 제한되지 않는 - 매우 낮은 투여량을 가질 수 있다. 따라서, 투여량은 DTS-108과 같이 기술분야에 알려진 펩타이드 약물에 비해 훨씬 낮을 수 있다(Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). 이는 몇몇 긍정적인 측면, 예를 들어 잠재적 부작용의 감소 및 비용의 감소를 갖는다.
바람직하게, 투여량(체중 kg 당)은 10 mmol/kg까지, 바람직하게 1 mmol/kg까지, 더욱 바람직하게 100 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 10 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 1 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 100 nmol/kg까지, 가장 바람직하게 50 nmol/kg까지의 범위이다.
따라서, 투여량 범위는 바람직하게 약 1 pmol/kg 내지 약 1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,01 mmol/kg, 약 50 pmol/kg 내지 약 1 μmol/kg, 약 100 pmol/kg 내지 약 500 nmol/kg, 약 200 pmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 약 300 pmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 약 500 pmol/kg 내지 약 50 nmol/kg, 약 750 pmol/kg 내지 약 30 nmol/kg, 약 250 pmol/kg 내지 약 5 nmol/kg, 약 1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 또는 상기 값의 어느 둘의 조합이다.
이러한 맥락에서, 치료의 처방, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 사용할 때 투여량의 결정 등은 전형적으로 일반의 및 다른 의사의 책임이며, 치료되는 질환, 환자 개인의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요소들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 방법의 예시는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명에 다라 사용된 약학적 조성물의 구성요소를 위해 상기 정의된 "안전하고 효과적인 양"은 본 발명에 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 긍정적인 변화를 현저하게 유도하기 충분한, 이들 구성요소의 각각 또는 모두를 의미한다. 동시에, 그러나, "안전하고 효과적인 양"은 심각한 부작용을 회피하기에 충분히 작으며, 이는 장점 및 위험 사이에 합리적인(sensible) 관계를 허용하는 것을 말한다. 이들 한계의 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 존재한다. 이러한 구성요소의 "안전하고 효과적인 양"은 치료되는 특정한 조건 및 또한 치료되는 환자의 연령 및 신체적 조건, 상태의 심각성, 치료의 기간, 병용 요법, 사용되는 특정한 약학적으로 허용가능한 담체의 성질, 및 동반 의사(accompanying doctor)의 지식 및 경험 내에 유사한 요소와 관련되어 다양할 수 있다. 본 발명에 따르는 약학적 조성물은 인간을 위해 및 또한 수의학적 목적을 위하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 약학적 조성물은 나아가 이들 물질의 하나에 추가하여, (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 버퍼, 안정화제 또는 기술분야에 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, 표현 "(호환가능한) 약학적으로 허용가능한 담체"는 바람직하게 조성물의 액체 또는 비-액체 기초를 포함한다. 용어 "호환가능한"은 상기 정의된 약학적으로 활성 구성요소와 및 보통의 사용 조건 하에 조성물의 약학적 효과를 상당히 감소시키는 상호작용이 발생하지 않는 이러한 방식 내 하나의 다른 구성요소와 혼합될 수 있는 본 발명에 사용된 약학적 조성물의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 반드시 물론, 치료되는 사람에 투여하기 위해 적절하도록 그들을 만들기 위해, 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다.
만약 본 발명에 사용된 약학적 조성물이 액체 형태로 제공된다면, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 액체 담체를 포함할 것이다. 상기 조성물은 (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 액체 담체 예를 들어 무-피로겐 물; 등장성 식염수 또는 버퍼 (수성) 용액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 등 버퍼 용액, 예를 들어 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마(Theobroma)로부터 오일과 같은 식물성 오일; 예를 들어 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산 등을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에 사용된 약학적 조성물의 주사를 위해, 버퍼, 바람직하게 수성 버퍼가 사용될 수 있다.
만약 본 발명에 사용된 약학적 조성물이 고체 형태로 제공된다면, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체를 포함할 것이다. 상기 조성물은 (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 호환가능한 고체 또는 액체 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있거나, 사람에게 투여되기에 적절한 캡슐화 화합물도 사용될 수 있다. 이러한 (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체의 일부 예시는 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 설탕; 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 가루화된 트래거캔스; 몰트; 젤라틴; 수지; 예를 들어 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제; 칼슘 설페이트 등이다.
(호환가능한) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 수 있다. (호환가능한) 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 따라서 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물이 투여되는 방법에 의해 원칙적으로 결정될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은 예를 들어 전신에(systemically) 투여될 수 있다. 투여를 위한 경로는 예를 들어 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내, 또는 경피 경로 등과 같이 비경구 경로(예를 들어 주사를 통해), 구강 또는 직장 경로 등과 같이 장관 경로, 비강, 또는 비강 내 경로 등과 같이 국소 경로, 또는 상피 경로 또는 패치 전달과 같이 다른 경로를 포함한다.
사용되는 약학적 조성물의 적절한 양은 동물 모델을 사용한 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 모델은 토끼, 양, 쥐, 랫, 개 및 비-인간 영장류 모델을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 주사를 위해 바람직한 단위 투여 형태는 물, 생리학적 식염수 또는 이들의 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사를 위해 적절한 담체는 하이드로겔, 조절 또는 지연된 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 교원질 기질(collagen matrices)을 포함한다. 국소 적용을 위해 적절한 약학적으로 허용가능한 담체는 로션, 크림, 겔 등에 사용하기에 적절한 것들을 포함한다. 화합물이 경구적으로(perorally) 투여된다면, 정제, 캡슐 등은 바람직한 단위 투여 형태이다. 구강 투여를 위해 사용될 수 있는 단위 투여 형태의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 담체는 선행 기술에서 잘 알려져 있다. 이들의 선택은 본 발명의 목적에 중요하지 않으며, 기술분야에서 통상의 기술자에게 의해 어려움 없이 만들어질 수 있는 맛, 가격 및 저장성과 같은 이차 고려사항에 의존할 것이다.
구강 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 파우더 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴과 같은 상기 정의된 고체 담체 및 선택적으로 어쥬번트를 포함할 수 있다. 구강 투여를 위한 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유와 같이, 상기 정의된 액체 담체를 포함할 수 있다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥 내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통(affliction) 부위에 주사를 위해, 유효 성분은 무-피로겐 및 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는, 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 기술분야 내 그들 관련 기술은 예를 들어 소듐 클로라이드 주사(Sodium Chloride Injection), 링거 주사(Ringer's Injection), 락테이트 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성 비히클(vehicles)을 사용하여 적절한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 이것이 개인에게 주어지는 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 핵산 분자, 다른 약학적으로 유용한 화합물인지에 따라, 투여는 바람직하게, 이것이 개인에게 이점을 보이기에 충분한, "예방적으로(prophylactically) 유효량 또는 "치료적으로 유효량"(상기 경우일 수 있음)이다. 실제 투여되는 양 및 투여 속도 및 시간-코스는 치료되는 것의 성질 및 심각성에 따를 것이다.
본 발명에 정의된 질병의 예방 및/또는 치료는 전형적으로 상기 정의된 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 용어 "조절"은 상기 어느 질병에서 과발현 될 경우에 JNK의 발현의 억제를 포함한다. 이는 또한 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열을 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열, 또는 세포 내 천연 c-jun, ATF2 및 NFAT4 결합 부위의 경쟁적 억제자와 같은, 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편을 사용함으로써, 상기 어느 질병 내 c-jun, ATF2 또는 NFAT4의 인산화의 억제를 포함한다. 용어 "조절"은 또한 하기에 제한되지 않는, c-jun, ATF2, 또는 NFAT4 및, 예를 들어 c-jun, AFT2 및 c-fos로 이루어진 AP-1 복합체와 같이, 그들과 관련된 파트너(partners)로 이루어진 전사 인자의 이종 및 동종 기원 복합체의 억제를 포함한다. 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환이 JNK 과발현과 관련될 때, 이러한 억제성(suppressive) JNK 억제자 서열은 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 경우에, "조절"은 이후, 예를 들어 JNK에 IB-펩타이드의 결합을 막는 IB 펩타이드 특이적 항체의 사용을 통해, 따라서 IB-관련된 펩타이드에 의한 JNK 억제를 예방하는 JNK 발현의 증가를 포함할 수 있다.
상기 개시된 약학적 조성물로 개체의 예방 및/또는 치료는 전형적으로 개체에 상기 약학적 조성물의 ("치료적으로 유효한") 양의 (인비보) 투여에 의해 수반될 수 있으며, 상기 개체는 예를 들어 어느 포유동물, 예를 들어 인간, 영장류, 쥐, 랫, 개, 고양이, 소, 말 또는 돼지일 수 있다. 용어 "치료적으로 유효한"은 약학적 조성물의 유효 성분이 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 개신하기에 충분한 양인 것을 의미한다.
따라서, 상기 정의된 어느 펩타이드, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 것에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편은 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위해, 예를 들어 활성화된 JNK 시그널링 경로의 조절을 통해, 본 발명의 특정한 실시예에서 활용될 수 있다.
그러나, 상기 정의된 펩타이드는 또한 핵산에 의해 코딩될 수 있으며, 이후, 예를 들어 유전자 치료에 사용을 위해 본 발명의 약학적 조성물의 일부를 형성할 수 있다. 이러한 맥락에서, 유전자 치료는 예를 들어 상기 정의된 약학적 조성물의 방법에 의해, 개체에 상기 정의된 특정한 핵산의 투여에 의해 수행되는 치료를 의미하며, 상기 핵산(들)은 독점적으로 L-아미노산을 포함한다. 본 발명의 이러한 실시예에서, 핵산은 질병 또는 질환의 기능을 조절함으로써 치료적 효과의 행사를 그 다음 제공하는, 이의 코딩된 펩타이드(들)을 생산한다. 기술 분야에서 활용가능한 유전자 치료와 관련된 어느 방법은 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다 (예를 들어 Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12: 488-505 참조).
바람직한 실시예에서, 상기 정의되고 유전자 요법에 사용되는 핵산은 적절한 숙주 내 상기 정의된 IB-관련된 펩타이드, 즉, SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열을 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편의 어느 하나 또는 그 이상을 코딩하고 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 특정한 실시예에서, 이러한 발현 벡터는 JNK 억제자 서열의 코딩 영역(들)에 사용가능하게 연결된 프로모터를 보유한다. 상기 프로모터는 상기와 같이, 예를 들어 유도적(inducible) 또는 구성적(constitutive)이며, 선택적으로 조직 특이적으로 정의될 수 있다.
다른 특정한 실시예에서, 상기 정의된 핵산 분자는, 상기 정의된 핵산 분자(및 이의 어느 다른 원하는 서열)의 코딩 서열이 유전체 내 원하는 위치에 동종 재조합을 촉진하는 영역의 옆에 있는, 유전자 치료에 사용되며, 따라서 이들 핵산의 염색체 내 발현을 제공한다 (예를 들어 Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935 참조).
유전자 치료의 목적을 위하여 환자에게 본 발명에 따라 상기 정의된 핵산의 전달은, 특히 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 상기 언급된 질병 또는 질환의 맥락에서 직접적(즉 환자는 직접적으로 핵산 또는 핵산 포함 벡터에 노출됨) 또는 간접적(즉 세포는 인비트로에서 핵산으로 우선 형질전환되고, 이후 환자에게 이식됨)일 수 있다. 이들 두가지 접근 방법은 인비보(in vivo) 또는 엑스비보(ex vivo) 유전자 치료로써 각각 알려져 있다. 본 발명의 특정한 실시예에서, 핵산은 이가 코딩된 생산물을 생산하기 위해 발현되는 곳에, 인 비보로 직접적으로 투여된다. 이는 예를 들어 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 핵산을 구성하며 세포 내(intracellular)가 되는 방식에서 투여(예를 들어 결함이 있는 또는 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염을 통해; U. S. 특허번호 4,980,286 참조); 지방으로 핵산을 코팅; 세포-표면 수용체/감염제와 관련된 사용; 리포좀, 미세입자, 또는 미세캡슐 내 캡슐화; 핵으로 들어가는 것으로 알려진 펩타이드에 연결된 투여; 또는 수용체 매개된 세포내섭취에 성향이 있는 리간드에 연결된 투여를 통하여(예를 들어 Wu and Wu, 1987.J Biol Chem 262: 4429-4432 참조), 기술분야에 알려진 어느 수많은 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이는 구체적으로 관심이 있는 수용체 등을 발현하는 "타겟"세포 타입에 사용될 수 있다.
본 발명의 수행에서 유전자 요법에 추가적인 접근 방법은 전기영동, 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 매개된 형질주입(transfection), 바이러스 감염 등과 같은 이러한 방법을 통해 인비트로(in vitro) 조직 배양 내 세포 내로 유전자 전달(상기 정의된 핵산을 포함)을 포함한다. 일반적으로 전달 방법은 세포에 선택적 마커의 수반되는 전달을 포함한다. 상기 세포는 이후 이들 흡수한 세포의 동정(isolation)을 촉진하기 위해 선택 압력(예를 들어 항생물질 저항성) 하에 위치하고, 형질전환된 유전자를 발현한다. 이들 세포는 이후 환자에게 전달된다. 특정한 실시예에서, 재조합 세포를 초래하는 인비보 투여 전에, 핵산은 기술 분야에 알려진 어느 방법, 예를 들어 형질전환, 전기천공법, 미세주입법, 관심있는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 미세세포 매개 유전자 전달, 스페로플라스트(spheroplast) 융합, 및 수용체 세포의 필수적인 발달 및 생리학적 기능이 전달에 의해 방해되지 않는 것을 보증하는 유사한 방법을 통해 세포 내로 도입된다. 예를 들어 Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217 : 599-618 참조. 선택된 기술은 핵산이 세포에 의해 발현 가능한, 세포 내로 핵산의 안정한 전달을 제공할 수 있다. 바람직하게, 전달된 핵산은 유전되며 세포 자손에 의해 발현가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 결과 재조합 세포는 예를 들어 상피 세포의 주사(예를 들어 피하), 환자에게 피부 이식과 같은 재조합 피부 세포의 적용, 및 재조합 혈액 세포의 정맥 내 주입(예를 들어 조혈 줄기(hematopoietic stem) 또는 간세포(progenitor cells))를 포함하는 기술 분야에서 알려진 다양한 방법을 통해 환자에게 전달될 수 있다. 원하는 효과, 환자 상태 등에 따라 사용을 위해 계획된 세포의 총량은 기술분야에 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 핵산이 유전자 치료의 목적을 위해 도입될 수 있는 세포는 어느 원하는, 활용 가능한 세포 타입을 포함하며, 제노제네익(xenogeneic), 헤테로제네익(heterogeneic), 신제네익(syngeneic), 또는 오토제네익(autogeneic)일 수 있다. 세포 타입은 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포(keratinocytes), 섬유아세포, 근육 세포, 간세포 및 혈액 세포, 또는 다양한 줄기 또는 간세포, 특히 배아 심장 근육 세포, 간 줄기 세포(국제특허공개 WO 94/08598), 신경 줄기 세포 (Stemple and Anderson, 1992,Cell 71 : 973-985), 조혈 줄기 또는 간 세포, 예를 들어 골수로부터 수득된 것, 제대혈, 말초혈, 및 태아간 등과 같은 분화된 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서, 유전자 치료를 위해 활용되는 세포는 환자에게 자가 조직(autologous)이다.
그렇지 않으면 및/또는 추가적으로, 본 발명에서 언급된 질병의 치료를 위한 타겟팅(targeting) 요법은 (타겟팅) 항체 또는 세포 특이적 리간드와 같이 타겟팅 시스템의 사용을 통해, 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및/또는 핵산, 보다 구체적으로 세포의 특정한 타입에 전달하는데 사용될 수 있다. 타겟팅을 위해 사용된 항체는 전형적으로 하기 정의된 어느 질병과 관련된 세포의 세포 표면 단백질에 특이적이다. 예를 들어, 이러한 항체들은 예를 들어 MHC 클래스 II DR 단백질, CD18 (LFA-1 베타 체인), CD45RO, CD40 또는 Bgp95과 같은 B 세포 관련 세포 표면 단백질과 같은 세포 표면 항체, 또는 예를 들어 CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138 등으로부터 선택된 세포 표면 단백질에 지시될 수 있다. 타겟팅 구성(constructs)은 전형적으로 세포 표면 단백질에 특이적인 항체에 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및 본 발명에 따라 본 발명에 정의된 핵산 공유 결합을 통해 또는 세포 특이적 리간드에 결합을 통해 제조될 수 있다. 단백질은 예를 들어 이러한 항체에 결합될 수 있거나 펩타이드 결합을 통해 또는 화학적 커플링, 가교결합 등을 통해 이에 결합될 수 있다. 타겟팅 요법은 이후 하기 정의된 어느 투여 경로, 예를 들어 복강내, 비강, 정맥내, 구강 및 패치 전달 경로를 통해 환자에게 약학적으로 효과적인 양으로 타겟팅 구성의 투여에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 정의된 타겟팅 항체 또는 세포 특이적 리간드에 결합되는, 본 발명에 따라 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산은 인비트로 또는 인비보로, 예를 들어 공유 결합의 가수 분해를 통해, 펩티다아제를 통해 또는 어느 다른 적절한 방법을 통해 방출될 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명에 따라 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산이 작은 세포 특이적 리간드에 결합될 경우, 리간드의 방출은 수행되지 않을 수 있다. 만약 세포 표면에 존재하는 경우, 키메라 펩타이드는 이의 트래피킹 서열의 활성에 따라 세포로 들어갈 수 있다. 타겟팅은 다양한 이유로 바람직할 수 있다; 예를 들어 만약 본 발명에 따라 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및 핵산이 수용 불가능한 독성일 경우 또는 그렇지 않으면 이것이 너무 높은 투여량을 요구하는 경우.
직접적으로 본 발명에 따르는 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드를 투여하는 대신에, 그들은 세포 내로 도입된 코딩 유전자로부터, 예를 들어 투여된 바이러스 벡터로부터 발현을 통해 타겟 세포 내 생산될 수 있다. 바이러스 벡터는 전형적으로 본 발명에 따라 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드를 코딩한다. 벡터는 치료되는 특정한 세포에 타겟이 될 수 있다. 게다가, 벡터는 정의된 조절에 따라 타겟 세포에 의해 보다 더 또는 덜 선택적으로 켜지는(switched on), 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 기술은 그들의 전구체 형태 대신에 성숙 단백질을 활용하는, VDEPT 기술(바이러스 지시된 효소 전구 약물 요법)의 변종을 나타낸다.
그렇지 않으면, 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드는 항체 또는 바이러스의 사용에 의해 전구체 형태로 투여될 수 있다. 이들 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드는 이후 생산된 활성화제에 의해 활성 형태로 변환될 수 있거나, 치료되는 세포에 타겟이 될 수 있다. 이러한 형태의 접근은 종종 ADEPT(항체 지시된 효소 전구약물 요법) 또는 VDEPT(바이러스 지시된 효소 전구약물 요법)로 알려져 있음; 세포 특이적 항체에 컨쥬게이션을 통해 세포에 활성화제를 타겟팅하는 것을 포함하는 전자, 반면 후자는 활성화제, 예를 들어 바이러스 벡터 내 DNA를 코딩하는 것으로부터 발현을 통해 벡터 내, JNK 억제자 서열 또는 키메라 펩타이드를 생산하는 것을 포함한다 (예를 들어 EP-A-415731 및 WO 90/07936 참조).
추가적인 실시예에 따르면, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산 서열 또는 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 또는 키메라 펩타이드에 항체, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편은, 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환으로부터 선택된 다양한 상태 및 질병 증상을 검출, 예측, 진단, 또는 감시하기 위해 (인비트로) 분석(예를 들어 면역 분석)에 활용될 수 있고, 이의 치료를 모니터할 수 있다. 면역 분석은 면역 특이적 결합이 발생할 수 있는 조건 하에, 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산 서열에 항체로 환자로부터 유래된 샘플을 접촉하는 단계, 및 이후 항체에 의해 어느 면역 특이적 결합의 양을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는 방법을 통해 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드 또는 핵산 서열에 특이적인 항체에는 JNK 또는 JNK 억제자 서열의 존재를 위해 환자로부터 조직 또는 혈청 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다; 상기 JNK의 비정상적인 수준은 발병 상태를 가리킨다. 활용될 수 있는 면역 분석은 웨스턴 블롯(Western Blots), 방사면역 측정법(radioimmunoassays, RIA), 효소연결면역흡착분석(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), "샌드위치" 면역분석, 면역침전분석, 침강소(precipitin) 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집(agglutination) 분석, 형광 면역 분석, 보체-결합 분석, 면역방사계측(immunoradiometric) 분석, 및 단백질-A 면역분석 등과 같은 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템을 사용한 기술들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그렇지 않으면, (인비트로) 분석은 예를 들어 배양된 동물 세포, 인간 세포 또는 미생물로부터 전형적으로 선택된 타겟 세포에, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산 서열 또는 상기 정의된 JNK 억제자 서열에 또는 키메라 펩타이드에 대한 항체를 전달함으로써 및 통상의 기술자에게 전형적으로 알려진 생물 물리적 방법을 통한 세포 반응을 감시하기 위해 수행될 수 있다. 본 발명에 전형적으로 사용된 타겟 세포는 배양된 세포(인비트로) 또는 인비보 세포, 즉 살아 있는 동물 또는 인간, 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견된 미생물의 기관 또는 조직을 구성하는 세포일 수 있다.
본 발명은 추가적으로 진단 또는 치료 목적을 위한, 특히 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 치료, 예방 또는 감시를 위한 키트의 용도를 제공하며, 상기 키트는 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산 서열 및/또는 이들 JNK 억제자 서열에 또는 상기 정의된 키메라 펩타이드에 항체, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열에, SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드에, SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 트래피킹 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열에, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편에 항-JNK 억제자 서열 항체, 또는 이러한 항-JNK 억제자 서열 항체 및 선택적으로 항체에 대한 표지된 결합 파트너를 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함한다. 그에 따라 항체에 병합된 표지는 화학 발광의(chemiluminescent), 효소의(enzymatic), 형광의, 비색의 또는 방사선 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 특정한 실시예에서, 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드를 코딩하거나, 그렇지 않으면, 이에 상보적인 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는, 상기 정의된 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환의 치료, 예방 또는 감시에 진단 용도를 위한 키트가 제공되고, 선택적으로 이들 핵산에 대하여 표지된 결합 파트너 또한 제공된다. 대안적인 특정한 실시예에서, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 용기, 중합효소 연쇄반응(PCR; 예를 들어 Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA 참조), 라가아제 연쇄 반응, 및 사이클릭 프로브 반응 등, 또는 상기 정의된 핵산의 맥락에서 사용된 기술분야 내 알려진 다른 방법을 위한 증폭 프라이머로써 활동할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라미어 쌍(예를 들어 각 6-30 뉴클레오티드 길이)을 포함하는 키트로서 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 키트는 상기 목적을 위한 분석 내 진단, 표준, 또는 조절로써 사용을 위해, 미리 결정된 양의 정제된 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 상기 정의된 키메라 펩타이드, 또는 이들을 코딩하는 핵산을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 설명된 특정한 실시예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명에 설명된 것들에 추가하여 본 발명의 다양한 변형들은 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 기술분야에 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
본 발명에 인용된 다양한 공개 문헌들은, 그들 전체가 참조로써 본 발명의 개시에 병합된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자의 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 설명된 것들과 유사 또는 동등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 실험에 사용될 수 있더라도, 적절한 방법 및 재료는 하기에 설명된다. 본 발명에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조 문헌은 그들 전체가 참조로써 병합된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서는 조절될 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 예시들은 오직 설명을 위한 것이며 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제의 억제자, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드 또는 동일한 것을 코딩하는 핵산뿐만 아니라 이를 포함하는 약학적 조성물은 JNK 시그널링과 강하게 관련된 다양한 질병 또는 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1A-C는 지시된 전사 인자 내 보존된 JBD 도메인 영역의 정렬을 보여주는 도표이다. 본 발명에 사용된 JNK 억제자 서열은 서열 정렬을 수행함으로써 식별된다. 이러한 정렬의 결과는 도 1A-1C에 본보기로 나타내었다. 도 1A는 IB1, IB2, c-Jun 및 ATF2 사이의 가장 높은 상동성의 영역을 묘사한다. 패널 B는 비교 근거를 위한 L-IB1(s) 및 L-IB1의 JBDs의 아미노산 서열을 묘사한다. 완전히 보존된 잔기는 별표(asterisks)를 통해 지시되는 반면, GFP-JBD23Mut 벡터 내 Ala로 변경된 잔기는 동그라미(open circles)를 통해 지시된다. 도 1C는 JNK 억제자 서열 및 트래피킹 서열을 포함하는 키메라 펩타이드의 아미노산 서열을 보여준다. 나타난 실시예에서, 트래피킹 서열은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) TAT 폴리펩타이드로부터 유래되며, JNK 억제자 서열은 IB1(s) 폴리펩타이드로부터 유래된다. 인간, 쥐, 및 랫 서열은 패널 B 및 C에서 동일하다.
도 2는 인간, 마우스 및 랫으로부터 제네릭 TAT-IB 융합 펩타이드의 서열을 나타내는 도표이다.
도 3은 하나의 우수한 접근 방법(one-well approach)에서 SEQ ID Nos: 9 및 11에 따르는 융합 펩타이드를 사용하여 HepG2 세포 내 내생(endogeneous) JNK-활성의 억제의 결과를 묘사한다. 도 3으로부터 보여질 수 있는 바와 같이, 특히 도 3에 패널 d, SEQ ID NO: 11에 따르는 D-TAT-IB1(s)(본 발명에서 D-JNKI로 축약)는 심지어 SEQ ID NO: 9에 따르는 L-TAT-IB1(s)(본 발명에서 L-JNKI로 축약)에 비해, JNK 활성을 보다 효과적으로 억제하였다.
도 4는 SEQ ID NO: 11에 따르는 키메라 JNK 억제자 서열, 또한 XG-102(실시예 12 참조)로 명명되는 것으로 세포 독성 분석의 결과를 나타낸다. 나타난 바와 같이, XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 HFFs에 대하여 세포독성이 아니다. HFFs는 96-웰 조직 배양 플레이트에 시드되었다(seeded). DMSO (5 μM 약물과 동일한 수준), 또는 1, 2, 및 5 μM에서 XG-102를 포함하는 배지는 24시간 동안 첨가되었다. 뉴트럴 레드(Neutral Red)가 간단히 첨가되었고, 세포는 고정된 후, 염료가 추출되었다. 흡수는 540nm에서 측정되었다. DMSO 및 1 μM XG-102 사이에 차이가 발견되지 않았다.
도 5는 SEQ ID NO: 11에 따르는 키메라 JNK 억제자 서열, 또한 수두 대상포진 바이러스(Varizella Zoster Virus, VZV)에 대한 XG-102로 명명되는 것 (실시예 12 참조)의 활성을 실험하기 위해 수행된 플라크(plaque) 감소 분석의 결과를 묘사한다. 나타난 바와 같이, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 특히 0.5 μM 및 1 μM의 농도에서, 수두 대상포진 바이러스(VZV)의 잠재적 억제자이다.
도 6은 SEQ ID NO: 11에 따르는 키메라 JNK 억제자 서열, 또한 XG-102(실시예 12 참조)로 명명되는 것을 사용하여 배양된 인간 섬유아세포 내 수두 대상포진 바이러스(VZV)의 억제의 결과를 나타낸다. 나타난 바와 같이, VZV는 XG-102 (SEQ ID NO: 11)에 대한 현저한 민감도를 나타낸다. VZV 복제는 음성 대조군 (XG-100, Tat 펩타이드 단독)의 존재에서는 보통이었다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 따라서 0.25 μM의 가장 낮은 농도 실험에서 이미 VZV 복제를 방지한다.
도 7은 블레오마이신(Bleomycin) 유도된 급성 폐 염증의 동물 모델을 사용하여 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)의 치료에 폐 균질화(lung homogenization) 내 MPO를 사용하여 폐 내 세포 보충(cell recruitment)에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성을 묘사한다. 나타난 바와 같이, MPO는 블레오마이신 투여 이후 현저하게 유도되지 않았다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 따라서 폐 내 MPO 수준에 오직 작은 효과만을 가졌다.
도 8은 블레오마이신 유도된 급성 폐 섬유증의 동물 모델을 사용하여 만성 폐쇄성 폐질환의 치료에 TNF 수준에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성을 묘사한다. TNF 수준을 측정할 때, XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 투여 이후 BALF 내 TNF 수준의 감소에 경향은 BLM 모델에서 관찰되었다. TNF 수준은 BLM 이후 매우 낮았다.
도 9는 블레오마이신 유도된 급성 폐 섬유종의 동물 모델을 사용하여 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료에 기관지 폐포 세척 공간(bronchoalveolar lavage space) 내 세포 보충에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성을 묘사한다. 0.1 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 림프구 보충을 현저하게 감소시켰고 총 세포의 수는 림프구 보충에 의해 이러한 점에 특성화된 염증 단계 동안 보충되었다. 0.1 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 기관지 폐포 공간으로 림프구 보충 또는 총 세포의 수를 증진시켰다 (그룹 당 n=5 쥐(mice); *, p < 0.05; **, p < 0.001).
도 10은 블레오마이신 유도된 급성 폐 섬유증의 동물 모델을 사용하여 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)의 치료에 조직학의 결과를 나타낸다. 폐의 3 μm 구획은 헤마톡실린(haematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색되었다. 염증 세포 축적, 섬유증 구역, 폐 구조(lung architecture)의 손실은 BLM 투여 이후 10일 동안 관찰되었다. 나타난 바와 같이, 이들 파라미터의 감소는 높은 투여량 (0.1 mg/kg)으로가 아닌, 낮은 투여랑 (0.001 mg/kg)에서 XG-102의 투여 이후에 관찰되었다.
도 11은 ELISA에 의해 결정된 뇌 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 치료의 효과를 나타낸다. 그래프는 트리톤(Triton) 40 및 트리톤 42로 다른 뇌 균질액(homogenate) 분획 내 ELISA에 의해 결정된 Aβ1 -40 (좌) 및 Aβ1 -42 (우) 수준을 나타낸다. 데이터는 개별 값(검정) 및 그룹 평균(mean) ± SEM으로 분산된 점 평면(scattered dot plot)으로 나타났다. 현저한 차이는 별표로 표시되었다 (* p<0.05; ** p<0.01). 현저한 그룹 차이는 Aβ1 -42에 대하여 오직 트리톤 X-100 분획에서 관찰되었다.
도 12는 ELISA에 의해 결정된 CSF Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 치료의 효과를 묘사한다. 그래프는 CSF 내 ELISA에 의해 결정된 Aβ1 -40 (좌) 및 Aβ1 -42 (우) 수준을 나타낸다. 데이터는 개별 값(검정) 및 그룹 평균 ± SEM으로 분산된 점 평면으로 나타내었다. 현저한 차이는 별표로 표시되었다 (* p<0.05; ** p<0.01). 양쪽 투여에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 처리는 CSF 내 Aβ1 -40 및 Aβ1-42의 현저한 감소를 유도하였다.
도 13은 hATT Tg 쥐 내 플라크의 티오플라빈S(ThioflavinS) 염색 가시화된 수에 치료 효과를 나타낸다: 그래프는 피질(cortex) 및 해마(hippocampus) 내 mm2 당 티오플라빈S 염색된 플라크의 수를 나타낸다. XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리는 해마 내 음성적으로 투여량 의존적 플라크 수를 감소시켰다. 데이터는 평균 +SEM으로 나타내었다. 그룹 당 N = 8. *...p <0.05; **...p < 0.01.
도 14는 hAPP Tg 쥐 내 티오플라빈S 가시화된 플라크 영역 [%]에 치료 효과를 묘사한다. 그래프는 피질 및 해마 내 티오플라빈S 양성 플라크의 플라크 영역 [%]을 나타낸다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 해마 내 플라크에 의해 수득된 영역을 현저하게 감소시켰다. 데이터는 평균 +SEM으로 나타내었다. 그룹 당 N = 8.
도 15는 제2형 당뇨병 동물 모델에 공복 혈당 수준 (절대 및 상대)에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 투여 결과를 설명한다. 공복 혈당은 68일 까지 매 세번째 날 및 그룹 A 및 C 내 111 일에 종결되기 까지 정기적으로 측정되었다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)으로 처리된 당뇨병 db/db 쥐의 공복 혈당 수준 내 명백하고 현저한 (p<0.001) 감소가 관찰되었다. XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)로 처리된 쥐의 공복 혈당 수준은 약 5 mmol/L의 낮은 안정기(low plateau)에 도달하였다. 이러한 효과는 투여 14일 이후에 자명하였고 연구 기간 내내, 따라서 21일 내지 111일 전체 워시-아웃 기간(wash-out period) 동안 지속되었다. 대조적으로, 투여 28일 동안 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (1 mg/kg)의 낮은 투여량은 효과가 없는 것으로 관찰되었다.
도 16은 제2형 당뇨병 동물 모델에 체중 상 10 mg/kg, XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 투여 결과를 설명한다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)로 처리된 쥐 내 체중 증가의 명백하고 현저한 (p<0.001) 방지를 관찰하였다. 이러한 효과는 투여 28일로부터 분명하였고 종결 111일의 날까지 유지되었다. 대조적으로, 투여 28일 동안 체중에 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (1 mg/kg)의 낮은 투여량의 효과는 관찰되지 않았다.
도 17, 18은 24시간 음식 및 취수(water intake)에 제2형 당뇨병 동물 모델 내 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 효과 및, 도 17(g) 및 18(일반화된 체중의 g)에 연구 68일에 대사 케이지(metabolic cages ) 내 측정된 소변과 대변 생산을 설명한다. 음식 섭취 및 소변 생산의 감소에 대한 경향이 관찰되었음에도 불구하고, 비히클 대조군에 비해 측정된 어느 파라미터에 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 현저한 효과는 관찰되지 않았다.
도 19, 20은 도 19 내 인슐린, MCP-1 및 IL-6의 혈장 수치; 도 20 내 tPAI-1, TNF 및 레지스틴(resistin)의 혈장 수치에 57, 77 및 108일에 측정된 제2형 당뇨병 동물 모델에서 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 효과를 설명한다; 혈장 레지스틴의 수준을 제외하고 비히클 대조군에 비해 어느 측정된 파라미터에 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 현저한 효과가 관찰되지 않았으며, 이는 77 및 108일에 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리된 동물에서 현저하게 높았다.
도 21은 정소상체(epididymal), 서혜부 피하(inguinal subcutaneous), 및 복막후 지방체(retroperitoneal fat pads)의 조직 중량에 제2형 당뇨병 동물 모델 내 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 효과를 나타낸다. 비히클 대조군에 비해 XG-102로 처리된 쥐 내 정소상체 (p<0.05) 및 복막후 (p<0.01) 지방체의 현저한 감소가 관찰되었다.
도 22는 뇌, 비장 및 심장의 조직 중량에 제2형 당뇨병 동물 모델 내 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 효과를 묘사한다. 비히클 대조군에 비해 이들 파라미터에 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 현저한 효과는 발견되지 않았다.
도 23은 신장 및 간의 조직 중량에 제2형 당뇨병 동물 모델 내 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (10 mg/kg)의 효과를 설명한다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 처리된 쥐 내 신장 (p<0.05) 및 간 (p<0.01) 질량의 현저한 감소가 관찰되었다.
도 24 일차(primary) 배양된 대식세포는 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 배양되고 광범위하게 세척되었다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 존재는 XG-102에 대한 특정한 항체를 사용하여 나타났다. XG-102는 일차(primary) 대식세포로 강하게 병합되었다.
도 25 쥐는 C14 (1mg/kg)로 방사성 표지된 펩타이드로 투여(s.c., i.v., i.p.)의 세가지 다른 경로를 통해 처리되었다. 동물들은 주사 72시간 이후 희생되었고 면역방사선촬영(immunoradiography)을 위해 처리되었다. 시상 섹션(Sagital sections)은 노출되었고 주로 간, 비장, 및 골수 내 XG-102 펩타이드 축적을 나타내었다 (XG-102: SEQ ID NO: 11).
도 26은 XG-102 i.v.의 1 mg/kg으로 주사된 랫의 간 내 XG-102 (SEQ ID NO: 11)에 대한 면역 염색을 보여준다. 동물은 주사 24시간 이후 희생되었다. 시현은 DAB 기질을 사용하여 수행되었다. 상기 도면은 다시 간 내, 및 특히, 쿠퍼 세포(Kupffer cells) (대식세포) 내 XG-102의 명백한 축적을 나타낸다.
도 27은 두가지 세포 라인에서 사이토카인 & 케모카인 방출의 억제를 나타낸다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 THP-1 세포 내 LPS-유도된 TNFa, IL-6 및 MCP-1 방출 (패널 A-C) 및 주르카트 세포(Jurkat cells) 내 PMA & 이오노마잉신 유도된 IFNg, IL-6 및 IL-2 생산 (패널 D-F)을 감소시키는, 골수(myeloid) 및 림프(lymphoid) 세포 라인 모두에서 사이토카인 방출을 억제한다. 대조군 (XG-101)은 이의 낮은 안정성 때문에 덜 효과적이다.
도 28은 일차 세포 내 사이토카인 방출의 억제를 보여준다. XG-102 (SEQ ID NO:11)은 또한 쥣과(murine) 대식세포 내 LPS-유도된 TNFa, IL-6 및 Rantes 방출 (패널 A-C) 및 쥣과 T 세포 내 PMA & 아이오노마이신-유도된 TNFa 및 IFNg 생산을 감소시키는, 일차 림프 및 골수 세포 내 사이토카인 방출을 억제한다. 효과는 XG-102 (패널 F)의 비-세포독성 농도에서 발생한다.
도 29는 랫으로부터 IB1 cDNA 서열 및 이의 예상된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 102)를 보여준다.
도 30은 rIB1 유전자-스플라이스 공여자 (SEQ ID NO:103)의 엑손-인트론 경계에 의해 코딩된 랫으로부터 IB1 단백질 서열을 보여준다.
도 31은 Homo sapiens (SEQ ID NO:104)로부터 IB1 단백질 서열을 나타낸다.
도 32는 Homo sapiens (SEQ ID NO:105)로부터 IB1 cDNA 서열을 보여준다.
도 33 JNK/p38 활성화에 섬 동정(islet Isolation)에 효과. 본 실험은 JNK 또는 p38에와 같이 격리 과정에 의해 유발된 어느 효과를 식별하기 위해 설계되었다. 대조군 튜불린 검출이 사용되었다. 소화 시간(min)의 기능으로 웨스턴 블롯 염색(Western blot stainig)을 나타내었다.
도 34 본 도면에 의해 격리 도중 JNK 활성화에 XG-102의 효과를 나타내었다.
도 35 격리 도중 JNK 활성화에 XG-102의 효과.
도 36 격리 도중 OCR/DNA에 XG-102의 효과.
도 37 HPLC 분석에 의해 ATP/ proteinJ에 XG-102 (DJNK 억제자)의 효과.
도 38은 XG-103이 배양 7일 이후 측정된 섬 생존능력(islet viability) (OCR/DNA)을 현저하게 증가시킴을 나타낸다.
도 39 도 41(A): 플루오레세인 주사 10분 이후 플루오레세인 혈관 촬영법 평가 (평균 점수). 평균 점수는 다섯개 그룹(XG-102 300 microgramm/ml, XG-102 3mg/ml, 켄코트 리타드(Kencort retard), 0,9 % NaCl 용액, 비처리군(untreated))에 대해 14일 및 21일에 나타내었다.
도 41(b) 14일 및 21일에 다섯개 그룹(XG-102 300 microgramm/ml, XG-102 3mg/ml, 켄코트 리타드, 0,9 % NaCl 용액, 비처리군)에 대한, 플루오레세인 주사 10분 후 플루오레세인 혈관 촬영(angiography) 평가 (평균 점수)의 비율.
도 41(C) 다섯개 그룹(XG-102 300 microgramm/ml, XG-102 3mg/ml, 켄코트 리타드, 0,9 % NaCl 용액, 비처리군)에 대한, 플루오레세인 주사 14일 및 21일 후에 ChNV 형성 10분의 발생 정도(incidence).
도 41(D) 다섯개 그룹(XG-102 300 microgramm/ml, XG-102 3mg/ml, 켄코트 리타드, 0,9 % NaCl 용액, 비처리군)에 대하여; 14일 및 21일에 플루오레세인 누출 확장(leakage extend)의 발생 정도.
도 40 신장해(nephropathy)의 아드리아마이신(Adriamycin) 유도된 유도에 신장 조직에 XG-102의 효과를 측정하기 위한 실험의 설계를 나타내었다. 랫 그룹들 및 그들의 치료 요법(regimen)을 나타내었다.
도 41 XG-102는 단백뇨(proteinuria)에 어떠한 역 효과도 유발하지 않는 것으로 나타났다. ELISA 분석은 관찰 기간(5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 25, 38, 41일)의 기능과 같이 그룹 1, 그룹 4 및 그룹 5에 대한 알부민 농도를 결정하는데 사용되었다.
도 42 실험 시작 8일 후 조직학적 분석. 그룹 1의 아드리아마이신 처리된 랫(왼쪽) 및 그룹 4의 아드리아마이신 및 XG-102 처리된 랫(오른쪽)의 비교.
도 43 실험의 시작 14일 이후 조직학적 분석. 그룹 1의 아드리아마이신 처리된 랫(왼쪽) 및 그룹 4의 아드리아마이신 및 XG-102 처리된 랫(오른쪽)의 비교.
도 44 실험의 시작 19일 이후 조직학적 분석. 그룹 1의 아드리아마이신 처리된 랫(왼쪽) 및 그룹 4의 아드리아마이신 및 XG-102 처리된 랫의 비교.
도 45 실험의 시작 41일 이후 조직학적 분석. 그룹 1의 아드리아마이신 처리된 랫(왼쪽) 및 그룹 4의 아드리아마이신 및 XG-102 처리된 랫(오른쪽)의 비교.
도 46 실험의 시작 8일 이후 c-jun 발현의 조직학적 분석 (염색). 왼쪽 아드리아마이신 처리된 조직학적 준비(preparation), 중간: 아드리아마이신 및 XG-102 처리된군(간질(interstitium) 내 c-jun 발현의 현저한 감소를 초래) 및 오른쪽에 대조군.
도 47 실험의 시작 14일 이후 c-jun 발현의 조직학적 분석 (염색). 왼쪽 아드리아마이신 처리된 조직학적 준비(preparation), 중간: 아드리아마이신 및 XG-102 처리된군(간질(interstitium) 내 c-jun 발현의 현저한 감소를 초래) 및 오른쪽에 대조군.
도 48은 ADR 투여 후 8, 14, 29, 41 및 56일에 아드리아마이신(ADR) 유도된 신장해 모델 내, 랫의 프로티데미아(protidemia) (A) 및 요소 수준 (B)에 의해 측정된 신장 기능을 나타낸다. 그룹 No. 1 ("ADR") 및 No. 2("ADR + XG-102")는 네크로패시(necropathy)를 유도하기 위해 ADR로 0일에 처리된 반면, 그룹 No. 3 ("NaCl") 및 No. 4 ("XG-102")는 0.9% NaCl을 수용하였다. 나아가, 그룹 Nos. 2 및 4는 XG-102로 0일에 처리된 반면, 그룹 Nos. 1 및 3은 비히클 (0.9% NaCl)을 수용하였다.
도 49는 과요오드산-시프(periodic acid-Schiff, PAS) (원배율(original magnification) x40)로 염색된 아드리아마이신(ADR) 유도된 신장해 모델에 랫의 신장 구역을 보여준다. 왼쪽 칼럼에 나타난 구역에 대하여, 랫은 ADR 투여 8일 후 희생된 반면, 왼쪽 칼럼에 나타난 구역에 대하여, 랫은 56일에 희생되었다. ADR은 오직 "ADR" 및 "ADR + XG102" 그룹에 투여된 반면, 그룹 "NaCl"은 0.9% NaCl을 오직 수용하였다. 그룹 "ADR + XG102"는 XG-102로 0일에 처리된 반면, 다른 그룹("ADR" 및 "NaCl")들은 비히클(0.9% NaCl)을 수용하였다.
도 50은 0일에 ADR 및 비히클로 처리된 그룹 "ADR" (위쪽 패널)에 대하여 및 0일에 ADR 및 XG-102로 처리된 그룹 "ADR + XG102" (아래쪽 패널)에 대하여 ADR 투여 이후, 8일 (왼쪽 네개 패널) 및 56일 (오른쪽 네개 패널)에 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome)(푸른색)으로 측정된 ADR 신장해 내 신장 섬유증을 보여준다. 원배율 x10은 각 날에 왼쪽 패널에 도시되고(depicted), 원배율 x40은 각 날에 오른쪽 패널에 도시되었다.
도 51 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드(puromycine aminonucleoside, PAN) 유도된 신장해에 XG-102의 효과를 조사하는 실험의 연구 설계. 0일 및 14일에 PAN 또는 이의 비히클은 신장해의 유발을 위해 주사되었다. 0일 및 14일에, PAN은 우선 투여되었고, XG-102가 투여되었다. 0일 내지 42일에 XG-102 또는 이의 비히클은 상기 설명된 i.v. 경로에 의해 일주일에 한번 투여되었다. 56일에 동물들은 희생되었고 샘플(혈액 및 신장)은 수집되었다.
도 52는 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드(PAN) 유도된 신장해 내 사구체 경화증 손상(glomerulosclerosis injury)에 XG-102의 효과를 보여준다. XG-102는 그룹 3 내지 6에 투여되었다 (범례 (legend)에 "cpd"로 표지됨). 그룹 2 및 그룹 6은 실시예 20의 연구 계획 내 언급된 것처럼 iv 주사의 수의 관점에서 다르다. 그룹 2의 점수는 동일한 실험 방법을 사용하여 Najakima et al. (2010)에 의해 보고된 것과 매우 유사함을 유의. ***언페어드 스튜던트 t-테스트(unpaired Student t-test)를 사용하여 P<0.001 대(versus) 그룹 1; # P<0.05; ###일원 변량 분석(one-way ANOVA) 이후 뉴먼-쿨스 검증(Newman-Keuls test)을 사용하여 P<0.001 대(versus) 그룹 2; §§§ 언페어드 스튜던트 t-테스트를 사용하여 P<0.001 대 그룹 2.
도 53은 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드 (PAN) 유도된 신장해 내 사구체(glomerular) 손상에 XG-102의 효과를 나타낸다. XG-102는 그룹 3 내지 6에 투여되었다(범례 내 "cpd"로 표지됨). 그룹 2 및 그룹 6은 실시예 20의 연구 계획 내 언급된 것처럼 iv 주사의 수의 관점에서 다르다. ***언페어드 스튜던트 t-테스트(unpaired Student t-test)를 사용하여 P<0.001 대(versus) 그룹 1; ###일원 변량 분석(one-way ANOVA) 이후 뉴먼-쿨스 검증(Newman-Keuls test)을 사용하여 P<0.001 대(versus) 그룹 2; §§§ 언페어드 스튜던트 t-테스트를 사용하여 P<0.001 대 그룹 2.
도 54는 당뇨병성 신장병(diabetic nephropathy)의 랫 모델 내 XG-102의 만성 투여의 효과를 조사하는 실시예 21의 연구 스케쥴을 보여준다. 동물은 도착 직후 고지방식(high fat diet)에 놓여졌다. 그룹 E 및 F 내 동물들은 초기 단계로부터 각 날에 매일 투여되었다.
도 55는 랫의 체중에 당뇨병성 신장해의 랫 모델 내 XG-102의 만성 투여의 효과를 보여준다. 오직 비-STZ 처리된 랫은 체중에 증가를 보였다. XG-102로 처리된 랫은 STZ 모델 내 비히클 처리된 랫에 비해 체중에 차이를 보이지 않았다. 그러나, 양성 레퍼런스(positive reference) (로사탄(Losartan))으로 처리된 렛의 체중은 현저하게 낮았다.
도 56은 XG-102 투여량 의존적으로 감소된 JNK (A) 및 PAF2 (B) 인산화는 섬 동정(islet isolation)/이식(transplantation)에 XG-102에 투여-반응을 측정하는 실험 내 15분 국소빈혈에 의해 유도됨을 보여준다(실시예 22). 랫 섬의 격리는 동물 희생 이후 즉시 또는 온 허혈(warm ischemia)의 15분 기간 이후 수행되었다. JNK 활성화는 격리 과정의 마지막에 웨스턴 블롯에 의해 측정되었다. 음성 대조군으로, JNK 활성화는 비가공된 랫 췌장에서 측정되었다.
도 57은 섬(islets)이 15분 허혈성 랫으로부터 및 비허혈성 랫으로부터 분리된 섬인, 랫 췌장 섬의 기능 및 생존력에 XG-102의 효과를 보여준다. 고정(static) 인슐린 분비 실험 (기초 또는 글루코스로 자극된)은 섬 동정 이후 직접적으로 및 37°C에서 18시간 배양 이후 수행되었다. 격리는 섬 기능에 영향을 미쳤으며, 기초 인슐린 분비는 어떤 조건에서든지 18시간 동안 배양된 섬에 비해, 격리 이후 직접적으로 사용된 섬 내에서 높았다. 그러나, 배양 이후, 국소빈혈 및 억제자 XG-102는 본 실험 내 섬 기능에 영향을 미치지 않았다.
도 58은 국소 빈혈이 30분까지 주어지고 XG-102가 100 microM에서 사용된, 다른 실험을 보여준다. 여전히, 높은 기초 분비는 인슐린 분비 테스트가 격리 이후 직접적으로 수행될 때 관찰되었다. 게다가 30분 국소 빈혈은 섬 기능에 부정적인 영향을 미쳤다. 이러한 예비적 결과들은 30분 국소빈혈이 JNK 활성화를 유도하는 15분에 비해 보다 나은 모델로 보임을 제안한다. 국소 빈혈 랫들로부터 섬이 격리되고 XG-102로 배양될 때, 글루코스 유도된 인슐린 분비는 허혈성 랫에 비해 높았다.
도 59 환자의 기질(disposition)은 실시예 27의 연구, 즉 수술 후 안내 염증에 덱사메타손 점안액(임상 2상)에 비해, XG-102의 단일 결막하(sub-conjunctival) 주사의 효율 및 안정성을 측정하기 위한 즉 무작위, 이중맹검(double-blind), 병렬군(parallel group), 컨트롤된(controlled), 다중심(multicenter) 실험에 포함되었다.
도 60은 세가지 처리군 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손에 대해, PP 분석 개체수(population)에 대해 연구 치료의 결막하 주사의 투여 이후, 28일 까지 실시예 27 평균 전방 챔버(anterior chamber) 세포 등급의 연구를 보여준다. 수직선은 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 61은 28일에 전방 챔버 세포 등급에 관하여, PP 및 FAS 데이터 세트 모두에 대해 첫번째 이차 산물(outcome)에 더하여, 실시예 27 일차 산물의 실시예 27 결과의 연구를 보여준다: 신뢰 구간(Confidence Intervals) 및 비-열세 한계(Non-inferiority margin).
도 62는 세가지 처리군 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손에 대해, 연구 처리의 결막하 주사의 투여 이후, 28일까지 수득된 실시예 27 전방 챔버 플레어 등급(FAS에 대하여)의 연구를 보여준다. 수직선은 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 63은 FAS에 대하여 28일까지 연구를 통해 정의된 시점에 수득된 LFM(Laser Flare Meter) 측정 실시예 27의 연구를 보여준다. 수직선은 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 64는 투여 그룹에 의해 보고된 부작용 사례(adverse events)의 개관 실시예 27의 연구를 보여준다.
도 65는 세가지 연구 그룹의 하나에 무작위화된 환자의 적어도 2%에 대해 보고된, AEs(MedDRA SOC 및 PT 용어에 의해 분류됨)의 요약 실시예 27의 연구를 보여준다.
도 66은 보고된 심각한 부작용 사례(SAEs)의 개관 실시예 27의 연구를 보여준다.
도 67은 XG-102 (도면에서 "D-JNKI1"로 표시) 또는 PBS 처리된 Mapk14f /f 및 Mapk14Δli * 쥐(왼쪽 패널) 및 XG-102 (즉 "D-JNKI1") 처리된 Mapk14f /f Junf /f 및 Mapk14 Δli * Jun Δli * 쥐(오른쪽 패널)에 간세포의 확산 실시예 28을 보여준다. 쥐들은 만약 가능하다면 DEN 처리 전에, XG-102 (체중 kg 당 20 mg) 또는 PBS로 주사되었다. 간세포의 증식은 DEN 처리 48시간 이후 Ki67 염색을 통해 분석되었다. Ki67-양성 세포의 정량을 나타내었다.
도 68 3X106 Huh7 인간 간암 세포는 4주령의 누드 쥐의 측면 구역에 피하 주사되었다 (실시예 29). 누드 쥐는 Hub7 주사 이후 5mg/kg으로 일주일에 두번 복강내 XG-102로 처리되었다. 종양 부피는 일주일에 두번 측정되었다. 쥐는 이종 이식(xenograft) 4주 후 죽었다. 점선 원은 이식된 종양을 가리킨다.
도 69는 동소적으로(orthotopically) 주사된 HEP G2 종양을 보유하는 쥐의 평균 체중 및 평균 체중 변화 곡선이 나타난 실시예 30을 보여준다. 쥐는 1mg/kg/inj에서 XG-102로 처리 이후, D10 및 D41에서 두번 반복된 Q4Dx4 처리 스케쥴로 IV 처리되었다. 그에 따라, 도 70에서 각각의 통계 데이터를 나타내었다.
도 70은 XG-102에 쥐의 내성(tolerance) 실시예 30을 보여준다. 평균 체중 및 MBWC ±SD가 표시된다. MBWC%는 고려된 날 및 첫번째 처리 날 (D10) 사이 평균 체중의 변화에 상응한다. 통계적 분석은 참고(reference)로 비히클 처리된 군을 갖는, 본페로니-던 테스트(Bonferroni-Dunn test)로 수행되었다.
도 71은 희생일(D185) 까지 그룹 당 생존하고 있는 쥐의 비율이 도시된, 쥐 장기 생존 곡선 실시예 30을 보여준다. 쥐들은 지시된 투여량에서 XG-102 이후 D10 및 D41에 두번 반복된 Q4Dx4 처리 스케쥴로 처리되었다.
도 72는 XG-102 및 XG-414 처리, 단독 또는 조합에 쥐의 내성 실시예 31을 보여준다. 평균 체중 및 평균 체중 변화± SD는 표시되었다. MBWC%는 고려된 날 및 첫번째 처리 날 (DIO) 사이에 평균 체중의 변화에 상응한다.
도 73은 희생일(D171)까지 그룹 당 생존하고 있는 쥐의 비율이 도시된, 쥐 장기 생존 곡선 실시예 31을 보여준다. 검시(autopsy)를 위해 D67에 희생된 쥐는 계산으로부터 제외되었다. 쥐는 지시된 투여량의 XG-102 이후 D10 및 D41에 두번 반복된 Q4Dx4 처리 스케쥴로 처리되었다.
도 74는 막대그래프 표시로 D67에 희생된 쥐 또는 D67 내지 최종 희생 사이의 현미경 평가를 통해 관찰된 종양 침입 실시예 31을 보여준다. 종양 테이크(take)의 수준은 도면 범례 내 구체화된 네가지 다른 카테고리로 분류되었다.
도 75는 항종양 활성 실험 동안 PC-3 종양을 갖는 쥐의 평균 종양 부피 실시예 32를 보여준다. D33에, 다섯가지 동물의 세 그룹은 비히클 및 XG-102 (0.1 및 1mg/kg/inj, Q4Dx4)로 처리되었다.
도 76은 쥐 맹장(caecum)에 HCT 116 종양 이식 이후 간 내 또는 이의 주변(periphery)(문(hilus))에 관찰된 전이성 종양 침입의 막대그래프 표시 실시예 33을 보여주며, 다른 그룹에서, PO 또는 SC는 비히클 또는 0.1 및 1 mgl/kg/adm.에서 X0-102 이후 Q1Dx14 처리 스케쥴로 처리되었다. 현미경 관찰의 분류는 범례 내 설명된 것과 같이 수행되었다.
도 77은 알비노 랫의 오른쪽 눈에 망막전도기록(electroretinography, ERG) 측정 실시예 34를 보여준다.
실시예
실시예 1: JNK 억제자 서열의 식별
JNK와 효과적인 상호작용을 위해 중요한 아미노산 서열은 알려잔 JNK 결합 도메인 JBDs 사이 서열 정렬에 의해 식별되었다. JBDs of IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] 및 ATF2 [SEQ ID NO: 16] 사이 서열 비교는 약하게 보존된 8 아미노산 서열 (도 1A 참조)을 정의한다. IB1 및 IB2의 JBDs가 결합 JNK 내 c-Jun 또는 ATF2에 대략적으로 100배 효율적이므로(Dickens et al. Science 277: 693 (1997), IB1 및 IB2 사이에 보존된 잔기는 최대 결합을 부여하기 위해 중요한 것으로 이해된다. IB1 및 IB2의 JBDs 사이 비교는 두 서열 사이 매우 보존된 일곱개 및 세개 아미노산의 두 블록을 정의한다.
이들 두 블록은 L-IB1(s) [SEQ ID NO: 1] 내 19개 아미노산의 펩타이드 서열 내 포함되며, 또한 IB1 [SEQ ID NO: 17]로부터 유래된 23 aa 펩타이드 서열 내 비교 근거(comparative reasons)를 보여준다. 이들 서열은 도 1B 내 보여지며, L-IB1 서열 내 대시 기호(dashes)는 L-IB1(s)를 갖는 보존된 잔기를 정렬하기 위한 서열 내 갭을 가리킨다.
실시예 2: JNK 억제자 융합 단백질의 제조
SEQ ID NO: 9에 따르는 JNK 억제자 융합 단백질은 두 프롤린 잔기로 이루어진 연결자를 통해 SEQ ID NO: 5에 따라, SEQ ID NO: 1의 C-말단을 HIV-TAT4g 57로부터 유래된 N-말단 10 아미노산 긴 담체 펩타이드에 공유 결합함에 의해 합성되었다(Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)). 이러한 연결자는 최대 유연성을 부여하기 위해 사용되었고 원치 않는 이차 구조 변화를 예방한다. 상기 기초 구조는 또한 각각 L-IB1(s) (SEQ ID NO: 1) 및 L-TAT [SEQ ID NO: 5]를 제조 및 설계하였다.
SEQ ID NO: 11에 따르는 모든-D 레트로-인버소 펩타이드는 그에 따라 합성되었다. 기초 구조는 또한 각각 D-IB1(s) [SEQ ID NO: 2] 및 D-TAT [SEQ ID NO: 6]를 제조 및 설계하였다.
SEQ ID NOs: 9, 10, 11 및 12에 따르는 모든 D 및 L 융합 펩타이드는 전통적인 Fmock 합성에 의해 생산되고, 나아가 질량분석기에 의해 분석되었다. 그들은 최종적으로 HPLC를 통해 정제되었다. 상기 프롤린 연결자의 효과를 결정하기 위해, 두가지 타입의 TAT 펩타이드는 두 프롤린을 갖는 것 및 갖지 않는 것으로 생산되었다. 두 프롤린의 추가는 세포 내 TAT 펩타이드의 침입 또는 국재화를 변형하는 것으로 나타나지 않았다. 보존된 아미노산 잔기를 보이는 일반적인 펩타이드는 도 2에 주어졌다.
실시예 3: JBD19에 의한 세포 사멸의 억제
JNK 생물학적 활성에 IB1(s)의 19 aa 긴 JBD 서열의 효과가 연구되었다. 상기 19 aa 서열은 녹색 형광 단백질 (GFP JBD19 구성)에 N-말단이 연결되고, IL1에 의해 유도된 췌장 베타-세포 세포자멸에 이러한 구성의 효과가 평가되었다. 세포자멸의 이러한 방식은 JBD1 - 280로 형질주입에 의해 억제되는 것으로 이전에 보여지는 반면, 기술분야에 알려진 ERK1/2 또는 p38의 특정한 억제자는 보호하지 않았다.
JNK19에 상응하는 및 완전히 보존된 영역에서 변이된 서열 뿐만 아니라 19개 아미노산의 보존된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 합성되었고, 녹색 형광 단백질 (GFP) (Clontech로부터)을 코딩하는 pEGFP-N1 벡터의 EcoRI 및 SalI 부위에 직접적으로 삽입되었다. 인슐린을 생산하는 TC-3 세포는 10% 태아 송아지 혈청(Fetal Calf Serum), 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 units/mL 페니실린 및 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 인슐린을 생산하는 TC-3 세포는 지시된 벡터로 형질주입되었고 IL-1 (10 ng/mL)는 세포 배양 배지에 첨가되었다. 세포자멸 세포의 수는 역 형광 현미경(inverted fluorescence microscope)을 사용하여 IL-1의 첨가 48시간 이후에 세어졌다. 세포자멸 세포는 세포질 특유의 "블레빙 아웃(blebbing out)"에 의해 일반 세포로부터 구별되었고 2일 후 세어졌다.
GFP는 대조군으로 사용된 녹색 형광 단백질 발현 벡터이며; JBD19는 IB1의 JBD로부터 유래된 19 aa 서열에 연결된 키메라 GFP를 발현하는 벡터이며; JBD19Mut는 GFP-JBD19와 동일하지만, 도 1B에 나타난 네 보존된 잔기에 JBD 돌연변이를 갖는 벡터이며; 및 JBD1 - 280는 전체 JBD (aa 1-280)에 연결된 GFP 벡터이다. 구조를 발현하는 GFP-JBD19는 전체 JBD1 -280 만큼 효율적으로 IL-1 유도된 췌장 세포 세포자멸을 예방한다.
추가 대조군처럼, 완전히 보존된 IB1(s) 잔기에 돌연변이된 서열은 세포자멸을 막는 능력이 크게 감소하였다.
실시예 4 : TAT-IB1(s) 펩타이드의 세포 수입(Import)
세포로 들어가기 위해 TAT 및 TAT-IB1(s) 펩타이드 ("TAT-IB 펩타이드")의 L- 및 D-거울상체의 능력이 평가되었다. L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s), 및 D-TAT-IB1(s) 펩타이드[SEQ ID NOs: 5, 6, 9 및 12, 각각]는 플루오레세인에 결합된 글리신 잔기의 N-말단 추가에 의해 표지된다. 표지된 펩타이드(1 μM)는 실시예 3 내 설명된 것처럼 유지되는 TC-3 세포 배양물에 첨가된다. 예정된 시간에 세포는 형광 현미경 하에 실험되기 전에, PBS로 세척되고 얼음같이 차가운(ice-cold) 메탄올-에탄올(1:1) 내 5분 동안 고정된다. 플루오레세인-표지된 BSA (1 μM, 12 moles/mole BSA)는 대조군으로 사용되었다. 결과들은 모든 상기 플루오레세인 표지된 펩타이드가 배양 배지에 첨가되면 효과적이고 빠르게(5분 미만) 세포 내로 들어가는 것을 증명한다. 정반대로, 플루오레세인 표지된 소혈청알부민(bovine serum albumin) (1 μM BSA, 12 몰 플루오레세인/몰 BSA)은 세포로 들어가지 않았다.
시간 경과 연구는 L-거울상 펩타이드에 대한 형광 신호의 강도가 24시간 후 70%로 감소함을 가리킨다. 신호가 작거나 없음은 48시간에 존재하였다. 대조적으로, D-TAT 및 D-TAT-IB1(s)는 세포 내에서 극도로 안정하다.
이들 모든-D 레트로-인버소 펩타이드로부터 형광 신호는 1주 후에도 여전히 매우 강하며 상기 신호는 단지 처리 2주 후 점차 감소하였다.
실시예 5 : c- JUN , ATF2 및 Elk1 인산화의 인비트로 ( In vitro ) 억제
그들의 타겟 전사 인자의 JNK 매개 인산화에 펩타이드의 효과는 인비트로에서 조사되었다. 재조합 및 비 활성화된 JNK1, JNK2 및 JNK3는 전사 및 번역 토끼 망상적혈구 용해질 키트(TRANSCRIPTION AND TRANSLATION rabbit reticulocyte lysate kit) (Promega)를 사용하여 생산되었고, 기질로서, 단독 또는 글라타치온-S-트랜스퍼라제(GST)에 융합되어, c-Jun, ATF2 및 Elk1과 함께 고체상 키나아제 분석에 사용되었다. 투여 반응 연구가 수행되었고, 상기 L-TAT 또는 L-TAT-IB1(s) 펩타이드 (0-25 μM)는 20분 동안 반응 버퍼(20 mM Tris-아세테이트,1mM EGTA, 10 mM p-니트로페닐-포스페이트 (pNPP), 5 mM 소듐 피로포스페이트, 10 mM p-글리세로포스페이트,1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)) 내에 재조합 JNK1, JNK2, 또는 JNK3 키나아제와 혼합되었다.
카나아제 반응은 이후 10 mM MgCl2 및 5 pCi 33P--dATP 및 GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) 또는 GST-ELK1 (aa 307-428)의 1 μg의 첨가에 의해 시작되었다. GST-융합 단백질은 스트라타진(Stratagene) (La Jolla, CA)으로부터 구매하였다.
글루타치온-아가로스 비드(beads)의 10 μL는 또한 혼합물에 첨가되었다. 반응 생산물은 이후 변성 10 % 폴리아크릴아미드 겔에 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 겔은 건조되고 그 다음 X-레이 필름(코닥)에 노출되었다. JNKs에 의한 c-Jun, ATF2 및 Elk1 인산화의 거의 완전한 억제가 2.5 μM 만큼 낮은 TAT-IB(s) 펩타이드 투여량에서 관찰되었다. 그러나, 현저한 예외는 Elk1의 JNK3 인산화의 TAT-IB(s) 억제의 부재이다. 종합적으로, TAT-IB1(s) 펩타이드는 그들의 타겟 전사 인자의 JNK 패밀리 인산화를 억제함에 우수한 효과를 보였다. 재조합 JNK1, JNK2, 및 JNK3에 의해 GST-Jun (aa 1-73) 인산화를 억제하는 D-TAT, D-TAT-IB1(s) 및 L-TAT-IB1(s) 펩타이드 (0-250 μM 투여량 연구)의 능력은 상기 설명된 것과 같이 분석되었다. 종합적으로, D-TAT-IB1(s) 펩타이드는 c-Jun의 JNK-매개 인산화를, 그러나 L-TAT-IB1(s)에 비해 약 10-20배 덜 효율적인 수준에서 감소시켰다.
실시예 6: 활성화된 JNKs에 의한 c- JUN 인산화의 억제
스트레스성 자극에 의해 활성화된 JNKs에 본 발명에 정의된 L-TAT 또는 L-TAT-IB1(s) 펩타이드의 효과는 자외선 조사된 HeLa 세포 또는 IL-1 처리된 PTC 세포로부터 JNKs를 허물기 위해(to pull down) GST-Jun을 사용하여 평가되었다. PTC 세포는 상기 설명된 바와 같이 배양되었다. HeLa 세포는 10 % 태아 송아지 혈청(Fetal Calf Serum), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 100 units/ml 페니실린 및 2 mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 내 배양되었다. 세포 추출물 제조를 위해 사용되기 1시간 전에, PTC 세포는 상기 설명된 바와 같이 IL-1로 활성화된 반면, HeLa 세포는 UV-광(20 J/m2)에 의해 활성화되었다. 세포 추출물은 용해 버퍼(20 mM 트리스-아세테이트(Tris-acetate), 1 mM EGTA, 1% 트리톤(Triton) X-100, 10 mM p-니트로페닐-포스페이트, 5 mM 소듐 피로포스페이트, 10 mMP-글리세로포스페이트, 1 mM 디티오트레이톨) 내 세포 배양물을 긁어냄(scraping)으로써 대조군, UV-광 조사된 HeLa 세포 및 IL-1 처리된 TC-3 세포로부터 제조되었다. 잔해는 SS-34 베크만 회전자(Beckman rotor) 내 15,000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 제거되었다. 100 μg 추출물은 1 μg GST-jun (아미노산 1-89) 및 글루타치온-아가로스 비드(Sigma)의 10 μL로 1시간 동안 실온에서 배양되었다. 스크래핑 버퍼로 네번 세척 이후, 비드는 20분 동안 L-TAT 또는 L-TAT-IB1(s) 펩타이드 (25 μM)로 보충된 동일한 버퍼 내 재현탁되었다. 이후 카나아제 반응은 10 mM MgCl2 및 5 pCi 33P-감마-dATP의 첨가에 의해 시작되고 30°C에서 30분 동안 배양되었다.
반응 생산물은 이후 변성 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 겔은 건조되었고 이후에 X-레이 필름(코닥)에 노출되었다. TAT-IB(s) 펩타이드는 상기 실험들 내 활성화된 JNKs에 의한 c-Jun의 인산화를 효과적으로 방지하였다.
실시예 7: 본 발명에 정의된 TAT- IB (s) 펩타이드에 의한 c- JUN 인산화의 인비보 억제
본 발명에 정의된 세포-투과성 펩타이드가 인비보에서 JNK 시그널링을 막을 수 있는지 결정하기 위해, 이종(heterologous) GAL4 시스템을 사용하였다. 상기 설명된 것처럼 배양된 HeLa 세포는 GAL4 DNA- 결합 도메인에 연결된 c-Jun의 활성화 도메인(아미노산 1-89)을 포함하는 GAL-Jun 발현 구성(스트라타진(Stratagene))과 함께 5xGAL-LUC 리포터 벡터로 공동-형질주입(co-transfected)되었다. JNK의 활성화는 직접적 업스트림 키나아제 MKK4 및 MKK7를 발현하는 벡터의 공동 형질주입에 의해 수행되었다 (Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999) 참조). 간단하게, 3x105 세포는 제조자의 지시에 따라 DOTAP (베링거 만하임(Boehringer Mannheim))을 사용하여, 3.5-cm 접시 내 플라스미드와 함께 형질주입되었다. GAL-Jun을 포함하는 실험에 대하여, 20 ng의 플라스미드는 1 μg의 리포터 플라스미드 pFR-Luc (스타라타진) 및 0.5 μg 의 MKK4 또는 MKK7 발현 플라스미드와 함께 형질주입되었다. 형줄주입 3시간 이후, 세포 배지는 변화되었고 TAT 및 TAT-IB1(s) 펩타이드 (1 μM)가 추가되었다. 루시퍼라제 활성은 단백질 함량에 표준화 이후 프로메가(Promega)로부터 "듀얼 리포터 시스템(Dual Reporter System)"을 사용하여 16시간 이후 측정되었다. TAT-IB1(s) 펩타이드의 추가는 MKK4 및 MKK7 매개된 JNK의 활성화에 따라 c-Jun의 활성화를 억제하였다. HeLa 세포가 JNK1 및 JNK2 동형(isoforms)을 발현하고 JNK3는 발현하지 않기 때문에, JNK3와 함께 세포를 형질주입하였다. 다시, TAT-IB(s) 펩타이드는 c-Jun의 JNK2 매개된 활성화를 억제하였다.
실시예 8: 모든-D 레트로 - 인버스 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 합성
본 발명의 펩타이드는 자연적 단백질 분해를 방지하는데 역으로 합성된 모든-D 아미노산 펩타이드(즉 모든 D-레트로-인버소 펩타이드)일 수 있다. 본 발명의 모든-D 레트로-인버스 펩타이드는 천연 펩타이드와 유사한 기능적 특징을 갖는 펩타이드를 제공할 수 있으며, 상기 구성요소 아미노산의 사이드 그룹(side groups)은 천연 펩타이드 정렬에 상응할 수 있으나, 단백질분해효소 저항성 백본을 보유한다.
본 발명의 레트로-인버소 펩타이드는 펩타이드 체인 내 아미노산을 부착함에 의해 D-아미노산을 사용하여 합성된 유사체(analogs)이며, 레트로-인버소 펩타이드 유사체 내 아미노산의 서열은 모델로 제공된 선택된 펩타이드 내의 정확하게 반대이다. 설명을 위해, 만약 자연 발생 TAT 단백질 (L-아미노산의 형태)이 서열 GRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 5]을 가진다면, 이 펩타이드의 레트로-인버소 펩타이드 유사체 (D-아모나신의 형태)는 서열 RRRQRRKKRG [SEQ ID NO: 6]을 가질 것이다. 레트로-인버소 펩타이드를 형성하는 D-아미노산의 체인을 합성하기 위한 절차는 기술분야에 알려져 있따 (예를 들어 Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996) 참조). 구체적으로, SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 11-12, 18, 20, 22 및 25-26에 따르는 레트로-펩타이드는 전통적 F-mock 합성에 의해 생산되고 추가적으로 질량 분석기에 의해 분석된다. 그들은 최종적으로 HPLC에 의해 정제된다.
네이티브(native) 펩타이드와 함께 고유의 문제는 자연적인 단백질분해효소 및 고유의 면역원성에 의한 분해이기 때문에, 본 발명의 이형이가(heterobivalent) 또는 이형다가(heteromultivalent) 화합물은 원하는 펩타이드의 "레트로-인버소 동형체(retro-inverso isomer)"를 포함하여 제조될 수 있다. 자연적 단백질 분해로부터 펩타이드를 보호함은 따라서 펩타이드를 활동적으로 파괴하는 목적의 면역 반응의 반감기를 연장시키고 규모를 감소킴으로써, 특정한 이형이가 또는 이형다가 화합물의 효율성을 증가시킨다.
실시예 9: 모든-D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 장기 생물학적 활성
장기 생물학적 활성은 실시예 5에서 나타난 바와 같이, 천연(native) 단백질분해효소에 의한 분해로부터 D-TAT-IB(s) 펩타이드의 보호 때문에 천연(native) L-아미노산 유사체에 비교할 때, 펩타이드 이형접합(heteroconjugate)을 포함하는 D-TAT-IB(s) 레트로-인버소 (상기 키메라 서열 참조)로 예상된다.
IL-1의 억제 유도된 D-TAT-IB1(s) 펩타이드에 의한 췌장 베타-세포 사멸이 분석되었다. TC-3 세포는 지시된 펩타이드 (1, μM)의 하나의 단일 첨가와 함께 30분 동안 상기 설명된 것처럼 배양된 후, IL-1(10 ng/ml)이 첨가되었다.
세포자멸 세포는 요오드화 프로피디움(Propidium Iodide) 및 Hoechst 33342 핵 염색의 사용에 의해 IL-1과 함께 배양 2일 이후 세어졌다. 최대 1,000 세포는 각 실험을 위해 세어졌다. 평균 (SEM)의 표준 오차는 표시되었다, n=5. D-TAT-IB1 펩타이드는 L-TAT-IB 펩타이드와 유사한 정도로 IL-1 유도된 세포자멸을 감소시켰다.
D-TAT-IB1 펩타이드에 의해 IL-1P 유도된 세포 사멸의 장기 억제는 또한 분석되었다. TC-3 세포는 지시된 펩타이드(1 μM)의 하나의 단일 첨가로 30분 동안 상기와 같이 배양된 후, IL-1 (10 ng/ml)이 첨가되고, 이틀마다 사이토카인을 첨가하였다. 세포자멸 세포는 이후 요오드화 프로피디움 및 Hoechst 33342 핵 염색을 통한 IL-1의 배양 15일 이후 세어졌다. TAT-IB1 펩타이드의 하나의 단일 첨가는 장기간 보호를 부여하지 않음을 주의한다. 최소 1.000 세포가 각 실험에 대해 세어졌다. 결과적으로, L-TAT-IB1(s)가 아닌 D-TAT-IB1(s)는 장기(15일) 보호를 부여할 수 있었다.
실시예 10: 본 발명에 따라 사용된 L-TAT-IB1(s) 펩타이드에 의한 JNK 전사 인자의 억제
겔지연분석(Gel retardation assays)이 AP-1 이중 표지된 프로브 (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (SEQ ID NO: 101)와 함께 수행되었다. 상기 지시된 것처럼, 처리되거나 5 ng/mlTNF-α로 1시간 동안이 아닌 HeLa 세포 핵 추출물. 본 발명에 따라 사용된 TAT 및 L-TAT-IB1(s) 펩타이드는 TNF-알파 30분 전에 추가되었다. 특정한 AP-1 DNA 복합체로 겔의 일부만이(비-표지된 특이적 및 비-특이적 경쟁자로 경쟁 실험을 통해 설명된 것처럼) 나타났다.
본 발명에 사용된 L-TAT-IB1(s) 펩타이드는 TNF-알파의 존재 내 AP-1 DNA 결합 복합체의 형성을 감소시켰다.
실시예 11: 올인원 우수 접근 방법(all-in one well approach)을 사용한 HepG2 세포 내 내생(endogenous) JNK 활성의 억제 (도 3 참조).
HepG2 세포는 실험 전날 3'000 세포/웰에 시드되었다(seeded). 이후, 인터루킨-1[IL-1betan)] 또는 종양 괴사 인자 [TNFalpha] (a)의 증가하는 농도가 30분 동안 JNK 활성화를 위해 첨가되었다. 세포는 20mM Hepes, 0.5% Tween pH 7.4에 용해되고 알파스크린(AlphaScreen) JNK에 가공되었다. (b) 10 ng/ml IL-1에 의해 유도되고, 384 웰/플레이트에서 측정된 (n=96) JNK 활성화를 위한 Z'. (c) 화학적 JNK 억제자[스타우로스포린(staurosporin) 및 SP600125]와 함께 내생 IL-1 베타 유도된 JNK 활성의 억제. (d) IL-1 의존적 JNK 활성에 SEQ ID NO: 9에 따르는 펩타이드 억제자 L-TAT-IB1(s)[본 발명에 L-JNKi (n)로 축약됨) 및 SEQ ID NO: 11에 따르는 D-TAT-IB1(s) (본 발명에 D-JNKi로 축약됨) 및 JBDs (TAT 서열이 없는 L-JNKI에 상응)]의 효과. 모든 패널은 세가지 독립 실험 (n=3)의 대표이다.
방법: 알파스크린(AlphaScreen) 키나아제 분석
원리(Principle): 알파스크린은 마이크로플레이트(microplate) 형식 내 생체 분자 상호작용을 연구하는데 사용되는 비-방사선 비드-기초의 기술이다. 두문자 ALPHA는 증폭된 발광 근접 상동 분석(Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay)을 의미한다. 이는 가깝게 근접한 "공여자(donor)" 및 "수용자(acceptor)" 비드를 가져오는 생물학적 상호작용을 포함하고, 이후 화학적 반응의 캐스케이드(cascade)는 증폭된 신호를 생산하기 위해 활동한다. 680 nm에서 레이저 여기에 따라, "공여자" 비드 내 감광제(프탈로시아닌)는 주변산소(ambient oxygen)를 여기된 단일항(singlet) 상태로 변환시킨다. 이의 4 μsec 반감기 내, 단일항 산소 분자는 용액 내 약 200 nm로 분산될 수 있으며, 만약 수용체 비드가 그 근처에 있다면, 단일항 산소는 "수용체" 비드 내 티옥센(thioxene) 유도체와 반응하여, 370 nm에서 화학 발광(chemiluminescence)을 발생시킨며, 나아가 동일한 "수용체" 비드 내 포함된 형광단(fluorophores)을 활성화시킨다. 여기된 형광단은 나중에 520-620 nm에서 빛을 방출한다. 수용체 비드가 없을 경우, 단일항 산소는 바닥 상태로 떨어지며 신호가 발생하지 않는다.
키나아제 시약(B-GST-cJun, 안티 P-cJun 항체 및 활성 JNK3)는 우선 키나아제 버퍼(20 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μM Na3VO4, 0.01% Tween-20)에 희석되고 웰에 첨가되었다(15 μl). 반응은 이후 23°C에서 1시간 동안 ATP의 10 μM의 존재 하에 배양되었다. 검출은 검출 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM NaCl, 80 mM EDTA, 0.3% BSA) 내 희석된, 비드 혼합물 (단백질 A 수용체 20 μg/ml 및 스트렙타비딘 공여체 20 μg/ml)의 10 μl의 첨가에 의해 수행된 후, 어둠 속 23°C에서 다른 1시간 배양하였다. JNK 내생 활성의 측정을 위해, 키나아제 분석은 JNK3가 세포 용해물(lysates)에 의해 교체되고 반응 키나아제 구성요소가 세포 용해 이후 첨가된 것을 제외하고, 상기 설명된 것처럼 수행되었다. B-GST-cjun 및 P-cJun 항체는 동일한 농도로 사용된 반면, ATP는 10 μM 대신에 50 μM로 사용되었다. 알파스크린 신호는 Fusion 또는 En　Vision 기구에서 직접적으로 분석되었다.
실시예 12: 바이러스 감염- 수두대상포진바이러스 ( varicella - zoster virus, VZV )의 치료에 모든-D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 활성의 결정
본 발명에 따라 사용된 IB(s) 펩타이드 및 모든-D 레트로-인버소 IB(s) 펩타이드의 활성의 결정은 배양된 숙주 세포 (인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts, HFFs)) 내 실험 화합물로 JNK 억제자 펩타이드 XG-102 (SEQ ID NO: 11)를 사용하여 실험되었다. 바이러스들은 그들의 생활사를 완성하기 위해 기능적인 세포 환경을 필요로하는 불가피한 세포내 기생체이다; 죽어가는 세포는 바이러스 복제를 지원하지 않는다. 추가적으로, 세포 기능의 억제자는 비 특이적으로 바이러스 성장을 억제할 수 있는, 세포에 독성일 수 있다. 따라서, 병들거나 죽어가는 숙주 세포는 비특이적으로 감소된 바이러스 역가를 보인다. 이는 결과를 변조할 수 있기 때문에, 세포독성 분석은 우선, 실험 화합물에 배양된 세포의 내성을 결정하여 수행된다. 그 다음, 플라크 감소 분석이 수행되었고 이후 JNK 억제자 펩타이드 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성이 감염된 세포 내 수두대상포진바이러스(Viral Zoster Virus, VZV)에 관하여 실험되었다.
A) 모든-D 레트로 - 인버스 IB (s) 펩타이드의 세포독성의 결정:
세포독성의 결정을 위해, 배양된 세포(인간 포피 섬유아세포 (HFFs))는 96-웰 조직 배양 플레이트에 시드되었다. DMSO (5 μM XG-102 (SEQ ID NO: 11)와 같은 수준), 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11)를 포함하는 배지는 24시간 동안 (1, 2, 및 5 μM)의 몇몇 농도에 첨가되었다. 그 다음, 중간 적색 분석(Neutral Red assay)이 수행되었다. 세포독성 분석(6개 복제(replicates)의 셋트 내)을 위한 중간 적색 비색(colorimetric) 분석은 그 다음 효율성 분석을 위해 최대 투여량으로 설정되어 사용되었다 (Taylor et al, 2004, J. Virology, 78:2853-2862에서 수행된 것과 같음). 살아있는 세포는 중간 적색을 흡수하며, 그에 따라, 흡수의 수준은 세포 생존력 및 수의 정량적인 측정이다. 중간 적색 흡수는 세포의 수에 직접적인 비율이며, 또한 일반 세포내섭취(endocytosis)를 반영한다. 따라서, 중간 적색의 짧은 펄스(brief pulse)가 0 또는 24시간에 배지에 첨가되었다. 고정화 및 추출 이후, 염료가 첨가되었고 각 샘플 내 염료의 양은 540nm에서 ELISA 플레이트 리더 내 측정되었다 (도 4 참조). 세포 독성은 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 어느 양에서도 관찰되지 않았으며, 세포 성장은 DMSO 희석물 단독 (대조군)에 비해 제한되지 않았다. 따라서, 1 μM의 표준 농도는 HFF 세포에 분명한 효과를 갖지 않았으며, 높은 투여량 또한 잘 용인되었다(tolerated).
B) 수두대상포진바이러스(VZV)에 대한 XG -102 ( SEQ ID NO: 11)의 항바이러스 효과를 측정하기 위한 플라크 감소 분석
XG-102 (SEQ ID NO: 11)이 투여량 의존적인 항바이러스 효과를 갖는지 결정하기 위해, 표준 1 μM 투여량 주변의 농도의 범위가 실험되었다. 본 플라크 감소 분석에서, 24-웰 플레이트 내 융합된(confluent) 인간 포피 섬유아세포 (HFFs)는 1:100의 비율(감염 MOI=0.01의 다수)에서 VZV-감염된 HFFs로 접종되고 2시간 동안 세포에 흡수되었다. 초과 바이러스는 세척되고, 0 (DMSO 단독), 0.5, 1, 또는 2 μM XG-102 (SEQ ID NO: 11)를 포함하는 배지가 첨가되었다. 하나의 샘플은 감염의 초기 수준을 측정하기 위해 본 시간에 수득되었다; 상기 각 웰은 ~150 pfu를 포함하였다. 24시간 이후, 복제 웰들은 트립신화(trypsinized)되고, 각 샘플 내 VZV-감염된 세포의 수를 결정하기 위해 그 다음 세포 현탁액은 삼배체(triplicate) 내 MeWo 세포 단일층에 역가되었다(titered). 비제한적 성장 동안, VZV는 세포-세포 확산에 의해 번식하기 때문에, 1일 동안 보통 10배 증가한다. 이는 DMSO 단독으로 처리된 배양물에 관찰된 것이며, 1200 ± 430 pfu를 생산하였다 (도 5). 상기 결정의 결과는 하기와 같다:
XG -102 ( SEQ ID NO: 11) VZV의 확산 ( pfu ) ± SD
0 μM (DMSO) 1233 ± 432
0.5 μM 260 ± 53
1.0 μM 212 ± 48
2.0 μM 312 ± 79
따라서 XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 VZV가 거의 200-300 pfu 생산과 함께, 모든 실험된 농도에서 강한 항바이러스 효과를 가진다. EC50에 더하여 이들 결과의 그래프를 사용하여, 약 0.3 μM XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 VZV 생산을 50%로 감소시키는 것으로 계산되었다.
세포독성 및 효율성 데이터로부터, 5.0 μM / 0.3 μM의 예비 선별 지수(Selective Index) (Tox/EC50)가 계산되었으며, 이는 ~17의 값을 주고, XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 농도가 세포의 50%를 죽일 수 있는 것에 아직 근접하지 못하였기 때문에, 상기 트루(true) SI는 더 높게 고려되었다.
C) XG -102 ( SEQ ID NO: 11)로 인간 포피 섬유아세포 ( HFFs ) 내 수두대상포진바이러스 (VZV) 복제의 측정
XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 인간 포피 섬유아세포(HFFs) 내 수두대상포진바이러스(VZV) 복제를 방지하는 XG-102의 최소 유효 투여량을 결정하기 위해, HFFs의 융합(confluent) 단일층은 2시간 동안 VZV-BAC-Luc 균주로 접종되었고, 이후 0.25, 0.5, or 1.0 μM의 농도 내 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 또는 음성 대조군(XG-100, 1.0 μM)으로 24시간 동안 처리되었다. 바이러스 생산은 루사퍼라제 분석에 의해 측정되었다. 샘플은 삼배체이며 평균 발광이 나타났다; 에러 바(error bars)는 평균의 표준 편차를 나타낸다.
결과적으로, VZV 복제는 음성 대조군(Tat 펩타이드 단독)의 존재 하에 일반적이다. XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 실험된 가장 낮은 농도, 0.25 μM에서 VZV 복제를 방지하였다. 최소 유효 투여량은 본 실험에서 결정될 수 없다. VZV가 감염 동안 JNK 활성에 왜 의존하는지 아직까지 알려져 있지 않는 동안, 이 효소에 대한 중대한 필요성으로 나타났다. XG-102 (SEQ ID NO: 11) 의 낮은 농도(0.25 μM)는 따라서 배양물 내 VZV 확산을 완전히 억제하는데 충분하다. 본 효과에 대한 한가지 가능한 설명은 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 이러한 양이 감염된 세포 내 모든 JNK 분자에 결합하는 것이다. 그렇지 않으면, 0.25 μM XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 VZV 복제에 최적인 역치(threshold) 밑으로 JNK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 실험의 결과들은 도 6에 요약되었다.
실시예 13: 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD )의 치료에 모든-D 레트로 - 인버스 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 활성 결정
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료에 실시예(exemplary) 모든-D 레트로-인버소 IB(s) 펩타이드 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성을 결정하기 위해, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 블레오마이신 유도된 급성 폐 염증 및 섬유증의 동물 모델에서 사용되었다. 블레오마이신 유도된 염증 및 섬유증의 프로토콜(protocol )은 문헌에서 종전에 설명되었다. 본 실험의 목적은 블레오마이신 유도된 염증 및 섬유증 내 기관지 폐포 세척(broncho alveolar lavage, BAL) 및 폐 내 호중구 보충(neutrophil recruitment)에 피하(s.c.) 경로에 의해 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 효과를 조사하는 것이다:
- 단일 블레오마이신 투여 1일 후 (10 mg/kg)
- 및 섬유증의 발달 10일에
1) 방법 및 실험적 접근(Method and experimental approach)
두가지 투여량에 실험 화합물 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 및 비히클 대조군은 블레오마이신의 단일 비강내 투여와 함께 s.c.로 주어졌고, 쥐들은 1일 및 10일 후 분석되었다. 모델로 사용된 동물들은 10 C57BL/그룹당 6마리 쥐(mice) (8 주령)이다. 실험 그룹들은 비히클, 0.001 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 및 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11)를 포함하며, 처리는 블레오마이신 투여 전 이후 삼일 마다, XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 반복된 피하 투여로 이루어진다. 24시간에 급성 폐 염증은 BAL 세척, 세포학, 세포 수, 및 폐 미엘로퍼옥시다아제 활성에 의해 감시되었다. 화합물의 효과는 비히클 대조군과 비교되었다. 폐 섬유증은 블로아미이신 단일 투여 10일 이후에 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 사용하여 조직학적으로 측정되었다.
1.1) 블레오마이신 투여
벨론 연구소(Bellon Laboratories) (Montrouge, France)로부터 식염수 내 블레오마이신 설페이트 (10 mg/kg 체중)은 광 케타민-실라신 마취(ketamine-xylasine anesthesia) 하에 40 μL의 부피 내 비강 주입에 의해 기도를 통해 주어졌다. 블레오마이신 유도된 염증 및 섬유증 모두에 블레오마이신 투여를 위한 그룹은 하기를 포함한다: 비히클, 0.001 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 및 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11). 블레오마이신 유도된 염증을 위한 경로는 피하 (s.c.) 경로, 및 단일 투여로 발생된 투여이다. 블레오마이신 유도된 섬유증을 위한 경로는 피하 (s.c.) 경로이며, 투여는 10일에 3회 발생하였다.
1.2) 기관지 폐포 세척액( Bronchoalveolar lavage fluid, BALF )
기도(trachea)의 절개 이후, 플라스틱 캐뉼라(cannula)가 삽입되었고, 기도는 PBS 용액 0.3 ml를 사용하여 세척되고 37°C로 가열되었다. 수집된 샘플은 2 분획으로 발송되었다(dispatched): 첫번째 것 (2 첫번째 세척에 상응하는 1ml)는 중재자(mediator) 측정에, 두번째 것은 세포 결정을 위해 (4ml) 사용되었다. 첫번째 분획은 원심분리 (10분 동안 600g)되었고 상청액은 분획되고 중재자 결정까지 -80°C에서 보관되었다. 세포 펠렛은 이후 0.4 ml 멸균 NaCl, 0,9%, 및 두번째 분획으로 모아진 것 내 재현탁되었고 세포 카운트를 위해 사용되었다.
1.3) 폐 균질화 (Lung homogenization)
BAL 이후 전체 폐는 제거되고 PBS의 1 ml로 마이크로튜브 (Lysing matrix D, Q Bio Gene, Illkrich, France) 내에 위치하였고, 총 폐 조직 추출물은 Fastprep® system (FP120, Q Bio Gene, Illkrich, France)을 사용하여 제조되었고, 상기 추출물은 이후 원심분리되고 중재자 측정 및 Sircol Collagen Assay (France Biochem Division, France)로 콜라겐 분석 전에 상청액은 -80°C에서 저장되었다.
1.4) 세포 수(count) 및 결정
총 세포 수는 마라세즈 혈구계산기(Malassez hemocytometer)를 사용하여 BAL 유체 내에 결정되었다. 차등(differential) 세포 수는 MGG Diff-quick (Dade Behring AG)로 염색 이후 시토스핀(cytospin) 제조 (Cytospin 3, Thermo Shandon) 상에 수행되었다. 차등 세포 수는 표준 형태학적 기준을 사용하여 200개 세포에 만들어졌다.
1.5) TNF 측정
BALF 내 TNF 수준은 제조자의 지시에 따라 ELISA 분석 키트 (Mouse DuoSet, R&D system, Minneapolis, USA)를 사용하여 결정되었다. 결과들은 pg/ml로 보고되었다.
1.6) MPO -측정
MPO-수준은 XG-102의 투여에 따라 측정되었다. MPO는 본 실험에 블레오마이신 이후 현저하게 유도되지 않았다. 게다가 XG-102는 폐 내 MPO 수준에 효과가 없었다.
1.7) 조직학(Histology)
BAL 및 폐 관류(perfusion) 이후, 라지 로브(large lobe)는 표준 현미경 분석을 위해 4% 버퍼 포름알데하이드 내 고정되었다. 3- m 구획은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색되었다.
2.) 결과
A) 첫번째 연구: 블레오마이신 ( BLM ) 유도된 급성 폐 염증
그룹: 비히클, XG-102 (SEQ ID NO: 11) 0.001 mg/kg 및 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 0.1 mg/kg
경로: s.c. 경로, 단일 투여랑
a) 기관지 세척 공간 ( bronchoalveolar lavage space) 내 세포 보충(recruitment)
0.1 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 호중구 보충 및 염증 단계 동안 보충된 총 세포의 수를 현저하게 감소시킨다. 0.001 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 호중구 보충 또는 기관지 폐포 공간 내 다른 세포 타입에 효과가 없었다 (그룹당 n= 5마리 쥐로 하나의 대표적 실험; *, p < 0.05; **, p < 0.001)
b) 폐 균질화에 MPO를 사용하여 폐 내 세포 보충
미엘로퍼옥시다제 (MPO)는 숙주 방어 시스템에 중요한 역할을 수행한다. 53kDa의 두 중사슬 및 15kDa의 두 경사슬로 이루어진 이러한 140 kDa 단백질은 1960년대에 처음 발견되었다. 백혈구의 활성화에 반응하여 호중구의 과립 및 단핵구로부터 MPO의 방출은 과산화수소 및 염소 이온을 차아염소산(HOCl), 강산화제로 변환시킨다. 비록 MPO가 방어 시스템에 중요한 목적을 제공하더라도, 다양한 연구는 MPO 또한 몇몇 염증성 상태에 중요한 역할을 수행함을 보여주며, 상기 증가된 MPO 수준은 예를 들어 관상 동맥 질병에 관련된다. 게다가, 조직 MPO 수준은 호중구의 활성화의 상태를 반영하며 호중구 조직 침입(infiltration)에 지표를 제공한다.
본 실험에서, MPO는 블레오마이신 투여 이후 현저하게 유도되었다. 따라서 XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 폐 내 MPO 수준에 효과가 없었다 (도 7 참조).
c) TNF 측정
TNF 수준을 측정할 때, TNF 수준이 BLM 투여 이후 매우 낮음에도 불구하고, XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 투여 이후 BALF 내 TNF 수준의 감소 경향이 관찰되었다 (도 8 참조).
d) 결론
0.1 mg/kg에서 관찰될 수 있으며, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 기관지 폐포 공간 내로 호중구 및 총 세포 보충을 감소시키며 TNF 수준을 감소시키는 경향을 유도한다. 게다가, 조직학적 슬라이드의 연구는 기관지 주변 공간 내 염증성 세포 축적의 감소를 보였다. 이는 따라서 XG-102 (SEQ ID NO: 11)가 블레오마이신 유도된 염증을 감소시키는 것으로 결론지어질 수 있다.
얻어진 결과들에 따르면, 본 실험은 섬유증 모델에 추가적으로 수행되었다.
B) 두번째 연구: 블레오마이신 ( BLM ) 유도된 폐 섬유증
그룹: 비히클, XG-102 (SEQ ID NO: 11) 0.001 mg/kg 및 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 0.1 mg/kg
경로: s.c. 경로, 10일에 3회
a) 기관지 폐포 세척 공간( bronchoalveolar lavage space) 내 세포 보충
0.001 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 림프구 보충 및 림프구 보충에 의한 시점에 특화된 면역 단계 동안 보충된 총 세포의 수를 현저하게 감소시켰다.
0.1 mg/kg에서, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 효과가 없음 (그룹 당 n= 5마리 쥐(mice); *, p < 0.05; **, p < 0.001) (도 9 참조).
a) 조직학
폐의 3 μm 구획은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다. 염증 세포 축적, 섬유증 부위, 폐 조직(architecture)의 손실이 BLM 투여 10일 이후 관찰되었다. 이들 파라미터의 감소는 낮은 투여량 (0.001 mg/kg)에서 XG-102의 투여 이후 관찰되었으나, 높은 투여량 (0.1 mg/kg)에서는 관찰되지 않았다 (도 10 참조).
b) 결론:
이는 0,001 mg/kg의 낮은 투여량으로 3회 투여된 XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 블레오마이신 유도된 이후 염증, 특히 본 시점에 관찰된 림프구 보충을 감소시키는 것으로 결론지어질 수 있다. 게다가, 이러한 투여량으로 3회 투여된 실험 물질은 블레오마이신 유도된 섬유증을 약화시켰다. 보다 보존된 폐 구조를 갖는 덜 확장된 섬유증 부위가 관찰될 수 있다.
실시예 14: 알츠하이머병의 치료에 모든-D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 활성 결정
알츠하이머병에 실시예 모든-D 레트로-인버소 IB(s) 펩타이드 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 활성을 결정하기 위해, XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 행동학적(behavioral) 모리스 수중미로 실험(Morris Water Maze test)뿐만 아니라 플라크 로드(load)를 측정하는 면역조직학적 실험 및 쥐의 뇌 내 β-amyloid1 -40 및 β-amyloid1-42 수준을 측정하는 ELISA 실험을 사용하여, 런던 및 스웨디쉬 변이(London and Swedish mutations)와 함께 APP751을 과발현하는 hAPP-형질전환 쥐 모델에서 평가되었다.
a) 방법
i) 도입
본 연구는 5개월(± 2주)령 암컷 hAPP Tg 쥐를 사용하여, 행동에 관하여 실험 물질(XG-102, SEQ ID NO: 11), 생화학적 및 면역학적 마커의 효율을 평가하기 위해 설계되었다. 따라서, 쥐들은 4개월까지 매 2 또는 3주 마다 처리되었으며, 처리 기간의 끝에 행동은 모리스 수중미로에서 평가되었다. 희생 뇌에서, CSF 및 혈액을 채취하였다. Aβ40 및 Aβ42 수준은 네가지 다른 뇌 균질 분획뿐만 아니라 Tg 쥐의 CSF 내에서 결정되었다. 플라크 로드는 처리군 마다 8마리 Tg 동물의 피질 및 해마에서 정량되었다.
ii) 동물
C57BL/6xDBA 백그라운드 및 5개월(± 2주)령의 암컷 Tg 쥐는 1 내지 3개 처리군으로 (n=12) 무작위로 정렬되었다. 동물들은 5개월령부터 시작하여 두가지 다른 농도로 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 투여를 받았으며 매 2 또는 3주 마다 피하(s.c.) 적용(applications)로 4개월까지 지속되었다. 본 연구를 위해 사용된 모든 동물은 어두운 눈을 가졌으며, MWM 풀(pool) 바깥에 랜드마크(landmarks)를 인식하는 것으로 나타났다. 그러나, 본 연구에 포함된 예비물(reserves)을 포함하는 모든 동물에 대하여 처리 시작 전에, 가시적인 플랫폼 훈련, 소위 사전 테스트에서 통제된, 동물의 능력이 부족해 보이는 것은 제외되었다. 특정 동물에 대한 핸디캡으로 보이는 것이 단정(affirmed)되는 경우에, 상기 쥐는 본 연구에서 제외되었다.
iii) 동물 식별 및 수용(Housing)
쥐들은 귀 표식(ear markings)에 의해 개별적으로 식별되었다. 그들은 Rettenmaier®에 의해 공급된 표준화된 설치류 베딩(bedding)에 개별 환지 케이지(individual ventilated cage, IVCs) 내 수용되었다. 각 케이지는 최대 다섯마리 쥐를 포함하였다. 쥐들은 국제적 표준에 기초하여 작성된 JSW 표준 운영 절차(JSW Standard Operating Procedures) (SOP GEN011)에 따라 보관되었다. 각 케이지는 연구 수, 성별, 동물의 개인 등록 번호, 생일뿐만 아니라 스크리닝 일자 및 처리군 할당을 가리키는 컬러 카드에 의해 식별된다. 연구 동안 온도는 약 24°C에서 유지되고 상대 습도는 약 40-70%에서 유지되었다. 동물들은 일정한 광주기 (12시간 광/암) 하에 수용되었다. 일반 수돗물은 동물에 임시로(ad libitum) 사용가능 하였다.
iv) 처리
40마리 암컷 hAPP 형질전환 쥐는 두가지 다른 투여량으로 실험 물질 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 0.1 mg/kg b.w./매2주 또는 10 mg/kg b.w./매3주로 처리되거나 (n=12/그룹), 4개월 동안 매 3주 마다 비히클 (n=12) s.c.로 처리되었다.
v) 모리스 수중 미로(Morris Water Maze, MWM )
모리스 수중 미로 (MWM) 과제는 100 cm의 직경의 검은 원형 풀(pool)에서 수행되었다. 수돗물은 22±1°C의 온도로 채워졌고 풀은 네가지 구획으로 사실상 나누어졌다. 투명한 플랫폼 (8 cm 직경)을 물 표면 약 0.5 cm 아래에 놓았다. 전체 실험 기간 동안, 사전 테스트를 제외하고, 플랫폼은 풀의 남서 사분면에 위치하였다. 4일간 지속된 트레이닝 기간 하루 전에 동물들은 소위 "사전 테스트" (두번의 60초 지속 실험)를 수행하였다. 본 과제를 수행한 동물만이 MWM 실험에 포함되었다. MWM 과제에서 각 쥐는 연속 4일 동안 세번의 시험을 수행하였다. 단일 시험은 최대 1분의 최대로 지속되었다. 이러한 시간 동안, 쥐들은 감추어진, 투명한 목표를 찾는 기회를 가졌다. 만약 동물이 물의 바깥으로 "길"을 찾지 못한다면, 조사다는 플랫폼 상으로 상기 쥐를 안내하거나 놓았다. 각 실험 이후 쥐들은 10-15초 동안 플랫폼 상에 휴식을 취하도록 두었다. 이 시간 동안, 쥐는 주변에 배향하는(to orientate) 가능성을 가졌다. 조사는 부정적인 영향으로부터 추적 시스템을 방지하기 위해, 흐린 조명 조건 하에 수행되었다 (Kaminski; PCS, Biomedical Research Systems). 풀 주변의 벽에, 검은색 포스터, 굵은 기하학적 상징(geometric symbols) (예를 들어 원 및 사각형)은 쥐가 그들의 배향성에 대한 랜드마크로써 상징을 사용할 수 있도록 고정되었다. 실험 당 하나의 수영 그룹은 다섯 내지 여섯마리 쥐로 구성되었고, 약 5 내지 10분의 실험 간 시간이 보장되었다. 탈출 대기(latency) (시간 [두번째] - 쥐가 숨겨진 플랫폼을 찾는데 필요하며 그에 따라 물로부터 탈출하기 위한)의, 경로(타겟에 도달하기 위한 궤도(trajectory) [미터]의 길이)의, 및 목표 사분면에서 지속(abidance)의 정량을 위해, 컴퓨터화된 추적 시스템이 사용되었다. 컴퓨터는 풀의 중앙에 위치한 카메라에 연결되었다. 카메라는 쥐 고리에 작은 머리핀으로 고정된, 발광 다이오드 (LED)의 신호를 검출하였다. 4일째 마지막 실험의 1시간 이후 쥐들은 소위 검사 시험(probe trial)을 수행하였다. 이 때, 플랫폼은 풀로부터 제거되고 1분 검사 시험 동안; 실험자는 전 목표 위치 위에 교차의 수를 세었다. 추가적으로 본 사분면 내 지속(abidance)뿐만 아니라 세가지 다른 사분면이 계산되었다. 본 실험을 통해 쥐는 플랫폼으로부터 어떠한 성질의(howsoever-natured) 단서도 갖지 못하였다.
vi) 조직 추출(Sampling)
처리 기간의 마지막에, 및 이후 모든 행동학적 실험, 모든 남아있는 쥐(n=28)는 희생되었다. 따라서, 모든 쥐는 SOP MET030에서 설명된 표준 흡입 마취(standard inhalation anesthesia) (Isofluran, Baxter)를 통해 진정되었다. 뇌척수액(Cerebrospinal fluid, CSF)은 둔적박리(blunt dissection) 및 대후두공(foramen magnum)의 노출을 통해 채집되었다. 노출에 따라, 파스퇴르피펫은 대후두공(foramen magnum) 내 약 0.3-1 mm의 깊이로 삽입되었다. CSF는 플로우(flow)가 완전 중단될 때까지 흡입(suctioning) 및 모세관 작용에 의해 수집되었다. 각 샘플의 두 부분표본(aliquots)은 즉시 동결되었고 ELISA 기술로 추가적인 분석을 위해 준비될 때까지 -80°C에서 보관되었다. CSF 추출 이후, 각 쥐는 등 기댐(dorsal recumbence)에 놓았고, 흉곽(thorax)을 열고 1 cc 주사기에 결합된 26-게이지 바늘을 우심실 챔버(right cardiac ventricular chamber)에 삽입하였다. 라이트 흡입(Light suction)이 바늘에 적용되었고 혈액은 EDTA에 수집되고, 그에 따라 혈장을 수집하기 위해 사용되었다. 혈장을 얻기 위해, 각 쥐로부터 혈액 샘플은 스윙 버킷(swing buckets) (GH - 3.8 Beckman)과 함께 로터(rotor)를 사용하여 원심분리기(GS - 6R Beckman) 내 10분 동안 1,750 rpm (700g)에서 회전되었다. 혈장은 냉동되었고 추가적인 분석까지 -20°C에서 저장되었다. 혈액 수집 이후, 형질전환 쥐는 0.9% 소듐 클로라이드로 심장내 관류되었다. 뇌는 빠르게 제거되고 소뇌(cerebellum)는 절단되었다. 모든 쥐의 우반구(right hemispheres)는 실온에서 1시간 동안 새로 생산된 4% 파라포름알데하이드/PBS (pH 7.4) 내 침수 고정되었다. 그 후에 뇌는 동결방지(cryoprotection)를 위해 24시간 동안 15% 수크로스 PBS 용액으로 전송되었다. 그 다음날 뇌는 이소펜탄 내 동결되었고 조직학적 조사(SOP MET042)를 위해 사용될 때까지 -80°C에서 저장되었다. 좌반구는 생화학적 분석을 위해 칭량되고 액체 질소 내 냉동되고 -80°C에서 저장되었다.
vii) Aβ 1 -40 및 Aβ 1 -42 의 결정
각 Tg 쥐의 네가지 다른 뇌 균질 분획(homogenate fractions)뿐만 아니라 CSF 샘플 내 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준은 ELISA 기술로 평가되었다. 매우 민감한 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 ELISA 테스트 키트를 The Genetics Company™, Switzerland (SOP MET058)로부터 구매하였다. CSF는 상기 설명된 것처럼 준비되었다. 뇌 균질물에 대하여 냉동 반구는 단백질분해효소 억제자 칵테일(cocktail)을 포함하는 TRIS 버퍼 식염수 (TBS)-버퍼(5 ml) 내 균질화 되었다. 상기 초기 뇌 TBS 균질물의 1.25ml는 -80°C에서 저장되고, 1.25 ml는 추가적으로 조사되었다. 남아있는 뇌 균질물(2.5 ml)는 원심분리되고 결과 상청액 (= TBS 분획)은 부분 표본되고 ELISA 결정까지 -20°C에서 보관되었다. 펠렛은 Triton X-100 (2.5 ml) 내 현탁되고, 원심분리하며 상청액 (= Triton X-100 분획)은 부분 표본되고 -20°C에서 보관되었다. 이들 단계는 SDS (2.5 ml)로 반복되었다. SDS 분획 중 펠렛은 그 다음 원심분리 전에 70 % 포름산 (0.5 ml) 내 현탁되었다. 수득된 상청액은 부분 표본된 1 M TRIS (9.5 ml)로 중화되었고 -20°C에서 보관되었다(= FA fraction). 네가지 뇌 균질 분획 (TBS, Triton X-100, SDS, 및 FA)의 샘플은 ELISA 기술과 함께 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 결정을 위해 사용되었다. ELISA 실험 키트는 The Genetics Company™, Switzerland (SOP MET062)로부터 구매하였다. 이는 TBS 및 Triton X-100이 단량체(monomeric)에서 올리고머(oligomeric) 구조로 가용화하는 것을 가정할 수 있다. 폴리머 유사 원섬유(protofibrils) 및 수불용성 소섬유(fibrils)는 SDS 및 FA 내 용해될 수 있다. 이러한 관점에서, 모든 네가지 분획의 조사는 또한 Aβ 중합 상태(Aβ polymerization status)에 대한 이해(insight)를 제공한다.
viii) 뇌 형태학의 평가
조사된 모든 Tg 동물의 뇌 조직은 본 절차의 변이에 의한 편향(bias)을 피하기 위해 정확하게 동일한 방법으로 다루어졌다. 층(모두 5층) 당 24마리 Tg 쥐들 (그룹당 8마리) 20개 냉동-섹션(sections)의 뇌 절반으로부터, 각 10μm 두께 (Leica CM 3050S)는 시상봉합적(sagittally) 절단되었고 5개 (각 층으로부터 하나)는 가공되었고 플라크 로드의 정량을 위해 평가되었다. 다섯개 시상봉합(sagittal) 층은 형태학 지도서(morphology atlas) 파시노스(Paxinos) 및 프랭클린(Franklin)으로부터 "마우스 브레인(The Mouse Brain)" (2nd edition)에 따르는 도면 104 내지 105, 107 내지 108, 111 내지 112, 115 내지 116 및 118 내지 119에 상응한다. 첫번째 층은 이의 영역 CA1, CA2, CA3, GDlb 및 GDmb로 전체 해마를 포함하기 위한 요구에 의해 구체화되었다. 면역 반응성은 단일클론 인간 Aβ-특이적 항체 6E10 (Signet)뿐만 아니라 티오플라빈S 염색을 사용하여 해마 내 및 피질 내에서 정량적으로 평가되었다. 남아있는 뇌 반구 또는 사용되지 않은 조직은 프로젝트의 끝까지 JSW CNS에 저장 및 보관되었다.
b) 평가
i) 행동
모리스 수중미로 실험에서 수영 경로의 길이, 탈출 지연, 수영 속도 및 검사 시험 내 전 플랫폼 위치상 교차 및 풀의 각 사분면 내 시간 소요는 특수한 컴퓨터 소프트웨어와 함께 각 Tg 동물에 대하여 측정되었다.
ii) 생화학적 평가
모든 Tg 쥐들로부터 CSF 샘플뿐만 아니라 뇌 재료(preparations)로부터 샘플은 시판중인 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 ELISAs로 분석되었다. 적절한 기준의 측정은 동시에 수행되었다. 뇌 재료로부터 샘플은 중복하여 분석되었다. 작은 샘플양 때문에 CSF 샘플은 단일 측정만으로 분석되었다.
iii) 조직학
i1) 아밀로이드 침적( Amyloid Depositions) 및 플라크 로드(Plaque Load)의 측정
6E10 면역조직화학에 대하여 하기 평가 절차가 사용되었다:
aa) 이미지에 대조(the contrast)를 적용함이 없이 슬라이스 보더(slice borders)의 시각화를 위하여 이미지를 대조.
bb) 대뇌 피질(cortical) 윤곽(outlines)의 상호적 그림(drawing) 및 이후 피질 부위(=영역 부위)의 측정.
cc) 관심 부위(AOI)의 상호적 그림, 염색된 물체는 임계 수준(각 이미지에 동일)에 기초하여 특정한 강도 및 8 μm2의 크기 초과로 검출됨.
dd) 각 물체의 부위의 측정, AOI 내 염색된 부위뿐만 아니라 신호/노이즈 비율(각 이미지에 동일)을 증가시키기 위해 대조적인 스무스(smooth) 이후 개체의 수의 합계.
ee) 해마에 대한 aa)-dd)의 반복.
ff) 평균 플라크 사이즈(= "플라크의 합계 부위/플라크의 수"), 상대적인 플라크 수 및 부위(= "플라크의 수/영역 부위" 및 "플라크의 합계 부위/영역 부위*100")의 계산.
gg) 엑셀 스프레드 시트에 자동화된 데이터를 전달, 파라미터 "이미지 제목, 영역 부위, 플라크의 수, 플라크 부위의 합, 상대적인 플라크 수, 상대적인 플라크 부위 및 평균 플라크 크기를 포함. 비고(remarks) 필드는 화질 및 제외 기준(exclusion criteria)을 기록하는데 각각 사용되었다. 제외 기준은 슬라이스, 많은 주름, 지배적 결함 또는 염색 불일치 (예를 들어 억제 시약의 완전한 반응을 지연시킬 수 있는 벌지(bulges)에 의해)의 누락된 부분을 포함한다.
hh) 저장 없이 이미지를 닫음(원시(raw) 데이터 원시를 유지).
c) 결과
i) 일반 관찰
총 40마리 암컷 hAPP Tg 쥐는 연구를 위해 포함되었다. 이들 쥐로부터 12마리 동물은 처리 기간이 종료되기 전에 알수 없는 이유에 의해 죽었다.
ii) 행동 결과(Behavioral Results)
MWM 내 공간 학습(Spatial learning)은 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리에 의해 널리 영향을 받지 않고 남았다. 0.1mg/kg 처리된 쥐는 1일 내지 4일 사이에 더 나쁜 학습 성과를 갖는 경향을 보였다. 1일 및 4일에 평균 수행의 이원 변량 분석(two-way ANOVA)은 모든 그룹에 대하여 매우 현저한 학습뿐만 아니라 (p<0.001), 또한 인자(factor) 처리의 현저한 영향 (p=0.045)을 나타내었다. 그러나, 본페로니의 후기 실험(Bonferroni's post tests)은 현저성에 이르지 않았다.
iii) 생화학적 결과
aa) 뇌 균질물 분획 내 Aβ 수준
실험 화합물 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 처리는 뇌 균질물 Aβ1 -40 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 11 참조). Aβ1 -42 수준에 그룹 차이는 오직 Triton X-100 분획에 나타났다. 이에, 실험 화합물 XG-102 (SEQ ID NO: 11) (0.1 mg/kg)의 낮은 투여량으로 처리된 동물은 비히클 그룹 (p<0.05)뿐만 아니라 높은 투여량 그룹 (p<0.01)에 비해 현저한 감소를 특징으로 한다.
bb) CSF Aβ 수준
실험 물질 XG-102 (SEQ ID NO: 2)로 처리 이후 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준은 비히클 그룹에 비해 CSF 내에서 현저하게 감소되었다. Aβ1 -40 및 Aβ1 - 42 p-값 모두는 XG-102 (SEQ ID NO: 2)의 높은 투여(10 mg/kg)에 대하여 p<0.01 및 상실(lose) 투여에 대하여 <0.05 였다 (도 12 참조).
iv) 뇌 조직학 및 면역조직화학의 결과
aa) 아밀로이드 침착 및 플라크 로드
플라크 로드는 두가지 다른 방법으로 정량되었다. 한편으로 인간 아밀로이드 펩타이드의 AA1-17에 대하여 주로 지정된 6E10로 IHC 염색이 수행되었고, 다른 한편으로 성숙, 신경염(neuritic) 플라크의 베타-시트 구조 및 코어를 표지하는 티오플라빈S 염색이 수행되었다. 우선, 측정된 영역 부위, 피질 및 해마는 모든 그룹에서 매우 일정하였고, 절단 내 문제 및 IHC 절차는 제외될 수 있으며 특정 정도에 또한 처리 유도된 위축(atrophy)을 가리킨다(변화의 >5%은 본 방법으로 검출가능함). 6E10 및 티오플라빈S 정량은 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리 이후 플라크의 중앙에 베타-시트 구조의 선택적인 감소를 나타낸 반면, 인간 아밀로이드는 처리로부터 영향을 받지 않는 것으로 남거나 약간 증가하였다. 구체적인 대뇌 피질에서 6E10 IR 플라크 로드는 10 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리된 쥐에서 비히클 대비 증가하였으나, 현저성 수준은 해마 플라크의 수에 이르렀다. 도 13 및 14는, 6E10 IHC에 대조적으로, XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리가 해마의 티오플라빈S 양성 플라크 수뿐만 아니라, 부위 백분율(플라크 수: 10mg/kg에 대하여 p<0.05, 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11)에 대하여 p<0.01)의 음성적인 투여량 의존적 감소를 유도함을 보여준다. 0.1mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리는 또한 평균 플라크 크기를 감소시키지만, 이러한 효과는 ANOVA (쌍을 이루지 않은(unpaired), 투-테일드 T-test(two-tailed T-test): p=0.074) 내 현저성 수준에 이르지 않았다. 이러한 효과는 피질 플라크, 피질 내에서 보다 해마 내에서 플라크 병리학의 후천적 발현(later onset)에 따른 가장 가능한 환경에 주어지지 않았다. 5개월령에 처리 시작은 정확하게 해마 내 플라크 침적의 시점을 맞춘 반면, 피질 플라크는 3개월령에 정량을 위해 사용된 배율에서 가시화되기 시작하였다. 정량적으로 티오플라빈S 염색된 플라크에 6E10의 비율은 증가하고 이중 표지된 슬라이스에서 보이는 것처럼 베타-시트 플라크는 크기가 작아졌다. 요약하면, 이들 데이터는 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리가 플라크 침적의 이른 단계에 베타-시트 형성 및 플라크 코어 내 베타 시트 형성의 각각 대해 활동함을 뒷받침한다.
d) 효과 및 결론의 요약
* 모리스 수중미로에 측정된 공간 탐색(Spatial navigation)은 치료로부터 널리 영향을 받지 않고 남았다. 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리는 첫번째 및 마지막 실험 날 사이에 근소하게 열악한 학습 능률을 초래하였다.
* 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11) 내 트리톤 X-100 분획 내 감소를 제외하고 그룹 Aβ1-40 및 Aβ1-42 뇌 수준은 안정하게 유지되었다.
* Aβ 수준의 감소는 투여(dosages) 및 절편 모두에 대하여 CSF에서 검출되었다.
* XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리는 6E10 정량 내 보다 높게 투여된 그룹 내 인간 아밀로이드 베타의 급격한 증가를 유도하였고, 이는 Aβ ELISA에서 얻어진 데이터에 따랐다.
* 티오플라빈S 염색에 의해 검출된 해마 베타-시트 로드가 XG-102 (SEQ ID NO: 11) 처리 이후 투여량 의존적으로 감소된 것과 대조적으로, 보다 낮은 투여량 0.1 mg/kg XG-102 (SEQ ID NO: 11)에서 보다 높은 정도(degree)를 위해, 반면 피질 플라크 로드는 변하지 않은채 남았다. 처리 시작에 해마 내 플라크 침적의 연령 의존적 발현에 따라 이는 플라크 침적의 이른 단계 내 베타-시트 형성에 이른 활동을 암시한다.
실시예 15: 제2형 당뇨병의 치료에 모든-D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩타이드 및 이의 변이체의 활성의 결정
실시예 15는 제2형 당뇨병의 치료에 매 셋째날 마다 (28일) 공복 혈당 수준을 평가함으로써 IB(s) 펩타이드 및 모든-D 레트로-인버소 IB(s) 펩타이드 및 이의 변이체의 활성을 결정하기 위해, 특히 제2형 당뇨병의 db/db 쥐 모델에서 XG-102 (SEQ ID NO: 11)로 만성적 처리의 효과를 결정하기 위해 설계되었다.
a) 재료 및 방법
i) 동물
스무마리(20) 수컷 db/db 쥐(8주령)의 전체는 Charles River (Germany)로부터 수득하였다. 도착시, 동물들은 그룹 수용되었고(n = 6-7마리/그룹) 일반 설치류 음식(Altromin standard #1324 chow; C. Petersen, Ringsted, Denmark) 및 물을 다른 지시가 있을때까지 임의로 제공하였다. 쥐들은 12:12 L/D 사이클 (4:00에 불을 켜고 16:00에 불을 끔) 및 온도 및 습도가 조절된 방안에 수용되었다.
ii) 그룹 및 무작위 추출(randomization)
-4일에, 쥐는 하기 약물 처리군 (n=6)의 하나에 참여하기 위해 혈당 수준(공복; Biosen S line analyzer (EKF diagnostic, Germany)에 측정된 혈당)에 따라 무작위 추출되었다:
1) 비히클 대조군, S.C. (생리학적 식염수)
2) XG-102 (SEQ ID NO: 11); 1 mg/kg; s.c.
3) XG-102 (SEQ ID NO: 11); 10 mg/kg; s.c
나열된 모든 투여량은 유리 염기에 대해 계산되었다. 약물 순도: 95.28%, 펩타이드 함량: 78.0%. 모든 화합물은 3 ml/kg의 부피로 피하(s.c.) 투여되었다.
비히클 대조군 및 XG-102 (SEQ ID NO: 11)를 위한 제조 지침은 하기와 같다:
우선, XG-102 (SEQ ID NO: 11)을 비히클에 용해시킨다. 제형(formulations) (각각 1 및 10 mg/kg의 투여량에 상응하는 0.33 및 3.3 mg/ml의 농도)는 하기 구체적인 절차에 따라 제조되었다. 농도는 실험 물품 순도 및 펩타이드 함량 (승수 계수(multiplier coefficient)는 1.346)을 고려하여 계산 및 발현되었다.
* 스톡(stock) 용액의 제조: 동결 건조된 실험 화합물 XG-102 (SEQ ID NO: 11)은 최소 1시간 동안 녹았으며(thawed) 1 mM(3.823 mg/mL에 상응)에서 비히클 내 스톡 용액과 같이 제조되었다. 부분 표본은 각 처리일에 제조되었고 약 -80°C에서 저장되었다. 요구되는 농도로 이러한 스톡 용액의 희석은 각 처리일에 수행되었다;
* 스톡 용액의 저장: 약 -80°C에서;
* 희석된 제조물(preparations)의 저장: 최대 24시간 동안 실온에서.
용해화 전에, 분말(powder)은 -20°C에서 저장되었다. 스톡 용액의 안정성은 약 -80°C에서 3개월이었다; 동물 투여를 위한 희석된 제형의 안정성은 실온에서 24시간이다. 만약 4-8°C에서 보관된다면 사용되지 않은 희석된 물질은 7일까지 보관될 수 있다.
c) 실험 절차
8일의 적응(acclimatization) 이후 쥐들은 아웃라인(outline) 그룹에 따라 04.00 PM에 불을 끄기 전에 8시간 SC 투여에 의해 21일 동안 08.00 AM에 매일 처리되었다. 이후, 연구 21일에 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 가장 높은 농도의 투여는 중지된 반면, 비히클 대조군 및 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (1 mg/kg)의 매일 투여는 연구 28일까지 지속되었다. 28일부터 111일에 종료까지 비히클 및 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg) 처리된 쥐는 세척(wash-out) 기간(비 투여)에 관찰된 반면, XG-102 (SEQ ID NO: 2) (1 mg/kg) 처리된 쥐는 처리 28일 이후 종료되었다(terminated).
i) 혈당
혈당은 헤마토크리트(hematocrite) 튜브 내 꼬리 혈관으로부터 10 μl 혈액 샘플의 수집 및 이후 Biosen s-line analyzer (EKF-diagnostic; Germany)을 통한 분석을 통해 6시간 투여 후 7시간 공복 동물로부터 측정되었다.
ii) 대사성 케이지 (Metabolic cages)
그룹 1+3: 쥐를 24시간 음식 및 물 섭취뿐만 아니라 24시간 소변 및 대변 생산을 기록하기 위해 대사성 케이지에 놓았다. 쥐는 n = 6-7의 두 하위 팀으로 계층화되었고 이후 대사적 특징 부여(characterisation)가 연구 71-72일에 수행되었다.
iii) 아디포킨 패널( Adipokine panel)
그룹 1+3: 세가지 경우에(연구 57, 66 및 108일) 혈액은 EDTA 코팅된 헤마토크릿 튜브(100μl)를 사용하여 꼬리 혈액으로부터 수집되었다. 혈액의 원심분리 이후 혈장은 수집되고 측정시까지 -20℃에서 저장되었다. 이후, 그 다음 아디포킨/사이토카인의 패널은 루미넥스(Luminex) 기초의 7-plex를 사용하여 결정되었다: 렙틴(leptin), 레시스틴(resistin), MCP-1, PAI-1, TNFa, 인슐린 및 인터루킨-6 (IL-6).
iv) 종결
그룹 1+3 (111 일): 이후 기관은 절단 및 칭량되었다: 서혜부(inguinal) 피하 지방, 부고환 지방(epididymal fat), 복막후 지방(retroperitoneal fat), 뇌, 간, 신장, 비장 및 심장. 상기 설명된 모든 기관은 가능한 장래 조직병리학적 실험을 위한 4% PFA 내 샘플이다. 또한, 췌장(일괄적으로(en bloc))은 가능한 입체학적 및 면역조직학적 분석을 위해 수집되었고, 눈은 망막증(retinopathy) 가능한 후기 분석을 위해 수집되었다. 그룹 2 (28일): 조직 또는 혈장이 수집되지 않음.
c) 결과
i) 일반적인 관찰
급성 투여 기간 동안 동물들은 보통의 민첩성 수준 및 활동성을 보였고 약물 처리된 동물에 진정의 징후는 없었다. 식품 및 물 섭취는 비히클 처리된 동물 가운데 정상 범위 내였다. 그러나, 약 2주 투여 이후, 고 투여량의 XG-102 (SEQ ID NO: 2)에 반응으로 피하 조직에 결정성 섬유증(nodular fibrosis)이 관찰되었고, 이들은 그룹 C로부터 모든 쥐에 개방창(open wounds)에 진행되었다. 그룹 B 내 보통의 결정성 섬유증이 관찰되었다. 결과적으로 주사의 부위의 교체가 사용되었다. 물 투여의 끝 이후에 동물들은 치료되고 결절성 섬유증은 점진적으로 사라졌다. 히클 처리된 동물에는 임상적 효과가 관찰되지 않았다.
ii) 혈당
공복 혈당 수준(절대 및 상대)는 도 15에 나타났다. 공복 혈당은 그룹 A 및 C에서 111일에 종결될 때까지 정기적으로 68일까지 매 세번째 날에 측정되었다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg) 처리된 당뇨병성 db/db 쥐의 공복 혈당 수준에 명확하고 현저한 (p<0.001) 감소가 관찰되었다. XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)로 처리된 쥐의 공복 혈당 수준은 약 5 mmol/L의 낮은 안정기(low plateau)에 이르렀다. 이러한 효과는 투여 14일 이후에 명백하고, 따라서 21일 내지 111일 전체 세척 기간 동안 본 연구 전반에 주장되었다. 대조적으로, 투여 28일 동안 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (1 mg/kg)의 낮은 투여에 효과는 관찰되지 않았따.
iii) 체중
체중 결정(절대 및 상대)는 도 16에 나타내었다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)로 처리된 쥐 내 체중 증가의 명백하고 현저한 (p<0.001) 억제가 관찰되었다. 이러한 효과는 투여 28일부터 명확하며 종결 111일까지 유지되었다. 대조적으로, 투여 28일 동안 체중에 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (1 mg/kg)의 낮은 투여량에 효과는 관찰되지 않았다.
iv) 대사 케이지(metabolic cages)
연구 68일에 대사성 케이지 내 24시간 동안 측정된 식품 및 물 섭취, 및 소변 및 대변 생산 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 효과는 도 17 (g) 및 18 (체중의 g에 표준화됨)에 나타내었다. 식품 섭취 및 소변 생산이 감소하는 경향이 관찰됨에도 불구하고, 비히클 대조군에 비해 측정된 어느 파라미터에도 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 현저한 효과가 관찰되지 않았다.
v) 아디포카인(Adipokines)
인슐린의 혈장 수준에 57, 77 및 108일에 측정된 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 효과, MCP-1 및 IL-6는 도 19에 나타내었다; tPAI-1, TNF 및 레시스틴의 혈장 수준은 도 20; 혈장 레시스틴의 수준을 제외하고 비히클 대조군에 비해 측정된 어느 파라미터에도 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 현저한 효과가 관찰되지 않았으며, 이는 77일 및 108일에 XG-102 (SEQ ID NO: 2) 처리된 동물에서 현저하게 높았다.
vi) 종결시 조직 중량(Tissue weight at termination)
정소상체(epididymal), 서혜부 피하(inguinal subcutaneous), 및 복막후 지방체의 조직 중량에 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 효과는 도 21에 나타내었다. 비히클 대조군에 비해 XG-102로 처리된 쥐 내 정소상체(p<0.05) 및 복막후(p<0.01) 지방 중량에 현저한 감소가 관찰되었다. 뇌, 비장 및 심장의 조직 중량에 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 효과는 도 22에 나타내었다. 비히클 대조군에 비해 이들 파라미터에 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)에 현저한 효과가 관찰되지 않았다. 최종적으로, 신장 및 간의 조직 중량에 비히클 또는 XG-102 (SEQ ID NO: 2) (10 mg/kg)의 효과는 도 23에 나타내었다. 비히클 대조군에 비해 XG-102 (SEQ ID NO: 2)로 처리된 쥐 내 신장 (p<0.05) 및 간 (p<0.01) 중량의 현저한 감소가 관찰되었다.
결과들을 요약하면, XG-102 (SEQ ID NO: 11), 10 mg/kg의 투여는 혈당 수준의 현저한 감소를 유도하는 것으로 나타났으며, 따라서 XG-102 (SEQ ID NO: 11)는 당뇨를 치료하고 혈당 수준을 증가시키는 촉망되는 새로운 수단으로 나타났다.
실시예 16: 무작위화 , 이중 은폐, 위약 조절, 투여량 증가 1상 (Phase I) 연구에 건강한 남성 자원자(volunteers)에 투여된 10, 40 및 80　 μg /kg XG -102 ( SEQ ID No.: 11)의 단일 정맥내 투입의 안전성, 내성 및 약동학
본 연구의 주요 목적은 건강한 남성 지원자에게 XG-102의 단일 증가(escalating) 투여량의 정맥(iv) 주입 후 XG-102의 안전성 및 내성을 측정하는 것이다. 본 연구의 두번째 목적은 건강한 남성 지원자에게 XG-102의 단일 증가 투여량의 iv 주입 후 XG-102의 약동학(pharmacokinetics)을 측정하는 것이다. 투여는 60분 iv 주입으로 투여되었다. 대조군 목적을 위해 플라시보 iv 주입은 대조군 개체로 투여되었다.
이는 단일 중심의, 무작위화된, 이중 맹검, 플라시보 조절된, 상승(ascending) 단일 투여, 순차적인 그룹 연구이다. XG-102 (10, 40 및 80 μg/kg)의 세가지 투여량 수준은 투여의 상승 순서로 연구되었고, 각 그룹 내 개체들은 XG-102를 수용한 6개 개체, 및 플라시브롤 수용한 2개 개체로, 무작위화 되었다. 스크리닝은 투여 전 3주 기간으로 수행되었다. 투여는 각 개체에 0일에 발생하였다. 조사자는 CRU (투여 후 24시간에)로부터 그들의 방출(discharge) 전에 모든 개체의 웰빙(well-being)을 확인하였다. 개체들은 후기 연구 측정을 위해 투여 이후 CRU 8 ±2 및 28 ±5 일에 반송되었다.
8개체의 3개 그룹 내, 24개체의 전부(18 내지 45령 내 건강한 남성 개체). 24 개체들은 본 연구에 들어가고 완료하였다. 모든 개체를 위한 데이터는 안정성 분석에 포함되었다; XG-102를 수용한 모든 개체를 위한 데이터는 약동학적 분석에 포함되었다.
Figure pct00002
t1/2의 관찰된 값은 짧았다(short). Cmax에 의해 측정된 피크 노출 및 AUC0 -last에 의해 측정된 누적 노출 모두는 투여량과 함께 증가하였다. Cmax의 투여량 증가는 그래픽 검사에 기초한 것보다 더욱 선형적으로 비례하는 것으로 나타나고 가장 높은 80 μg/kg 투여 이후 이의 투여 표준화된 값의 기하 평균의 증가는 다른 투여량에 대해 90% 신뢰 구간을 초과한다. AUC0 -last의 투여량의 증가는 이의 기하 평균 투여 표준화된 값의 90% 신뢰 구간이 이후 다른 실험된 투여량과 겹치지 않는 것처럼, 40 내지 80 μg/kg 선형적 비례보다 명백하였다; 반면 10 및 40 μg/kg 이후 값에 비교할 때 90% 신뢰 구간은 중복되었으나, 10 μg/kg 투여량 이후 이의 기하 평균 투여 표준화된 값은 40 μg/kg 투여량 이후 상응하는 90% 신뢰 구간 내 모든 값보다 낮았다.
XG-102는 건강한 남성 개체에 10, 40 또는 80 μg/kg의 단일 iv 투여량으로 투여될 때 안전하고 잘 견뎠다. XG-102를 수용한 개체 내 역 효과의 빈도는 플라시보를 수용한 개체 내 빈도와 유사하였다. 임상 연구 데이터, 생명 징후(vital signs), ECGs, 신체 검사 또는 안구 검사 (기저부(fundus) 및 IOP)에 임상적으로 현저한 점은 발견되지 않았다.
XG-102 정맥 주입이 끝난 이후, 이의 혈장 농도는 급격하게 감소하였고, 값을 10 μg/kg XG-102 iv 주입 거의 2시간 이후, 40 μg/kg XG-102 iv 주입의 시작 3시간 이후 및 80 μg/kg XG-102 정맥 주입의 시작 거의 7시간 이후까지 정량의 하한 이하로 유도하였다. 측정된 t1/2 및 MRT 값은 0.36 내지 0.65 시간 및 0.76 내지 1.02 시간, 각각 범위의 투여 수준당 기하 평균 값으로, 짧았다.
XG-102의 AUC0 -last는 40 μg/kg 및 80 μg/kg 투여량 사이 이의 기하 평균 투여 표준화된 값에 대한 비-중첩 90% 신뢰 구간 및 10 μg/kg 내지 40 μg/kg 사이의 이의 기하 평균 투여 표준화된 값에 대한 90% 신뢰 구간 사이에 오직 제한된 중첩을 갖는, 실험된 투여량 범위 내 투여량을 갖는 선형 비율보다 더욱 증가한다.
XG-102의 Cmax는 40 내지 80 μg/kg의 투여량을 갖는 선형 비율보다 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 80 μg/kg 투여량 그룹 내 기하 평균 투여량 표준화된 Cmax는 다른 투여량 그룹 내 기하 평균 투여 표준화된 Cmax에 대한 90% 신뢰 구간 바깥 보다 높으나, 기하 평균 투여 표준화된 Cmax에 대한 90% 신뢰 구간은 모든 투여량 수준 사이에 중복된다.
XG-102 약동학적 파라미터의 상호주관적 변동성(intersubject variability)은 10 및 40 μg/kg 투여량 (약 15-30% 범위 내 대부분 파라미터를 위한 기하 평균의 CV%, 제외는 10 μg/kg 투여량 그룹에서 t1/2 및 총 Vss)으로 처리된 개체 내에서 보통이으나, 다른 것보다 MRT(14.7%)에 대해, 약 29-44% 범위 내, 80 μg/kg 투여량 그룹 내에서 보다 높았다. 이러한 높은 변동성은 낮은 샘플 크기 또는 이러한 투여량에 보다 명백한 관찰된 비-선형성(linearities)의 결과의 효과일 수 있다.
실시예 17: 돼지 섬(porcine islet) 분리 결과를 증진시키는 XG -102의 용도 (SEQ ID No.: 11)
본 목적은 (a) 세포 스트레스 및 사멸을 유도하는 섬 동정 동안 발생하는 JNK의 대량 활성화를 방지; (b) 돼지 모델을 사용하여, 섬 생존력 후-격리(post-isolation) 내 증진을 초래하는, 섬(islet) 사멸의 감소시키는데 XG-102의 능력을 측정하는 것이다.
JNK의 급격한 활성화에 돼지 섬 동정 결과는 섬 동정 절차의 시작 ~20분 이후 조직 샘플 내에서 관찰되었다 (도 33). 존재하는 데이터의 분석은 획득(procurement) 동안 췌장 수준에 자이겐 XG-1 02 JNK 억제자의 첨가 및 격리 동안 격리 연구실 및 섬 동정 용액(10 마이크로몰 농도) 내로 전송이 JNK의 화렁화를 억제하고(도 34), c-fos 유전자의 상대적인 발현을 감소시키며(도 35), OCR/DNA (도 36) 및 ATP/단백질 [총 세포 단백질] (도 37)에 의해 측정된 새로 격리된 섬의 생존력에 통계적으로 현저하고 중요한 효과를 가짐을 설명한다. 비교는 동일한 췌장 공여자로부터 유래된 쌍을 이룬 비처리된 대조군으로 항상 만들어졌다. 도 36 및 37에 나타난 섬 생존력에 데이터는 격리 동안 전형적으로 관찰된 JNK 활성화에 감소(도 33) 및 c-fos 유전자 발현(도 35)을 초래하는 감소와 일치한다. 생존력에 차이, JNK 활성 및 c-fos 발현은 배양 7일 이후 보다 작아졌다. 격리의 6/6(100%)는 컷-오프(cut-off) 초과한 OCR/DNA 값을 초래하고 NHPs에 성공적으로 이식되었다(도 38). 이는 이러한 모델 내 생존력에 더욱 보통의 증진은 재료(preparations)의 이식 가능성에 큰 영향을 가질 수 있음을 확인한다. 활용가능한 데이터에 기초함. XG-102는 인간 또는 돼지 섬 동정을 위해 사용되는 우수한 제제인 것으로 밝혀졌다.
돼지 모델은 하기 이유에 따라 적절하다: (1) 돼지 췌장의 크기는 랫 또는 개(canine) 췌장에 비해 인간 췌장과 가깝다; (2) 돼지 섬은 미래의 임상적 섬 이종 이식(xenotransplantation)을 위해 가능한 선택으로 고려된다 - 그에 따라 대단히 중요하게 요구되는 돼지 섬 동정에 향상은 궁극적으로 임상적으로 관련될 수 있다.
뇌사 공여자로부터 유래된 임상적 섬 타가 이식(allo-transplantation)을 위한 인간 췌장은 전형적으로 WIT에 대한 것은 아니지만, 8-12시간의 CIT(조달 병원으로부터 동정 연구실까지 전송에 필요한 시간)를 가진다.
심정지 공여자로부터 인간 췌장은 15분 WIT에 노출되었고, WIT에 의한 손상에 관한 우려로 인해 현재 일반적으로 활용되지 않으며, 그들은 또한 8-12시간의 CIT를 겪을 것이다.
섬 자가-이식을 위해 만성 췌장염 환자로부터 제거된 기관은 WIT를 겪을 수 있으며 제한된다 (1-2시간 CIT). 만성 췌장염 환자로부터 췌장은 전형적으로 염증이 생기며 이미 스트레스를 받았기 때문에 돼지 모델 이하와 함께 보고된 향상은 임상적 자가 이식 경우에 더욱 더 클 수 있는 것으로 예상된다. 이는 또한 장기적인 저온 허혈 시간을 갖는 임상적 알로-케이스(allo-cases)에서 사실인 것으로 예상되며 다른 JNK 억제자를 사용하여 다른 그룹을 통해 보고되었다. JNK 활성화는 췌장 조달 시간으로부터 CIT를 증가시키며; JNK 억제자로 JNK 활성화를 억제시킴은 섬 생산, 생존력 및 이식 결과를 향상시키고 실험된 가장 긴 저온 허혈 시간에 가장 현저하였다.
실시예 18: 랫 아르곤 레이저-유도된 맥락막 혈관신생( Choroidal Neovascularization) 모델을 사용한 맥락막 혈관 신생의 감소에 XG -102 ( SEQ ID No. 11)의 효과.
본 실험의 목적은 두가지 투여량에 XG-102의 두가지 정맥내 투여가 레이저 유도된 맥락막 신생(ChNV)의 랫 모델 내 맥락막 혈관신생의 감소를 초래하는지 결정하는 것이다. 이러한 모델은 나이 관련 황반 변성(macular degeneration)의 치료를 위한 실험 화합물의 잠재적 용도를 예측하도록 한다.
유색 브라운 노르웨이(Brown Norway) 랫 40마리(+ 10 예비)는 각 동물 8마리의 다섯개 그룹으로 나누었다. 맥락막 혈관신생은 오른쪽 눈에 532 nm 아르곤 레이저 광응고장치(photocoagulator) (100 ms 동안 150 mW에서 75 μm-크기의 점 6개)를 사용하여 유도되었다. 실험, 참조 및 대조군 물품은 0일(유도 이후 즉시) 및 7일에 정맥 주사를 통해 투여되었다. 혈관 촬영은 처리 및 비처리된 동물에 유도 14일 및 21일 이후 유도에, 플루오레세인(추적자) 피하 주사 10분 이후 수행되었다. 23일에 희생된 후, 모든 동물의 처리된 오른쪽 눈은 채집되었고 맥락막은 평면으로 고정되었다. 후원자의 요청에, ChNV의 부피의 정량은 수행되지 않았다.
실험 구성(Experimental set-up):
XG-102: 3 000 μg/ml (15 μg/눈(eye)에 해당) 및 300 μg/ml (1.5 μg/눈에 해당). Kenacort® Retard (참조 대조군으로 4% 트리암시놀렌 아세토니드(triamcinolone acetonide)). 대조군 비히클: 식염수 (0.9% NaCl).
동물
종: 랫(Rat). 이는 본 실험 모델에 가장 일반적으로 사용된 종임
혈통(Strain): 브라운 노르웨이(Brown Norway) (유색).
나이: 약 8주.
체중: 175 - 200 g (주문(on ordering)).
수(Number)/성별: 50 수컷 (연구 40; 예비 10).
사육자: "할런 프랑스(Harlan France)" - FR-03800 Gannat.
연구 설계
브라운 노르웨이 혈통으로부터 40마리 (+ 10마리 예비) 유색 랫은 8마리(+2마리 예비) 동물의 다섯개 그룹으로 나누었다. 맥락막 혈관신생은 오른쪽 눈에 532 nm 아르곤 레이저 광응고장치 (100 ms 동안 150 mW에 6개 75 μm 크기의 점)를 사용하여 유도되었다.
실험 물품 (두가지 투여량, 그룹 1-2), 비히클 및 참조 (5 μl)는 0일 (동일한 마취 하에 혈관신생의 유도 이후) 및 7일에 오른쪽 눈에 정맥 주사를 통해 투여되었다. 기저부 신생혈관은 처리 및 비처리된 동물의 오른쪽 눈에 하이델베르크의 망막 혈관 조영술(Heidelberg's Retinal Angiography, HRA)를 사용하여 14일 및 21일에 평가되었다.
하기 표는 처리 군 내 동물의 배당을 요약한다:
그룹 번호. 처리 투여량 투여 경로 동물의 수
1 XG-102 3 000 μg/ml IVT (0일 및 7일에 오른쪽 눈에 5 μl) 14, 17, 38, 26, 28, 31, 23, S8
2 300 μg/ml 24, 40, 19, 21, S5, 6, 39, 18
3 식염수 - 37, 12, 22, S3, 4, 3, 33, 35
4 Kenacort® Retard 4% 트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide) 10, 3, 15, S1, 32, 8, 16, 9
5 비처리 - - 29, 7, 20, 36, S9, 27, 1, 11
동물의 선별
40마리+10마리 예비 동물은 본 연구에 포함되었다. 안구 결함의 눈에 보이는 증상(visible sign)이 없는 동물만이 선별되었다. 이후, 처리군 내 할당은 Excel® 소프트웨어의 랜덤 기능을 통해 수행되었다. 50마리 동물들은 유도되고 따랐다. 처리군에 무작위 할당은 그룹 당 여덟마리 동물 및 예비 동물을 결정하였다. 이들 후자 동물들은 만약 일반적으로 포함된 하나 또는 두마리 동물이 죽을 경우에 결과의 계산에 포함되었으며, 투여 절차 동안 또는 각막 혼탁(corneal opacity) (반복된 마취에 의해) 동안 렌즈에 영향을 미쳤다.
혈관신생의 유도
0일자에, 동물들은 실라진/케타민 혼합물의 근육 주사를 통해 마취되었다. 오른쪽 눈으로부터 동공(Pupils)은 0.5% 트로피카미드의 한 방울의 적하(instillation)에 의해 팽창되었다. 이후, 여섯개 맥락막 화상(burns) (75 μm 점 크기)은 아르곤 레이저 광응고장치(532 nm; 150 mW; 100 ms)를 사용하여 주요 혈관 분지 사이에, 시신경 유두(optic disc) 주변에, 컨택트 렌즈와 함께, 세극등(slit lamp)을 통해 수행되었다. 레이저 치료 시간에 버블(bubble)의 생성은 브루흐 막(Bruch's membrane)의 파열을 보였다.
투여의 경로 및 방법
동물들은 실라진/케타민 혼합물의 근육 내 주사를 통해 마취되었다. 실험 물품, 참조 및 비히클 (5 μl)은 오른쪽 눈에 초자체내(intravitreous) 주사되었고 투여 양생(dose regimen)은 0일 및 7일이었다. 주사는 수술 현미경(operating microscope)을 통해 수행되었다.
0일에 예정된 초자체내 주사가 수행된 이후 동일한 마취 하에 신혈관 형성이 유도되었다.
초자체내 주사는 유리체(pars plana)에 측두 상부(supratemporal) 지역에 위치하였고 10 μl 해밀턴에 고정된 30G 바늘을 사용하여 수행되었다. 채워진 주사기는 이후 마이크로리터 범위에 정확한 주사를 수행하기 위해 UltraMicroPump III로 고정되었다.
체중
모든 동물들의 체중은 연구의 시작 전에 그후 일주일에 한번 기록되었다. 유도 및 처리(기준점) 전에, 이후 7, 14 및 21일에 기록된 동물 체중은 모두 기준점에 정상 범위 내였다: 180,6 ± 12,3 g (mean ± SD, n = 40). 21일에, 실험 물품, 비히클 및 비처리된 그룹 사이에 관련된 차이가 관찰되지 않았다. 동물은 하기와 같이 증가함: 300 μg/ml 및 3000 μg/ml의 XG-102에 대하여 각각 + 53 g (+ 29%) 및 + 62 g (+ 34%), 비히클 그룹 및 비처리 그룹에 대하여 각각 + 56 g (+ 31%) 및 + 59 g (+ 34%).
Kenacort® retard로 처리된 동물은 기준점 및 유도 21일 이후 사이에 +21 g (+ 12%) 증가하였다.
플루오레세인 혈관 조영법( Fluorescein Angiography )
플루오레세인 혈관 조영법은 HRA를 사용하여 14일 및 21일에 수행되었다. 실라진/케타민의 혼합물 근육 내 주사를 통한 마취 및 동공 확장(pupillary dilation) 이후, 10% 소듐 플루오레세인의 250 μl/100 g(체중)은 26G 인슐린 주사기를 사용하여 피하 주사되었고, 플루오레세인 사진은 염료 주사 10분 이후 기록되었다.
본 연구는 40마리 브라운 노르웨이 랫에서 수행되었다. 아르곤 레이저는 오른쪽 눈에 ChNV를 유도하기 위해 사용되었다. ChNV의 발달은 플루오레세인 혈관 조영(FA)에 의해 평가되었다. 처리 (실험, 참조 및 대조군 물품)은 유도 0일 및 7일 이후 초자체내 투여를 통해 만들어졌다. 혈관 조영은 유도 14일 및 21일 이후, 플루오레세인(추적자) 주사 10분 이후 수행되었다. 등급은 각 병변에 플루오레세인의 가장 높은 강도에 기초하며, 누출 부위의 크기에 의해 결정되지 않는다.
결과는 시점 마다 및 각 처리에 대한 주어진 강도 점수 및 양 시점 각각에 점 수의 빈도를 통해 그룹 평균 점수로 나타내었다. 만 휘트니 테스트(Mann and Whitney test)는 처리 및 대조군 사이의 FA 점수에 통계쩍으로 현저한 차이가 있는지 결정하는데 사용되었다. 통계적인 현저성은 p <0.05가 만 휘트니 U 테스트와 함께 얻어지는 경우에 기인한다.
도 39 A는 플루오레세인 누출의 강도를 나타낸다 (평균 점수 ± SD). 그리고 도 39 B는 양쪽 시점에 실험물-처리된 눈에 누출 점의 비율을 설명한다. 도 39 C 및 39 D는 누출 점 (점수 > 0) 및 최대 누출 점 (3의 점수) 각각의 백분율을 설명한다.
플루오레세인 혈관 조영의 평가
혈관 촬영에 플루오레세인의 누출은 마스크 패션의(masked fashion) 두명의 실험자에 의해 평가되었고 하기와 같이 등급화되었다: 0점, 비 누출; 1점, 약간 염색됨; 2점, 보통 염색됨; 3점, 강하게 염색됨. 만약 특정한 병변에 할당된 두가지 점수가 동시에 일어나지 않는 경우에, 보다 높은 점수는 분석을 위해 사용된다.
평면 고정 재료(Flat Mount Preparation)에 표지를 통한 ChNV의 이소렉틴 B 4 로 평가 (선택의 정량)
23일에, Dolethal®의 i.p. 주사를 통한 안락사 이후, 처리된 오른쪽 눈은 채집되고 4% 파라포름알데하이드 용액에 1시간 동안 실온에서 고정되었다. 세척 이후, 망막, 맥락막 및 공막은 해부되었다. 망막은 조심스럽게 벗겨졌다. 공막-맥락막은 평면 고정되었고 FITC-isolectin B4 항체로 억제 이후 배양되었다.
통계적 분석
그룹 평균 값 및 표준 편차는 모든 파라미터에 대하여 계산되었다. 실험 물품 및 비히클의 다양한 농도 사이에 차이의 통계적 현저함을 측정하기 위해, 만 휘트니 U 테스트가 사용되었다.
결과
(1) 참조 화합물 케나코트(Kenacort) vs 비히클 및 비처리군
하기 표는 14일 및 21일에 10분에 FA의 결과를 요약한다 (그룹 당 n = 8 동물, 오른쪽 눈)
처리 투여량 시점 플루오레세인 누출의 평균 점수 빈도
(% spots with score x)
평균 ± SD 감소vs 비히클의 % 0 점 1 점 2 점 3 점
비처리 - 14일 2.1 ± 1.0
(n = 48)		 - 10 19 25 46
21일 2.1 ± 0.9
(n = 48)		 - 4 21 38 38
비히클 (NaCl)
IVT D0, D7 		0.9% 14일 2.9 ± 0.5
(n = 48)		 - 0 4 6 90
21일 2.2 ± 1.0
(n = 48)		 - 6 21 23 50
케나코트 리타드(Kenacort ® retard)
( 트리암시놀론 아세토니드 ) IVT D0, D7 		4% 14일 0.1 ± 0.3
(n = 46)		 97 %
(p < 0.001) 		87 13 0 0
21일 0.3 ± 0.5
(n = 45)		 86 %
(p < 0.001) 		69 31 0 0
수치 데이터는 프리젠테이션을 위해 반올림 되었을 수 있음을 참고, 그에 따라 수동 재계산은 약간 다른 값을 나타낼 수 있음.
14일에, 점들의 90%는 ChNV의 형성을 가리키는 비처리된 오른쪽 눈에서 누출되었다. 평균 점수는 2.1 ± 1.0 (n = 48)이다. 21일에, 비처리된 동물은 96%의 누출 점들 및 ChNV의 지속을 가리키는 2.1 ± 0.9 (n = 48)에 평균 점수를 보였다.
14일에 100%의 점들은 ChNV의 형성 및 심각성을 가리키는 2.9 ± 0.5 (n = 48)의 평균 점수를 갖는 비히클 처리된 눈에서 누출되었다. 21일에, ChNV의 지속을 가리키는, 누출되고 2.2 ± 1.0 (n = 48)의 평균 점수인 94%의 점들을 갖는 누출 점의 빈도에 관련된 변화가 없었다.
FA의 점수는 0일 및 7일에 두 유리체 내 투여 후에 따른 Kenacort® retard는 비히클 그룹에 대해 0.1 ± 0.3 (n = 46) vs 2.9 ± 0.5의 평균 점수를 통해 나타나는 것처럼 14일에 비히클에 비해 플루오레세인 누출을 97%까지 감소시킴을(p <0.001, 만&휘트니-U 테스트) 보였다.
누출 점의 빈도는 14일에 누출 점의 100%를 보였던 비히클 처리된 동물에 비해 Kenacort® retard 그룹에서 누출 점의 13%로 감소되었다.
21일까지, Kenacort® retard로 두번 처리된 동물들은 각각 0.3 ± 0.5 (n = 45) vs 2.2 ± 1.0의 평균 점수로 나타나는 것처럼 비히클 처리된 동물에 비해 맥관 누출(vascular leakage)의 86%까지 상대적인 감소를 보였다 (p <0.001, 만 & 휘트니 테스트).
21일에 비히클 그룹에 비해 누출 점의 비율은 Kenacort® retard에 대해 누출 점의 31% 대(versus) 비히클에 대해 94%로 나타나 변하지 않았다.
(2) XG -102-처리된 그룹 대(vs) 비히클 그룹
하기 표는 14일 및 21일에 10분에 FA의 결과를 요약한다 (n= 그룹 당 8마리 동물, 오른쪽 눈).
처리 투여랑 시점 플루오레세인 누출의 평균 점수 빈도
(점수 x를 갖는 % 점)
평균 ± SD 감소 대 비히클의 % 점수 0 점수 1 점수 2 점수 3
XG -102
IVT D0, D7		 300 μg/ml Day 14 2.4 ± 0.9
(n = 44)		 17%
(p < 0.05) 		7 9 18 66
Day 21 2.4 ± 0.8
(n = 44)		 -9% 5 9 32 55
3000 μg/ml Day 14 1.7 ± 0.7
(n = 43)		 41%
(p < 0.001) 		0 44 44 12
Day 21 2.3 ± 0.7
(n = 43)		 -5% 0 14 47 40
비히클
NaCl
IVT D0, D7		 0.9% Day 14 2.9 ± 0.5
(n = 48)		 - 0 4 6 90
Day 21 2.2 ± 1.0
(n = 48)		 - 6 21 23 50
수치 데이터는 프리젠테이션을 위해 반올림 되었음을 참고, 따라서 수동 재계산은 약간 다른 값을 나타낼 수 있음.
결과의 요약은 도 39에 제공된다.
동물들의 일반적인 행동은 XG-102의 양쪽 투여량의 초자체내 투여 이후 변화되지 않았다. 관련 합병증은 임상적 후속 조치 동안 발견되지 않았다.
동물 체중은 연구 기간 동안 증가되었다: XG-102 300 μg/ml 및 3000 μg/ml 대하여 각각 + 53 g (+ 29%) 및 + 62 g (+ 34%), 대(versus) 비히클 그룹 및 비처리군에 대하여 각각 + 56 g (+ 31%) 및 + 59 g (+ 34%). Kenacort®로 처리된 동물은 21 g(+12%)의 체중 증가를 보였다.
비히클 그룹에서, 유도된 눈은 레이저 손상 이후 14일 및 21일에 일관된 플루오레세인 누출을 보였다. 평균 플루오레세인 누출은 ChNV의 형성 및 심각성을 가리키는 누출 점의 100%와 함께 14일에 2.9 ± 0.5
(n = 48 임팩트(impacts))였다. 21일에, ChNV의 형성은 누출점의 94% 및 2.2 ± 1.0 (n = 48 impacts)의 평균 플루오레세인 누출의 94%와 일치하는 것으로 남았다.
0일 및 7일에 Kenacort® (200 μg/투여)의 두 초자체내 투여는 14일 및 21일에 Kenacort® retard에 대하여 0.1 ± 0.3 (p < 0.001) 및 0.3 ± 0.5 (p < 0.001) 대(versus) 비히클에 대하여 2.9 ± 0.5 및 2.2 ± 1.0) 각각 평균 점수와 함께 유도 이후 14일 및 21일에 ChNV 형성의 빈도를 억제하였다. 14일에, 병변의 13%는 참조-처리된 그룹에 누출을 보이는 동안 100%는 비히클 그룹에 누출을 보였다. 21일까지, 누출 점의 빈도는 비히클 (94%)에 비해 Kenacort® retard (31%)와 함께 감소되어 유지되었다.
300 μg/mL 및 3000 μg/mL에서 XG-102로 처리된 동물은 비히클에 비해, 낮은 투여량에 대해 2.4 ± 0.9의 평균 점수와 함께 17%까지(p<0.001), 및 높은 투여량에 대해 1.7 ± 0.7의 평균 점수와 함께 41%까지(p<0.001) 14일에 맥관 누출의 현저한 감소(p<0.05)를 보였다. 21일에, XG-102의 양쪽 투여량은 비히클에 비해 맥관 누출의 상대적인 감소를 보이지 않았다.
3점을 갖는 점들의 비율의 감소가 비히클 대조군에 대해 3점인 점들의 90%에 비해, 낮은 및 높은 XG-102 농도 각각에 대해 3점의 66% 및 12%로 나타난 것과 같이, 14일에 300 μg/ml 및 3000 μg/ml XG-102 그룹에 대해 기록되었다.
ChNV를 측정하는 해부학적 및 기능적 매트릭스(metrics)를 사용하고 주어진 실험 환경 하에, 300 및 3000 μg/ml에서 초자체내 투여된 XG-102는 마지막 투여 이후 7일 (연구의 14일) 맥관 누출을 억제하였다.
실시예 19: 아드리아마이신-유도된 신증(nephropathy)에 XG -102의 효과
본 실시예의 목적은 염증성 신장병, 신증에 XG-102의 효과를 연구하는 것이다. 아드라이마이신 처리는 랫 및 쥐에 인간 국소 분절 및 사구체 경화증(focal segmental and glomerular sclerosis) (FSGS)처럼 보이는(mimicking) 사구체 질병을 유도한다. 본 모델에서, 관 모양 및 세포간 염증성 병변은 질병 과정 동안, 부분적으로 심한 단백뇨에 의해 발생한다. 치료(therapy)가 없으면, 신장 질병은 8주 내에 말다 신부전으로 진행한다. 족세포(Podocyte) 손상은 사구체 경화증을 유도하는 서열 내 초기 단계의 하나이다. 본 연구의 목적은 XG-102가 신장 장애 및 신부전의 발달을 예방할 수 있는지 조사하는 것이다.
XG-102 (대조군 NaCl 0,9%)는 랫 i.v.에 투여된다. 총 50마리 랫, XG-102 (낮은 투여량 (20 μg/kg), 중간 투여량 (200 μg/kg) 및 높은 투여량 (2000 μg/kg) 수용된 3개 그룹(10마리의)으로 처리되었다. 이들 세가지 그룹의 모두 (및 플라시보 그룹)은 0일에 10 mg/kg 아드리아마이신으로 처리되었다. 10마리의 다섯번째 그룹은 아드리아마이신을 전혀 수용하지 않았고 NaCl 대조군으로 처리되었다. 조직학적 재료(Histological preparations)는 8, 14, 29 및 41일에 제공되었다. 이들 조직학적 재료는 명백하게 XG-102가 - 전체 관찰 기간 동안 - 아드리아마이신 유도된 신증에 현저한 양성적 효과를 가짐을 가리킨다. 신증 조직은 세포 손실로부터 현저하게 회복되었다, 도 42 내지 45 참조). XG-102에 의한 처리 없이 또는 XG-102에 의한 처리와 함께 c-jun 발현에 효과는 도 46 및 47에 각각 제공된다.
추가 연구에서, 40마리 수컷 Sprague-Dawley 랫 (Charles River)이 사용되었다 (10마리 랫의 4개 그룹으로 나눔). 신증은 0일에 아드리아마이신 10 mg/kg의 단일 정맥내 주사에 의해 유도되었다. XG-102 (SEQ ID NO: 11; 2 mg/kg; NaCl 0.9% 내)는 0일에 꼬리 혈관 내 정맥 내 투여되었다. 투여 부피는 0.2 ml 이었다.
하기 표는 무작위 할당을 요약한다:
그룹 N° ADR
(0일)		 처리
(0일)		 투여량 부피/ 투여 경로 투여 농도 동물의 수
1 10 mg/kg NaCl 0.9% 0.2 ml, IV 0 10
2 10 mg/kg XG-102
2 mg/kg		 0.2 ml, IV 1 mg/ml 10
3 NaCl 0.9% NaCl 0.9% 0.2 ml, IV 0 10
4 NaCl 0.9% XG-102
2 mg/kg		 0.2 ml, IV 1 mg/ml 10
각 날짜에, 모든 동물의 일반적인 행동 및 외양이 관찰되었다. 동물의 건강은 감시되었다 (빈사 상태(moribund) 동물, 체중의 비정상적 주요 감소, 물질의 주요 불내성(intolerance) 등). 랫은 제거되지 않았다.
혈액은 그룹 당 4마리 랫으로부터 7, 14, 28, 42 및 56일에 꼬리 혈관으로부터 채집되었다. 혈청 크레아틴 농도, 혈중 요소 및 프로티데미아(protidemia)는 Advia Chemistry 1650 (Bayer Healthcare AG, Leverkusen, Germany)로부터 적절한 키트를 사용하여 측정되었다. 그룹 당 두마리 랫은 마취 이후 7, 14, 28, 42 및 56일에 희생되었다. 동물 희생 이후, 양쪽 신장을 채집하였다. 조직학적 실험을 위해 고정된 조직 표본은 세립도 알코올(graded alcohol) 용액에 탈수, 톨루엔에 정화(cleared), 및 파라핀에 매립되었다. 섹션 (4 μm)들은 과요오드산 시프(periodic acid-Schiff, PAS)로 염색되었고, 메이신 트리크롬(Masson's trichrome) 염색은 콜라겐 침적을 검출하는데 수행되었다. 사구체 및 세뇌관 간질(tubulointerstitial) 경화증은 현미경으로 정량되었다.
결과는 Microsoft Excel® 소프트웨어를 사용하여 개별적인 형태 및 요약된 데이터 표로 표현되었다. 수치 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)으로 표현되었다. 실험된 동물의 수가 적기 때문에, 통계적인 분석은 수행되지 않았다.
질병의 진행 동안 신장 기능에 XG-102의 효과:
요소 및 크레아티닌 혈청 수준은 신장병 과정 동안 신장 기능을 연구하기 위해 측정되었다. 크레아티닌이 열량 투여(calorimetric dosage)를 방해하기 때문에, 오직 요소만이 신장 기능의 양호한 표지자로 분석되었다. 요소 혈청 수준은 비처리된 랫에서 현저하게 안정하므로 (5 mmol/l 이하), ADR은 말단 신장해를 나타내는 28일부터 41일에 25 mmol/l까지, 이후 56일에 48 mmol/l까지 급격하게 증가하는 요소 수준의 점진적인 증가를 유도하였다 (도 38 B). 다른 한편으로, XG-102 처리된 랫은 질병의 과정에 전반적으로 10 mmol/l 이하의 요소 혈청 수준을 보였다 (도 48B). 다른 한편으로, XG-102 처리된 랫은 질병의 과정에 전반적으로 10 mmol/l 이하의 요소 혈청 수준을 보였다 (도 48B). XG-102 단독으로 처리된 랫의 신장 기능은 0.9% NaCl 처리된 랫과 유사하였다. 이들 결과는 XG-102가 신장병 및 신부전증의 진행을 예방함을 제안한다.
조직 병리학적 발견(PAS 및 메이슨 트리크롬 염색(Masson trichrome staining)):
ADR-유도된 구조적 변화는 광학 현미경으로 평가되었다. 식염수 처리된 대조군 랫은 형태학적으로 일반적인 사구체와 세뇨관을 보였다. 8일에, 광학 현미경 실험은 국소 분절 사구체경화증을 갖는 일부 구역 및 ADR 신증 그룹에 및 단백질성 캐스트(casts)를 보였다. 대조적으로, 비록 일부 세관(tubules)이 XG-102 처리된 랫에 단백질로 채워지더라도, 사구체는 부재 또는 사구체간질의 세포과다(mesangial hypercellularity)와 함께 일반적인 구성(architecture)을 보이는 반면, 세관 구조 및 간질(interstitium)은 병리학적 변화를 보이지 않았다 (도 49). 14일까지, ADR 처리된 랫은 점진적인 사구체 경화증, 히알린 디포짓(hyaline deposit), 세관 팽창(tubular dilation) 및 캐스트(cast) 형성을 보였다. 사구체 경화증의 정도는 이러한 그룹에서 급격하게 나빠졌고, 심각한 세균 위축(tubular atrophy) 및 간질 섬유화(interstitial fibrosis)와 관련된, 29일 및 41일까지 대부분의 사구체에서, 사구체 다발 및 보우먼 공간(Bowman's space) 사이에 명확한 접착과 함께 확산되었다. 56일에, 확산 사구체 경화증은 모든 사구체에서 발견되었다 (도 50). 그러나, XG-102 처리된 랫은 8일에 상대적으로 일반적인 형태를 가지며, ADR 처리된 랫에 비해 56일에 몇몇 국소 및 분절 사구체 경화증 및 세뇨관 간질성 섬유증을 발달시킨다. 완전히, 이들 결과는 XG-102가 사구체 및 세뇨관 간질성 섬유증의 발달을 예방함을 강력하게 제안하며, 이러한 그룹에 신장 기능의 보존을 설명할 수 있다.
본 연구 결과는 XG-102가 ADR에 의해 유도된 사구체 및 세뇨관 간질성 손상의 진행을 예방한다는 증거를 제공한다. 게다가, 이러한 분자는 신장 기능을 보호한다.
실시예 20: 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 (PAN) 유도된 신장해에 XG -102의 효과
본 연구의 목적은 56일 동안 랫에 만성 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 유도된 신장해에 XG-102의 효과를 평가하는 것이다. 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 (PAN)은 손실(loss) 및 족세포 발 진행의 융합을 유도하는 족세포(podocyte) 독소이다. PAN 유도된 신증은 인간 특발성 신증후군(idiopathic nephritic syndrome) 및 국소 분절 사구체 경화증의 잘 설명된 모델이다(Pippin JW, 2008). PAN 신증으로 랫에 보이는 사구체의 형태적 변화는 인간 미세 변화 질환(minimal change disease, MCD) 및 국소 분절 사구체 경화증 (FSGS)의 것들과 가깝게 닮았다. 랫에 PAN의 복강내 투여는 단백뇨, 저알부민혈증(hypoalbuminemia) 및 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) (급성기)에 의해 특징지어지는, 신장 증후군의 빠른 발달을 초래한다. 이는 인간MCD의 동물 모델에서 확립되었다. 국소 분절 사구체 경화증의 병리학적 병변은 반복된 복강내 PAN 주사에 의해 유도된 만성 PAN 신증에 관찰되었다(Nakajima, T., Kanozawa, K., & Mitarai, T. (2010). Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis. J Saitama medical university, 37(1)). 손상의 메커니즘에 따라, PAN은 만성 단계에 사구체 경화증 및 간질성 섬유증(interstitial fibrosis) (Hewitson TD, 2012)을 포함하는 반응성 산소종(ROS) 및 조직 손상의 생산을 통해 직접적인 DNA 손상을 유발한다.
본 실험에서 90마리의 수컷 위스타 랫(Wistar rats) (Charles River, France)가 사용되었다 (15 랫의 6개 그룹으로 나눔). 신증을 유발하기 위해 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드(PAN)은 0일에 130 mg/kg (5 ml/kg)의 투여량 및 14일에 60 mg/kg (5 ml/kg)의 투여량으로 복강내로 투여되었다 (Nakajima, T., Kanozawa, K., & Mitarai, T. (2010). Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis. J Saitama medical university, 37(1)). 대조군 랫 (그룹 1)은 0일 및 14일에 식염수 i.p의 동일한 양을 수용하였다. XG-102 또는 이의 비히클(NaCl 0.9%)은 0일에 첫번째 PAN 주사로부터 시작해서 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일에 총 7번의 주사로 일부일에 한번(그룹 1 내지 5) 꼬리 혈관에(i.v.) 투여되었다. 별도의 실험 그룹에서 (그룹 6), XG-102는 0일에 PAN 주사 이후 21일부터 시작하여 21, 28, 35 및 42일에 총 4번 주사를 일주일에 한번 꼬리 혈관(i.v.)으로 투여되었다.
XG-102 투여를 위해 XG-102 파우더는 실험되는 가장 높은 농도에 비히클 NaCl 0.9%에서 용해되었다. 가장 높은 농도는 이후 낮은 농도를 위한 저장 용액을 나타낸다. 각 저장 용액은 필터 (0.2 μm) 멸균되었다. 투여되는 낮은 농도 용액은 i.v. 주사를 위한 부피에 따라 식염수 (0.9% NaCl) 내 여과된 저장 용액을 희석하여 제조되었다.
하기 표는 실험 그룹을 요약한다:
그룹 PAN (i.p.) 처리 (i.v.) i.v. 투여 횟수 동물/그룹의 수
1 no 비히클 7 15
2 yes 비히클 7 15
3 yes XG-102 (1 mg/kg) 7 15
4 yes XG-102 (2 mg/kg) 7 15
5 yes XG-102 (4 mg/kg) 7 15
6 yes XG-102 (4 mg/kg) 4 15
본 연구 설계는 도 51에 나타내었다. 간단하게 0일 및 14일에 PAN또는 이의 비히클 (식염수)는 신증(nephropathy)의 유도를 위해 주사되었다. 0일 및 14일에, PAN이 우선 투여, 이후 XG-102 투여되었다. 0일 내지 42일에 XG-102 또는 이의 비히클(NaCl 0.9%)은 상기 설명된 i.v. 경로를 통해 일주일에 한번 투여되었다.
동물들은 일주일에 한번 계량되었다. 모든 PAN 처리된 동물들은 체중의 감소를 보였다. 그러나, 모든 PAN 처리된 동물들은 체중에 대해 동질적(homogeneous)이었다, 즉 XG-102의 효과는 체중에 PAN/식염수 그룹 (그룹 2)에 비해 관찰되지 않았다.
56일에 동물들은 희생되었고 샘플(혈액 및 신장)은 채집되었다. 특히, 혈액 및 신장에 대해 채집되는 동물들은 펜토바비탈 (60 mg/kg; Ceva Sante Animale; Libourne, France)의 주사에 의해 마취되었다. 혈액 샘플은 복부 정맥으로부터 수집되었고, 응고(EDTA 3K; 30 분, 4°C)를 위해 튜브로 전송된 이후, 혈장 채집을 위해 원심분리(10 분, 3000 rpm, 4°C) 되었다. 혈장은 크레아티닌 및 요소 분석을 위해 사용될 때까지 -20°C에 저장되었다. 신장은 제거되었고, 모든 연결 조직 및 캡슐로부터 깨끗하게 되었고 전자 미세저울(Mettler, Toledo)에 계량되었다. 신장 샘플은 24-72h 동안, 특히 48h, 포르말린 용액 10%(Sigma Aldrich, France) 내 고정된 이후, 파라핀에 매립되었다. 세가지 구획 (3 내지 5 μm)는 블록 당 제조되었다. 슬라이드는 형태학적 변화, 사구체 경화증 및 간세포 섬유증 정량의 조직학적 평가를 위해 각각, 헤마톡실린/에오신(HE), PAS-메텐아민 실버 및 시리우스 레드를 통해 염색되었다. 모든 슬라이드는 Hamamatsu (Japan)로부터 Nanozoomer 2.0 HT를 사용하여 X20에서 디지털화 되었다. 조직학적 준비(preparation) 및 이미지화는 Histalim (Montpellier, France)을 통해 수행되었다. 혈장 크레아티닌 및 요소는 Phenotypage platform of Genotoul (Rangueil Hospital, Toulouse, France)에 의해 ABX Pentra 400 Clinical Chemistry analyzer (HORIBA)를 사용하여 정량되었다.
결과는 전문 조직병리학자 평가에 따라 반-정량적인 점수화를 통해 나타났다. 사구체 경화증의 조직학적 실험을 위해 사구체 변화는 본 발명에 참조로 병합되는 Nakajima, T., Kanozawa, K., & Mitarai, T. (2010). Effects of edaravone against glomerular injury in rats with chronic puromycin aminonucleoside nephrosis. J Saitama medical university, 37(1)에 의해 설명된 반 정량적 점수화 시스템을 사용하여 평가되었다. 간단히, 사구체 손상의 정도는 동물 당 50개 사구체의 전체에 대하여, 신장 구획(동물 당 2개 구획) 당 25개 사구체에 측정되었다. 개별적인 사구체에 손상의 정도는 사구체 관여의 백분율에 기초하여, 0 내지 4 규모를 사용하여 등급화되었다.
Score 0: 일반,
Score 1: 사구체의 25%까지의 병변,
Score 2: 사구체의 25-50% 사이의 병변,
Score 3: 사구체의 50-75% 사이의 병변, 및
Score 4: 사구체의 75-100% 사이의 병변
모든 데이터는 평균 값 ± 평균의 표준 오차(s.e.m.)으로 계산되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism, version 4 (GraphPad Software Inc., LaJolla, USA)를 사용하여 수행되었다. 이원 변량 분석(two-way ANOVA)을 사용하여 모든 그룹의 비교는 체중 결과에 대한 본페로니(Bonferroni's) 후기-실험에 따랐다. 그룹 1 (식염수/식염수) 및 그룹 2 (PAN/식염수) 사이의 비교는 언페어드 스튜던트 t-테스트(unpaired Student t-test)를 사용하여 수행되었다. 비히클 및 XG-102의 효과는 뉴먼-쿨즈(Newman-Keuls) 테스트 이후 일원 변량 분석(one way ANOVA)을 사용하여 비교되었다. P<0.05 값은 통계적 현저성으로 수용되었다. 그룹 2 (PAN/비히클) 및 그룹 6 (PAN/XG-102 4mg/kg-4 iv) 사이의 비교는 언페어드 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행되었다.
사구체 경화증 손상의 결과는 도 32에 나타내었다. 본 연구의 주요 목적의 하나는 랫에 반복된 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 주사에 의해 유도된 국소 분절 사구체 경화증(FSGS)의 확립된 모델에 사구체 경화증 손상을 평가하는 것이다. 결과는 XG-102의 7 iv 주사는 투여량 의존적 방식으로 PAN-유도된 사구체 경화증을 현저하게 감소시키는 것으로 보였다. 그러나 1 mg/kg의 투여량은 이러한 병리학적 특징에 효과가 없었다. 21일 시작으로부터, 4 mg/kg 투여량의 XG-102의 4 iv 주사는 PAN에 의해 유도된 사구체 경화증을 감소시키는데 XG-102의 강한 효과를 초래하였다 (도 52).
사구체 손상의 결과는 도 53에 나타내었다. 본 연구의 주요 목적의 하나는 랫에 반복된 PAN 주사에 의해 유도된 사구체 손상에 XG-102의 효과를 평가하는 것이다. 본 결과는 XG-102가 (i) 2 및 4 mg/kg의 투여량에 7 iv 주사가 병변의 심각(사구체 손상 점수) 뿐만 아니라 또한 현저하게 감소된 사구체 손상 빈도(손상된 사구체의 백분율)의 심각(severity)의 기간에 PAN-유도된 사구체 경화증을 현저하게 감소시키는 예방적 효과를 가지며, (ii) XG-102는 후기-PAN 투여 21일로부터 시작하여, 4 mg/kg 투여량의 XG-102의 4 iv 주사가 병변(사구체 손상 점수) 및 사구체 손상 빈도(손상된 사구체의 백분율)의 모든 심각의 기간에 사구체 경화증에 강한 효과를 유도하는 치료 효과를 가짐을 보였다.
실시예 21: 당뇨병성 신증의 랫 모델에 XG -102의 만성 투여의 효과
본 연구의 목적은 당뇨병성 신증의 랫 모델에, JNK 억제자 펩타이드, XG-102 (1, 2, 4 mg/kg, 9주 동안 매주 정맥 투여)의 만성 투여의 효과를 평가하는 것이다. 로사르탄(Losartan)은 양성 대조군으로 사용되었다.
Charles River (Margate, Kent)로부터 74마리 수컷 스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 랫 (200-250g; 4마리 예비 동물 포함)이 사용되었다. 랫은 고지방식 (지방으로부터 유래된 kcal의 D12492 60%) 및 수돗물에 항상 접근할 수 있는 폴리프로필렌 케이지에 쌍으로 수용되었다. 먹이는 Research Diets, New Jersey, USA로부터 구매하였다. 모든 동물들은 일반 광(불을 켬: 07:00-19:00)에 21±4oC 및 55±20% 습도에 유지되었다.
본 연구 스케줄은 도 54에 나타내었다. 동물들은 본 연구 전체에 걸쳐 쌍으로 수용되었다. 3주령 동안, 그들은 매주 계량되었다(음식 및 물은 오직 세번째 주 동안 두번 계량될 것이다 (즉 월요일 및 목요일에 STZ 투여 전 주). 습관화(habituation)의 세번째 주 동안, 혈액 샘플은 휴대용 글루코스 미터 (One Touch Ultra 2)를 사용하여 자유로운 식이 상태에 측면 꼬리 정맥으로부터 채집되었다. 혈액 채집은 약 09:00부터 시작되었다.
본 연구의 규모로 인해, 동물들은 72시간의 위상(out of phase) 두개의 분리된 집단 (각 n=4 또는 6 가능한한 쌍을 이룬 수용)으로 수행되었다. 약 40마리 동물은 집단(Cohort) A 및 잔여 30마리는 집단 B에, 체중, 혈장 포도당 및 음식 및 물 섭취에 가능한한 균형을 맞추어 할당되었다. 당뇨병의 유도를 위해 스트렙토조토신(STZ)이 사용되었다. STZ로 투여된 동물의 당뇨병 형질이 STZ의 묶음(batch)에 매우 의존적이므로, 선행 연구는 최적의 STZ 투여량 (35 또는 45 mg/kg ip)을 확인하기 위해 수행되었다. STZ 또는 비히클은 동물들이 도 34에 구체적으로 설명된 것처럼 약 3주 동안 식단에 유지된 이후 주어졌다. 예비 동물들은 STZ (집단 당 1쌍)로 투여될 것이다.
그룹 투여(ip) 집단(Cohort) A 집단(Cohort) B
A 비히클 0.05M 시트르산 pH 4.5 ip 4 6
B-G STZ (선행으로부터 선택됨(selected from pilot)) ip 36 24
동물들의 각 쌍은 동일한 처리로 투여되었다 (즉 양쪽 다 비히클-처리된 것 또는 양쪽 다 STZ-처리될 것). 후기 STZ 투여 7일 기간 동안, 동물들은 매일 계량되었고 음식 및 물 흡수는 매주 두번 결정되었다. 잔여 연구 기간 동안, 동물들은 계량되었고 물 및 음식 섭취는 매주 두번 측정되었다 (항상 정맥내 투여일에 및 전형적으로 물 보충일(s)에). 그 후, 체중 및 가능한 음식 및 물 섭취 후기 STZ에 기초하여, 동물들은 투여 방식에 차이에 비추어 하기 설명된 것처럼 그룹 B-F로 할당되었다.
그룹 투여 집단 A 집단 B
B-E IV 투여 24 16
F-G PO 투여 12 8
STZ(또는 비히클) 처리 1주후에 혈액 샘플은 자유 식이 상태에 글루코미터 (One Touch Ultra2)를 사용하여 측면 꼬리 혈관으로부터 채집되었다 (혈액 샘플은 약 09:00 시작에 수집됨). 그 후, 그룹 A-E에 동물들은 정맥내 경로를 통해 비히클로 투여되었고, 그룹 F-G에 동물들은 구경 경로를 통해 1% 메틸 셀룰로오스로 투여되었다. 그룹 F-G의 동물들은 매일 약 09:00에 시작하여 매일 한번 투여를 계속하였다. 동물들은 투여 전에 계량되었다 (본 계량이 기록됨). 음식 및 물은 오직 정맥내 그룹 (A-E)과 같이 동일한 날에 기록되었다.
이러한 기준 단계는 일주일 동안 지속되었다. 주말을 향하여 동물들은 혈당, 및 가능한 체중 및 음식 및 물 흡수 데이터에 기초하여 약물 처리에 할당되었다. 할당은 하기 표와 같이 설명된다:
그룹 그룹 STZ 집단 A 집단 B 전체 N
A 비히클 (식염수) - NON-STZ NO 4 6 9-10
B 비히클 (매주 식염수 iv) STZ 6 4 9-10
C XG-102 (매주 1 mg/kg iv) STZ 6 4 9-10
D XG-102 (매주 2 mg/kg iv) STZ 6 4 9-10
E XG-102 (매주 4 mg/kg iv) STZ 6 4 9-10
F 비히클 (매일 메틸 셀룰로오스 po) STZ 6 4 9-10
G 로사르탄(Losartan) (매일 25 mg/kg po) STZ 6 4 9-10
투여는 9주 동안 지속되었다 (총 9번 투여, 도 54 참조). 그룹 F 및 G에 동물들은 계량되었고 약 09:00에 매일 투여되었다. 그룹 A-E내 동물들은 정맥내 경로를 통해 일주일에 한번 투여되었다 (도 54에 설명된 것처럼). 모든 그룹에서, 음식 및 물 흡수는 일주일에 두번 결정되었다 (iv 투여하는 날 및 물 보충하는 날에). 혈당은 매달 결정되었다. 샘플들은 글루코미터(One Touch Ultra2)에 의해 사전에 설명된 것처럼 채집되었다. 혈액 샘플은 자유 식이 상태에서 채집되었다 (약 09:00에 시작). 동물들은 시간이 정해진 계획에 각각의 경로에 의해 직후 투여되었다. 투여 이후, 각각의 동물은 24시간 동안 음식 및 물에 대한 접근이 자유로운 대사성 케이지에 놓여졌다. 증발을 감소시키기 위해, 유리 소변 수집기를 폴리스티렌 용기(Sca-online, UK)에 놓아 두었으며, 이는 얼음으로 채워졌다. STZ와 함께 매일 소변 부피에 증가가 예상되기 때문에, 소변은 각 대사성 케이지에 대한 24시간 총 소변 부피가 기록될 수 있도록 간격(예를 들어 8시간 마다)을 두어 채집(및 냉장 보관)되었다. 각 시점에 부분 표본은 모아졌고, 동물 당 단일 24시간 샘플이 채집되었다. 24시간 모아진 소변의 300 μl의 부분 표본은 채집되고 -80°C에서 냉동되었다. 크레아티닌, 글루코스, 요소, 총 단백질 및 전해질 (Na, K, Cl 및 Ca)은 COBAS C111 및 관련된 시약을 사용하여 소변 샘플에 결정되었다 (모든 소변 분석에 대하여 n=2). 소변 채집 기간을 위해, 랫은 케이지에 교체 시간 및 제거시에 계량되었다. 소모된 음식 및 마신 물 또한 계산되었다. 혈당 및 소변 파라미터 (크레아티닌, 글루코스, 요소, 총 단백질 및 전해질)은 상기 설명된 투여의 추가 개월이 지난 이후에 다시 결정되었다 (도 54 참조).
8주 처리 동안 (도 54 참조), 동물의 사구체 여과 속도 (GFR)는 FITC-이눌린(inulin) 방법을 사용하여 측정되었다. 이는 본 발명에 참조로 병합된 Stridh, S., Sallstrom, J. et al (2009): "C-Peptide Normalizes Glomerular Filtration Rate in Hyperfiltrating Conscious Diabetic Rats" Oxygen Transport to tissue XXX. Advances in experimental medicical and biology. 645:219-25의 방법에 기초하여 수행되었다. 구체적으로, FITC-이눌린 (1.5%)는 식염수에 용해되었고 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과되었다. 잔여 자유 FITC를 제거하기 위해, 용액은 1000 Da 컷-오프(cut-off) 투석막 (Fisher UK로부터 Spectra Por 6)을 사용하고 빛으로부터 보호하여 4 ℃에서 밤새 2000 ml의 식염수에서 투석되었다. 투석된 인슐린은 사용전 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과되었다. 각 동물은 꼬리 혈관을 통해 (즉 정맥 내) FITC-이눌린의 1 ml (15 mg)으로 투여되었다. 투여 후 2, 5, 9, 15, 24, 35, 55, 80 분에 혈액 샘플 (80 μl)은 리튬-헤파린 채집 튜브(Sarstedt CB300LH)에 수집되었다. 저온 원심분리로 원심분리를 거친 각 혈액 샘플 및 혈장 샘플은 496 nm 여기(excitation) 및 520 nm 방출(emission)에서 형광의 차후 결정을 위해 클린(clean) 부분 표본 바이알에 나누어졌다.
최종적으로, 동물 및 음식 및 물은 계량되었다. 동물들은 이후 죽여졌으며 최종 혈액 샘플 (EDTA-코팅된 튜브에 약 4.5 mL)은 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 채집되었다. 혈액 샘플은 저온 원심분리에 회전되었고 부분 표본 (0.5 mL의 5개 부분 표본)은 냉동 저장되었다 (-80℃). 검시(necropsy)에, 좌측 및 우측 신장은 제거 및 계량되었다. 각 신장은 시상적으로(sagittally) 두개의 절반으로 절단되었고 약 5일 동안 고정을 위해 10% 중성 버퍼 포르말린의 포트(pot)에 놓아졌다. 상기 신장은 이후 왁스에 내장되었고 각 신장으로부터 하나의 절반은 그 다음 가공을 위한 하나의 왁스 블록을 생산하기 위해 각 카세트(cassette)에 놓았다 (즉 하나의 절반 오른쪽 신장 및 하나의 절반 왼쪽 신장과 함께 하나의 블록). 나머지 신장 절반은 폐기되었다. 왁스 블록을 위해, 모든 조직은 Tissue Tek VIP 프로세서(탈수를 위해 등급화된(graded) 알코올 및 클리어런트(clearant)로 자일렌(xylene)을 사용)를 사용하여 준비되었다. 상기 블록은 이후 새로운 히스토(histo)-왁스에 내장 전에 파라핀 히스토-왁스로 침윤되었다. 신장 조직은 약 4-5μm에서 구획화되었고 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 과요오드산 쉬프(periodic acid Schiff, PAS)를 위한 방법을 사용하여 염색되었다. 그 다음, 슬라이드는 병리학자에 의한 측정을 위해 송부되어질 것이다 (예를 들어 Harlan Laboratories Ltd. UK에). 병리학자는 "+, ++, +++" 시스템(또는 유사)을 사용하여 반 정량적으로 사구체 경화증, 세관 위축 및 간세포 팽창에 대해 H&E 및 PAS에 의해 염색된 모든 슬라이드를 평가하였다.
XG-102는 시판중인 멸균 식염수에 1 ml/kg 부피로 투여되었다. 이의 끝에, XG-102는 가장 높은 투여가 제조되고 (4 mg/ml) 보다 낮은 투여가 이러한 4 mg/ml 저장의 희석에 의해 제조되는, 멸균 식염수의 첨가에 의한 첫번째 투여 전에 제조되었다. 부분 표본은 이후 각 투여 세션(session)을 위해 제조되었고 사용시까지 냉동 보관되었다(-80℃, -80℃에서 3개월 안정성). 투여하는 날의 아침에 각 부분 표본은 냉동고로부터 제거되었고 투여 전에 실온에서 해동되었다 (예를 들어 약 30분). 해동 용액은 투여 전에 인버전(inversion)에 의해 혼합되었다. 모든 투여는 실험 물품은 8시간 동안 10 μg/ml - 50 mg/ml의 농도에 실온에서 식염수에서 안정하기 때문에, 8시간 이내에 해동 이후 가능한한 빠르게 그러나 모든 경우에서 완료되었다. 멸균 폴리프로필렌 플라스틱(피펫 팁을 포함)이 사용되었다. 저장 용액은 보다 낮은 투여를 위해 사용 전 및 희석 전에 필터 멸균(0.2 μm)될 것이다. 로사르탄 포타슘은 Chemical supplier (예를 들어 Tocris UK)로부터 구매하였고 5 ml/kg의 부피로 1% 메틸 셀룰로오스의 비히클에서 각 아침에 투여를 위해 제조되었다. 투여 인자는 적절한 곳에 적용되었다.
연구의 말단에, 체중 및 음식 및 물병의 중량은 분석되었다. 결과는 체중으로, 첫번째 4주 동안 매주 및 그후 4주 마다 체중의 변화, 및 전체 약물 투여 기간에 걸쳐, 연구의 말단에서 체중의 % 감소 및 대조군에 비해 약물 처리, 첫 4주 동안 매주마다 및 이후 4주 마다 및 급식 연구의 기간에 걸쳐 식품 및 물 섭취, 누적 음식 섭취 및 평균 음식 및 물 섭취에 변화로 나타났다. 체중에 다른 처리의 효과 및 식품, 누적 식품 및 물 흡수는 인자로 처리 및 집단 및 공변인(covariate)으로 기준점(1일 체중 또는 -6일 내지 0일에 평균 식품 또는 물 소모)과 함께 공분산(covariance)의 이원 분석을 통해 분석되었고, 이후 적절한 STZ 비히클 그룹에 대해 각 그룹을 비교하기 위해 적절한 다중 비교 검정(multiple comparisons tests) (양측(two-tailed))이 수행되었다. 혈당은 인자로써 처리 및 집단과 공변인으로써 기준점 체중, 출혈 순서 및 사전 연구 혈장 수준과 함께 일반 선형 모델에 의해 분석되었다. 적절한 변형 및/또는 로버스트 회귀분석(robust regression) 기술은 이상치의 영향을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 적절한 다중 비교 실험(양측)은 적절한 STZ 비히클 그룹에 대해 각 그룹을 비교하는데 사용되었다. 소변 크레아티닌, 글루코스, 요소, 총 단백질 및 전해질은 처리 그룹 평균 ± SEM으로 나타내었다. 분석은 인자로써 처리 및 집단과 함께 일반 선형 모델에 의해 수행되었다. 적절한 변형 및/또는 로버스트 회귀분석 기술은 이상치의 영향을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 적절한 다중 비교 테스트(양측)은 적절한 STZ 비히클 그룹에 각 그룹을 비교하기 위해 사용되었다. 신장 무게는 인자로써 처리 및 집단 및 공변인으로써 1일 체중과 함께 일반 선형 모델에 의해 분석되었다. 체중의 변화에 의해 유발된 효과가 추가된 효과를 결정하기 위해, 분석은 인자로써 처리 및 집단과 공변인으로써 최종 체중과 함께 일반 선형 모델을 통해 수행되었다. 로그 변형 및/또는 회귀 분석 기술은 적절한 경우에 사용되었다. 적절한 다중 비교 기술은 적절한 STZ 비히클 그룹에 대해 각 그룹을 비교하는데 사용되었다. 병리학적 평가를 위해, 각 처리는 추출 윌콕슨 순위 합 테스트(Wilcoxon rank sum tests)에 의해 적절한 STZ 비히클 그룹과 비교되었다.
GFR은 FITC 이눌린(inulin)/ AUC0 -8의 투여량으로 계산되었다. AUC (FITC 이눌린 농도의)는 0 분에 2 내지 5분 라인의 외삽법(extrapolation)과 함께 로그-선형 사다리꼴 법칙(Stridh) 및 24 내지 80분에 최종 단계 동안 log-변형된 데이터의 선형 회귀분석에 의해 계산되었다. 계산된 GFR 값은 인자로써 처리 및 집단과 함께 변이의 이원 분석을 통해 분석되었다. log 변형 및/또는 로버스트 회귀분석 기술은 적절한 경우에 사용되었다.
GFR을 제외한 모든 분석에, 기준 주가 공변인으로 사용된 기준 값에 영향을 미치는 동안, 다른 경로에 의해 투여되는 것과 같이, po 투여된 동물들(animals dosed po)로부터 각각 분석되었다. 비-STZ 그룹은 상기 설명된 모든 분석으로부터 제외되었다. 분리 분석은 분석 내 모든 그룹을 포함하는, 비-STZ 그룹에 비교를 위해, 그러나, 투여 전 주 동안 그들에 비해, STZ로 처리 전에 기준 공변인을 사용하여 수행되었다. 모든 분석에서 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 현저한 것으로 고려될 수 있다.
랫의 체중에 당뇨병성 신증의 본 랫 모델에 XG-102의 만성 투여의 효과는 도 55에 나타내었다. 오직 비-STZ 처리된 랫이 체중에 증가를 보였다. XG-102 처리된 랫은 STZ 모델에 비히클 처리된 랫에 비해 체중에 차이를 보이지 않았다. 양성 참조 로사르탄으로 처리된 랫의 체중은 그러나 현저하게 낮았다. 이들 결과는 XG-102가 잘 견디는(well-tolerated) 반면, 양성 참조 로사르탄은 체중의 현저한 감소를 초래함을 가리킨다.
실시예 22: 섬 동정/이식에 XG -102에 투여량 반응성의 평가
본 연구는 섬 동정 (실시예 17 참조)에 대한 종전의 연구 및 Noguchi et al. (Noguchi, H., S. Matsumoto, et al. (2009). "Ductal injection of JNK inhibitors before pancreas preservation prevents islet apoptosis and improves islet graft function." Hum Gene Ther 20(1): 73-85.)에 의해 공개된 것에 기초한다. 이들 연구는 섬이 섬 동정 절차의 시작 20분 이후 이르게 시작하는 JNK의 급격한 활성화를 겪는 돼지 섬 동정 모델에 나타났다. 본 활성화는 이미 손상되기 쉬운 조직에 온 허혈(warm ischemia), 효소 소화(enzymatic digestion) 및 기계적 스트레스(mechanic stress)를 조합한 방법의 결과이다. 실시예 17의 연구는 전치료의 시간에 돼지 췌장으로 세척된(flushed) 보존 용액에 XG-102(10 μM)의 정맥내 첨가는 산소 소모 속도 (OCR), 및 ATP 농도에 의해 측정된 섬 세포 생존력 및 기능성에 현저한 영향을 가지며 JNK 활성화 및 c-fos 유전자 발현에 감소와 상관됨을 보였다. Noguchi et al은 다른 억제자를 사용하였고 전치료 직후 췌장 관(duct)으로 동일한 몰 농도로 이를 첨가하였다. 돼지 및 인간 췌장이 사용되었다. 그들은 ATP 농도에 의해 측정된 섬 생존력에 유사한 효과뿐만 아니라, 당뇨병 쥐의 신장 캡슐 아래 이식 전환(reversal) 이후) 당뇨병에 인비보(in vivo) 영향을 보였다. 실험의 본 세트의 목적은 XG-102의 투여량 반응성 곡선 및 섬 동정에 이를 활용하는 최적 농도를 결정하는 것이다. 본 질문에 답하기 위해, 설치류 모델이 활용되었다. 인간 및 설치류 췌장 및 섬 사이에 차이가 인정되더라도, 이러한 모델은 이의 솔직함(straightforwardness) 및 높은 비용 효율 때문에 선택되었다. 이들 실험의 목적은 오직 필요한 XG-102의 최적 투여량의 결정이며, 랫 모델은 유효한 것으로 나타났다. 주요 목적은 임상적 동종 이계(allogeneic) 섬 이식 결과의 향상을 위한 인간 췌장에 JNK 억제이므로, 억제자의 도관내(intraductal) 주사는 이들 실험에 수행되었다. 이는 효과에 가장 좋은 방법이며 화합물은 임상적 셋팅(setting)에 사용될 것이다.
동정 이후 랫 섬에 JNK 활성화를 측정하기 위해, 랑게르한스(Langerhans) 섬은 콜라게나제를 사용하여 전통적 효소 방법을 통해 루이스(Lewis) 랫으로부터 동정되었다. 동정은 동물 희생 직후 또는 온 허혈의 15분 기간 이후에 수행되었다. JNK 활성화는 동정 절차의 마지막에 웨스턴 블롯을 통해 측정되었다. JNK 활성화는 음성 대조군으로 비가공된 랫 췌장으로 측정되었다. 실험은 허혈(ischemia)의 각 조건에 3마리 랫에 음성 대조군 1마리를 추가하여, 3회 반복하여 수행되었다. 이는 총 21마리의 루이스 랫을 나타낸다. 도 56에 나타낸 본 결과는 XG-102 투여량 의존적으로 감소된 JNK(도 56 A) 및 PAF2(도 56B) 인산화는 15분 허혈을 통해 유도됨을 보인다.
섬 생존력에 XG-102의 효과를 연구하기 위해, 허혈의 기간(비 온 허혈 vs 15분 온 허혈)의 관점에서 최적 모델, 즉 JNK 억제 이후 차이를 가장 바람직하게 보일 수 있는 모델은 종전 실험의 결과에 기초하여 선택되었다. 동정은 세트 농도 또는 비히클에서 XG-102를 사용하여, 콜라게나제 용액에 희석되고 췌장의 효소적 소화 전에 췌장관에 주사되어 수행되었다. 동일한 몰 농도의 XG-102 또는 비히클은 다양한 세척 또는 정화(purification) 용액이 활용되고, 배양 배지 내에서, 동정 절차 전체에 걸쳐 사용되었다. 동정된 섬은 RPMI 기초의 배양 배지에 밤새 배양되었다. 각 실험의 세트를 위해, 이후 XG-102 농도는 활용되었다: 1 μM, 3 μM, 10 μM, 50 μM 및 100 μM. 세마리 동물이 각 농도에 대하여 각 그룹 내 활용되었고, 실험은 결과에 기초하여 2-3회 반복되었다. 이는 60-90마리 루이스 랫의 전체를 나타낸다. 섬 생산량(yields)은 결정되었다. 섬 생존력의 그 다음 측정은 수행되었다: JNK 활성화, OCR, ATP 농도, 카스파제 방출 등.
인비보(in vivo)에서 섬 기능에 XG-102의 효과를 연구하기 위해 보충적 동정이 인비보 섬 기능에 JNK 억제의 효과를 측정하기 위해 수행되었다. 인비보 실험은 오직 상기 설명된 인비트로 실험에 가장 효과적인 XG-102 몰 농도 또는 비히클과 함께 사용하여 동정된 섬과 함께 수행되었다. 섬 동정은 상기와 같이 수행되었다. 각 동정을 위해, 1000 및 2000 IEQ는 스트렙토조토신 유도된 당뇨병 면역결핍 쥐의 신장 캡슐 하에 이식되었다. 당뇨병 전환(reversing) 동물의 비율 및 당뇨병의 전환에 필요한 시간은 XG-102 처리된 또는 대조군 섬으로 이식된 동물 사이에 비교되었다. 이식은 3회 반복되었다. 필요한 동물의 수는 약 30마리 루이스 랫 및 24마리 NOD-scid 쥐이다.
도 57에 나타난 것처럼, 랫 췌장의 기능 및 생존력에 XG-102의 효과를 연구하기 위해, 섬은 15분 허혈 랫으로부터 및 비허혈 랫으로부터 섬이 동정되었다. 고정적(static) 인슐린 분비 실험(기본 또는 글루코스를 사용하여 자극됨)은 섬 동정 직후 및 37°C에서 18시간 배양 이후에 수행되었다. 이는 동정이 섬 기능에 영향을 미치는 것으로 관찰될 수 있다. 실제 기본 인슐린 분비는 어떠한 조건에서든 18시간 동안 배양된 섬에 비해 동정 직후 사용된 섬에서 높았다. 이들 높은 기본 수준은 섬의 고통(distress)을 반영한다. 그러나 배양 이후, 허혈 및 억제자 XG-102는 본 실험에서 섬 기능에 영향이 없었다.
종전의 실시예에서 15분 허혈 랫으로부터 섬은 글루코스에 반응하여 대조군 랫으로부터 섬에 비해 동일한 양의 인슐린을 분비하는 것으로 나타났기 때문에, 새로운 실험이 수행되었고, 상기 허혈은 30분 동안 수행되었고 JNK 억제자 XG-102는 100 microM에서 사용되었다 (도 58). 본 실시예에서, 동정 직후 인슐린 분비 실험시 높은 기초(basal) 분비가 여전히 관찰되었다. 게다가, 30분 허혈은 섬 기능에 부정적 영향을 가졌다. 이들 예비 결과는 30분 허혈이 JNK 활성화를 유도하기 위해 15분에 비해 보다 우수한 모델인 것으로 제안한다. 섬이 허혈 랫으로부터 동정되고 XG-102로 배양될 때, 글루코스-유도된 인슐린 분비는 허혈성 랫에 비해 높으며(도 58), 이는 섬 기능에 XG-102의 양성 효과를 제안한다.
실시예 23: 결막하 주사 이후 랫 레이져 -유도된 맥락막 혈관신생( Choroidal Neovascularization, CNV )에 XG -102 ( SEQ ID No. 11)의 효과
본 연구의 목적은 레이저 유도된 맥락막 혈관신생 (CNV)의 모델에 랫에 결막하 주사를 통해 투여될 때, XG-102, JNK 억제자의 효과를 결정하는 것이다. 실시예 18의 맥락에서 개설된 것처럼, 이러한 모델은 연령 관련된 황반 변성(AMD)의 치료를 위한 화합물의 잠재적인 용도에 관하여 예견한다. 실시예 18에 설명된 연구와 대조적으로, 투여의 결막하 경로는 인간에 투여를 위해 다른 바람직한 경로이기 때문에 본 연구를 위해 선택되었다.
하기 실험 그룹들이 할당되었다:
그룹 번호. 실험 물질 투여 수준
( μg /eye) 		투여 부피
( μL /eye) 		투여 농도 동물의 수
수컷
1 비히클 대조군 0 5 0 mg/mL 8
2 XG-102 0.15 5 0.03 mg/mL 8
3 XG-102 1.5 5 0.3 mg/mL 8
4 XG-102 15 5 3 mg/mL 8
5 참조물 2 200 5 4% 8
비히클 대조군, 0.9% NaCl은 리시브(received)로 투여되었다. 트리암시놀론 아세토니드 4%는 "참조물 2"를 제공하며 또한 리시브로 투여되었다. XG-102 제조를 위해, 가장 높은 투여 수준과 동일한 저장 용액이 비히클, 주사용 0.9% 소듐 클로라이드, 및 0.22 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터를 통해 멸균 여과된 것에 제조되었다. 낮은 투여 수준은 저장 용액에 즉시 희석을 통해 제조되었다. 투여 제형은 투여 수준 요구를 충족시키기 위해 적절한 농도로 한번 제조되었다. 모든 희석물은 비히클과 함께 저장 용액을 즉시 희석함으로써 제조되었다. 두가지 투여 부분 표본 (1일 및 8일)은 제조되고 -20°C로 유지하여 냉동고에 저장되었다. 각 투여 수준의 부분 표본(s)은 투여 각 날짜에 주위 온도(ambient temperature)에서 해동되었고 용액은 6시간 이하의 실온에서 유지되었다.
44마리 수컷 브라운 노르웨이 랫 (Charles River; 10주령)이 사용되었다. 14일의 최소 적응 기간은 수용(receipt) 동물 사이 및 연구실 환경에 동물을 적응시키기 위해 치료의 시작에 허용되었다. 동물들은 유사한 그룹 평균 체중을 달성하기 위해 계층화된 무작위 계획에 의해 그룹으로 할당되었다. 건강이 나쁘거나 체중 범위가 극심한 동물은 그룹으로 할당되지 않았다. 투여의 시작 전에, 본 연구에 사용하기에 부적절한 것으로 고려된 어느 할당된 동물들은 동일한 배송으로부터 수득된 대체 동물에 의해 교체되었고 동일한 환경 조건 하에 유지되었다. 투여의 시작 이후, 연구 동물들은 사고 부상, 비-테스트 글 관련된 건강 이슈, 또는 유사한 환경의 경우에 대체 동물로 교체 기간 동안 교체되었다. 대체 동물들은 3일 이내에 연구에 교체로 사용되었다. 도착시 동물들은 무작위화 되기까지 개별적으로 수용되었다. 무작위화 이후에, 동물들은 자동 급수 밸브가 장비된 스테인리스 강 다공성 바닥 케이지에 그룹 수용되었다 (동일한 투여 그룹의 3마리까지 함께). 동물들은 계획된 절차/활성 동안 분리되었다. PMI 영양 국제 보증 설치류 식품(PMI Nutrition International Certified Rodent Chow) No. 5CR4 (14% 단백질)은 연구에 전반적으로, 설계된 절차 동안을 제외하고 임의로(ad libitum) 제공되었다. 역삼투 및 자외선 조사에 의한 처리 이후 지방 수돗물은 자동화된 급수 시스템을 통해 각 동물들에 자유롭게 급여되었다 (계획된 절차 동안 제외). 동물들은 정신적/환경적 강화를 위해 사회적으로 수용되었고 연구 절차/활동 동안을 제외하고, 하이딩 튜브(hiding tube) 및 씹을 수 있는 객체(chewing object)와 같은 물품이 제공되었다.
연구 1일에 레이저 유도된 맥락막 신생혈관(CNV) 절차가 수행되었다. CNV 절차 전에 산동제(mydriatic) 방울 (1% 트로피카미드)가 양쪽 눈에 적용되었다. 추가 실험은 수의 안과 의사(veterinary ophthalmologist)에 의해 적절하게 고려되어 수행되었다. 동물들은 절차 전 및 동안에 이소플루란(isoflurane)/산소 혼합물로 마취되었다. 마취 하에, 4개 점 패턴은 300 mW의 초기 동력 고정에 (레이저 동력은 거품 형성을 위해 증가될 수 있음) 810 nm 다이오드 레이저를 사용하여 각 눈의 시신경 유두(optic disc) 주변에 주요 망막 혈관 사이에, 80 μm의 초기 점 크기 및 0.1 초의 기간에 만들어졌다. 레이저 파라미터는 브루흐 막의 파열(rupture)을 보증하는데 필요하도록 조정되었다. 브루흐 막의 파괴가 특정한 점에 대하여 확인되지 않는 경우에는, 이는 기록되었다. 이러한 경우 또는 출혈(hemorrhage)의 경우, 추가적인 점은 만약 수의 안과 의사에 의해 적절하게 고려될 경우에 첨가될 수 있다. 망막 출혈과 같이 어느 주목할만한 경우는 각 레이저 점에 대해 기록될 수 있다. 만약 출혈이 너무 심각하면, 동물들은 본 연구에서 제외되고 교체될 수 있다. 눈의 건조는 필요에 따라, 절차 동안 식염수 용액 및/또는 카르복시메틸셀룰로오스 소듐 1.0%로 유지되었다.
비히클 대조군, 실험 물품 또는 참조 물품은 상기 실험 설계에서 지시된 것처럼 1일 및 8일에 각 동물의 왼쪽 및 오른쪽 눈에 결막하 주사에 의해 투여될 것이다. 동물들은 투여량(dose) 투여를 위해 마취(이소플루란)되었고, 면허가 있는 수의 안과 의사에 의해 수행되었다. 국소 항생제 (겐타마이신 점안액)는 처리 하루 전, 그 다음 주사 및 주사 이후 적어도 하루에 한번 양쪽 눈에 두번 적용되었다. 투여 전에, 산동제 방울 (1% 트로피카미드 및/또는 2.5% 페닐에프린)은 각 눈에 적용되었다 (추가 적용은 수의 안과의사에 의해 적절하게 고려된 것으로 수행될 수 있다). 투여 동안, 동물들은 이소플루란/산소 가스로 마취 하에 유지되었다. 결막은 주사 USP를 위한 0.9% 소듐 클로라이드로 세척되었다. 0.5 cc 테루모(Terumo) 인슐린 주사기에 부착된 29-게이지, 1/2-인치 바늘이 각 결막하 주사를 위해 사용되었다 (1 주사기/그룹/처리). XG-102, 비히클 대조군 및 참조 물품은 1일 및 8일에 50 mL/eye의 투여 부피로 각 동물의 눈에 투여되었다. 양쪽 눈은 실험 투여 절차에 의해 유발된 어느 비정상을 기록하는 각 처리 직후에 실험되었다.
하기 나열된 살아있는(in-life) 동안 절차, 관찰, 및 측정이 수행되었다. 보다 빈번한 관찰은 만약 필요한 것으로 고려된다면 수행될 수 있다. 하루에 두번, 아침에 한번 및 오후에 한번, 연구 전체에 걸쳐 사망율(Mortality)/빈사(Moribundity) 체크가 수행되어, 동물들은 일반 건강/사망률 및 빈사에 대하여 관찰되었다. 동물들은 가능한 발견의 식별 또는 확인을 위해 필요하지 않으면, 관찰 동안 케이지로부터 제거되지 않았다. 하루에 한번, 주 -1에 시작하여, 케이지사이드(Cageside) 관찰이 수행되었고, 동물들은 가능한 발견의 식별 또는 확인을 위해 필요하지 않을 경우, 관찰 동안 케이지로부터 제거되지 않았다. 매주, 주-1에 시작하여, 구체적인 임상적 관찰이 수행되었고, 동물들은 실험을 위해 케이지로부터 제거되었다. 매주, 주-2에 시작하여, 체중은 오직 건강 감시 목적으로 기록되었고, 동물들은 개별적으로 계량되었다. 매주, 전 처리 기간의 마지막 주 동안 시작하여, 음식 섭취는 오직 건강 감시 목적을 위해 계획된 안락사의 날을 제외하고 정량적으로 측정되었다. 스크리닝 목적의 사전연구에, 안과적 실험이 수행되었고, 모든 동물들은 검안경(funduscopic) (간접 검안경 검사(ophthalmoscopy)) 및 생체 현미경 (슬릿 램프) 실험을 받았다. 사용된 산동제는 1% 트로피카미드이다. 사전 연구에 한번 및 주 1, 2 및 3의 끝에, 플루오레세인 혈관 촬영이 수행되었고, 산동제 방울 (1% 트로피카미드)는 테스트 전에 적어도 10분 각 눈에 적용되었다 (추가 적용은 만약 필요한 것으로 고려될 경우 투여됨). 눈의 수화(Hydration)는 식염수 용액으로 잦은 세척(irrigation)을 통해 유지되었다. 동물들은 필요에 따라, 이소플루란/산소 혼합물 하에 및/또는 진정제 칵테일(케타민 75 mg/kg; 실라진 7.5 g/kg)로 유지되었다. 적외선 및/또는 적색 자유 모드(red free modes)에 단일 및/또는 ART 기저부 이미지는 혈관 촬영을 위한 참조 이미지를 제공하기 위해 수득되었다. 0.2 ml의 10% 소듐 플루오레세인 주사(Sodium Fluorescein Injection) USP는 빠른 꼬리 혈관 주사를 통해(아보카스(abbocath)를 통해) 투여되었고, 그 다음 0.5 ml 식염수 세척(flush) 되었다. 스틸 이미지(Still images)는 플루오레세인 주사 이후 및 및 플루오레세인 주사 5분 이내로 적어도 2분 양쪽 눈으로부터 기록되었다. 평가를 위해 스틸 이미지 상 개별적인 레이저 점들은 후에 합의 점수를 결정하는 2명 독립적인 리더(readers)에 의해 0-4의 범위로 반 정량적으로 누출에 대하여 평가되었다.
플루오레세인 혈관 조영 점수화 절차에서, 첫번째 혈관 조영 이미지 (JPEG 또는 BMP)는 HRA2로부터 수출되고 CD 또는 다른 적절한 매체에 복사되고 적절한 컴퓨터에 검토되었다. 등급화 절차에서 이미지는 등급화를 위한 적절한 초점 수준에서 선택되었다. (1 이미지/눈 이상이 모든 레이저 점을 등급화하기 위해 필요할 수 있다.) 혈관 촬영은 두명의 과학자에 의해 독립적으로 등급화되고 레이저 점의 각각에 대한 등급이 기록되었다. 각자에 의해 등급화가 완성된 이후에, 등급은 비교되었고 어느 불일치는 양쪽의 당사자에 의해 검토되었고, 그에 따라 등급이 동의되고 기록되었다. 등급 규모는 하기 개시된 것처럼 0-4이다:
0 = 비 누출 (오직 레이저 흉터 또는 가시적인 매우 분산된 작은 하이퍼(hyper)-형광 구역).
1 = 최소 누출 (분산의 작은 구역 또는 레이저 유도된 결함 영역 내 남아있는 고체 하이퍼 형광).
2 = 약간 누출 (레이저-유도된 결함 영역의 경계 내에 일반적으로 남아있는 반고체 하이퍼형광).
3 = 보통 누출 (레이저-유도된 결함 영역의 경계 내에 일반적으로 남아있는 반고체 내지 고체 하이퍼-형광).
4 = 상당한 누출 (레이저 유도된 결함 영역의 경계를 넘어 확장된 고체 하이퍼-형광 영역).
만약 동물이 연구 동안 죽거나 안락사될 경우에, 검시는 수행되지 않고 시체는 폐기되었다. 계획된 안락사까지 생존한 동물들은 최종 체중이 기록되었다. 동물들은 이소플루란 마취 이후 복부 대동맥(abdominal aorta)으로부터 채혈을 수행하였다. 가능한 때, 동물들은 투여 그룹에 돌아가면서(rotating across) 안락사되었고, 대조군을 포함하는, 각 그룹으로부터 유사한 동물의 수는 날(day(s)) 내내 부검되었다. 하기 조직 수집 및 보존 표에 식별된 조직의 대표적인 샘플은 모든 동물로부터 수집되었고 다른 지시가 없으면 10% 중성 버퍼 포르말린에 보존되었다:
조직 체중 수집 현미경 평가 코멘트
동물 식별 - X - -
눈 - X - 양쪽(Bilateral); 데이비슨 정착액(Davidson's fixative)에 24 내지 48시간 고정 및 적어도 18시간 동안 70% 에탄올에 전송, 가공시까지 70% 에탄올에 저장. (안락사된 동물만)
시신경(Nerve, optic) - X - 양쪽; 데이비슨 정착액에 24 내지 48시간 고정 및 적어도 18시간 동안 70% 에탄올에 전송, 가공시까지 70% 에탄올에 저장 (안락사된 동물만)
X = 수행되는 절차; - = 해당사항 없음(not applicable).
하기 주요 컴퓨터화된 시스템은 본 연구에 사용되었다:
시스템 명칭 수집 및/또는 분석된 데이터의 설명
프로반티스(Provantis) 투여 투여량(Dose administration), 체중, 음식 섭취, 임상 관찰, 임상 관찰의 정도, 임상 생화학, 혈액학, 응고, 소변 검사, 안과학 및 총 병리학(gross pathology)
디스펜스(Dispense) 실험 물품 수령(receipt) 및/또는 실험 물품 및/또는 비히클 및/또는 참고 물품(s)의 책임(accountability)
SRS (SAS로 구축된 PCS-MTL 인하우스 어플리케이션) 및 Windows를 위한 SAS 시스템 살아있는 수 및 최종 데이터의 통계 분석
하이델베르크(Heidelberg) HRA 2 / EyeExplorer를 갖는 하이델베르크 스펙트라리스(Heidelberg Spectralis) 플루오레세인 혈관 촬영
평균 및 표준 편차는 체중, 식품 섭취 및 플루오레세인 혈관 촬영에 대해 계산되었다. 다른 데이터는 개별적인 기준으로 보고되었다.
실시예 24: 랫 치주염 모델에 염증성 반응에 JNK 억제자 XG -102의 억제 효과
본 연구의 목적은 랫에 치주염 모델에 유도된 염증에 XG-102 (SEQ ID NO: 11)의 영향을 조사하는 것이다. 30마리 랫은 본 연구에 사용되었다 (10마리 랫의 4개 그룹으로 나눔).
실험적 치주염은 0일에 1st 어금니(동물 당 하나의 어금니) 주변에 위치한 결찰(ligature)에 의해 유도되었다. 2 또는 4 mg/kg의 일 투여량은 잇몸 내로(intra gingivally, IGV) 투여되었다.
하기 표는 무작위 할당을 요약한다:
그룹 N° 결찰(Day 0) 처리 투여 경로 동물의 수
1 - - IGV 10
2 Yes NaCl 0.9% IGV 10
3 Yes XG-102 2 또는 4 mg/kg IGV 10
각 날짜에, 모든 동물의 일반적인 행동 및 외양이 관찰되었다. 만약 동물 건강이 본 연구의 지속과 호환되지 않는 경우(빈사 동물, 체중의 비정상적 주요 손실, 물질의 주요 불내성 등), 동물들은 연구 감독의 책임 하에 윤리적으로 희생되었다. 치주염 염증 측면은 잇몸 조직의 육안 관찰을 통해 분석되었다. 플라크 지수 및 잇몸 염증 지수는 치주의 임상적 지수들로써 측정되었다.
약 17일에 동물들은 희생되었고 샘플이 채집되었다. 염증 세포의 평가를 위하여, 염증 세포의 정량은 조직 형태학적 측정을 통해 수행되었다. 염증성 단백질 수준의 평가를 위해, 염증성 단백질(p-JNK, TNF, IL-1, IL-10, MMP-8, MMP-9)의 수준은 잇몸 조직 균질액(homogenates)으로부터 측정되었다. 조직 파괴의 평가를 위해, 뼈 조직 파괴는 방사성 분석 (마이크로-CT)에 의해 그룹 당 3마리 동물에 평가되었다. 치주 복합체 파괴는 조직학적 분석을 통해 평가되었다. 뼈 미세구조(microarchitecture)의 평가를 위해, 뼈 섬유주(trabecular) 측정 (두께, 분리)은 방사성 분석(마이크로-CT)을 통해 평가되었다. 구강 박테리아의 식별을 위해, 치과 포켓(dental pockets) 내 박테리아 군집은 9가지 치주 병원균(periodontopathogens)에 DNA 프로브 (real time PCR)에 의해 식별되었다. 콜라겐 뼈대를 위해, 총 콜라겐 양의 측정은 편광 광학 현미경을 사용하여 수행되었다. 콜라겐 I/콜라겐 III 비율은 조직 형태 계측 분석(histomorphometrical analysis)을 통해 측정되었다.
실시예 25: 스트렙토조토신 처리된 랫 ( IVT )에 당뇨병성 망막증(Retinopathy) 예방 연구에 XG -102 ( SEQ ID No. 11)의 효과
본 연구의 목적은 스트렙토조토신 (STZ) 처리된 (고혈당(hyperglycemic)) 랫에 유리체내(intravitreal) 주사를 통해 투여될 때, 당뇨병성 망막증을 예방하기 위해 XG-102의 능력을 결정하는 것이다.
본 연구 설계는 하기와 같다:
그룹 No./
식별 		STZ (mg/kg) Day -7 XG -102
투여 수준 (μg/eye)
1, 8, 15일 		투여 부피(μL) 투여 농도(mg/mL) 동물의 수
수컷
1/ 유도되지 않음, 비히클 0 0 5 0 3
2/XG-102 - 0.2 μg/눈 55 0.2 5 0.04 8
3/ XG-102 - 2 μg/눈 55 2 5 0.4 8
4/비히클 55 0 5 0 5
그룹 2, 3, 4로부터 모든 동물은 -7일에 STZ의 55 mg/kg 정맥내(IV) 투여를 수용하였다.
0.0412 g의 유도제(STZ)를 포함하는 멸균 바이알은 사전 계량되었고, 밀봉되고 -7일에 그룹 2 내지 4의 동물 및 예비 동물에 투여를 위한 투여실에 이송되었다. 비어있는 중복(duplicate) 세트, 적절하게 표지된 멸균 바이알이 제공되었다. 재구성된 STZ 용액은 투여를 위해 이들 바이알로 여과되었다. 참조 물품, 0.9% NaCl은 리시브(received)로 투여되었다. XG-102는 보정 계수 1.383을 사용하여 제조되었다. 가장 높은 투여 수준과 동일한 저장 용액은 비히클, 주사용 0.9% 소듐 클로라이드, 및 0.22 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터를 통해 멸균 여과되어 제조되었다. 낮은 투여 수준은 저장 용액에 직접 희석을 통해 제조되었다. 투여 제형은 투여 수준 요구를 충족시키는 적절한 농도로 한번 제조되었다. 모든 희석물은 비히클을 갖는 저장 용액을 직접 희석함으로써 제조되었다. 세가지 투여 부분 표본 (1, 8 및 15일)은 제조되고 -20°C에서 유지되도록 냉동고에 저장되었다. 각 투여 수준의 부분 표본(s)은 투여 각 날짜에 주변 온도에서 해동되었고 용액은 6시간 이하로 실온에 유지되었다.
60마리 수컷 브라운 노르웨이 랫은 Charles River Labs, Inc., Portage, Il로부터 수득하였다. 동물들은 약 8주령이며 166 내지 228g 중량이었다. 브라운 노르웨이 랫은 STZ-유도된 당뇨병성 망막증 모델에 사용하기 위해 허용된 종으로써 본 연구를 위한 동물 모델로 선택되었다. 본 연구에서 사용된 동물의 총 수는 실험 물품의 효과를 적절하게 특성화하는데 필요한 최소한으로 고려되었다. 본 연구는 이의 목적을 달성하기 위해 동물의 불필요한 수를 요구하지 않는 것으로 설계되었다. 20일의 최소 적응 기간은 연구실 환경에 동물을 적응시키기 위해 수용(receipt) 동물 사이 및 처리의 시작에 허용되었다. 동물들은 유사한 그룹 평균 체중을 달성하기 위해 계획된 계층화된 무작위화 스킴(scheme)에 의해 그룹으로 할당되었다. 건강이 나쁘거나 체중 범위가 극단적인 동물은 그룹으로 할당되지 않았다. 투여의 시작 전에, 본 연구에 사용하기 부적절한 것으로 고려된 어느 할당된 동물은 동일한 배송으로부터 수득된 대체 동물로 교체되고 동일한 환경 조건 하에 유지되었다. 대체 동물들은 시작 3일 이내에 연구에 교체로 사용되었다. 도착시, 동물들은 무작위화 되기까지 개별적으로 수용되었다. 무작위화 이후에, 동물들은 자동 급수 밸브가 장착된 스테인리스 강 다공성 바닥 케이지에 그룹 수용되었다 (동일한 투여 그룹의 3마리 동물까지 함께). 동물들이 보관된 방은 본 연구 기록에 기록되었다. 동물들은 설계된 절차/활동 동안 분리되었다. 30% 내지 70%의 상대 습도와 19°C 내지 25°C의 온도가 유지되었다. 설계된 절차를 위해 중단될 때를 제외하고, 12시간 광/12시간 암 사이클이 유지되었다. PMI 영양 국제 인증 설치류 음식(PMI Nutrition International Certified Rodent Chow) No. 5CR4 (14% 단백질)은 설계된 절차 동안을 제외하고, 본 연구 전체적으로 임의로(ad libitum) 제공되었다. 역삼투 및 방사선 조사에 의핸 치료 이후 지방 수돗물은 자동 급수 시스템을 통해 각 동물에 자유롭게 공급되었다 (설계된 절차 동안은 제외). 동물들은 정신적/환경적 향상을 위해 사회적으로 수용되었고, 연구 절차/활동에 의해 중단되는 때를 제외하고, 하이딩(hiding) 장치 및 씹을 수 있는 객체와 같은 물품이 제공되었다.
유도제의 투여를 위해(그룹 2 내지 4, -7일), 동물 당(예비 동물 포함) STZ의 하나의 바이알은 27.5 mg/mL의 농도를 제공하기 위해, 주사용 멸균수 1.5 mL로 주사의 3분 이내에 재구성되었다. 바이알은 STZ를 용해시키기 위해 인버트(inverted)되거나 돌려졌다(swirled). 결과 용액은 빈 멸균된 적절하게 표지된 바이알에 0.22 μm Millex-GV 필터를 통해 여과되었다. STZ (55 mg/kg)는 주사기를 통해 제형의 3분 이내에, -7일에 정맥 주사를 통해 투여되었다. 투여 부피는 2 mL/kg 였으며 실제 투여량 투여는 각 동물의 가장 최근 실제 체중에 기초하였다. 동물들은 주사 동안 억제되었다(restrained).
실험 물품 또는 참조 물품은 실험 설계 표에 지시된 것처럼 1, 8 및 15일에 각 동물의 왼쪽 및 오른쪽 눈에 유리체내 주사를 통해 투여되었다. 동물들은 투여랑 투여를 위해 마취(이소플루란)되었고, 이는 면허가 있는 수의 안과의사에 의해 수행되었다. 국소 항생제 (겐타마이신 점안액)은 주사 이후 처리 전에 하루에 두번 및 주사 이후 하루에 적어도 한번 양쪽 눈에 적용되었다. 투여 전에, 산동제 방울 (1% 트로피카미드 및/또는 2.5% 페닐에프린)은 양쪽 눈에 적용되었다 (추가 적용은 수의 안과의사에 의해 적절하게 고려될 때 수행되었다). 투여 동안, 동물들은 이소플루란/산소 가스로 마취 하에 유지되었다. 결막은 주사용 0.9% 소듐 클로라이드 USP로 세척되었다. 32 게이지의 10 μL 해밀턴 주사기, 1/2-인치 바늘은 각 유리체내 주사를 위해 사용되었다 (1 주사기/그룹/처리). 투여 부피는 5 μL/eye이다. 양쪽 눈은 투여 절차에 의해 유발된 어느 비정상(특히 수정체, 유리체 및 망막에)을 기록하기 위해 각 처리 직후 슬랫-램프 생체 현미경 및/또는 간접적 검안경 검사를 통해 실험되었다. 각막 혼탁은 마취를 포함하는 실험 절차에 두번째로 고려되었다. 이들 혼탁의 일부는 또한 각막 혈관신생과 관련된다. 다른 안구 연구는 잘 알려졌으나, 일반적으로 낮은 빈도 또는 그룹에 걸쳐 산발적이며/또는 지속되지 않는다. 이들 연구는 포함되나, 하기에 제한되지 않는다: 다초점/분산 각막 혼탁, 유리체 기포, 초점/분산/다초점 유리체 혼탁, 및 초점 망막 혼탁.
스트렙토조토신은 랫에 당뇨병성 망막증을 유도하기 위해 정맥 주사를 통해 투여되었다. 유리체내 주사 경로는 이는 인간에 투여의 의도된 경로이기 때문에 실험 물품을 위해 선택되었다. 투여 수준은 컨셉 연구의 종전 증명뿐만 아니라 MTD 및 투여의 IVT 경로를 사용한 독성 연구로 얻어진 정보에 기초하여 선택되었다.
하기 설명된 살아있는 도중(in-life) 절차, 관찰, 및 측정은 연구 동물에 대하여 수행되었다. 연구 전체에 걸쳐, 동물들은 하루에 두번, 오전에 한번 및 오후에 한번 일반적인 건강/사망률 및 빈사에 대하여 관찰되었다. 동물들은 가능한 발견의 식별 또는 확인을 위해 필요하지 않는 경우, 관찰 동안 케이지로부터 제거되지 않았다. 동물들은 케이지로부터 제거되고, 구체적인 임상적 관찰이 -1 주 동안부터 시작하여 매주 수행되었다. 동물들은 -1 주 동안 시작하여, 일주일에 두번 개별적으로 계량되었다. 음식 섭취는 전처리 기간의 마지막 주 동안 시작하여 매주 정량적으로 측정되었다. 모든 동물들은 전처리에 한번 및 22일에 다시 검안경(funduscopic) (간접 검안경 검사(ophthalmoscopy)) 및 생체 현미경 (슬릿 램프) 실험을 받았다. 사용된 산동제는 1% 트로피카미드 였다. 안압은 사전 연구에 한번 및 22일에, TonoVet™ 리바운드 안압계를 사용하여, 각 안과학 실험 이후 측정되었다. 전 처리 안압계 해독(readings)은 주간 변동성(diurnal variability)을 감소시키기 위해 최종 측정을 위해 예상된 것처럼 동시에 수행되었다.
망막 전위도(Electroretinogram) 평가는 플루오레세인 혈관 촬영 전에, 전처리에 한번 및 6, 13, 및 20일에 수행되었다. 동물들은 ERG 녹화 전에 밤새 암적응된 후 75 mg/kg 케타민 및 7.5 mg/kg 실라진의 근육 주사로 마취되었다. 트로피카미드 (1%)는 실험 전에 양쪽 눈에 적용되었다 (추가적인 적용은 만약 필요한 것으로 고려도리 경우 투여되었다). 안검은 리드 검경(lid speculum)의 수단에 의해 집어 넣어졌으며, 컨택트 렌즈 또는 골드 루프 전극을 각 눈의 표면에 놓았다. 바늘 전극을 각 눈의 아래 피부(참조) 및 이마(brow)의 뒤쪽(posterior) 머리에 또는 꼬리(바닥)의 기초에 놓았다. 카르복시메틸셀룰로오스 (1%) 방울을 그들을 눈에 놓기 전에 컨택트 렌즈 전극의 내부 표면에 적용하였다.
각 ERG 경우는 다음과 같은 일련의 암순응(scotopic) 단일 플래쉬 자극으로 이루어진다:
1) -30 dB 단일 플래쉬, 파진폭(wave amplitude) 및 지연(latency), 5 단일 플래쉬의 평균, 플래쉬 사이 10초.
2) -10 dB 단일 플래쉬, a- 및 b- 파진폭 및 지연, 5 단일 플래쉬의 평균, 플래쉬 사이 15초.
3) 0 dB, 2 단일 플래쉬의 평균, a- 및 b- 파진폭 및 지연, 플래쉬 사이 약 120초 (보다 긴 시간이 허용가능함).
암순응 반응의 평가 이후, 동물들은 약 5분의 기간 동안 (보다 긴 시간이 허용가능함) 약 25 내지 30 cd/m2에 배경 불빛에, 1 Hz(a- 및 b- 파진폭 및 지연)의 명소시 흰색 점멸(photopic white flicker)의 20 스위프(sweeps)의 평균에 따라, 이후 29 Hz(b-파폭 및 지연)에 명소시 점멸의 20 스위프에 순응하였다. 파형은 a- 및 b- 파폭 및 지연에 대하여 분석되었고, 0 dB 암소시 자극으로부터 4를 통해 변동 잠재(oscillatory potentials, OP) 1은 여과되고 진폭 및 지연에 대해 분석되었다.
플루오레세인 혈관 촬영 평가는 망막전도기록(electroretinography) 이후, 전처리에 한번 및 7, 14, 및 21일에 수행되었다. 이소플루란/산소 혼합물은 마취와 같은 절차 전 및 동안 사용되었다. 산동제, 1% 트로피카미드는 필수적으로 사용되었다. 눈의 수화는 필요에 따라 식염수 용액으로 세척을 통해 유지되었다. 0.2 mL의 소듐 플루오레세인 주사 U.S.P.는 빠른 꼬리 혈관 주사를 통해, 이후 0.5 mL 식염수 세척을 통해 투여되었다. 기저부의 스틸 이미지는 플루오레세인 주사 이후 10-15분 사이에 양쪽 눈으로부터 기록되었다. 이미지는 오른쪽 눈 먼저, 그 다음 왼쪽눈으로부터 수득되었다. 국소 블랜드(bland) 안연고제는 혈관 촬영 이후 눈에 투여되었다. 이미지는 혈관 온전함(integrity)/분산 누출에 대해 정량적으로 평가되었다.
혈당 수준 결정은 전-STZ 처리시 한번, -6 일 (STZ 투여 다음 날) 및 이후 일주일에 세번 (모든 동물) 되었다. 추가적인 혈당 측정은 동물 건강 상태를 감시하는데 필요에 따라 수행될 수 있다.
수준은 꼬리 혈관으로부터 수득된 혈액 방울을 사용하여 글루코미터(glucometer)를 통해 결정되었다. 값은 mmol/L로 측정되었고 보고 목적을 위해 18을 곱하여 mg/dL로 전환되었다. 소변 글루코스 수준 결정은 매주, -1 주 시작에, 밤새 수집 이후 되었다. 동물들은 채집 기간 동안 음식 및 물에 접근하였다. 소변 글루코스는 P800 분석기를 사용하여 임상 연구 부서에 의해 측정되었다.
이소플루란 마취 이후 복부 대동맥으로부터. 가능한 때, 동물들은 투여 그룹에 걸쳐 돌아가며 안락사 되었고, 대조군을 포함하는 각 그룹으로부터 동물의 유사한 수는 하루 종일 유사한 시간에 부검되었다.
주요 연구 동물은 시체 및 근골격 시스템; 모든 외부 표면 및 구멍(orifices); 두개강(cranial cavity) 및 뇌의 외부 표면; 및 그들의 관련된 기관 및 조직과 함께 흉부, 복부, 및 골반 구멍(cavities)의 평가를 포함하는 부검 실험을 완성하기 위한 대상이다. 부검 절차는 동물 해부학 및 총 병리학(gross pathology)에 적절한 훈련 및 경험을 가진 자격이 있는 사람에 의해 수행되었다. 수의 병리학자, 또는 다른 적절하게 자격이 있는 사람이 가능하다.
하기 식별된 조직의 대표적인 샘플은 모든 동물로부터 수집되었고 다르게 지시되지 않으면 10% 중성 버퍼 포르말린에 보존되었다.
조직 수집 및 보존
조직 중량 수집 현미경 평가 코멘트
동물 식별 - X - -
눈 - X - 양쪽; 데이비슨 정착액(Davidson's fixative)에 고정 (안락사된 동물만).
총 병변/질량(masses) - X - -
시신경(Nerve, optic) - X - 양쪽; 데이비슨 정착액에 고정 (안락사된 동물만)
X = 수행되는 절차; - = 해당 사항 없음.
하기 파라미터 및 종료점은 본 연구에 평가되었다: 사망률, 임상 증상, 체중, 체중 변화, 음식 섭취, 안과학, 안압, 망막전도기록(ERG), 플루오레세인 혈관 촬영, 혈액 및 소변 당 결정, 총 부검 실험.
당뇨병성 망막증 랫 모델과 일치하여, 과혈당 관련 사망, 허약 상태의 임상 징후, 및 체중의 감소, 체중 증가, 증가된 음식 섭취, 및 혈액 및 소변 당 수준에 극심한 증가가 있었다. STZ-유도된 그룹에 나타난 다중 안구 변화는 과혈당 상태의 성질, 특히 전방 피질 백내장(anterior cortical cataracts)에 이차적이다. 본 연구 도중 XG-102 관련된 죽음은 없었다. XG-102 관련된 임상 징후 또는 체중, 체중 증가 또는 음식 섭취에 효과는 없었다. 플루오레세인 혈관 촬영 형상화(imagery)는 어떠한 혈관 누출을 나타내지 못하였고, 부검시 XG-102 관련된 육안 발견도 명백하지 않았다.
6, 13 및 20일에, ≤ 2 μg/eye XG-102 주어진 동물에 대한 암순응 및 명순응 ERG 측정의 일부 진폭은 STZ-처리된 대조군 동물에 비해 약간 증가하거나 필적하였으나, 이들 반응은 대조군 변동성 내에 일반적으로 유지되었다. XG-102 그룹에 대한 지연은 대조군 및/또는 전처리 변이 내에 비슷하였으며 유지되었다. STZ-처리된 대조군과 ≤ 2 μg/eye XG-102 주어진 동물을 비교할 때, 진동(oscillatory) 잠재적 진폭에 일부 암순응 차이가 있다.
하기 표는 경우에 따라 모든 ERG 자극에 대한 진폭의 요약을 포함한다 (전처리, 및 6, 13 및 20일, 각각). 값들은 그룹 평균 및 표준 편차를 나타낸다(하기):
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
이들 데이터로부터 검색될 수 있는 것처럼, 파장 진폭의 감소를 역전시키는(reverse) XG-102의 경향이 있다.
실시예 26: 스트렙토조토신 처리된 알비노 랫(결막하)에 당뇨병성 망막증 예방 연구에 XG -102 ( SEQ ID No. 11)의 효과
본 연구의 목적은 3주 동안 스트렙토조토신 (STZ) 처리된(고혈당) 랫에 매주 결막하 주사를 통해 투여될 때, 당뇨병성 망막증을 예방하기 위한 XG-102의 능력을 결정하는 것이다.
본 실험의 설계는 하기에 나타내었다:
그룹 No./
식별 		STZ (mg/kg) Day -7 실험 물품
투여 수준 (μg/eye/week) 		투여 부피 (μL) 투여 농도 (mg/mL) 동물의 수
수컷
1/유도되지 않음, 비히클 0 - 50 0 8
2/유도됨, 비히클 55 - 50 0 10
3/ XG-102 - 낮은 투여량 55 2 50 0.04 8
4/ XG-102 - 중간 투여량 55 20 50 0.4 8
5/ XG-102 - 높은 투여량 55 200 50 4 8
그룹 2 내지 5의 모든 동물은 -7 일에 STZ의 55 mg/kg 정맥(IV) 투여를 수용함.
순수 롱 에반스(Naive Long Evans) 랫이 사용되었다 (42 마리 수컷 동물; 10주령, 투여 시간에; Charles River, St. Constant, QC). 롱 에반스 랫은 STZ-유도된 당뇨병성 망막증 모델에서 사용을 위해 허용된 모델과 같이, 본 연구를 위한 동물 모델로 선택되었다. 본 연구에 사용된 동물의 총 수는 실험 물품의 효과를 적절하게 특성화하기 위해 최소한으로 요구된 것으로 고려되었고, 이의 목적을 달성하기 위해 동물의 불필요한 수를 요구하지 않는 것으로 설계되었다. 이때에, 연구실 동물에 연구는 인간에 대한 추정(extrapolation)을 위해 가장 활용가능한 기초를 제공한다. 살아있는 동물을 사용하지 않는 허용가능한 모델은 현재 존재하지 않는다. 대체(alternates)의 계획된 방출은 4일째이다. 동물들은 스테인레스 강 케이지에 수용되었다. PMI 영양 국제 인증 설치류 식품 No. 5CR4 (14%　단백질)는 동물의 크기 및 연령에 적절한 양으로 매일 제공되었다. 역삼투압 필터를 통해 가공되고 UV 광 처리를 통과한 지방 수돗물은 각 동물들에게 자유롭게 허용되었다. 동물들은 정신적/환경적 향상을 위해 사회적으로 수용되었고(3마리까지 동물/케이지), 연구 절차/활동 동안을 제외하고, 하이딩 튜브 및 씹을 수 있는 객체와 같은 물픔이 제공되었다. 연구에 사용하기 적절한 것으로 결정된 동물만이 할당되었다. 도착시 동물들은 무작위화 되기까지 개별적으로 수용되었다. 무작위화 이후 동물들은 사회화 되었다(socialized).
유도제(STZ)의 0.0412 g을 포함하는 멸균 바이알은 -7일에 그룹 2 내지 5 동물 및 선택된 예비 동물들에 투여를 위해 사전 계량, 밀봉 및 투여실로 전송되었다. 비어있는, 적절하게 표지된 멸균 바이알의 중복(duplicate) 세트가 제공될 것이다. 재구성된 STZ 용액은 투여를 위해 이들 바이알로 여과될 것이다. 실험 물품, XG-102는 제공된 보정 계수(correction factor)를 사용하여 제조되었다. 가장 높은 투여 수준과 동일한 저장 용액은 비히클, 주사용 0.9% 소듐 클로라이드에 제조되었고, 0.22 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터를 통해 멸균 여과되었다. 낮은 투여 수준은 식염수와 함께 상기 저장 용액을 직접 희석함으로써 제조되었다. 투여 부분 표본은 제조되고 -20°C에서 유지하기 위해 냉동고에 보관되었다. 각 투여 수준의 부분 표본(s)은 투여 각 날짜에 주변 온도에 해동되었고 용액은 6시간 이하의 실온에서 유지되었다. 비히클, 주사용 0.9% 소듐 클로라이드는 리시브(received)로 투여되었다. 동물 당(예비 동물 포함) STZ의 하나의 바이알은 27.5 mg/mL의 농도를 제공하기 위해, 주사용 멸균수, USP의 1.5 mL로 주사의 3분 이내에 재구성 되었다. 바이알은 STZ를 용해시키기 위해 인버트 또는 돌려졌다. 재구성된 STZ 용액은 투여를 위한 비어있는 멸균 바이알로 0.22　μm Millex-GV 필터를 통해 여과되었다. STZ는 주사기를 통해 혼합(formulation) 3분 이내에, -7일에 정맥 주사를 통해 투여되었다. 투여 부피는 2 mL/kg이며 실제 투여량은 각 동물의 가장 최근 실제 체중에 기초하였다. 동물들은 주사 동안 억제될 것이다. STZ-처리된 동물은 혈당 수준이 ≥ 250 mg/dL일 경우에 당뇨병으로 고려되었다. 실험 물품 또는 비히클은 1, 8 및 15일 및 다시 24일 (Rep 1), 23일 (Rep 2 및 3), 22일 (Rep 4) 및 34일 (Rep 1) 33일 (Rep 2 및 3) 및 32일 (Rep 4)에 각 동물의 왼쪽 및 오른쪽 눈에 결막하 주사를 통해 투여되었다. 동물들은 투여량 투여를 위해 마취되었고(이소플루란) 자격증을 가진 수의 안과의사에 의해 수행되었다. 국소 항생제 (0.3% 토브라마이신 연고)는 처리 하루 전에, 주사 이후 및 주사 하루 후에 적어도 한번, 양쪽 눈에 두번 적용되었다. 투여 전에, 산동제 방울 (1% 트로피카미드 및/또는 2.5% 페닐에프린)은 각 눈에 적용되었다 (추가 적용은 수의 안과의사에 의해 적절한 것으로 고려되는 것으로 수행될 수 있다). 투여 동안 동물들은 이소플루란/산소 가스로 마취 하에 유지되었다. 결막은 주사용 0.9% 소듐 클로라이드 USP.로 세척되었다. 0.5 cc 테루모 인슐린 주사기에 부착된 29 게이지, 1/2-인치 바늘은 각 결막하 주사를 위해 사용되었다 (1 주사기/그룹/처리). 실험 물품 또는 참조 물품은 50　mL/eye의 투여 부피에 각 동물의 눈에 투여되었다. 양쪽 눈은 투여 절차에 의해 유발된 어느 비정상을 기록하기 위해 각 처리 직후 실험되었다. 스트렙토조토신은 랫에 당뇨병성 망막증을 유도하기 위해 IV 투여되었다. 결막하 경로는 이것이 인간에 투여의 의도된 경로이기 때문에 실험 물품을 위해 선택되었다. 투여 수준은 컨셉 연구뿐만 아니라 MTD 및 투여의 결막하 경로를 사용한 독성 연구의 종전 증거와 함께 얻어진 정보에 기초하여 선택되었다. 질병율(Morbidity)/사망률(mortality) 체크는 매일 적어도 두번 (AM 및 PM) 수행되었다. 케이지 사이드 관찰은 하루에 한번 수행되었다. 구체적인 임상 실험은 매주 수행되었다. 정량적인 식품 섭취는 매주 수행되었다. 체중은 일주일에 두번 기록되었다. 안과 실험은 사전 연구에 한번 및 37일 (Rep 1), 36일 (Rep 2 및 3) 및 35일 (Rep 4)에 다시 수행되었다. 모든 동물은 검안경(funduscopic) (간접 검안경 검사(ophthalmoscopy)) 및 생체 현미경 (슬릿 램프) 실험을 받았다. 사용된 산동제는 1% 트로피카미드이다. 안압은 사전 연구에 한번 및 37일 (Rep 1), 36일 (Rep 2 및 3) 및 35일 (Rep 4)에 측정되었다. 사전 처리 안압측정기(tonometry) 해독(readings)은 주간 변동성(diurnal variability)을 감소시키는 최종 측정에 대해 예상되는 것과 같이 동시에 수행되었다. 안압은 안과학 실험 이후, TonoVet™ 리바운드(rebound) 안압측정기를 사용하여 측정되었다.
망막 전위도 평가는 전처리에 한번 및 7, 14, 21일, 및 36일 (Rep 1), 35일 (Rep 2 및 3) 및 34일 (Rep 4)에 수행되었다. 동물들은 ERG 기록 전에 밤새 암적응 되었고 이후 75 mg/kg 케타민 및 7.5 mg/kg 실라진의 근육내 주사로 마취되었다. 트로피카미드 (1%)는 실험 전 각 눈에 적용되었다 (추가 적용은 만약 필요한 것으로 고려될 경우 투여될 수 있음). 안검은 리드 검경(lid speculum)의 수단에 의해 집어 넣어졌으며, 컨택트 렌즈 또는 골드 루프 전극을 각 눈의 표면에 놓았다. 바늘 전극을 각 눈의 피부 아래 (참조) 및 이마(brow)의 뒤쪽(posterior) 머리에 또는 꼬리(바닥)의 기초에 놓았다. 카르복시메틸셀룰로오스 (1%) 방울을 그들을 눈에 놓기 전에 컨택트 렌즈 전극의 내부 표면에 적용하였다.
1) -30 dB 단일 플래쉬, 5 단일 플래쉬의 평균, 플래쉬 간 10초.
2) -10 dB 단일 플래쉬, 5 단일 플래쉬의 평균, 플래쉬 간 15초.
3) 0 dB, 2 단일 플래쉬의 평균, 플래쉬 간 약 120초 (보다 긴 시간이 허용 가능함).
암순응 반응의 평가 이후, 동물들은 약 5분의 기간 동안 (보다 긴 시간이 허용가능함) 약 25 내지 30 cd/m2에 배경 불빛에, 1 Hz의 명소시 흰색 점멸(photopic white flicker)의 20 스위프(sweeps)의 평균에 따라, 이후 29 Hz에 명소시 점멸의 20 스위프에 적응되었다. 파형은 a- 및 b- 파폭 및 지연에 대하여 분석되었고, 0 dB 암소시 자극으로부터 4를 통해 변동 잠재(oscillatory potentials, OP) 1은 여과되고 진폭 및 지연에 대해 분석되었다.
인도시아닌 그린(Indocyanin Green) 혈관 촬영 평가는 전처리시 한번 (-2 일 또는 -1일) 및 8, 15, 22 일, 및 35일 (Rep 1), 34일 (Rep 2 및 3) 및 33일 (Rep 4)에 수행되었다. 이소플루란/산소 혼합물은 마취 절차 전에 및 도중에 사용되었다. 사용된 산동제 시약은 필요에 따라 1% 트로피카미드이다. 눈의 수화는 필요에 따라 식염수 용액으로 세척을 통해 유지되었다. 0.2 mL의 0.5% 인도시아닌 그린은 빠른 꼬리 혈관 주사를 통해 투여되었고, 이후 0.5 mL 식염수 세척되었다. 기저부의 스틸 이미지는 ICG 주사 이후 10-15분 사이에 양쪽 눈으로부터 기록되었다. 이미지는 오른쪽 눈 먼저 그 다음 왼쪽으로부터 수득되었다. 국소 블랜드 안과 연고는 혈관 촬영 이후 눈에 투여되었다. 이미지는 혈관 온전함(integrity)/분산 누출에 대해 정량적으로 평가되었다.
혈당 수준 결정은 전-STZ 처리시 한번, -6 일 (STZ 투여 다음 날) 및 -1일에 다시 측정되었다. 추가적인 혈당 측정은 동물 건강 상태를 감시하는데 필요에 따라 수행될 수 있다. 수준은 꼬리 혈관에서 채집된 혈액 방울을 사용하여 글루코미터에 의해 결정된다. 값들은 mmol/L로 측정되고 보고 목적을 위해 18을 곱하여 mg/dL로 변환된다.
계획된 안락사까지 생존하는 주요 연구 동물은 이소플루란 마취 이후 복부 대동맥으로부터 방혈(exsanguination)에 의해 안락사되었다. 가능한 때, 동물들은 대조군을 포함하는 각 그룹으로부터 동물의 유사한 수가 하루에 걸쳐 유사한 시간에 부검되도록, 투여 그룹에 걸쳐 돌아가면서 안락사 되었다. 조직(눈, 시신경)의 대표적인 샘플은 모든 동물로부터 채집되고 다른 지시가 없는 한 10% 중성 버퍼 포르말린에 보존되었다. 눈 및 시신경은 양방향으로 채집되었고 데이비슨(Davidson's) 정착액에 24 내지 48시간 동안 고정된 이후 70% 에탄올에 저장되었다(안락사된 동물만).
실시예 27: 수술후 안내 염증에 덱사메타손 안약과 비교하여, XG -102의 단일 결막하 주사의 효율 및 안전성을 측정하기 위한 무작위화된 , 이중 맹검 , 병렬 그룹, 조절된, 다중심 실험 (임상 2상 )
안과 수술의 기술적 발전에도 불구하고, 이러한 절차의 신체적 트라우마는 수술 후 안구 염증을 보증하는 처리를 유도하기를 계속한다. 안구 조직에, 아라키돈산은 염증의 가장 중요한 지질 유래된 중재자인, 프로스타글란딘(PG)에 사이클로옥시게나제(COX)에 의해 대사된다1. 수술 트라우마는 COX-1 및 COX-2의 활성화에 의해 PGs를 차례로 발생시키는 아라키돈산 케스케이드(cascade)의 계기를 유발한다. 세포막 내 인지질은 화학적으로 분명한 PGs의 패밀리인 아라키돈산을 발생시키는 포스포리파제 A를 위한 기질이며 류코트리엔(leukotriens)이 생산된다2. 안구 염증의 치료를 위한 '황금 표준'은 국소 코르티코스테로이드 및/또는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)이다. (단기) 코르티코스테로이드 사용과 함께 보고된 부작용은 백내장 형성, 증가된 안압(Intra Ocular Pressure, IOP), 증가된 바이러스 감염에 민감성 및 각막 상피(corneal epithelial) 및 기질(stromal) 상처 치료의 지연을 포함한다3,4. 추가로, 코르티코스테로이드와 함께 연장된 치료는 글루코스 장애, 고혈압, 녹내장의 발달, 시력 결함, 시야의 손실, 및 후방 수정체피막하백내장 형성과 같이 전신 부작용을 유발하는 것으로 알려졌다5. 조사 중인 임상 시험용 약품(Investigational Medicinal Product, IMP) - XG-102 -는 비-아데노신 트리포스페이트(ATP) 경쟁적 방식에서 c-Jun N-말단 키나아제 (JNK) 활성을 선택적으로 억제하는 프로테아제 저항성 펩타이드이다. XG-102는 D-배열에 글리신 (아키랄(achiral)인 것)을 제외한 모든 아미노산을 갖는 31개 D-아미노산 JNK 억제자 펩타이드이다. 이러한 선택은 그들의 투여 직후 펩타이드를 종종 분해하는, 프로테아제에 대한 화합물의 저항성을 증가시키기 위해 만들어졌다. JNK 활성화가 자가면역 및 염증성 질병에 관여되는 활성자 단백질-1 (AP-1) 전사 인자 패밀리 및 다른 세포성 인자의 인산화 및 활성화를 유도하기 때문에, JNK 경로를 억제하는 화합물은 지시된 치료 값을 가질 수 있다. 랫 및 토끼에 안구 MTD (최대 용인된 투여량(Maximum Tolerated Dose)) 연구뿐만 아니라 토끼에 안구 국소 내성(ocular local tolerance)은 XG-102가 결막하, 유리체내(IVT) 및 정맥(iv) 투여 이후 잘 견딤(well-tolerated)을 보였다. 결막하 투여 이후 랫 및 토끼에 안구 MTD 연구는 랫에 20 μg 및 토끼에 600 μg 주변에 관찰된 역효과 수준이 없음(NOAEL)을 보였다. 단일 및 반복된(7일 동안 매일) 결막하 투여 이후 안구 약동학은 토끼에 연구되었고 XG-102는 안구 구조에 따라 1 내지 4시간 사이 tmax와 함께 투여 7일 이후에도 맥락막, 안구 결막 및 홍채 섬모체에 여전히 존재함을 보인 반면, XG-102는 혈장에 어느 때에도 검출되지 않았다. 안내 염증을 치료(수술 후)하기 위한 현재 '황금 표준'의 유해한 부작용이 주어져, 이는 한편으로 염증을 감소시키는데 효과적인 반면, 다른 한편으로 코르티코스테로이드 사용과 관련된 (해로운) 부작용을 갖지 않는 다른 치료 대안을 찾는 것이 임상적으로 당연하다. XG-102는 전임상 연구 및 지금까지 수행된 I/Ib 상 연구 모두에서 촉망되는 결과를 보였다.
종전 실험은 수술후 또는 외상후(post-traumatic) 안내 염증을 갖는 환자에게 '일반적인' 수술실(post-op) 항염증 요법에 추가로 투여된, XG-102의 단일 결막하 주사의 안전성 및 내성을 측정하기 위해 설계된, 오픈 라벨, 단일 중심, 투여량 증가(dose escalation)/투여 발견 연구였다. 조사된 XG-102 투여량은 45, 90, 450 및 900 μg이다. 총 20명의 환자(각 투여 그룹당 5명의 환자)는 본 연구에 등록되었다. 본 연구의 결론은 최근 수술후 또는 트라우마 안내 염증을 갖는 환자에게 결막하 주사로 투여된 XG-102는 안전하고 잘 견딘다는 것이다. 종전 연구의 성공적인 완성 이후에, 안구 염증에 XG-102의 개발을 계속하고, 목적이 덱사메타손 안약에 비해, 수술후 안내 염증의 진전(evolution)에서 수술 수 즉시 투여된 XG-102의 단일 결막하 투여의 효율성 및 안전성을 평가하는 것인 본 연구를 수행하기로 결정되었다. 이는 수술 후 안내 염증의 진전에 독립(stand-alone) 치료로 투여될 때 XG-102의 효율을 조사하는 첫번째 연구이다.
SDD-1002-035 연구의 목적은 수술 후 안구 염증에 21일 동안 4회/1일 투여된 덱사메타손 안약에 비해, 수술 절차의 종료 이후 최대 3시간 이내에 투여된 XG-102 90 또는 900 μg의 단일 결막하 주사의 효율성 및 안전성을 평가하는 것이다.
SDD-1002-035 연구의 주요 목적은 900 μg XG-102의 단일 결막하 주사가 수술후 안내 염증의 진전에 21일 동안 4회/1일 투여된 덱사메타손 안약 처리에 비해 비-열등(non-inferior)한지 평가하는 것이다. 본 실험의 주요 목적에 따라, 주요 결과는 덱사메타손 안약과 XG-102 900 μg을 비교하는 연구 처리의 결막하 주사의 투여 후 28일에 평균 전방 챔버(anterior chamber) 세포 등급을 통해 평가되었다.
두번째 목적은 덱사메타손 안약 (21일 동안 4회/1일 투여)에 비해 90 μg 또는 900 μg XG-102의 단일 결막하 주사의 효과를 평가하는 것이다:
효율성 결과(outcome) 파라미터
a) 28일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손)
b) 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 900 μg vs 덱사메타손)
c) 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손)
d) 7, 14 및 28일에 전방 챔버 플레어(flare) 등급 (XG-102 900 μg vs 덱사메타손)
e) 7, 14 및 28일에 전방 챔버 플레어 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손)
f) 구조 약물 치료(Rescue medication) 사용
g) 시간에 따른 안내 염증의 진전
안전성 및 내성 결과 파라미터:
a) ETDRS 방법에 의한 시력(Visual acuity)
b) 슬릿 램프 실험 연구
c) 안 기저부(ophthalmic fundus) 실험의 결과
d) 안압(Intra Ocular Pressure, IOP) 측정
e) 생명 징후 (혈압(BP), 맥박(PR) 및 리듬)
f) 혈액학 및 화학 연구실 테스트의 결과
g) 역효과의 발현
h) 환자의 부분 집합(subset)(약 30명)에 연구 처리의 투여 1시간 이후 혈장 내 XG-102의 존재(또는 부재)
본 실험은 동일한 크기의 세개 병렬군으로 무작위화되고(1:1:1), 조절되고, 이중 맹검, 다중심 비 열등성 임상 실험이다. 센터(center)에 의해 차단된 무작위화는 웹 기초(web-based), 보안, 무작위화 시스템을 사용하여 수행되었다. 적합한 환자는 18살 이상의 하기 안구 수술 중 하나를 받은 남성 또는 여성(폐경 후, 또는 난관 결찰 또는 자궁 절제술에 의해 불임)이다:
(a) 하기를 위한 위한 수술에 포함될 수 있는 수술과 조합된 전방 및 후방 부분(anterior and posterior segment): 백내장 및 망막 박리, 백내장 및 망막황반상부(epimacular) 막 및/또는 백내장 및 망막황반원공(macular hole), 또는 (b) 녹내장 수술, 또는 (c) 복합체 후방 부분 수술, 또는 (d) 당뇨병성 망막증 및/또는 복잡한 망막 박리 안구 수술과 관련된 백내장 수술을 포함할 수 있는 복잡한 안구내 수술. 환자들은 만약 하기 배제 기준의 하나가 무작위화 순간에 존재한다면 참여할 자격이 없었다:
1. 연구 처리의 투여 전에 12주 이내에 어느 시험용 약물(investigational drug)의 투여.
2. 덱사메타손 안약 처방에 사용 금지 사유(contraindication)의 존재.
3. 지속적인 진균 또는 세균 안구 감염, 항감염 치료의 난치의 존재.
4. 코르티코스테로이드 사용에 의해 유발된 것으로 알려진 안내 고혈압의 전력.
5. 불완전한 재상피화(incomplete re-epithelialization)와 관련된 각막 궤양, 각막 천공 또는 병변의 존재.
6. 실험자의 판단에 본 연구를 방하할 수 있는, 어느 수술 또는 의학적 조건의 존재.
7. 단백질 타입 약물 또는 백신에 어느 심각한 역반응 또는 과민증의 전력.
8. 계절 알러지 반응(예를 들어: 고초열(hay fever), 천식)을 위해 현재 치료됨.
9. 출산 가능성의 여성.
10. 본 연구에 28일까지(즉 마지막 방민이 수행된 날짜) 폐경기가 아닌 여성 파트너와 효과적인 피임 방법(예를 들어 조합된 피임약 또는 차단 피임법(barrier methods))을 사용하지 않으려는 남성.
11. 본 절차의 제공에 따르지 않으려는 환자들.
본 연구 프로토콜은 138명의 환자가 무작위화 및 연구 처리의 결막하 주사로 투여될 수 있도록 계획되었다. 또한 본 연구 프로토콜에서 연구 처리의 결막하 주사가 투여되지 않은 무작위화된 환자는 교체될 수 있는 것으로 규정되었다. 환자들은 눈 수술의 종결 최대 3시간 이후 이내에 250 μl 의 단일 결막하 주사로 투여되는 XG-102 90 또는 900 μg로 또는 21일 동안 매일 4회 주입되는 덱사메타손 안약에 무작위로 할당되었다. 첫번째 연구 처리 안약은 연구 처리의 결막하 주사 이후 최대 15분 이내에 주입되었다. 블라인딩(blinding)을 유지하기 위해, 환자들은 NaCl 0.9% 용액을 포함하는 안약을 수용한 XG-102 그룹에 무작위화되었고, 덱사메타손 그룹에 무작위화된 환자들은 NaCl 0.9%를 포함하는 결막하 주사로 투여되었다. 환자들은 연구 처리의 결막하 주사의 투여 이후 총 28(± 5)일 뒤를 이었다. 그들은 연구 프로토콜에 의해 요구되는 방문/조사를 수행하기 위해 외래 환자 클리닉으로 돌아왔다. 하기 표는 각 방문에 수행된 절차/조사에 추가하여 계획된 방문 스케쥴을 보여준다. 계획된 연구 프로토콜은 데이터 안전성 및 검토 위원회(DSMB)가 환자 안전성을 감독하는데 책임이 있다. 이는 연구 동안 누적되는 환자 데이터를 검토함에 더하여, 그들의 발생에 따라 심각한 역효과(Serious Adverse Events, SAE)를 검토함에 의해 수행되었다. 데이터 검토의 시기(timing)에 관한 상세는 DSMB 차터(charter)에서 설명되었다.
측정 스크리닝 방문: 안구 수술 전 방문 1
결막하 주사 이후 21 시간 (± 3 시간) 		방문 2
결막하 주사 이후 7 일(± 1 일) 		방문 3
결막하 주사 이후 14 일(± 2 ) 		방문 4
결막하 주사 이후 28 일(± 5 )
서면 동의서
(Written informed consent)		 Xa
인구통계 데이터
(Demographic data),
안과(ophthalmolog), MH		 Xb
신장, 체중 Xb
수반 치료
(Concomitant treatments)		 Xb x x x x
시티드 바이탈 사인
(Seated vital signs)		 Xb x x
안 기저부
(Ophthalmic fundus)		 Xb x x x x
안압
(Intra Ocular Pressure)		 Xb x x x x
슬릿 램프 실험 ± 레이저 플레어 미터
(Laser Flare Meter)		 Xb x x x x
시력 검사
(ETDRS법에 의해)		 Xb x x x x
혈액 채취 Xb,c x x
최종 포함/제외 기준 검사 Xb
무작위화 Xd
연구 처리 주사기의 준비 Xe
연구 처리의 투여(Admin.) Xf
XG-102 정량을 위한 혈액 채취 Xg
역 효과 보고 Xh x x x x
a. 서면 동의서는 수행되는 수술 절차 전에 또는 수행되는 절차와 관련된 어느 연구 전에 수득되었다.
b. 수행되는 안구 수술 전에 수행됨.
c. 하기 혈액 샘플은 수행되는 수술 절차 전에 수행됨. 수행되는 화학적 혈액 샘플은 하기와 같음: 아스파르테이트 트랜스아미나제(Aspartate Transaminase, AST), 알라닌 트랜스아미나제(Alanine Transaminase, ALT), C-반응 단백질(C-Reactive Protein, CRP), 크레아틴 키나아제(creatine kinase, CK), 글루코스, 크레아티닌 및 감마-글루타밀 트랜스퍼라제. 혈액학: 헤모글로빈 (Hb), 헤마토크리트(hematocrit, HCT) 및 전체 백혈구 카운트.
d. 수술 절차 수행 전에, 환자 적격성이 결정됨. 적합한 환자들은 수술 절차가 시작되기 전에 웹-기초의 시스템을 사용하여 무작위화됨.
e. 연구 처리 바이알은 결막하 주사 적어도 한시간 전에 냉동고로부터 제거되었다. 바이알은 연구 처리 주사기의 준비 전에 해동을 위해 주변온도에 안전한 장소에 놓았다. 연구 처리 안약은 연구 처리 바이알과 동시에 조제실로부터 회수되었다.
f. 연구 처리의 투여(결막하 주사 및 안약)는 수술 절차의 종료 이후 최대 3시간 이내에 수행되었다. 결막하 주사 우선, 그 다음 안약은 5 내지 15분 이후에 투여되었다.
g. 오텔 디외 병원(Hotel-Dieu Hospital)으로부터 모집된 약 30명의 환자에 연구 치료의 투여 1시간 이후 수행되었다.
h. 연구 처리의 투여가 시작되자마자 역 효과의 발현의 관찰이 시작되었다.
환자들은 세개 연구 그룹의 하나로 무작위화 되었다:
1. XG-102 90 μg의 단일 결막하 주사 + 21일 동안 플라시보 안약 4회/일 또는
2. XG-102 900 μg의 단일 결막하 주사 + 21일 동안 플라시보 안약 4회/일 또는
3. NaCl 0.9%의 단일 결막하 주사 + 21일 동안 덱사메타손 안약 4회/일
센터에 의해 차단된 무작위화는 웹 기반 (즉 e-SOCDATTM) 무작위화 시스템을 사용하여 중심적으로 수행되었다.
실험 물품 XG-102는 90 및 900 μg 투여량(250 μl의 단일 투여)으로 사용되었다. 투여의 방법은 단일 결막하 주사이다. 치료의 기간은 하나의 단일 투여(결막하 주사)이다. (제조 배치 번호(Manufacturing batch number) XG-102 90μg: PF.243.CR 및 제조 배치 번호 XG-102 900μg: PF.245.CR)
참조 물품 덱사메타손(Dexafree ®)은 1 mg/ml의 투여량으로 사용되었다. 투여의 방식은 안약이었다 (4회/일, 21일). 처리의 기간은 21일 - 4회/일이다. (배치 번호: X750 및 Z472)
플라시보 NaCl은 0.9%의 투여량에서 사용되었다. 투여의 방법은 단일 결막하 주사(250 μL) 또는 안약(4회/1일, 21일)이다. 처리의 기간은 하나의 단일 투여(결막하 주사) 및 안약에 대해 21일 - 4회/일이다. 제조 배치 번호: Y479 (안약) 및 1139512112 (결막하 주사.
전임상 약리학 및 독성학 연구에 더하여 종전 연구로부터 수득된 안전성 및 임시 효능(preliminary efficacy) 데이터에 기초하여, 두가지 투여량 - 90 및 900 μg XG-102 -은 본 실험을 위해 선택되었다. SDD-1002-023 연구에서, 90 및 900 μg 투여량의 안전성 프로파일은 유사하다. 추가로, 코르티코스테로이드 안약과 조합된 안내 염증의 감소는 양쪽 투여 그룹에서 같은 방식으로 행동하였다. 본 연구를 위해 얻어진 예방적 수단(DSMB의 역할, 및 지속적인 염증의 경우 오픈 라벨 항염증 처리를 유도하는 가능성)을 고려할 때, 본 연구를 위해 선택된 XG-102 투여는 한편으로는 환자의 안전성 타협을 고려하지 못하는 반면, 다른 한편으로는 본 연구의 목적을 위해 의미있는 데이터를 제공하기에 충분히 높았다. 투여의 결막하 경로는 안전성 및 효율성이 이러한 투여 경로를 사용하는 동물 및 인간에 나타나는 것과 같이, 조사 하에 진단과 함께 환자에게 투여의 의도된 경로의 하나이다. 본 연구를 위해 선택된 사용을 위해 덱사메타손 투여량 (즉 1 mg/ml / 0.4 ml 안약)에 추가로 빈도(즉 하루에 4 방울) 및 기간(즉 21일)은 수술 후 안구 염증에 대한 임상 시험에서 사용된 것처럼 덱사메타손 안약을 위한 사용의 표준 투여량/기간이다.
본 연구 프로토콜은 연구 처리의 결막하 주사가 눈 수술의 종료에 최대 3시간 이내에 투여되며 이는 첫번째 연구 처리 안약의 점적(instillation)을 통해 최대 15분 이내에 따라 규정되었다. 안구 수술의 종료시 연구 처리의 투여는 본 연구 포함의 일부인 안구 수술 절차를 따라 항염증 치료의 투여를 위한 표준 루틴(routine)을 따랐다.
실험자, 환자, CC(협력 센터)에 수술팀 또는 후원자 인사(약물 감시(pharmacovigilance) 스태프 외)는 무작위화 계획에 접근하지 못하였다. XG-102 용액 또는 플라시보 (즉 NaCl 0.9% 용액)을 포함하는 본 연구 치료 바이알은 외양 및 일관성(consistency)에서 동일하였다. 덱사메타손 용액 또는 NaCl 0.9%를 포함하는 단일 투여 용기내 안약 용액은 외양 및 일관성이 동일하였다. 연구 치료의 패키징 및 라벨링은 GMP (Good Manufacturing Practice) 및 GCP (Good Clinical Practice)에 따라 수행되었다. 추가로, 본 연구 처리 팩(packs)에 부착된 라벨의 내용은 임상 실험을 위한 지역 규정을 따랐다. 각 환자를 위해 두가지 동일한 수의 연구 처리 팩이 공급되었다. 하나의 연구 처리 '팩'은 XG-102 용액 (90 또는 900 μg)의 1 바이알 또는 플라시보 (NaCl 0.9%)의 1 바이알을- 환자가 무작위화 되는 처리군에 의존하여 - 포함하며, 두번째 '팩'은 21일 동인 4회/1일로 처리할 수 있도록 충분히 공급되는 덱사메타손 또는 플라시보 (NaCl 0.9%)를 포함하는 단일 투여 용기 내 안약 용액을 포함한다. 환자에게 할당될 때, 연구 처리 팩 넘버는 다른 환자에 대하여 할당되지 않았다. 환자의 연구 식별 번호 (즉 환자 식별 번호)는 본 연구 처리를 이끈 사람에 의해 수기로 라벨에 기록되었다. 외부 연구 처리 박스의 크기 및 모양은 XG-102 및 플라시보 용액에 대하여 동일하였다. 환자의 연구 처리 할당의 인식(knowledge)이 관심 환자의 추가 의학적 관리를 결정하는데 필요한 경우 또는 만약 환자의 처리 할당의 인식이 관리 보고 목적을 위해 요구되는 경우의 긴급 상황에서, 블라인드 된 시험자 또는 약물 감시 직책으로 위임된 후원자는 각각, 보안, e-SOCDATTM 내 웹-기반의 실험 특이적 처리 할당 시스템을 통해 관심 환자에 대한 연구 처리 코드에 사용자 접근 권한을 가진다. 만약 처리 코드가 어느 한명의 환자에 대해 접근되는 경우, 연구 처리 코드 접근에 관한 모든 정보(즉 처리 코드의 접근하는 사람의 이름, 이유, 날짜 및 시간 및 코드가 접근된 환자)는 만약 연구 처리 코드가 접근되는 경우 웹-기반의 시스템에 추적 및 저장될 수 있다.
주요 목적은 연구 처리의 결막하 투여의 투여 후 28일에 평균 전방 챔버 세포 등급에 의해 평가되었다. 주요 목적의 평가를 위한 기준은 하기와 같다
a. 28일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 900 μg vs 덱사메타손).
두번째 목적을 위한 평가 기준은 하기와 같다
a. 28일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손
b. 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 900 μg vs 덱사메타손)
c. 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손)
d. 7일, 14 및 28일에 전방 챔버 플레어 등급 (XG-102 900 μg vs 덱사메타손)
e. 7일, 14 및 28일에 전방 챔버 플레어 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손)
f. 구제 약물 치료 사용
g. 클리어 안구 염증(Cleared ocular inflammation)에 의해 측정된 것처럼 시간에 따른 안내 염증의 진전.
방문의 시기 및 빈도에 더하여 각 방문에 수행된 절차를 묘사하는 순서도(flow chart)는 상기 표에서 찾을 수 있다. 안과학적 실험은 기준점에 수행되었다(즉 수술 날, 그러나 수술이 수행되기 전). 그에 따라, 환자들은 결막하 주사가 투여된 이후 21 (± 3) 시간, 및 이후 7 (± 1), 14 (± 2) 및 28 (± 5) 일 보게 되었다. 실험자의 변동을 감소시키기 위해, 상가 자리는 가능한, 동일한 실험자가 본 실험에 걸쳐 동일한 환자에 대하여 모든 안과학 실험을 수행할 수 있도록 지시되었다. 안과학적 측정은 본 연구에 특이적인 지시에 따라 수행되었다. 후자는 개시 방문 동안 및 각 감시 방문 동안 현지 팀(site teams)과 함께 검토 및 논의되었다. 세포 / 플레어 카운트 및 세포 / 플레어 등급의 결정을 위해, SUN 워킹 그룹의 합의(SUN Working Group's consensus)가 SUN 워킹 그룹 정의를 사용하는 자리에 의해 사용되었다 ("Standardization of Uveitis Nomenclature for Reporting Clinical Data. Results of the First International Workshop.," American Journal of Ophthalmology, vol 140, no. 3, pp. 509-516, 2005).
안전성 평가를 위한 기준은 하기와 같다:
a. ETDRS 방법에 의한 시력
b. 슬릿 램프 실험 연구
c. 안 기저부 실험의 결과
d. 안압(IOP) 측정
e. 생체 징후 (혈압(BP), 맥박(PR) 및 리듬)
f. 혈액학 및 화학적 연구실 실험의 결과
g. 부작용의 발현
h. 환자의 부분 집합 (약 30명)에 연구 처리의 투여 1시간 이후 혈장 내 XG-102의 존재(또는 부재).
부작용에 대한 정의는 하기와 같다:
부작용(AE)은 '어느 의약학적 물품이 투여되는 환자에서 뜻밖의 의학적 발현 및 본 치료와 인과 관계를 필수적으로 가지지 않는 것'으로 정의된다. AE는 따라서 의약품의 용도와 일시적으로 관련되거나, 의약품과 관련되어 고려되든지 간에, 어느 비호의적인 및 의도하지 않은 징후, 증상 또는 질병이다.
AE는 하기 경우일 때 심각한 것으로 고려된다:
* 죽음을 초래
* 생명을 위협
* 개체에(in-subject) 입원 또는 기존 입원의 연장이 요구됨
* 지속적이거나 현저한 장애/불능을 초래
* 처리 기간 동안 임신된 자손에 선천적인 이상(congenital anomaly)/선천적 기형(birth defect)을 초래
* 환자를 의학적으로 현저하고 위태롭게 하거나 상기 결과의 하나를 방지하는데 개입(intervention)을 필요로 함
"심각한"의 정의에 용어 "생명을 위협"은 개체가 상기 경우의 시간에 죽음의 위험에 있는 경우를 의미하거나; 가설적으로 보다 심각한 죽음을 유발할 수 있는 경우를 의미하지 않는다. 의심되는 예상되지 않는 심각한 부작용(Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction, SUSAR)은 예상되지 않고(즉 투여되는 연구 처리의 예상되는 결과와 일치하지 않음) 심각한 처리에 관련된 의심되는 부작용으로 정의된다.
혈장 내 XG-102의 정량(혈장)은 하나의 자리에 위치한 32명의 환자의 하위 집단에 평가되었다. 정맥 혈액 샘플 (2 ml)는 연구 처리의 결막하 투여 60분 후에 Li-Heparin 튜브를 사용하여 수득되었다. 샘플이 수행되는 정확한 시간은 e-CRF에 제공된 공간에 들어왔다. 혈액 샘플은 실온에서 2,500 RPM에서 10분 동안 원심분리 되었다. 원심분리 이후, 피펫을 사용하여, 혈장은 두개의 1.5 ml 동결 튜브(cryotubes)에 전송되었다. 동결 튜브는 이후 -80°C에서 냉동고에 놓았고 이후 나중에 분석을 책임지고 있는 중앙 연구실에 온도 데이터 로거(logger)와 함께 드라이 아이스 내에서 보내졌다. 중앙 연구실에서 수령함에 따라, 샘플은 분석시까지 -80°C에서 저장되었다.
통계적 방법: 주요 목적은 연구 처리의 결막하 주사 이후 28일에 전방 챔버 세포 등급에 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 안약 사이에 비열등성 비교이다. 주요 결과는 Per-Protocol (PP) 개체수에 대하여 분석되었고 Full Analysis Set (FAS)에서 민감성 근거를 위해 반복되었다. 덱사메타손에 XG-102 900 μg의 비열등성은 만약 측정된 차이 주변의 95% CI의 상한이 0.5 전방 챔버 세포 등급 아래일 경우, 공표되었다. XG-102 90 μg 및 덱사메타손을 포함하는 28일에 일차 이차 종-점- 전방 챔버 세포 등급은 주요 결과와 같은 동일한 방식으로 분석되었다. 모든 다른 이차 결과는 0.005의 양면 알파 값을 사용하여 FAS에서 우월성 테스트에 의해 평가되었다. 안전성 분석은 처리를 받음을 통해 FAS 그룹에 수행되었다.
본 연구에 포함된 환자의 처분은 도 59에 나타내었다. 첫번째 환자는 2012년 7월 18일에 사전 동의서를 제공하였다. 마지막 환자는 2013년 9월 2일에 마지막 환자와 함께 무작위화되었고, 마지막 방문은 2013년 10월 3일에 수행되었다. 총 157명의 환자는 사전 동의서를 제출하였고 이들 중 151명은 무작위화 되었다. 151명의 무작위화된 환자 가운데 6명은 연구 처리의 결막하 주사가 투여되지 않았다. 본 연구 프로토콜에 요구에 따라, 이들 무작위화된 환자들은 교체되었다. 총 145명의 환자는 연구 처리(즉 XG-102 또는 플라시보)의 결막하 주사가 투여되었고 144명의 환자는 연구 프로토콜에 의해 계획된 연구를 완성하였다. 총 1명의 환자는 후속 조치로부터 철회하였다. 하기 표는 세가지 연구 그룹에 대한 후속 조치의 완성도를 보여준다:
Figure pct00008
데이터는 환자의 수(%). N= 각 그룹에 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율, tx=처리(treatment).
Full Analysis Set (FAS)는 연구 처리의 결막하 주사가 시작/투여된 모든 무작위화된 환자들을 포함한다. FAS 세트는 치료 목적 원리(intention-to-treat principle)에 따라 분석되었으며, 즉 환자들은 그들이 치료를 받은 것과 관계 없이 무작위화된 처리군에서 평가되었다. 추가로, 데이터는 허용된 시간대에 외부에서 수행된 방문에 대한 FAS 분석 세트로부터 제거되었다.
PP 분석 세트는 FAS의 하위 집단이다. 환자들은 후속 조치 동안에 오픈 라벨 항염증 치료의 무작위화 및/또는 유도 이후 주요 위반 때문에, 이 경우에 PP 분석 데이터 세트로부터 제외되었다. 추가적으로, 데이터는 허용된 시간대 외부에서 수행된 방문에 대하여 PP 분석 세트로부터 제거되었다.
안전성 세트는 연구 처리의 결막하 주사가 시작/투여된 모든 무작위화된 환자들을 포함한다. 환자들은 처리(treated)에 따라, 즉 그들이 받은 치료(treatment)에 따라 분석되었다. 안전성 세트는 안전성 분석을 위한 주요 분석 세트이다.
기준점 특성 및 동반이환(comorbidities)은 FAS 및 PP 개체군 모두에 대하여 세가지 처리군 사이에 균형이 맞추어졌다. 하기 표는 PP 분석 개체군에 대한 치료군에 의한 주요 기준점 동반이환의 일부를 보여준다. 각막 박리가 있는 환자의 백분율은 XG-102 900 μg (41%) 및 덱사메타손 그룹 (40%)에 비해 XG-102 90 μg (52%) 에 할당된 환자에서 보다 높은 반면, 당뇨병이 있는 환자의 백분율은 XG-102 90 μg 그룹 (22%) 및 덱사메타손 그룹 (26%)에 비해 XG-102 900 μg 그룹 (33%)에 무작위화된 환자에서 보다 높았다.
Figure pct00009
데이터는 환자의 수(%)이다. N=각 그룹에 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율.
하기 표는 처리군에 의해, 기준점에 안구 수술에 대한 지시에 추가하여 PP 분석 개체군을 위해 수행되는 수술의 형태를 보여준다. 복합체 후방 분절 수술을 받은 환자의 백분율은 XG-102 900 μg (46%) 및 덱사메타손 그룹 (42%)에 할당된 환자들에 비해, XG-102 90 μg (50%)에 할당된 환자에서 보다 높았다. 기준점에서 수술 수행 도중 가스(SF6 또는 C2F6)가 주입된 각 처리군에 환자의 백분율은 각각 43% (XG-102 90 μg), 37% (XG-102 900 μg) 및 38% (덱사메타손)이다.
Figure pct00010
데이터는 환자의 수이다(%). N=각 그룹에 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율, SD=표준 편차
.Nr. available = 데이터가 활용가능한 환자의 수
28일에 전방 챔버 세포 등급 - XG-102 900 μg vs 덱사메타손:
주요 종점은 조절된 반복된 측정 모델을 사용하여, 덱사메타손 그룹과 함께 XG-102 900 μg 투여량과 비교하여, 28일에 전방 챔버 세포 등급에 평균 차이로 분석되었다. 7, 14 및 28일 방문에 대해 수집된 데이터만이 반복된 모델에서 사용되었다. 주요 분석은 PP 분석 데이터 셋트에 수행하는 것이며 민감도 분석은 FAS 데이터 세트에 수행되었다. 첫 두번째 결과에 대하여, - 즉 28일에 전방 챔버 세포 등급 (XG-102 90 μg vs 덱사메타손) - 비열등성은 0.5 전방 챔버 세포 등급의 동일한 비-열등성 마진(margin)을 사용하여, 주요 종점에 대하여와 같이 동일한 방식으로 결정되었다. PP 분석 개체군에 대한 연구 처리의 결막하 주사의 투여 이후 28일까지 평균 전방 챔버 세포 등급은 세가지 처리군 - 즉 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 - 에 대하여 도 60에 보여지는 반면 통계적 모델 결과는 하기 표에 보여진다:
Figure pct00011
CI=신뢰 구간, μg=마이크로그램, % =백분율, tx=처리(treatment).
* 주요 비교(Primary comparison)'
주요 결과(outcome)의 결과(results)에 더하여 첫 두번째 결과는 PP 및 FAS 데이터 셋트 모두에 대하여 도 61에 나타냈다. XG-102 900 μg은 28일에 전방 챔버 세포 등급에 의해 측정된 것처럼 수술후 안내 염증의 진전에 덱사메타손 안약에 대해 비열등하다 (-0.054 전방 세포 등급의 차이, 95% 신뢰 구간 (CI) -0.350 - 0.242, p<0.001). 동일한 분석은 FAS에서 반복되었고 XG-102 900 μg는 덱사메타손 안약에 비해 비열등한 것으로 발견되었다 (-0.032 세포 등급 차이, 95% CI -0.301 - 0.238, p<0.001). FAS 및 PP 분석 세트에 대하여 상한 교차된 제로(upper boundary crossed zero)를 고려하면, XG-102 900 μg은 28일에 전방 챔버 세포 등급에 대하여 덱사메타손 안약에 비해 우수하지 않다 (FAS에 대하여 p=0.818 및 PP 분석 세트에 대하여 p=0.720).
28일에 전방 챔버 세포 등급 - XG-102 90 μg vs 덱사메타손:
덱사메타손 안약과 함께 XG-102 90 μg을 비교하는 이차 종점에 관하여, XG-102 90 μg은 수술후 안내 염증의 진전에 덱사메타손에 비해 비열등하다 (차이 0.086 전방 세포 등급, 95% CI -0.214 - 0.385, p= 0.003). 동일한 분석은 FAS에서 반복되었고 XG-102 90 μg은 덱사메타손 안약에 비해 비-열등한 것으로 발견되었다(0.053 전방 세포 등급의 차이 95% CI -0.215 - 0.321 p<0.001).
XG-102 90 μg vs 덱사메타손 및 XG-102 900 μg vs 덱사메타손에 대하여 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급:
XG-102 90 μg vs 덱사메타손 및 XG-102 900 μg vs 덱사메타손에 대하여 7일 및 14일에 전방 챔버 세포 등급에 대한 통계 분석이 FAS 데이터 세트에서 수행되었다. 7일 또는 14일에 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이 및 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 사이에 전방 챔버 세포 등급에 통계적으로 현저한 차이는 없었다.
XG-102 90 μg vs 덱사메타손 및 XG-102 900 μg vs 덱사메타손에 대하여 7일, 14 및 28일에 전방 챔버 플레어 등급:
28일까지 얻어진 전방 챔버 플레어 등급(FAS에 대하여)은 도 62에 보여지고 모델 결과는 하기 표에 나타내었다. 7일 또는 14일 또는 28일에 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이 및 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 사이에 전방 챔버 플레어 등급에 통계적으로 현저한 차이는 없었다.
Figure pct00012
CI=신뢰 구간, μg=마이크로그램, % =백분율, tx=처리.
클리어된(Cleared) 안구 염증:
시간에 따른 안구 염증의 평가는 클리어된 안구 염증을 통해 측정되었다. 후자는 전방 세포 등급 = 0 및 전방 챔버 플래어 등급 = 0으로 정의된 0등급의 합산된(summed) 안구 염증 점수를 갖는 개체의 비율로 정의된다. 이러한 결과는 덱사메타손과 함께 XG-102 900 μg 및 덱사메타손과 함께 XG-102 90 μg을 비교하여 7일, 14 및 28일에 평가되었다. FAS 및 PP 개체군에 대한 요약 통계 결과는 하기 표에 나타내었다. 일반적인 치료 그룹에 비해, XG-102 900 μg 그룹에 할당된 환자에 대하여, FAS에 수행된 분석에 관하여, 수술 후 7일에 클리어된 염증을 가질 확률(the odds)은 0.76 (95% CI 0.25 - 2.28)이며, 수술 후 14일에, 1.25 (95% CI 0.47 - 3.32) 및 수술 후 28일에, 1.13 (95% CI 0.49 - 2.60)이다. 일반적인 치료 그룹에 비해, XG-102 90 μg 그룹에 할당된 환자에 관하여, 수술 후 7일에 클리어된 염증을 가질 확률은 0.52 (95% CI 0.15 - 1.83)이며, 수술 후 14일에, 0.85 (95% CI 0.30 - 2.40) 및 수술 후 28일에 1.24 (95% CI 0.54 - 2.87)이다. XG-102 900 μg 그룹에 할당된 환자에 대하여, 일반적인 치료 그룹에 비해, PP 분석 세트에 수행된 분석에 관하여, 수술 7일 후 클리어된 염증을 가질 확률은 0.84 (95% CI 0.28 - 2.46)이며, 수술 후 14일에, 1.12 (95% CI 0.41- 3.05) 및 수술 후 28일에, 1.26 (95% CI 0.52 - 3.04) 였다. 일반적인 치료 그룹에 비해 XG-102 90 μg 그룹에 할당된 환자에 관하여, 수술 후 7일에 클리어된 염증을 가질 확률은 0.56 (95% CI 0.16 - 1.97)이며, 수술 후 14일에, 0.97 (95% CI 0.34 - 2.77) 및 수술 후 28일에, 1.45 (95% CI 0.58 - 3.61)였다.
Figure pct00013
데이터는 환자의 수임(%). N=각 그룹에 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율. Tx=처리.
**클리어된(Cleared) 안구 염증은 0 세포(즉 0과 같은 세포 등급) 및 노 플레어(no flare) (즉 0과 같은 플레어 등급)로 정의됨
레이저 플레어 미터 (LFM):
연구 전반에 걸쳐 정의된 시점에 얻어진 LFM 측정은 시간에 따른 LFM 측정 및 FAS에 대하여 28일까지 도 63에 묘사되었다.
구조 약물 치료(Rescue medication)는 실험자에 의해 판단된 것처럼 지속된 안구 염증 때문에, 후속 조치 동안 환자를 위해 처방된 어느 오픈-라벨 항염증 안구 처리로 연구 프로토콜에 정의된다. 연구 프로토콜은 연구 처리 안약이 오픈-라벨 항염증 안구 처리의 유도에 중지되는 것을 약정한다(stipulated). XG-102 90 μg 그룹에 도입된 구조 약물 치료를 위한 환자의 백분율은 덱사메타손 그룹에 비교할 때(XG-102 90 μg 및 덱사메타손 그룹에 대해 각각 21.3% vs 4.0% (p=0.013)) 통계적으로 다른 반면, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 간의 차이 (두 그룹에 대하여 각각 14.6% 및 4.0%)는 통계적으로 현저하지 않았다 (p=0.88)
혈장내 약동학:
XG-102의 정량을 위한 혈액 채취는 오텔-디외(Hotel Dieu) 병원 (파리)에 모집된 32명의 환자의 하위 집단에 XG-102의 결막하 투여 60분 이후에 이루어졌다. 혈장 내 XG-102의 정량의 분석학적 보고는 XG-102가 어느 환자에 대한 혈장 샘플 내에서 검출되지 않음을 보였다 - 하기 표 참조:
Figure pct00014
데이터는 환자의 수임(%). N=XG-102 정량 샘플이 수득된 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율. LLOQ=정량의 한계 미만 *LLOQ 이하의 값(즉 < 10ng/mL)는 '검출되지 않음'으로 고려되었다
요약하면, XG-102 900 μg은 수술 후 안내 염증의 진전에 덱사메타손 안약에 비해 비열등하다 (-0.054 전방 세포 등급의 차이, 95% CI -0.350 -0.242, p<0.001). 동일한 분석은 FAS에서 반복되었고 XG-102 900 μg은 덱사메타손 안약에 비해 비열등한 것으로 발견되었다 (차이 -0.032 세포 등급, 95% CI -0.301 - 0.238, p<0.001). FAS 및 PP 분석 세트에 대하여 상한 크로스된 제로(upper boundary crossed zero)를 고려하면, XG-102 900 μg은 28일에 전방 챔버 세포 등급에 대하여 덱사메타손 안약에 비해 우수하지 않다 (FAS에 대하여 p=0.818 및 PP 분석 세트에 대하여 p=0.820).
덱사메타손 안약과 함께 XG-102 90 μg을 비교하는 이차 종점에 관하여, XG-102 90 μg은 수술 후 안내 염증의 진전에 덱사메타손 안에 비해 비열등하다(차이 0.086 전방 세포 등급, 95% CI -0.214 - 0.385, p=0.003). 동일한 분석은 FAS에 반복되었고 XG-102 90 μg은 덱사메타손 안약에 비해 비열등한 것으로 발견되었다 (0.053 전방 세포 등급의 차이 95% CI -0.215 - 0.321 p<0.001).
7일 또는 14일에 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이 및 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 사이에 전방 챔버 세포 등급에 통계적으로 현저한 차이는 없었다. 7일에 또는 14일 또는 28일에 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이 및 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 사이에 전방 챔버 플레어 등급에 통계적으로 현저한 차이는 없었다.
시간에 따른 안구 염증의 평가는 클리어된 안구 염증에 의해 측정되었다. 후자는 전방 세포 등급 = 0 및 전방 챔버 플레어 등급 = 0으로 정의된 0 등급의 합산된 안구 염증 점수를 갖는 개체의 비율로 정의된다. 이러한 결과는 덱사메타손과 함께 XG-102 900 μg 및 덱사메타손과 함께 XG-102 90 μg을 비교하여 7일, 14 및 28일에 평가되었다. XG-102 900 μg에 할당된 환자를 위하여, 일반적인 치료 그룹에 비해 FAS에 수행되는 분석에 관하여, 수술 후 7일에 클리어된 염증을 갖는 확률은 0.76 (95% CI 0.25 - 2.28)이며, 수술 후 14일에, 1.25 (95% CI 0.47 - 3.32) 및 수술 후 28일에, 1.13 (95% CI 0.49 - 2.60)이다. 일반적인 치료 그룹에 비해 XG-102 90 μg 그룹에 할당된 환자에 관하여, 클리어된 염증을 가질 확률은 수술 후 7일에 0.52 (95% CI 0.15 - 1.83), 수술 후 14일에 0.85 (95% CI 0.30 - 2.40) 및 수술 후 28일에 1.24 (95% CI 0.54 - 2.87)였다.
안전성 평가
노출의 규모:
본 연구는 이중 맹검 연구이다. 무작위화되고 결막하 주사가 시작된 모든 환자는 투여 그룹에 의해 본 안전성 분석에 포함되었다. 오직 처리 신생 AEs가 분석되었으며, 즉 연구 처리의 결막하 주사의 시작 이후 발생된 AEs. 만약 연구 치료 안약이 조기에 중지되는 경우 (즉 21일 전), 본 연구 프로토콜에 따라, 관심 환자들은 28일까지 후속 조치를 계속하였다. 연구 처리의 결막하 주사는 47명의 환자는 XG-102 90 μg 투여되었고, 48명의 환자는 XG-102 900 μg 투여되었고 덱사메타손 그룹에 할당된 50명의 환자는 NaCl 0.9%로 투여된 총 145명의 환자에게 투여되었다. 연구 처리의 결막하 주사가 시작된 모든 환자에 대하여, 연구 처리의 총 량(즉 250 μL)이 투여되었다.
본 연구 처리 안약을 위한 환자에 의한 노출은 하기 표에 나타내었다. 연구 처리 안약에 관하여, 본 프로토콜에 의해 요구되는 본 연구 처리 안약의 점적에 전반적인 준수는 세개 연구 그룹에서 > 90%이다. XG-102 처리 그룹에 할당된 환자들은 준수가 91%인 덱사메타손 그룹에 할당된 환자에 비해 본 연구 처리 안약의 점적에 약간 높은 준수를 가졌다 (XG-102 90μg 및 XG-102 900 μg 그룹 각각에 대하여 95% 및 94%). 50명의 환자들은 81 방울(81 x 0.05mg=4.05mg)의 최대 축적된 투여량으로 평균 20일(6-21일, 최소-최대) 동안 덱사메타손 안약을 수용하였다.
Figure pct00015
각주: 본 연구 처리 안약을 조기에 중지한 환자에 대하여, 준수는 사용/계획처럼 계산되었다
*100 계획된 곳 = 4*(시작으로부터 철회까니 일자). 프로토콜에 의해 계획된 연구 처리 안약을 사용한 환자에 대하여, 준수는 ((81 - 비사용된 안약 병)/81)*100으로 계산되었다.
역효과(Adverse events)
투여 그룹에 의한 역효과의 요약:
보고된 역효과(심각 및 비심각)은 투여 그룹에 의해 도 64에 나타내었다. AE가 보고된 환자의 수에 관하여 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 그룹 사이 및 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 사이에 통계적으로 현저한 차이는 없었다. XG-102 90 μg에 할당된 환자에 관하여, 총 78 AEs는 이 그룹에 할당된 31 / 47 (66%) 환자에 대하여 및 XG-102 900 μg에 할당된 환자에 대하여 보고되었고, 총 69 AEs는 32 / 48 (67%) 환자에 대하여 보고되었다. 덱사메타손 그룹에 할당된 환자에 대하여, 총 55 AEs는 29/50 (58%) 환자에 대하여 보고되었다. 본 연구 처리의 투여 후 24시간 이내에 AE를 경험한 환자의 백분율은 세가지 연구 처리 그룹 사이에 유사하였다 (즉 XG-102 90 μg, the XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 각각에 대해 34%, 27% 및 30%).
심각성 및 투여 그룹에 따라 보고된 AEs의 분포는 하기 표에 나타내었다. 보고된 AEs의 대다수 (약 70%)는 세가지 투여 그룹에 대하여 '보통'인 것으로 조사자에 의해 고려되었다.
심각성
투여 그룹 가벼운 보통 심각
XG-102 90 μg 55 (70.5%) 6 (7.7%) 17 (21.7%)
XG-102 900 μg 49 (71.0%) 12 (17.4%) 8 (11.6%)
덱사메타손 42 (76.4%) 9 (16.4%) 4 (7.3%)
데이터는 경우(event)의 수 (% 또는 보고된 경우)
본 연구 처리 안약의 중단을 유도하는 AEs의 요약 개관은 하기 표에 투여 그룹을 통해 나타내었다:
투여 그룹 연구 처리의 중단을 유도하는 역효과
XG-102 90 μg 11 (14.1%)
XG-102 900 μg 8 (11.6%)
덱사메타손 3 (5.5%)
데이터는 경우의 수(보고된 경우의 %)
XG-102 90 μg 투여 그룹에 할당된 모든 환자에 대하여, 11번 경우 (이러한 투여 그룹에 모든 보고된 AEs의 14%)는 연구 처리의 조기 철회를 초래한 반면, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 투여 그룹에서, 연구 처리 안약은 8번 경우(이러한 투여 그룹에 모든 보고된 AEs의 12%) 및 3번 경우(이러한 투여 그룹에 모든 보고된 AEs의 6%) 각각에 중단되었다.
조사자들은 어느 연구 처리에 각각 보고된 AE의 관계를 (블라인드 방식으로) 측정하였다. 경우는 조사자가 본 질문에 답하여 '가능' 또는 '개연성 있는(probable)'으로 체크할 경우, 연구 처리에 관련된 것으로 고려되었다. 추가로, 조사자는 경우(event)가 관련된 것으로 고려되는 연구 처리(즉 XG-102 또는 덱사메타손)에 특정되었다 - 하기 표 참조. AEs는 XG-102 90 μg에 환자에 대해 보고된 18번 경우, XG-102 900 μg에 환자에 대해 보고된 13번 경우, 및 덱사메타손 그룹에 환자에 대해 보고된 15번 경우(하기 표 참조)에 연구 약물 치료에 가능성 있거나 개연성 있게 관련된 것으로 조사자들에 의해 고려되었다(블라인드 측정). 보고된 SAEs의 어느 것도 본 연구 처리에 가능하거나 개연성 있게 관련된 것으로 조사자들에 의해 고려되지 않았다.
Figure pct00016
데이터는 경우의 수. N=각 그룹에 환자의 수, #=수, μg=마이크로그램, %=백분율.
역효과의 전시:
보고된 경우는 만약 조사자들이 e-CRF에 질문 '연구 처리에 관련'에 응답한 '가능' 또는 '개연성 있는'으로 체크한 경우 연구 처리에 관련된 것으로 고려된다. 세개 연구 그룹의 하나에 무작위화된 환자의 적어도 2%에 보고된 AEs의 요약 (MedDRA SOC 및 PT 용어로 분류됨)은 도 65에서 찾을 수 있다.
역효과의 분석
전체적으로, AE가 보고된 환자의 수에 관하여 XG-102 투여 그룹 및 덱사메타손 투여 그룹 사이에 통계적으로 현저한 차이가 없었다. XG-102 90 μg에 할당된 환자에 대하여, 총 78 AEs가 이러한 그룹에 할당된 31 / 47 (66%) 환자에 대하여 및 XG-102 900 μg에 할당된 환자에 대하여 보고되었고, 총 69 AEs가 32/48 (67%)로 보고되었다. 덱사메타손 그룹에 할당된 환자에 대하여, 총 55 AEs는 29/50 (58%)에 대하여 보고되었다. 연구 처리의 투여 이후 24시간 이내에 AE를 경험한 환자의 백분율은 세가지 연구 처리 그룹 사이에 유사하다 (즉 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹의 각각에 대해 34%, 27% 및 30%).
가장 빈번하게 보고된 AEs는 SOC 'EYE DISORDERS 이다. 이러한 SOC 내, 49 경우는 XG-102 90 μg에 할당된 26명 (55%) 환자들에 대해 보고되었고, 43 경우는 XG-102 900 μg에 할당된 24명 (50%) 환자들에 대해 보고되었고, 30 경우는 덱사메타손에 할당된 환자의 16명 (32%)에 대해 보고되었다. 이러한 SOC에 보고된 경우에 대한 환자의 수에 관하여 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 그룹 사이 통계적으로 현저한 차이가 있다(p=0.025). 염증 ('안 염증', '각막 부종', '안검 부종')을 암시하는 경우는 XG-102 900 μg 또는 덱사메타손 투여 그룹에 할당된 환자에 비해 XG-102 90 μg에 할당된 환자에 대하여 보다 빈번하게 보고되었다. 안구 통증은 덱사메타손 그룹에 비해, XG-102 900 μg 그룹에 할당된 환자에 대하여 보다 빈번하게 보고되었고, 이러한 경우가 보고된 환자의 수에 차이는 통계적으로 현저하였다 (p=0.029). SOC '조사' 내에서, '증가된 안압'은 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 각각에 대해 10% 및 14%에 비할 때, XG-102 90 μg (23%)에 할당된 환자에서 보다 빈번하게 보고되었다. 이러한 경우가 보고된 환자의 수에 차이(XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이)는 통계적으로 현저하지 않았다. 연구 처리 안약은 XG-102 90 μg에 할당된 11명의 환자에 대해, XG-102 900 μg에 할당된 8명의 환자에 대해 및 덱사메타손에 할당된 3명의 환자에 대한 AE 때문에 중단되었다. 도 65는 무작위화된 그룹과 무관하게 적어도 2%의 환자에 발생된 AEs의 요약을 보여준다 (MedDRA SOC 및 Preferred Term (PT)에 의해 분류됨).
심각한 부작용
염려되는 심각한 부작용은 도 66에 나열되었다. 총, 9 SAEs는 9명의 환자에 대하여 보고되었다 - 즉 XG-102 90 μg 투여 그룹에 무작위화된 4명의 환자, XG-102 900 μg 투여 그룹에 무작위화된 3명의 환자 및 덱사메타손 투여 그룹에 무작위화된 2명의 환자. 총, 하나의 SAE (XG-102 90 μg 투여 그룹에 무작위화되니 환자에 대해)는 연구 처리의 결막하 주사의 투여 이후 첫 24시간 내에 보고되었다. 보고된 SAEs의 어느 것도 연구 처리에 관련된 것으로 조사자에 의해 고려되지 않았다. 모든 보고된 SAEs에 대한 '심각함에 대한 이유'는 '입원'이다. 보고된 SAEs의 개괄은 도 66에 나타내었다.
임상 연구실 평가
본 연구에 대해 수행된 혈액학 및 화학 분석은 하기 표에 나타내었다. 모든 연구실 실험은 국부적으로(locally) 수행되었다.
혈액학: 헤모글로빈, 헤마토크리트(hematocrit),
백혈구 수치(WBC), 호중구, 호염기성세포, 호산 백혈구(eosinophils), 단핵 백혈구 및 림프구
화학: 크레아티닌, 아스파르테이트 트랜스아미나제(Aspartate Transaminase, AST), 알라닌 트랜스아미나제(Alanine Transaminase, ALT), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(gamma-glutamyltransferase, gamma-GT), 글루코스, CK, CRP
안전성 결론
종합적으로, XG-102 90 μg 및 XG-102 900 μg은 복합 안구 수술을 받은 환자에서 잘 견뎠다. 본 연구 처리 안약은 XG-102 90 μg에 무작위화된 11명의 환자에 대해, XG-102 900 μg에 무작위화된 8명의 환자에 대해, 및 덱사메타손에 무작위화된 3명의 환자에 대해 조기에 중단되었다. 연구 처리의 조기 철회의 이유는 일차적으로 안구 염증의 지속 때문이며, 조사자의 의견은 항염증 치료의 강화(intensification)를 필요하게 하였다. 관심 환자에 대하여, 오픈-라벨 항염증 안구 처리와 함께 치료가 시작되었다.
본 연구에 기록된 치명적인 경우는 없었다. 총 9 SAEs는 9명의 환자에 대하여 보고되었고 이들 경우의 어느 것도 본 연구 처리에 관련된 것으로 고려되지 않았다.
보고된 AEs의 총 수에 관하여, 여기에 AE가 보고된 환자의 수에 관하여 XG-102 투여 그룹 및 덱사메타손 그룹 모두 사이에 통계적으로 현저한 차이가 없다. XG-102 90 μg에 할당된 환자에 관하여, 총 78 AEs는 본 그룹에 할당된 환자 및 XG-102 900 μg에 할당된 환자에 대하여 31 / 47 (66%)로 보고되었고, 총 69 AEs는 32 / 48 (67%) 환자들에 대하여 보고되었다. 덱사메타손 그룹에 할당된 환자에 대하여, 총 55 AEs는 29 / 50 (58%) 환자들에 대하여 보고되었다. 연구 처리의 투여 이후 24시간 이내에 AE를 겪은 환자의 백분율은 세가지 처리군 사이에 유사하다 (즉 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 각각에 대해 34%, 27% 및 30%). 안구 염증의 AE 암시(suggestive)를 경험한 환자의 수는 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹에 비해 XG-102 90 μg 그룹에 할당된 환자에서 보다 높았으며, 이는 XG-102 90 μg이 복합 안구 수술에 이차적인 안구 염증의 치료에 덜 효과적일 수 있음을 제안한다. 안구 통증의 AE 암시를 경험한 환자의 수는 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 그룹에 비해 XG-102 900 μg 그룹에 할당된 환자에서 보다 높았다. XG-102 90 μg 그룹에 두명의 환자에 대하여, 안구 통증은 연구 처리의 결막하 주사의 주사 이후 24시간 미만으로 보고되었다 - 이들 환자의 한명을 위하여, 진통 처리는 수술 후 처방되지 않았다. 이들 환자의 한명을 위하여, 안구 통증은 AE 35일 후에 다시 보고되었으며, 이는 환자가 증가된 IOP를 갖는 것으로 보고된 때와 동일한 시점이었다.
XG-102 900 μg 그룹에 세 환자에 대하여 (즉 환자 FR-02-0013, FR-03-003 and FR-05-0060), 안구 통증은 연구 처리의 결막하 주사의 주사 이후 24시간 미만에 보고되었고, 이들 환자의 한명에 대하여 (즉 환자 FR-02-0013) 안구 통증은 5일 이후 AE로 보고되었다. 동일한 투여 그룹에 네 환자에 대하여(즉 환자 FR-04-0108, FR-05-0127, FR-05-0152 and FR-05-0155), 안구 통증은 부수적으로 연구 처리의 결막하 주사 이후 > 24시간에 보고되었다. 이들 환자의 세명에 대하여, 안구 통증은 다른 AEs (즉 환자 FR-02-0113, FR-05-0127 및 FR-05-0155)와 함께 부수적으로 보고되었다. 안구 통증은 부수적으로 연구 처리의 결막하 주사 이후 > 24시간에 덱사메타손 그룹에 한명의 환자(즉 FR-03-0087)에 대해 보고되었다. 이러한 경우는 다른 AE와 함께 부수적으로 보고되었다. 복합 수술이 수행됨을 고려하면, 안구 통증은 또한 수술 후 스티치(stitches)의 존재에 관련될 수 있다.
요약
준수(Compliance): 연구 처리의 결막하 주사가 시작된 모든 환자에 대하여, 총 량(즉 250 μL)가 투여되었다. 세 연구 처리 그룹에서, 연구 처리 안약에 전반적인 준수는 > 90%이다.
안전성: 역효과가 보고된 환자의 수에 관하여 XG-102 투여 그룹 및 덱사메타손 그룹 사이에 통계적으로 현저한 차이는 없었다. XG-102 90 μg에 할당된 환자에 대하여, 총 78 역효과가 본 그룹에 할당된 환자 및 XG-102 900 μg 에 할당된 환자에 대해 31 /47 (66%)로 보고되었고, 총 69 부작용은 32 / 48 (67%) 환자들에 대해 보고되었다. 덱사메타손 그룹에 할당된 환자에 대하여, 총 55 역효과는 29 / 50 (58%) 환자들에 대해 보고되었다. 연구 처리의 투여 이후 24시간 이내에 역효과를 경험한 환자의 백분율은 세개 연구 처리군 사이에 유사하였다 (즉 XG-102 90 μg, XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 각각에 대해 34%, 27% 및 30%). XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹에 비해, 안구 염증의 역 효과 암시를 경험한 XG-102 90 μg 그룹에 할당된 보다 많은 환자는 XG-102 90 μg가 복합 안구 수술에 이차적으로 안구 염증의 치료에 덜 효과적일 수 있음(900 μg 및 덱사메타손 투여 그룹에 비해)을 암시할 수 있다. 안구 통증의 역효과 암시를 경험한 환자의 수는 XG-102 90 μg 및 덱사메타손 그룹에 비해 XG-102 900 μg 그룹에 할당된 환자에서 보다 높았다. 안구 통증은 수술에 따른 스티치(stitches)의 존재에 관련될 수 있다. '증가된 안압'은 XG-102 900 μg 및 덱사메타손 그룹 각각에 대해 10% 및 14%에 비교할 때, XG-102 90 μg(23%)에 할당된 환자에 대해 보다 빈번하게 보고되었다. 이러한 경웅의 환자의 수에 차이가 보고됨 (XG-102 90 μg 및 덱사메타손 사이는 통계적으로 현저하지 않음).
주요 (약 70%)의 모든 보고된 역효과(AE)는 가벼운 것으로 조사자에 의해 고려되었다. 전체적으로, AEs는 XG-102 90 μg에 환자에 대해 보고된 18 경우에 대해, XG-102 900 μg에 환자에 대해 보고된 13 경우에 대해, 덱사메타손 그룹에 환자에 대해 보고된 15 경우에 대해 연구 약물 치료와 관련하여 가능 또는 개연성 있는 것으로 조사자에 의해 고려되었다(블라인드 측정). 치명적인 경우는 본 연구에 보고되지 않았다. 총, 9 SAEs가 9명의 환자에 대해 보고되었고 이들 중 어느 경우도 연구 처리에 관련된 것으로 고려되지 않았다.
XG-102의 정량은 32명의 환자의 하위 집단에 수행되었다. 혈액 샘플은 연구 처리의 결막 하 주사 1시간 이후 수득되었다. 채집된 모든 샘플(및 투여 그룹에 할당과 무관)에 대하여 XG-102 농도는 < 10 ng/ml의 정량의 하한(Lower Limit of Quantification, LLOQ) 미만인 것으로 분석되었다.
비-열등성의 우리의 정의에 따라, 단일 결막하 주사로 투여된 XG-102 900 μg 및 XG-102 90 μg 모두는 복합 안구 수술을 받은 환자에서, 전방 챔버 세포 등급에 의한 측정처럼 수술 후 안내 염증의 치료에 21일 동안 4회/일 주입된 덱사메타손 안약으로 처리에 비해 비-열등하였다.
전반적으로, XG-102 90 μg 및 XG-102 900 μg는 잘 견뎠다. 보고된 역효과의 어느 것도 XG-102의 불내성의 또는 비가역적 역효과의 암시는 아니었다. XG-102 90 μg에 보고된 안 염증을 암시하는 경우의 증가된 수는, 이러한 투여량이 복합 안내 수술에 따른 환자에 수술 후 안내 염증의 치료에 덜 효과적임을 제안한다. 이는 또한 XG-102 90 μg 그룹에 지속적인 안 염증 때문에 구조 약물 치료가 도입된 환자의 백분율에 의해 아마 수행될 수 있다. 연구 처리의 결막하 주사의 투여 1시간 이후 측정된 XG-102의 혈장 정량은 XG-102의 전신 통과(systemic passage)가 없음을 설명한다.
실시예 28: p-38 ( Mapk14 ) 결핍 쥐에 인비보 (in vivo ) 헤파토카르시노마(hepatocarcinoma)에 XG -102의 효과
p-38로 또한 알려진 Mapk14는 세포 증식 및 종양 형성의 잘 알려진 음성 조절자이다. 봉 녀구에서, Mapk14f /f 및 Mapk14Δli * 쥐뿐만 아니라 Mapk14f /f Junf /f 및 Mapk14 Δli * Jun Δli * 쥐가 사용되었다. "Mapk14Δli *", 및 "Mapk14 Δli * Jun Δli *"은 각각 본 발명에서 polyIC-처리된 Mx-cre/Mapk14f /f 쥐, 및 Mx-cre 삭제된 Mapk14f /f Junf /f 쥐를 각각 의미하며, 따라서, Mx-cre 절차에 의해, Mapk14 "삭제", 및 Jun 삭제, 즉 "Mapk14-/-" 쥐, 및 "Mapk14-/-Jun-/-" 쥐 각각을 각각 초래한다.
XG-102는 디에틸니트로사민 (DEN)-유도된 간세포 및 간 종양 세포의 과다세포증(hyperproliferation)에 이의 효과를 연구하기 위해 20 mg/kg의 투여량으로 복강내로 일주일에 두번 투여되었다 (Hui L. et al., p38a suppresses normal and cancer cell proliferation by antagonizing the JNK-c-Jun pathway. Nature Genetics, 2007; 39: 741-749 참조). PBS는 대조군으로 사용되었다. 구체적으로 Mapk14f/f and Mapk14Δli * 쥐는 DEN 처리 전에 PBS 또는 XG-102로 (kg 체중 당 20 mg) 주사되었다. 쥐 내 간세포의 증식은 DEN 처리 및 정량 48시간 이후 Ki67 염색에 의해 이후 분석되었다.
도 67은 XG-102("D-JNKI1"으로 도면에 언급된) 또는 PBS 처리된 Mapk14f /f and Mapk14Δli* 쥐에 간세포의 증식의 왼쪽 패널 (Ki67-양성 세포의 정량)을 보여준다. PBS 조건(대조군)에서, Mapk14-/- cells (Mapk14Δli *)는 세포 증식 및 종양 형성에 Mapk14 (p38)의 음성 조절이 존재하지 않기 때문에, Mapk14+/+ 세포(Mapk14f /f)에 비해 보다 집중적으로(intensively) 증식한다. XG-102의 투여는 XG-102 (DJNKI1)의 활동성에 의해 Mapk14(Mapk14-/- 세포 내)의 이러한 "비-활동성"을 되돌린다.
도 67의 오른쪽 패널에는 XG-102 (도면에 "D-JNKI1"으로 언급) 처리된 Mapk14f /f Junf/f(Mapk14+/+ Jun+/+ 의미) 및 Mapk14 Δli * Jun Δli *( Mapk14-/- Jun-/- 의미) 쥐에 간세포의 증식(Ki67-양성 세포의 정량)을 보여준다. 상기 결과는 PBS 조건에 Mapk14f/f 및 XG-102(DJNKI1) 조건에 Mapk14 Δli *의 그들과 동등 및 유사(mimic)하다. 따라서, XG-102 활동성은 세포 라인에 Jun 유전자를 삭제하는 것과 "동등"하다. 이러한 점에서, 이들 결과는 XG-102가 암 세포 라인의 성장에 활성을 가지며(Mapk14 삭제에 의해 유도된 과성장을 되돌림), 이는 아마도 Jun에 의해 조절됨을 확인할 수 있다.
실시예 29: 인비보 (in vivo ) 인간 간 암 세포(이식된)에 XG -102의 효과
인비보 인간 간암 세포에 XG-102의 효과를 연구하기 위해, 3X106 Huh7 인간 간암 세포는 4주령 누드 쥐의 양쪽 측면 부위에 피하 주사되었다. 누드 쥐는 Huh7 주사 이후 5mg/kg으로 일주일에 두번 복강내(intraperitoneally) XG-102로 처리되었다. 종양 부피는 일주일에 두번 측정되었다. 쥐들은 이식 4주 후 죽였다.
도 68에 나타난 것처럼, 인간 간세포의 암종(carnimoma)의 피하 주사 이후 일주일에 두번 복강내 투여된 XG-102는 5 mg/kg의 투여량에서 종양 성장을 현저하게 감소시켰다.
실시예 30: 동소 이식( orthotopic ) HEP G2 인간 간 암종을 갖는 스위스 누드 쥐에 1mg/kg XG -102의 항종양 활성
본 연구의 목적은 동소 이식 Hep G2 인간 간암종 종양을 갖는 SWISS 누드 쥐의 모델에 1 mg/kg XG-102의 항종양 활성을 결정하는 것이다.
20마리 건강한 암컷 SWISS 누드 쥐는 Charles River (L'Arbresles, France)로부터 수득하였다. 동물 실험은 동물 실험의 유럽 윤리 가이드라인 및 실험 종양 형성에 동물의 복지(welfare)를 위한 영어 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물들은 온도(23± 2°C), 습도(45 ± 5%), 광주기(12시간 광/12시간 암) 및 공기 교환의 통제된 조건 하에 방에서 유지되었다. 동물들은 SPF 조건에 유지되었고 실온 및 습도는 계속적으로 감시되었다. 공기 조절 시스템은 재순환 없이 시간 당 14회 공기 변화를 위해 프로그램되었다. 각 방으로 고르게 분산되기 전에, 일련의 필터를 통해 신선한 외기가 통과되었다. 높은 압력(20 ± 4 Pa)은 쥐 군집(colony) 내 오염 또는 병원균의 확산을 방지하기 위해 실험실에 유지되었다. SPF 조건 하에 일하는 모든 사람은 그들이 축산(animal husbandry) 지역에 들어올 때 위생 및 의복에 관한 특정한 가이드라인을 따랐다. 동물들은 음식 및 물을 공급하기 위해 장착된 폴리카보네이트 케이지(UAR, Epinay sur Orge, France) 에 수용되었다. 사용된 표준 구역(area) 케이지는 내부 표준 수술(operating) 절차에 따라 케이지 당 최대 10마리 쥐와 함께 800 cm2이다. 동물을 위한 침구는 멸균 나무 부스러기(SERLAB, Cergy-Pontoise, France)이며, 일주일에 한번 교체되었다. 동물 음식은 SERLAB (Cergy-Pontoise, France)로부터 구매하였다. 멸균 조절된 과립의 형태는 DIETEX이다. 음식은 임의로 제공되었고, 케이지 상부에 금속 뚜껑에 위치하였다. 물은 또한 고무 스토퍼 및 스트로 튜브와 함께 장착된 물병으로부터 임의로 제공되었다. 물병은 세척되고, 물로 채워지고, 필터를 통해 멸균 되고 일주일에 두번 교체되었다.
XG-102 투여를 위해 저장 용액은 멸균수(WFI, Aguettant)에 10 mM로 제조되었다(38.22 mg/ml에 대응). 부분 표본은 각 처리를 위해 제조되었고 약 -80°C에서 저장되었다. 0.2 mg/ml에 상기 저장 용액의 WFI와 함께 희석은 각 처리일에 수행되었고 최대 24시간 동안 2-4°C에서 저장되었다. 저장 용액의 안정성은 약 -80°C에서 100일 이상이며; 동물 투여를 위해 희석된 제형의 안정성은 2-4°C에서 24시간이다. 희석된 제형은 사용시까지 얼음에 유지되었고 사용되지 않은 희석된 물질은 폐기되었다. XG-102의 처리 투여는 1 mg/kg/inj에 주사되었다. 주사는 D10, D14, D18, D22, D41, D45, D49 및 D53 ([Q4Dx4]x2)일에 수행되었다. XG-102 물질은 쥐의 미정맥(caudal vein)을 통해 5 ml/kg으로 정맥내(IV) 주사되었다. 주사 부피는 쥐의 가장 최근의 개별적 체중에 따라 조정되었다.
종양 세포 라인 및 배양 배지는 구매하였고 Oncodesign에 의해 제공된다:
세포 라인 타입 종 원천
(Origin) 		참조
Hep G2 인간 간암종
(Human hepatocarcinoma)		 human ATCC* 4
* 아메리칸 타입 배양 콜렉션(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA).
Hep G2 세포 라인은 1975에 간세포 암종과 함께 15살 아르헨티나 소년(Argentine boy)의 종양 조직으로부터 설립되었다(ADEN D.P. et al., Nature, 282: 615-616, 1979). 종양 세포는 습기가 있는 공간에 (5% CO2, 95% 공기) 37°C에서 부착 단층과 같이 성장하였다. 배양 배지는 2 mM L-글루타민(Ref BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 포함하며 10% FBS(Ref DE14-801E, Lonza)로 보충된 RPMI 1640이다. 실험적 용도를 위해, 세포들은 트립신-벌센(versene) (Ref 02-007E, Cambrex)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리되고, 칼슘 또는 마그네슘 없이 행크스 배지에 희석되고(Ref BE10-543F, Cambrex), 완성 배양 배지의 첨가에 의해 중성화되었다. 세포는 혈구계(hemocytometer)에서 카운트되었고 그들의 생존력은 0.25% 트립판 블루 배제(exclusion)를 통해 측정되었다. 마이코플라즈마 검출은 제조자의 지시에 따라 MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Ref LT07- 318, Lonza)를 사용하여 수행되었다. MycoAlert® 분석은 마이크플라스마 효소의 활성을 이용하는(exploits) 선택적인 생화학적 실험이다. 실행 가능한 마이코플라스마는 용균되고 효소는 ADP를 ATP로 변환을 촉매하는 MycoAlert® 기질과 반응한다. MycoAlert® 기질의 첨가 전 후에 샘플 내 ATP 수준을 측정함으로써 비율은 수득될 수 있으며, 이는 마이코플라즈마의 존재 또는 부재의 표지이다. 마이코플라즈마
실험은 세포 라인의 세포 상청액으로부터 중복하여(in duplicate) 분석되었고 음성 및 양성 대조군(MycoAlert® Assay Control Set Ref LT07-518, Lonza)과 비교되었다 (Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002, data not shown but archived).
실험 설계:
종양 유도 24시간 전에, 20마리 암컷 SWISS 누드 쥐는 γ-소스(source)로 방사능 처리되었다 (2.5 Gy, Co60, INRA, Dijon, France). D0에, Hep G2 종양은 20마리 암컷 SWISS 누드에 동소 이식적으로 유도되었다. 마취 하에, 동물 복부는 무균 상태 하에 정중 절개(median incision)를 통해 절개되었다. RPMI 1640 배양 배지의 50 μl에 현탁된 1000만 (107) Hep G2 종양 세포는 간의 피막 하(subcapsular) 부위에 주사되었다. 복강(abdominal cavity)은 그 뒤에 5-0 봉합(sutures)과 함께 2 층에 닫았다.
10일에, 쥐는 10마리 쥐의 2개 그룹을 만들기 위해 그들의 체중에 따라 처리 시작 전에 무작위화 되었다. 각 그룹의 체중은 다른 것으로부터 통계적으로 차이가 없었다 (변량의 분석). 그룹 1로부터 쥐들은 D10, D14, D18, D22, D41, D45, D49 및 D53 ([Q4Dx4]x2)에 5 ml/kg/inj.에 비히클의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 2로부터 쥐들은 D10, D14, D18, D22, D41, D45, D49 및 D53 ([Q4Dx4]x2)에 1 mg/kg/inj.에 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였다:
그룹 동물 No. 처리 투여(mg/kg/ inj .) 경로 처리 스케줄
1 8 비히클 - IV [Q4Dx4]x2
2 7 XG-102 1 IV [Q4Dx4]x2
생존한 쥐들은 D185에 희생되었다. 쥐들은 행동 및 생존에 대한 연구 전반적으로 매일 감시되었다. 체중은 연구 전반적으로 모든 쥐에 대해 일주일에 두번 감시되었다. Isoflurane® Forene (Centravet, Bondoufle, France)은 세포 주사, IV 처리 및 희생 전에 동물을 마취시키기 위해 사용되었다. 실험의 과정 도중에, 동물들은 만약 하기의 어느 것이 발생되면 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 Isoflurane®으로 마취 하에 죽였다:
* 고통의 징후(악액질(cachexia), 약화(weakening), 움직이거나 먹기 힘듬),
* 화합물 독성 (곡만(hunching), 경련(convulsions)),
* 3일 연속 20% 체중 손실 또는 어느 날이든 25% 체중 손실.
각 경우에 부검이 수행되었다. 쥐가 빈사로 보이는 경우, 그들은 희생되었고 부검되었다. 간은 채집 및 계량되었다.
체중 분석을 위해 쥐의 체중 곡선을 그렸다. 평균 체중 변화(MBWC): 처리된 동물의 그램 단위에 평균 체중 변화(X일에 체중 마이너스 10일에 체중)가 계산되었다.
효율성 파라미터는 백분율로 표현되었다 (T/C%). T는 약물로 처리된 동물의 중간 생존 시간이며 C는 비히클로 처리된 대조군 동물의 중간 생존 시간이다. 생존 시스템은 T/C 백분율이 125를 초과하는 경우 성공의 정도를 가리킨다. T/C%는 하기와 같이 표현된다: T/C%= [T/C] x 100. 쥐의 생존 곡선을 그렸다. 평균 생존 시간은 사망일의 평균과 같이 처리의 각 그룹에 대해 계산되었다. 중간 생존 시간은 사망일의 평균과 같이 처리의 각 그룹에 대해 계산되었다. 로그-랭크(Kaplan-Meier) 테스트는 생존 곡선을 비교하기 위해 사용되었다. 체중 및 MBWC의 통계 분석은 StatView® 소프트웨어(Abacus Concept, Berkeley, USA)를 사용하는 본페로니/던 테스트(Bonferroni/Dunn test) (ANOVA 비교)를 사용하여 수행되었다. p 값 <0.05는 현저한 것으로 고려된다. 모든 그룹은 그들 자신과 함께 비교되었다.
도 69에 동소 이식적으로 주사된 HEP G2 종양을 갖는 쥐의 평균 체중 및 평균 체중 변화 곡선을 나타내었다. 쥐들은 D10 및 D41에 Q4Dx4 처리 스케쥴을 두번 반복한 이후 1mg/kg/inj에 XG-102로 IV 처리되었다. 도 69에 나타난 바와 같이, 체중에 대해 명백한 차이는 발생하지 않았으며, XG-102가 잘 견딤을 가리킨다. 그에 따라, 도 70에 개별적인 통계 데이터를 나타내었다.
도 71은 희생일(D185)가 묘사될 때까지 그룹 당 생존한 쥐의 비율인, 쥐 장기 생존 곡선을 보여준다. 쥐는 D10 및 D41에 Q4Dx4 처리 스케쥴 두번 반복 이후 지시된 투여량에 XG-102로 처리되었다. 이들 데이터는 XG-102로 처리된 쥐에 대한 연장된 생존을 명백하게 보여준다. 그에 따라, 통계 데이터는 하기 표에 나타내었다 (HepG2 종양으로 이종 이식되고 XG-102로 처리된 쥐의 생존 분석):
처리 (D10 &D41, Q4Dx4) 중간 생존 시간 ±SD (일) 중간 생존 시간(일) T/C (%)
비히클 102 ± 8 102 -
XG-102 1mg/kg 111 ± 14 123 120
그룹 Chi df p 현저성(significance)
XG-102 1mg/kg 5.1550 1 0.0232 S
쥐 생존 시간은 T/C (%) 값처럼 중간 생존 시간과 같이 나타났다 (처리된 그룹의 사망일의 중간 및 종양을 갖는 비처리된 대조군 그룹 사이에 비율). 통계 분석은 로그-랭크 테스트로 수행되었고, 비히클 처리된 그룹은 참조로 되었다. 종합하면, 이들 데이터는 XG-102의 투여는 HepG2 종양으로 이종 이식된 쥐의 생존 시간을 연장시킴을 가리킨다.
실시예 31: 동소 이식 HEP G2 인간 간 암종을 갖는 Swiss 누드 마우스에 XG -102 (투여/반응)의 항종양 활성
본 연구의 목적은 동소 이식 Hep G2 인간 간 암종 종양을 갖는 SWISS 누드 쥐의 모델에서 XG-102 (투여/반응)의 항종양 활성을 결정하는 것이다. 32마리의 건강한 암컷 SWISS 누드 쥐는 Charles River (L'Arbresles, France)로부터 수득하였다. 동물 실험은 동물 실험의 유럽 윤리 가이드라인 및 실험 종양 형성에 동물의 복지를 위한 영어 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물들은 온도(23 ± 2°C), 습도 (45 ± 5%), 광주기(12시간 광/12시간 암) 및 공기 교환의 통제된 조건 하에 방에서 유지되었다. 동물들은 SPF 조건 및 실온에서 유지되었고 습도는 계속적으로 감시되었다. 공기 조절 시스템은 재순환 없이 매시간 14번 공기 변화를 위해 프로그래밍 되었다. 각 방으로 고르게 확산되기 전에, 일련의 필터를 통해 신선한 외부 공기를 통과시켰다. 고압 (20 ± 4 Pa)은 마우스 군집 내에 오염 또는 병원균에 확산을 방지하기 위해 실험실에 유지되었다. SPF 조건 하에 일하는 모든 사람은 그들이 축산(animal husbandry) 지역에 들어올 때 위생 및 의복에 관한 특정한 가이드라인을 따랐다. 동물들은 음식 및 물을 공급하기 위해 장착된 폴리카보네이트 케이지(UAR, Epinay sur Orge, France) 에 수용되었다. 사용된 표준 구역(area) 케이지는 내부 표준 수술(operating) 절차에 따라 케이지 당 최대 10마리 쥐와 함께 800 cm2이다. 동물을 위한 침구는 멸균 나무 부스러기(SERLAB, Cergy-Pontoise, France)이며, 일주일에 한번 교체되었다. 동물 음식은 SERLAB (Cergy-Pontoise, France)로부터 구매하였다. 멸균 조절된 과립의 형태는 DIETEX이다. 음식은 임의로 제공되었고, 케이지 상부에 금속 뚜껑에 위치하였다. 물은 또한 고무 스토퍼 및 스트로 튜브와 함께 장착된 물병으로부터 임의로 제공되었다. 물병은 세척되고, 물로 채워지고, 필터를 통해 멸균 되고 일주일에 두번 교체되었다.
XG-102 투여를 위해 XG-102는 멸균수 (WFI, Aguettant, France)로 1 mg/ml의 농도에 제조되었다. 이후 멸균수로 0.2 및 0.02 mg/ml의 농도로 희석되었다. 모든 이들 단계는 쥐에 주사 전 1시간 이내에 수행되었다. XG-102는 0.1, 1 및 5 mg/kg/inj로 주사되었다. 네번의 주사가 수행되었으며, 각각은 4일로 분리되었다 (Q4Dx4). XG-102 물질은 쥐의 미정맥을 통해 5 ml/kg에 정맥(IV) 주사되었다. 주사 부피는 쥐의 가장 최근 개별적 체중에 따라 조정되었다.
종양 세포 라인 및 배양 배지는 구입하였고 Oncodesign에 의해 제공된다:
세포 라인 타입 종 원천 참조
Hep G2 인간 간 암종 human ATCC* 4
* 아메리칸 타입 배양 컬렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA.
Hep G2 세포 라인은 1975에 간세포 암종과 함께 15살 아르헨티나 소년(Argentine boy)의 종양 조직으로부터 설립되었다(ADEN D.P. et al., Nature, 282: 615-616, 1979). 종양 세포는 습기가 있는 공간에 (5% CO2, 95% 공기) 37°C에서 부착 단층과 같이 성장하였다. 배양 배지는 2 mM L-글루타민(Ref BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 포함하며 10% FBS(Ref DE14-801E, Lonza)로 보충된 RPMI 1640이다. 실험적 용도를 위해, 세포들은 트립신-벌센(versene) (Ref 02-007E, Cambrex)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리되고, 칼슘 또는 마그네슘 없이 행크스 배지에 희석되고(Ref BE10-543F, Cambrex), 완성 배양 배지의 첨가에 의해 중성화되었다. 세포는 혈구계(hemocytometer)에서 카운트되었고 그들의 생존력은 0.25% 트립판 블루 배제(exclusion)를 통해 측정되었다. 마이코플라즈마 검출은 제조자의 지시에 따라 MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Ref LT07- 318, Lonza)를 사용하여 수행되었다. MycoAlert® 분석은 마이크플라스마 효소의 활성을 이용하는(exploits) 선택적인 생화학적 실험이다. 실행 가능한 마이코플라스마는 용균되고 효소는 ADP를 ATP로 변환을 촉매하는 MycoAlert® 기질과 반응한다. MycoAlert® 기질의 첨가 전 후에 샘플 내 ATP 수준을 측정함으로써 비율은 수득될 수 있으며, 이는 마이코플라즈마의 존재 또는 부재의 표지이다. 마이코플라즈마
실험은 세포 라인의 세포 상청액으로부터 중복하여(in duplicate) 분석되었고 음성 및 양성 대조군(MycoAlert® Assay Control Set Ref LT07-518, Lonza)과 비교되었다 (Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002).
실험 설계:
종양 유도 24시간 전에, 32 마리 암컷 SWISS 누드 쥐는 γ-소스(source)로 방사능 처리되었다 (2.5 Gy, Co60, INRA, Dijon, France). D0에, Hep G2 종양은 32 마리 암컷 SWISS 누드에 동소 이식적으로 유도되었다. 마취 하에, 동물 복부는 무균 상태 하에 정중 절개(median incision)를 통해 절개되었다. RPMI 1640 배양 배지의 50 μl에 현탁된 1000만 (107) Hep G2 종양 세포는 간의 피막 하(subcapsular) 부위에 주사되었다. 복강(abdominal cavity)은 그 뒤에 5-0 봉합(sutures)과 함께 2 층에 닫았다.
10일에, 쥐는 8마리 쥐의 4개 그룹을 만들기 위해 그들의 체중에 따라 처리 시작 전에 무작위화 되었다. 각 그룹의 체중은 다른 것으로부터 통계적으로 차이가 없었다 (변량의 분석).
그룹 1로부터 마우스는 4일마다 한번 4회 반복(Q4Dx4) 5 ml/kg/inj.로 비히클의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 2로부터 마우스는 4일마다 한번 4회 반복(Q4Dx4) 0.1 mg/kg/inj.로 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 3으로부터 마우스는 4일마다 한번 4회 반복(Q4Dx4) 1 mg/kg/inj.로 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 4으로부터 마우스는 4일마다 한번 4회 반복(Q4Dx4) 5 mg/kg/inj.로 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였다:
그룹 No. 동물 처리 투여량 (mg/kg/inj.) 경로 처리 스케줄
1 8 vehicle - IV Q4Dx4
2 8 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 8 XG-102 1 IV Q4Dx4
4 8 XG-102 5 IV Q4Dx4
생존한 쥐는 D171에 희생되었다.
쥐들은 행동 및 생존에 대한 연구 전반적으로 매일 감시되었다. 체중은 연구 전반적으로 모든 쥐에 대해 일주일에 두번 감시되었다. Isoflurane® Forene (Centravet, Bondoufle, France)은 세포 주사, IV 처리 및 희생 전에 동물을 마취시키기 위해 사용되었다. 실험의 과정 도중에, 동물들은 만약 하기의 어느 것이 발생되면 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 Isoflurane®으로 마취 하에 죽였다:
* 고통의 징후(악액질(cachexia), 약화(weakening), 움직이거나 먹기 힘듬),
* 화합물 독성 (곡만(hunching), 경련(convulsions)),
* 3일 연속 20% 체중 손실 또는 어느 날이든 25% 체중 손실.
각 경우에 부검이 수행되었다.
D67에, 무작위화 동안 그룹 당 무작위로 선택된 3마리 쥐는 육안 발달의 관찰을 위해 희생되었다. 각 그룹에 남은 쥐는 생존 감시를 위해 보관되었다. 최종 희생은 D171에 수행되었다. 일차 종양 및 간은 채집되고 희생된 동물로부터 계량되었다. 각 간은 10% 중성 버퍼 포르말린에 고정되었다. 수집 48시간 이후, 그들은 파라핀(Histosec®)에 내장되고 아나패쏠로지컬(anapathological) 분석을 위해 사용되었다. 조직학 분석을 통해 쥐 간에 전이성 침입의 측정을 위해, 파라핀-내장된 구획(5μm)은 자일렌에 탈파라핀화 되고 100%, 95% 및 70% 에탄올에 연속 배양을 통해 재수화되었다(rehydrated). 모든 구획은 조직학 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (HE) (Ref. S3309, Dakocytomation, Trappes, France) 으로 염색되었다. 커버슬립은 수성 마운턴트(mountant) (Aquatex, Ref 1.08562, Merck)로 고정되었고 구획은 광학 현미경(DMRB
Leica)하에 관찰되었다. 조직학적 구획은 간에 전이성 침입을 결정하기 위해 병리학자에 의해 분석되었다.
체중 분석을 위해 쥐의 체중 곡선을 그렸다. 평균 체중 변화(MBWC): 처리된 동물의 그람 단위 평균 체중 변화 (X일에 체중 마이너스 D10에 체중)가 계산되었다.
효율성 파라미터는 백분율로 표현되었다 (T/C%). T는 약물로 처리된 동물의 중간 생존 시간이며 C는 비히클로 처리된 대조군 동물의 중간 생존 시간이다. 생존 시스템은 T/C 백분율이 125를 초과하는 경우 성공의 정도를 가리킨다. T/C%는 하기와 같이 표현된다: T/C%= [T/C] x 100. 쥐의 생존 곡선을 그렸다. 평균 생존 시간은 사망일의 평균과 같이 처리의 각 그룹에 대해 계산되었다. 중간 생존 시간은 사망일의 평균과 같이 처리의 각 그룹에 대해 계산되었다. 로그-랭크(Kaplan-Meier) 테스트는 생존 곡선을 비교하기 위해 사용되었다. 체중 및 MBWC의 통계 분석은 StatView® 소프트웨어(Abacus Concept, Berkeley, USA)를 사용하는 본페로니/던 테스트(Bonferroni/Dunn test) (ANOVA 비교)를 사용하여 수행되었다. p 값 <0.05는 현저한 것으로 고려된다. 모든 그룹은 그들 자신과 함께 비교되었다.
도 72는 동소 이식적으로 주사된 HEP G2 종양을 갖는 쥐의 평균 체중 및 평균 체중 변화에 관하여 통계 데이터를 보여준다. 쥐들은 D10 및 D41에 두번 반복된 Q4Dx4 처리 스케줄 이후 XG-102로 IV 처리되었다. 도 72에 나타난 바와 같이, 체중에 대하여 현저한 차이가 발생하지 않았으며, 이는 XG-102가 잘 견딤을 가리킨다.
도 73은 희생일(D171)까지 그룹 당 생존한 쥐의 비율이 묘사된, 쥐 장기 생존 곡선을 보여준다. 부검을 위해 D67에 희생된 쥐들은 계산으로부터 제외되었다. 쥐는 D10 및 D41에 두번 반복된 Q4Dx4 처리 스케줄 이후 지시된 투여량에 XG-102로 처리되었다. 이들 데이터는 투여량 의존적 방식으로 XG-102로 처리된 쥐에 대하여 연장된 생존을 명백하게 보여준다. 따라서, 통계 데이터를 아래에 나타내었다 (HepG2 종양으로 이종 이식된 및 XG-102로 처리된 쥐의 생존 분석):
처리 (D10 &D41, Q4Dx4) 중간 생존 시간(일) T/C (%) 통계 분석
비히클 86 - -
XG-102 0.1mg/kg 105 123 NS
XG-102 1mg/kg 138 161 NS
XG-102 5mg/kg 118 137 NS
부검을 위해 D67에 희생된 쥐는 계산으로부터 제외되었다. 쥐 생존 시간은 T/C(%) 값과 같이 중간 생존 시간으로 표현되었다(처리된 그룹 및 종양을 갖는 비처리된 대조군의 사망일의 중간 사이의 비율). T/C% 값 >125%는 항종양 유효성(effectiveness)의 지표이다.
하기 표는 간으로 HepG2 암세포의 종양 발달을 보여준다. 간에 종양 덩어리(masses)의 검출은 D171에 희생된 쥐에 HE 염색 이후 현미경 관찰을 통해 수행되었다:
그룹 동물ID 관찰
비히클 933 간에 종양
XG-102 0.1mg/kg 8665
2925		 간에 종양 (1.3cm)
종양 비검출
XG-102 1mg/kg 8631
8641
2929		 종양 비검출
종양 비검출
간에 종양 (1.9cm)
XG-102 5mg/kg 2931
2765
2767		 종양 비검출
종양 비검출
종양 비검출
도 74에서 D67 또는 D67 내지 최종 희생 사이에 희생된 쥐의 현미경 평가에 의해 관찰된 종양 침입은 히스토그램 표현으로 나타내었다. 종양 발생의 수준은 도면 범례에 구체화된 4가지 다른 카테고리로 분류되었다.
실시예 32: 피하 PC-3 인간 전립선 종양을 갖는 Balb /c 누드 쥐에 XG -102의 항종양 활성
본 연구의 목적은 피하 PC-3 인간 전립성 종양을 갖는 Balb/c Nude 쥐의 모델에 XG-102 (투여/반응)의 항종양 활성을 결정하는 것이다.
15 마리 건강한 수컷 Balb/c 누드 쥐는 Charles River (L'Arbresles, France)로부터 수득하였다. 동물 실험은 동물 실험의 유럽 윤리 가이드라인 및 실험 종양 형성에 동물의 복지(welfare)를 위한 영어 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물들은 온도(23± 2°C), 습도(45 ± 5%), 광주기(12시간 광/12시간 암) 및 공기 교환의 통제된 조건 하에 방에서 유지되었다. 동물들은 SPF 조건에 유지되었고 실온 및 습도는 계속적으로 감시되었다. 공기 조절 시스템은 재순환 없이 시간 당 14회 공기 변화를 위해 프로그램되었다. 각 방으로 고르게 분산되기 전에, 일련의 필터를 통해 신선한 외기가 통과되었다. 높은 압력(20 ± 4 Pa)은 쥐 군집(colony) 내 오염 또는 병원균의 확산을 방지하기 위해 실험실에 유지되었다. SPF 조건 하에 일하는 모든 사람은 그들이 축산(animal husbandry) 지역에 들어올 때 위생 및 의복에 관한 특정한 가이드라인을 따랐다. 동물들은 음식 및 물을 공급하기 위해 장착된 폴리카보네이트 케이지(UAR, Epinay sur Orge, France)에 수용되었다. 사용된 표준 구역(area) 케이지는 내부 표준 수술(operating) 절차에 따라 케이지 당 최대 10마리 쥐와 함께 800 cm2이다. 동물을 위한 침구는 멸균 나무 부스러기(SERLAB, Cergy-Pontoise, France)이며, 일주일에 한번 교체되었다. 동물 음식은 SERLAB (Cergy-Pontoise, France)로부터 구매하였다. 멸균 조절된 과립의 형태는 DIETEX이다. 음식은 임의로 제공되었고, 케이지 상부에 금속 뚜껑에 위치하였다. 물은 또한 고무 스토퍼 및 스트로 튜브와 함께 장착된 물병으로부터 임의로 제공되었다. 물병은 세척되고, 물로 채워지고, 필터를 통해 멸균 되고 일주일에 두번 교체되었다.
XG-102 투여를 위해 XG-102는 멸균수(WFI, Aguettant, France)에 0.2 mg/ml의 농도로 제조되었다. 이후 멸균수로 0.02 mg/ml의 농도로 희석되었다. 모든 이들 단계는 쥐에 주사 전 1시간 이내에 수행되었다. XG-102는 0.1 및 1 mg/kg/inj로 주사되었다. 네번의 주사가 수행되었으며, 각각은 4일로 분리되었다 (Q4Dx4). XG-102 물질은 쥐의 미정맥을 통해 5 ml/kg에 정맥(IV) 주사되었다. 주사 기간 동안 꼬리가 괴사되는 경우, 복강내(IP) 경로가 사용되었다. 주사 부피는 쥐의 가장 최근 개별적 체중에 따라 조정되었다.
종양 세포 라인 및 배양 배지는 구입되었고 Oncodesign에 의해 제공되었다:
세포 라인 원천(Origin) 소스
(Source) 		참조
PC-3 인간 전립선 선종
(Human prostatic adenocarcinoma)		 ATCC* BISSERY M.C. et al., Bull. Cancer 1991, 78: 587-602.
* 아메리칸 타입 배양 컬렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA.
PC-3는 62살 남성 코카시아인(Caucasian)으로부터 등급 IV 전립선 선종의 골 전이로부터 시작되었다(VOLENEC F.J. et al., J Surg Oncol 1980;13(1):39-44). 종양 세포는 습기가 있는 공간에 (5% CO2, 95% 공기) 37°C에서 부착 단층과 같이 성장하였다. 배양 배지는 2 mM L-글루타민(Ref BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 포함하며 10% FBS(Ref DE14-801E, Lonza)로 보충된 RPMI 1640이다. 실험적 용도를 위해, 세포들은 트립신-벌센(versene) (Ref 02-007E, Cambrex)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리되고, 칼슘 또는 마그네슘 없이 행크스 배지에 희석되고(Ref BE10-543F, Cambrex), 완성 배양 배지의 첨가에 의해 중성화되었다. 세포는 혈구계(hemocytometer)에서 카운트되었고 그들의 생존력은 0.25% 트립판 블루 배제(exclusion)를 통해 측정되었다. 마이코플라즈마 검출은 제조자의 지시에 따라 MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Ref LT07- 318, Lonza)를 사용하여 수행되었다. MycoAlert® 분석은 마이크플라스마 효소의 활성을 이용하는(exploits) 선택적인 생화학적 실험이다. 실행 가능한 마이코플라스마는 용균되고 효소는 ADP를 ATP로 변환을 촉매하는 MycoAlert® 기질과 반응한다. MycoAlert® 기질의 첨가 전 후에 샘플 내 ATP 수준을 측정함으로써 비율은 수득될 수 있으며, 이는 마이코플라즈마의 존재 또는 부재의 표지이다. 마이코플라즈마
실험은 세포 라인의 세포 상청액으로부터 중복하여(in duplicate) 분석되었고 음성 및 양성 대조군(MycoAlert® Assay Control Set Ref LT07-518, Lonza)과 비교되었다 (Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002).
실험 설계:
종양 유도 48시간 전에, 15 마리 수컷 Balb/c 누드 쥐는 γ-소스(source)로 방사능 처리되었다 (2.5 Gy, Co60, INRA, Dijon, France). D0에, 200 μl의 RPMI 배지에 현탁된 2천만 (2x107) PC-3 세포는 60마리 수컷 Balb/c 누드 쥐의 오른쪽 측면에 피하 주사되었다.
평균 종양 부피가 80±38 mm3에 달할 때, 쥐는 5마리 쥐의 3개 그룹을 만들기 위해 그들의 종양 부피에 따라 처리 시작 전 무작위화 되었다. 각 그룹의 종양 부피는 다른 것으로부터 통계적으로 차이가 있지 않았다 (변량의 분석).
시험 물질의 처리 스케쥴은 아래와 같다: 그룹 1로부터 쥐는 4일에 한번 4회 반복하여 (Q4Dx4) 5 ml/kg/inj.에 비히클의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 2로부터 쥐는 4일에 한번 4회 반복하여 (Q4Dx4) 0.1 mg/kg/inj.에 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였고, 그룹 3으로부터 쥐는 4일에 한번 4회 반복하여 (Q4Dx4) 1 mg/kg/inj.에 XG-102의 하나의 IV 주사를 수용하였다:
그룹 동물 No. 처리 투여량
(mg/kg/ inj .) 		경로 처리 스케줄
1 5 비히클 - IV Q4Dx4
2 5 XG-102 0.1 IV Q4Dx4
3 5 XG-102 1 IV Q4Dx4
쥐들은 종양이 2000 mm3의 최대 부피에 도달할 때 희생되었다.
쥐들은 행동 및 생존에 대한 연구 전반적으로 매일 감시되었다. 체중 및 종양 부피는 연구 전반적으로 모든 쥐에 대해 일주일에 두번 감시되었다. Isoflurane® Forene (Centravet, Bondoufle, France)은 세포 주사, IV 처리 및 희생 전에 동물을 마취시키기 위해 사용되었다. 실험의 과정 도중에, 동물들은 만약 하기의 어느 것이 발생되면 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 Isoflurane®으로 마취 하에 죽였다:
* 고통의 징후(악액질(cachexia), 약화(weakening), 움직이거나 먹기 힘듬),
* 화합물 독성 (곡만(hunching), 경련(convulsions)),
* 3일 연속 20% 체중 손실 또는 어느 날이든 25% 체중 손실,
* 종양 부피가 2000 mm3 초과.
각 경우에 부검이 수행되었다.
체중 분석을 위해 쥐의 체중 곡선을 그렸다. 곡선은 죽은 쥐의 40% 이상이 적어도 하나의 그룹에 기록될 때 중단되었다. 평균 체중 변화(MBWC): 처리된 동물의 그람 단위 평균 체중 변화 (X일에 체중 마이너스 D33에 체중)가 계산되었다.
종양 부피는 가장 큰 종양의 직경에 상응하는 길이 및 가장 작은 종양의 직경에 폭: TV= (길이 x 폭2)/2인 하기 식으로 계산되었다. 종양 성장 곡선은 평균 종양 부피 (MTV) +/- SD를 사용하여 그렸다. 곡선은 40%의 쥐가 죽을 때 중단되었다. 개별적인 종양 부피 곡선 또한 그렸다. 하기 보여진 것처럼 다른 시점에 계산된 상대 종양 부피 (RTV)를 사용하는 상대 종양 부피 곡선을 그렸다. 곡선은 쥐의 40% 이상이 죽을 때 중단되었다. RTV는 하기 식에 따라 계산되었다:
RTV = (DX에 종양 부피)/(D33에 종양 부피) X 100
종양 배가 시간(Tumor doubling time, DT)는 지수 종양 성장 단계가 Vivo Manager® 소프트웨어를 사용하여 계산되는 동안 200%의 MTV에 도달하는데 필요한 기간으로 정의된다. V에 도달하는 시간은 계산되었다. 부피 V는 실험 데이터로부터 추측되고 종양 성장의 지수 단계에서 선택된 목표 부피로 정의된다. 부피 V는 각 그룹의 모든 쥐에 대해 가능한한 가깝게 선택되고, 이러한 부피 V에 도달하는 시간은 실험 데이터로부터 추정된다. 처리된 그룹의 중간 종양 부피 대(versus) 비히클 처리된 그룹의 비율로 정의된 종양 성장 억제 (T/C%)가 계산되었다. NCI 표준에 따라 T/C% 비율에 대한 효과적인 기준은 ~ 42%이다 (BISSERY M.C. et al., Bull. Cancer 1991, 78: 587-602). 모든 통계 분석은 Vivo Manager® 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 처리의 독성 및 효율성의 통계 분석(BWC, MBWC, TV, RTV, TTRV 및 DT)은 본페로니 던 테스트(ANOVA 비교)를 사용하여 수행되었다. 모든 그룹은 서로 비교되었다.
도 75에서 항종양 활성 실험 동안 PC-3 종양을 갖는 쥐의 평균 종양 부피를 보여준다. D33에, 5마리 동물의 3개 그룹은 비히클 및 XG-102(0.1 및 1mg/kg/inj, Q4Dx4)로 처리되었다. 이들 데이터는 상기 효과가 1 mg/kg XG-102에 대하여 보다 유망하여, 투여량 의존적 방식에서 XG-102 처리에 대하여 시간에 따른 종양 부피의 감소를 가리킨다.
실시예 33: 동소 이식 HCT 116 인간 결장 종양을 갖는 SCID 쥐에 종양 성장에 XG -102의 효과
본 연구의 목적은 SCID 쥐에 동소 이식적으로 이종 이식된(xenografted) HCT 116 인간 결장 종양의 성장에 XG-102의 효과를 결정하는 것이다.
80 마리 건강한 수컷 SCID 쥐는 Charles River (L'Arbresles, France)로부터 수득하였다. 동물 실험은 동물 실험의 유럽 윤리 가이드라인 및 실험 종양 형성에 동물의 복지(welfare)를 위한 영어 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물들은 온도(23± 2°C), 습도(45 ± 5%), 광주기(12시간 광/12시간 암) 및 공기 교환의 통제된 조건 하에 방에서 유지되었다. 동물들은 SPF 조건에 유지되었고 실온 및 습도는 계속적으로 감시되었다. 공기 조절 시스템은 재순환 없이 시간 당 14회 공기 변화를 위해 프로그램되었다. 각 방으로 고르게 분산되기 전에, 일련의 필터를 통해 신선한 외기가 통과되었다. 높은 압력(20 ± 4 Pa)은 쥐 군집(colony) 내 오염 또는 병원균의 확산을 방지하기 위해 실험실에 유지되었다. SPF 조건 하에 일하는 모든 사람은 그들이 축산(animal husbandry) 지역에 들어올 때 위생 및 의복에 관한 특정한 가이드라인을 따랐다. 동물들은 음식 및 물을 공급하기 위해 장착된 폴리카보네이트 케이지(UAR, Epinay sur Orge, France)에 수용되었다. 사용된 표준 구역(area) 케이지는 내부 표준 수술(operating) 절차에 따라 케이지 당 최대 10마리 쥐와 함께 800 cm2이다. 동물을 위한 침구는 멸균 옥수수 속대(corn cob) 침구(LAB COB 12, SERLAB, CergyMPontoise, France)이며, 일주일에 한번 교체되었다. 동물 음식은 DIETEX 로부터 구매하였다. 멸균 조절된 과립의 형태는 DIETEX이다. 음식은 임의로 제공되었고, 케이지 상부에 금속 뚜껑에 위치하였다. 물은 또한 고무 스토퍼 및 스트로 튜브와 함께 장착된 물병으로부터 임의로 제공되었다. 물병은 세척되고, 물로 채워지고, 필터를 통해 멸균 되고 일주일에 두번 교체되었다.
XG-102 투여에 대해 XG-102의 필요한 양은 비히클에 용해되었다. 조성물은 하기 설명된 절차에 따라 제조되었다. 농도는 계산되고 실험 물품 순도 및 펩타이드 함량을 고려하여 표현되었다(승수 계수(multiplier coefficient)는 74.6%). XG-102의 해동 이후, 저장 용액은 멸균 수(WFI, Batch 500 111 00 J, Aguettant, France)에 10 mM에서 제조되었고(38.22 mg/ml에 상응) 최소 20분 동안 실온에서 평형되었다. 부분 표본은 각 처리일에 제조되었고 약 -80°C에서 저장되었다. 요구되는 농도로 이러한 저장 용액의 희석은 각 처리일에 수행되었고 최대 24시간 동안 2-4°C에서 저장되었다. 저장 용액의 안정성의 기간은 약 -80°C에서 100일 이상이다. 동물 투여를 위해 희석된 제형의 안전성의 기간은 2-4°C에서 24시간이다. 희석된 용액은 사용시까지 얼음에 유지되었다. 사용되지 않은 물질은 폐기되었다. XG-102는 총 14일 연이은 투여(Q1Dx14)를 위해 0.1 및 1 mg/kg/inj.에서 매일 한번씩 주사되었다. 물질 투여의 경로는 하기와 같다: 5 ml/kg/inj.에 피하 주사됨, 5 ml/kg/adm에 캐눌라(canula)를 통해 경구 섭식(oral gavage)을 통해 쥐에 경구(per os, PO) 투여됨. 주사 및 투여 부피는 쥐의 매일 개별 체중에 따라 조정되었다.
종양 세포 라인 및 배양 배지는 구매하였고 Oncodesign에 의해 제공된다:
세포 라인 원천 소스 참조
HTC116 인간 결장 선암(Human colon adenocarcinoma) ATCC* BRATTAIN M.G. et al., Cancer Res. 1981, 41: l751M1756.
* 아메리칸 타입 배양 컬렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA.
HCT 116 변이체 세포 라인은 남성 환자의 단일 결장 암종의 일차 세포 배양물로부터 동정되었다(BRATTAIN M.G. et al., Cancer Res. 1981, 41: l751M1756). 종양 세포는 습기가 있는 공간에 (5% CO2, 95% 공기) 37°C에서 부착 단층과 같이 성장하였다. 배양 배지는 2 mM L-글루타민(Ref BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 포함하며 10% FBS(Ref DE14-801E, Lonza)로 보충된 RPMI 1640이다. 실험적 용도를 위해, 세포들은 트립신-벌센(versene) (Ref 02-007E, Cambrex)으로 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리되고, 칼슘 또는 마그네슘 없이 행크스 배지에 희석되고(Ref BE10-543F, Cambrex), 완성 배양 배지의 첨가에 의해 중성화되었다. 세포는 혈구계(hemocytometer)에서 카운트되었고 그들의 생존력은 0.25% 트립판 블루 배제(exclusion)를 통해 측정되었다. 마이코플라즈마 검출은 제조자의 지시에 따라 MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Ref LT07- 318, Lonza)를 사용하여 수행되었다. MycoAlert® 분석은 마이크플라스마 효소의 활성을 이용하는(exploits) 선택적인 생화학적 실험이다. 실행 가능한 마이코플라스마는 용균되고 효소는 ADP를 ATP로 변환을 촉매하는 MycoAlert® 기질과 반응한다. MycoAlert® 기질의 첨가 전 후에 샘플 내 ATP 수준을 측정함으로써 비율은 수득될 수 있으며, 이는 마이코플라즈마의 존재 또는 부재의 표지이다. 마이코플라즈마
실험은 세포 라인의 세포 상청액으로부터 중복하여(in duplicate) 분석되었고 음성 및 양성 대조군(MycoAlert® Assay Control Set Ref LT07-518, Lonza)과 비교되었다 (Internal Standard Operating Procedure No TEC-007/002).
실험 설계:
종양 유도 24 내지 48시간 전에, 5 마리 SCID 쥐는 γ-소스(source)로 방사능 처리되었다 (1.8 Gy, Co60, INRA, Dijon, France). 200 μl의 RPMI 배지에 현탁된 천만 (107) HCT 세포는 5마리 암컷 SCJD 쥐의 오른쪽 측면에 피하 주사되었다. 종양이 1000-2000 mm3이 달할 때, 쥐는 희생되었다. 종양은 D0에 75마리 쥐의 맹장에 동소 이식적으로 이식되는 새로운 종양 절편(20~30 mg)을 얻기 위해 동물로부터 수술적으로 절제되었다.
종양 이식 24 내지 48 시간 전에, 75마리 SCID 쥐는 γ-소스(1.8 Gy, Co60, INRA, Dijon, France)로 방사선 처리되었다. 수술은 7th XG-102 처리 이후 2시간의 최소 지연(delay)와 함께, 오후에 수행되었다. 마취된 동물로부터 복부는 무균 조건 하에 정중 절개(median incision)를 통해 개방되었다. 맹장은 몸 밖으로 내어졌고 작은 병변은 맹장 벽에 수행되었다. 종양
절편은 병변에 놓았고 6/0 봉합(sutures)으로 고정되었다. 복강은 그후 4/0 봉합으로 2층으로 닫아졌다.
D-7에 쥐들은 15마리 쥐의 5개 그룹을 형성하기 위해 처리 시작 전에 그들의 체중에 따라 무작위화되었다. 각 그룹의 체중은 다른 것으로부터 통계적으로 다르지 않았다 (변량의 분석). 처리는 D-7에 하기 처리 스케줄에 따라 시작되었다:
* 그룹 1로부터 쥐는 총 14일 연속 투여를 위해 하루에 한번(Q 1Dx14) 5 ml/kg/inj.에 XG-102 비히클의 하나의 PO 투여를 수용하였다,
* 그룹 2로부터 쥐는 총 14일 연속 투여를 위해 하루에 한번(Q1Dx14) 0.1 mg//kg/inj.에 XG-102의 하나의 PO 투여를 수용하였다,
* 그룹 3으로부터 쥐는 총 14일 연속 투여를 위해 하루에 한번(Q1Dx14) 1 mg//kg/inj. 에 XG-102의 하나의 PO 투여를 수용하였다,
* 그룹 4로부터 쥐는 총 14일 연속 투여를 위해 하루에 한번(Q1Dx14) 0.1 mg//kg/inj. 에 XG-102의 하나의 SC 투여를 수용하였다,
* 그룹 5로부터 쥐는 총 14일 연속 투여를 위해 하루에 한번(Q1Dx14) 1 mg//kg/inj. 에 XG-102의 하나의 SC 투여를 수용하였다:
그룹 동물 No. 처리 경로 투여량(mg/kg/ inj .) 처리 스케줄
1 15 vehicle po - Q1Dx14
2 15 XG-102 po 0.1 Q1Dx14
3 15 XG-102 po 1 Q1Dx14
4 15 XG-102 sc 0.1 Q1Dx14
5 15 XG-102 sc 1 Q1Dx14
쥐들은 행동 및 생존에 대한 연구 전반적으로 매일 감시되었다. 체중 및 종양 부피는 연구 전반에 걸쳐 모든 쥐에 대하여 일주일에 두번 감시되었다. Isoflurane® Forene (Centravet, Bondoufle, France)는 세포 주사, 수술(동소 이식 종양 이식) 및 희생 전에 동물을 마취하기 위해 사용되었다. SC 종양 증식 동안, 종양 부피는 연구 전반적으로 모든 쥐에 대해 일주일에 두번 감시되었다.
쥐들은 D26에 희생되었다. 간 및 종양은 모든 동물에 대해 수집 및 계량되었다. 종양 절(nodules)에 의한 간의 침입은 육안으로 평가되었다. 간 및 종양은 10% 중성 버퍼 포르말린에 고정되었다. 채집 48시간 이후, 그들은 파라핀(Histosec®)에 내장되었고 조직학적 분석을 위해 사용되었다. 두 슬라이드는 각 종양의 중심에 두 다른 부분으로부터 공급(issued)되었다. 각 슬라이드는 쥐 식별 번호에 의해 식별되었다. 하나의 슬라이드는 간 마다 공급되었고, 이의 중앙에 위치하였다. 이는 쥐 식별 번호에 의해 식별되었다. Ki67 마커에 의한 증식 색인(index)의 결정을 위해, 파라핀 내장된 구획(5 μm)은 자일렌에 탈파라핀화 되고(Ref. 11699027, Labonord,
Templemars, France) 100%, 95%, 및 70% 에탄올에 연속 배양을 통해 재수화 되었다(Ref. 13099500, Labonord). 내생 퍼옥시다제(Endogenous peroxidase)는 첫 항체의 첨가 전에 실온에서 10분 동안 과산화수소 포함 용액에 조직을 배양함으로써 억제되었다. 비오틴 차단 시스템은 백그라운드를 감소시키기 위해 사용되었다. 구획은 첫번째 항체의 첨가 전에 교차 반응성을 억제하기 위해 실온에서 3% 염소 혈청으로 완성된 PBS (1X) 내 3% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 20분 동안 처리되었다. 조직 구획은 쥐 항-인간 Ki-67 클론 MIB-1 단일클론 항체로 실온에서 1시간 동안 배양되었다 (Ref M7240, Dako cytomation; 1: 100 희석, 80 μg/ml). 비-관련된 바이오티닐화된 쥐 lgGl 항체(Ref X0931, Dako cytomation, 1: 120 희석, 100 μg/ml)는 반응의 특수성을 보장하는 음성 대조군 슬라이드로 사용되었다. 구획은 비오틴에 결합된 이차 염소 항-마우스 항체(Ref. 89904, Sigma)로 추가로 배양되었다. 이후, 조직 구획은 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 컨쥬게이트와 함께 실온에서 30분 동안 배양되었다 (Ref PK-6100, Vector Laboratories,
1 :50 희석). DAB 퍼옥시다제 기질(Ref SK-4100, Vector Laboratories)은 반응을 시각화하기 위한 색원체(chromogen)로 사용되었다. 구획은 조직학 연구를 위해 메이어 헤마톡실린(Mayer's haematoxylin)으로 대비 염색되었다. 각 배양 이후, 구획들은 1X PBS로 두번 세척되었다. 커버슬립은 수성 마운탄트로 고정되었고 구획은 광학 현미경(DMRB Leica) 하에 시각화되었다.
조직학적 분석을 통한 쥐 간에 전이의 검출을 위해, 파라핀 고정된 구획(5μm)은 자일렌에 탈파라핀화 되었고 100%, 95% 및 70% 에탄올에 연속 배양을 통해 재수화되었다. 모든 구획은 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (HE) (Ref. 83309, Dakocytomation, Trappes, France)로 염색되었다. 커버 슬립은 수성 마운탄트(Aquatex, Ref 1.08562, Merck)로 고정되고 구획들은 광학 현미경(DMRB Leica) 하에 관찰되었다. 조직학적 구획은 간에 전이성 침입을 결정하기 위해 경험이 있는 병리학자에 의해 분석되었다.
체중 분석을 위해 쥐의 체중 곡선을 그렸다. 곡선은 죽은 쥐의 40% 이상이 적어도 하나의 그룹에 기록될 때 중단되었다. 평균 체중 변화(MBWC): 처리된 동물의 그람 단위 평균 체중 변화 (X일에 체중 마이너스 D-7에 체중)가 계산되었다.
종양 무게가 계산되었다. 종양 성장 억제 (T/C%)는 처리군 대 비히클 처리군의 중간 종양 중량의 비율로 정의된다. NCI 표준에 따른 T/C%에 대한 효과적인 기준은 ≤ 42%이다. 증식 색인 (Ki-67 염색)의 반정량을 위해, 염색된 종양 구획의 많은 이미지가 블라인드 분석되었고 비 염색(비 염색된 부위에 상응하는 레벨 0), 낮은 염색(염색된 부위의 10% 미만에 상응하는 레벨 1), 보통 염색(염색된 부위의 10 내지 30%에 상응하는 레벨 2) 및 강한 염색(염색된 부위의 30% 이상에 상응하는 레벨 3)으로 분류되었다. 대표 사진을 찍었다. 간에 전이의 검출을 위해 평균 간 중량이 측정되었고, 간마다 전이의 수는 전체 간에 육안으로 및 조직학적 분석을 통해 구획에 평가되었다. 결과는 표에 보고되었다. 대표 사진을 찍었다. 모든 통계 분석은 Vivo manager® 소프트웨어를 사용하여 수행되었고, 독성의 통계 분석 및 처리의 효율(MBWC, TV, 부피 V 및 V, DT 도달 시간)은 본페로니/던 테스트(ANOVA 비교)를 사용하여 수행되었다. 모든 그룹은 서로 비교되었다.
천만(107) HCT 116 세포는 5번 방사선 처리된 암컷 SCID 쥐에 SC 주사되었다. 마이코플라즈마는 세포에서 관찰되지 않았고 그들의 생존력은 주사 전 99% 였다. 39일 후, 평균 종양 부피가 864±426 mm3일 때, 쥐는 희생되었다. 그들의 종양은 분리되었고 약 20~30 mg의 조각으로 절단되었다. 그들의 조각은 75마리 처리된 동물의 막창자(ceacum)로 D0에 이식되었다. D0 내지 09에, 종양 이식에 의한 수술 합병증은 비히클 처리된 그룹에 쥐의 33%의 죽음을 유도하였다. 처리된 그룹에, 죽음의 백분율은 효과과 관련된 투여가 없이, 40%, 34%, 47% 및 40% 였다. XG-102로 처리는 비히클 처리된 그룹에 비해 현저하게 치명적으로 변화시키지 않은 사실은 처리가 동물에 의해 잘 견딤을 제안한다. 게다가, 처리 시작일(D-7) 및 수술 이틀 전(D-2) 사이, 육일 연속 처리는 어느 현저한 체중 손실을 유도하지 않았으며, XG-102가 잘 견딤을 가리킨다. D-2에, MBWC는 비히클 처리된 그룹에 +5.2±4.6% 내지 0.1 mg/kg/adm에 PO 처리된 그룹에 +7.1±4.6% 사이로 분산되었다. 추가로, 수술 후, MBWC 차이는, 수술 전 및 후의 MBWC를 비교할 때, 수술에 의해 유발된 현저한 감소가 모든 그룹에 관찰되더라도, 다른 투여량에서 비히클 처리된 그룹 및 XG-102 처리된 것들 사이에 관찰되지 않았다.
D26에 희생된 쥐에 평균 간 중량은 비히클 처리된 그룹에 0.82±0.17g 및 0.1 mg/kg에 PO 처리된 그룹에 0.91±0. 17g 사이로 분산되었다. 그들은 현저하게 차이나지 않았다. 비히클 처리된 그룹에서 20%는 간에 어떠한 전이도 발달하지 않았다. 도 76에 나타난 바와 같이, 이러한 대조군은 간에 1 이상의 전이를 발달하는 쥐의 수가 가장 높은(40%) 것의 하나이다. 처리군에서, 이러한 점수는 1 mg/kg에 PO 처리된 그룹에 12.5% 내지 0. 1 mg/kg에 PO 처리된 또는 1mg/kg에 SC 처리된 그룹에 25% 사이로 분산된다. 현저하게, 1 mg/kg에 PO 처리된 그룹은 간 전이가 없는 쥐의 가장 높은 수를 가지며, XG-102가 HCT 116 동소 이식 종양의 전이력을 감소시킬 수 있음을 제안한다.
실시예 34: 랫(AMD 모델)에 광수용체 광손상을 감소시키는데 XG -102의 효율성의 평가
본 연구의 목적은 광 유도된 광수용체 세포 사멸에 XG-102의 투여 효과를 조사하는 것이다.
50마리 수컷 랫(Sprague-Dawley (알비노 랫); 약 8 주; 200 - 250 g (주문시))이 사용되었다. 랫은 본 실험 모델에 가장 일반적으로 사용되었다. 동물들은 연구 전에 실험되었고 특히 주의는 눈에 되었다. 동물은 그들의 도착 이후 2주 동안 관찰되었다. 동물들은 매일 병의 징후가 관찰되었다. 안구 비정상이 없는 오직 건강한 동물이 본 실험에 사용을 위해 수용되었다. 동물은 각각 표준 케이지 (420 x 270 x 190 mm)에 수용되었다. 모든 동물은 동일한 환경 조건 하에 수용되었다. 온도는 22 ± 2°C로 고정되고 상대 습도는 55 ± 10% 였다. 방은 지속적으로 환기되었다(시간당 15회). 12시간 광(200-300 lx) 및 12시간 암의 주기가 자동적으로 조절되었다. 이들 파라미터는 계속적으로 조절되고 기록되었다. 연구 전반적으로, 동물들은 음식 및 물에 자유롭게 접근하였다. 그들은 표준 펠렛 식이로 급여되었다. 수돗물은 플라스틱 병으로부터 임의로 활용가능하다.
연구 설계:
48마리 랫은 각 8마리 동물의 6개 그룹으로 무작위로 나누어졌다.
실험 물품(XG-102: 30 mg/ml, 3 mg/ml, 및 0.3 mg/ml) 및 비히클(0.95% NaCl)은 유도의 하루 전에 오른쪽 눈에 유리체내 주사로 투여되었다. 참조 (페닐-N-테스트-부틸니트론(PBN) (50 mg/kg)) 및 비히클은 유도 시작 30분 전, 이후 12시간의 광 노출 동안 3회, 그 다음 유도 이후 한번 복강내 주사되었다. 동물들은 24시간 동안 지속적인 광(7000 lux)에 놓아졌다. 망막 전위도(ERG)는 광 처리 전 및 유도 이후 9, 16 및 23일에 기록되었다. 눈은 이후 조직학 및 외핵층(ONL) 두께 측정을 위해 수집되었다. 하기 표는 처리군에 동물의 할당을 요약한다:
그룹 No. 처리 투여량 투여 경로(부피) 투여 시간 동물 식별
1 XG-102 30 000 μg/mL
150 μg/eye		 i.v.t. (5 μl) Day before induction
(D0)		 13, 38, 9, 35, 2, 23, 25, 36
2 3 000 μg/mL
15 μg/eye		 18, 28, 5, 27, 16, 12, 30, 1
3 300 μg/mL
1.5 μg/eye		 3, 11, 8, 17, 31, 7, 22, 15
4 비히클 - 6, 29, 24, 21, 40, 32, 14, 37
5 PBN 50 mg/kg i.p.
(2.5 ml/kg)
(5 times)		 유도 30분 전, 이흐 2h, 4h, 6h (광 노출-D1 동안) 및 유도 이후 24h(노출의 중단 - D2 에) 4, 39, 19, 33, 10, 26, 34, 20
6 클 - 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48
50마리 중 48마리 동물은 본 연구에 사용되었다. 안구 결함의 눈에 보이는 징후가 없는 동물만 선택되었다. 이후, 처리군에 무작위화는 Excel® 소프트웨어에 무작위화 기능에 의해 수행되었다.
투여의 경로 및 방법
유리체내 주사를 위해 동물들은 실라진/케타민의 혼합물의 근육내 주사를 통해 마취되었다. 실험 물품(5 μl) 및 비히클(5 μl)은 오른쪽 눈에 주사되었다. 주사는 50 μl Hamilton에 고정된 33G-비늘을 사용하여 유리체(pars plana)에 측두 상부(supratemporal) 부분에 수술 현미경 하에 수행되었다. 채워진 주사기는 마이크로리터 범위에 정확한 주사를 수행하기 위해 UltraMicroPump III로 고정되었다. 참조 및 비히클은 1 ml-주사기에 고정된 30G 바늘을 사용하여 2.5 ml/kg의 투여 부피에 복강내 주사되었다.
광 노출: 밤새 암 적응된 랫은 투명한 플라스틱 케이지에 지속적인 백색 형광(7000 lx)에 24시간 동안 노출되었다. 각 케이지는 하나의 랫을 포함한다. 노출 이후 랫은 순환 광 조건으로 사육하기 위해 되돌아왔다.
모든 동물의 체중은 연구 시작 전에 이후 연구의 종결시에 기록되었다. 각 날짜에 모든 동물의 일반적인 행동 및 양상이 관찰되었다.
ERG는 암 적응되고 마취된 동물의 오른쪽 눈에 유도 전 및 7, 14 및 21일 이후 노출의 중단(9, 16 및 23일)시에 기록되었다. 지연 시간 (a- 및 b- 파장에 대해) 및 a- 파장 및 b-파장 진폭은 각 ERG에 대해 측정되었다; 지연 시간은 100분의 1초로 표현되었고 기준값의 백분율로 a-파장 및 b-파장은 광 노출 전에 수득되었다. 측정 15분 전에 10 μl Mydriaticum® (0.5% 트로피카미드)는 동공 확장을 위해 주입되었다.
ERG 파라미터:
* 색깔: 백색 최대.
* 최대 강도: 2.6 cd.s/m2 (0dB); 지속 기간(Duration) 0.24 ms; 플래쉬의 수: 1.
* 필터: 50 Hz.
* 임피던스 역치: 90 kW.
ONL 두께의 측정: ERG 테스트 이후, 동물들은 펜토바비탈의 과투여에 의해 안락사되었고 오른쪽 눈은 제핵, 고정 및 파라핀에 내장되었다. 구획 (5 μm 두께)은 수직 경선(vertical meridian)을 따라 수행되었고 트리크롬 메이슨(Trichrome-Masson)으로 염색되었다. 수직 경선은 시신경을 포함한다. ONL 두께는 표준 현미경(Leica)를 사용하여 열등 망막(inferior retina)에 시신경으로부터 500 내지 3500 μm 사이 매 500 μm (일곱 지점)에 수행되었다.
결과는 개별적인 형태로 표현되었고 마이크로소프트 Excel® 소프트웨어를 사용하여 데이터 표에 요약되었다. 그룹 평균 값 및 표준 편차는 계산되었다. 통계적 만 휘트니 테스트는 그룹 쌍(pair-wise) 사이 차이를 평가하는데 사용되었다. 각 비히클 그룹에 시점 사이 비교를 위해, 프리드먼(Friedman) 테스트가 사용되었다.
결과
일반적인 행동 및 외양은 모든 동물에서 일반적이었다.
동물 체중 모두는 기준에 일반 범위 내였다: 379 ± 13 g (평균 ± SD;
n = 48). 희생일(23일)에 실험물 및 비히클 사이에 가시적인 차이가 관찰되지 않았다. 연구 시작 직전(기준) 및 안락사 일에 각 그룹에 대해 기록된 평균 체중은 약 31 ± 5%를 얻은 체중과 함께 일반 범위 내였다(평균± SD; n = 48).
망막 전위도
광수용체에 보호 효과를 조사하기 위해, 실험, 비히클 및 참조 물품은 광 유도된 광퇴행(photodegeneration) 모델에 평가되었다. 망막의 기능적 등급은 망막 전위도에 의해 평가되었다. 망막 전위도 파폭은 기준값에 일반화되었고 기준값의 백분율로 표현되었다. 도 77은 다른 그룹에 대한 회복의 시간 경로를 설명한다.
페닐-N-tert-부틸니트론, 광 유도된 광수용체 사멸로부터 알비노 랫을 보호하는 것으로 보이는 합성 항산화제는 본 분석에 참조로 사용되었다. XG-102의 세가지 투여량이 실험되었다: 1.5 μg/eye (0.3 mg/ml, 낮은 투여량), 15 μg/eye (3 mg/ml, 중간 투여량) 및 150 μg/eye (30 mg/ml, 높은 투여량). 진폭(%; 평균 ± SD)에 대한 a 및 b-파장의 평균 값은 하기 표에 요약되었다:
Figure pct00017
만 휘트니 테스트(Mann and Whitney test)에 의해 §p < 0.05, x vs. 비히클 .
Figure pct00018
만 휘트니 테스트에 의해 §p < 0.05, x vs. 비히클 .
또한 도 77에 나타난 바와 같이, 복강내 또는 유리체내 주사를 통해 비히클로 주사된 포함된 그룹에 평균 a-파폭은 기준점에 대조군 값에 비해 9, 16 및 23일에 감소를 보였다. a-파장은 9일(p < 0.01), 16일(p < 0.01) 및 23 (p < 0.05)에 대조군 값의 50% 미만으로 감소하였다. b-파장은 Day 9 (p < 0.01) 및 Day 16 (p < 0.01)에 대조군 값의 50% 미만으로 현저하게 감소하였다. 23일에, 감소는 통계적으로 현저하지 않았다. PBN으로 처리되고 손상 광에 노출된 그룹에, 망막 기능은 넓은 규모로 보존되었다. a-파장의 회복은 Day 9 (p < 0.01)에, Day 16 (p < 0.01)에 및 Day 23 (p < 0.01)에 비히클에 비해 현저하게 상승되었고 각각 70.4%, 79.6% 및 76.2%였다. 유사하게, b-파장의 회복은 9, 16 및 23일에 각각 100%, 103.6% 및 102.4%로 비히클에 비해, 현저하게 높았다(p<0.01).
15 μg/eye까지 초자체내 XG-102의 다른 투여량으로 처리되고 손상 광에 노출된 랫은 9, 16 및 23일에 비히클에 비해 넓은 규모로 망막 기능의 보존을 보였다. a-파장의 회복은 낮은 및 중간 투여량에 대해 각각 16일에 47.5% (p < 0.01) 및 51.1% (p < 0.01)이고 23일에 48.3% (p < 0.01) 및 41.8% (p < 0.05)였다. 유사하게, b-파장의 회복은 비히클에 비해 높았으며, 각각 낮은 및 중간 투여량에 대해 9일에 55.3% 및 60.6%, 16일에 61.7% 및 62.3%, 23일에 73.5% 및 56.5% 였다. 반면, 고-투여량 (150 μg/eye group) XG-102은 광 손상을 예방하는데 효과가 없는 것으로 보였다. a-파장의 회복은 9, 16 및 23일에 각각, 비히클 그룹에 대해 23.6%, 24.1% 및 23.7% 대 5.7%, 13.2% 및 22.5% 였다. 유사하게, b-파장의 회복은 9, 16 및 23일에 각각, 비히클 그룹에 대해 31.9%, 38.9% 및 37.1% 대 15%, 24.8% 및 30.6% 였다.
ONL 두께
광수용체 구조를 보존하는 처리의 능력을 평가하기 위해 ONL의 두께가 21일 이후 노출 중단 (Day 23)에 평가되었다. 평균 값은 하기 표에 요약되었다:
처리 ONL 두께(μm) ONL 두께 손실
(대조군 비-유도된 눈과 % 비교)
비-유도된 눈(내부 데이터) 40.6 ± 4.6 -
비히클 (IVT) 13.94 ± 3.35 66%
XG-102 (ivt, 1.5 μg/eye) 24.89 ± 4.01§ 39%
XG-102 (ivt, 15 μg/eye) 24.42 ± 5.99§ 40%
XG-102 (ivt, 150 μg/eye) 18.95 ± 9.17 53%
비히클 (ip) 12.56 ± 8.15 69%
PBN (ip, 50 mg/kg) 34.05 ± 4.00§ 16%
§p < 0.05 by 만 휘트니 테스트, x vs. 비히클 ( ivt , ip).
ONL 두께에 감소는 비히클 처리된 랫의 눈에 관찰되었다. 평균 ONL 두께의 66% 내지69% 감소는 비처리된 눈에 비해 노출 이후 비히클 처리된 눈에 관찰되었다. PBN의 투여는 비히클 그룹에 비해 현저한 보호를 보였다(ivt 및 ip, p < 0.001). 랫이 PBN으로 처리될 때, ONL은 보존되었다. 오직 작은 감소(16%)가 일반 조건에 비처리된 눈에 비해 관찰되었다 (40.6 ± 4.6 μm, 내부 데이터). ONL 두께의 감소는 낮은 및 중간 투여량으로 XG-102 처리된 랫에서 억제되었다 (비히클에 비해 p < 0.01). 보호는 높은 투여량 XG-102에 관찰되지 않았다. 평균 ONL 두께의 40% 손실은 낮은 및 중간 투여량 XG-102 처리된 눈에 관찰되었다.
따라서, 실험적 조건 하에, 이는 하기와 같이 언급될 수 있다:
* 비히클 처리된 그룹에(투여의 2개 경로: ivt, ip) 밝은 광 노출은 망막 기능의 감소 및 광수용체 손실을 유도하였다. 노출 23일 이후, a-파장의 회복은 18.6% (ip) 및 22.5% (ivt)이며; 평균 ONL 두께의 69%(ip) 및 66%(ivt) 손실이 관찰되었다.
* PBN의 전신 투여(i.p.)는 광 손상으로부터 망막을 현저하게 보호한다. PBN-처리된 그룹은 a-파장의 76.2%를 유지하였고 평균 ONL 두께의 작은 손실(16%)만이 관찰되었다.
* 1.5 및 15 μg/eye XG-102의 유리체내 주사는 광손상으로부터 망막을 현저하게 보호한다.
* XG-102 처리된 그룹은 a-파장의 48.3% 및 41.8%를 유지하고 평균 ONL 두께의 40% 손실이 관찰되었다.
이러한 점에서, 통계 분석에 따르면, XG-102 (1.5 및 15 μg/eye)의 유리체내 주사는 망막 기능을 보호하는데 효율적이다. 이들 실험 조건 하에서, 결과는 1.5 μg 및 15 μg/eye 투여량에 IVT에 의한 XG-102는 급성 광-유도된 손상으로부터 망막의 구조 및 기능을 보호함을 가리킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Xigen Inflammation Ltd. <120> Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of various diseases <130> IMP152568 <160> 105 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB1(s) (see Table 1) <400> 1 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB1(s) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 2 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: Description of sequence: general formula: NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and threonine <220> <221> REPEAT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (10)..(16) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <400> 3 Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Gln Asp Xaa <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: general formula: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH, <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (4)..(10) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and Threonine <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and threonine <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <400> 4 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa Xaa <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT (see Table 1) <400> 5 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 6 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 7 Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 8 Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <400> 9 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and Threonine <220> <221> REPEAT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (20)..(26) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 10 Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa 20 25 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptid D-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(31) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 11 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptid: D-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (4)..(10) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and threonine <220> <221> REPEAT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 12 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 20 25 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: peptide IB1-long (see Table 1) <400> 13 Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide IB2-long (see Table 1) <400> 14 Ile Pro Ser Pro Ser Val Glu Glu Pro His Lys His Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Arg Leu Thr Thr Leu Gly Ala Gln Asp Ser 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide derived from c-Jun (see Table 1) <400> 15 Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Asn Leu Lys Pro His 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide derived from ATF2 (see Table 1) <400> 16 Thr Asn Glu Asp His Leu Ala Val His Lys His Lys His Glu Met Thr 1 5 10 15 Leu Lys Phe Gly Pro Ala Arg Asn Asp Ser Val Ile Val 20 25 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB1 (see Table 1) <400> 17 Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 15 Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB1 (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(23) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 18 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (9)..(15) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is selected from serine or threonine, <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <400> 19 Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln 1 5 10 15 Asp Xaa Xaa <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (5)..(11) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 20 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 21 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(17) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 22 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT-IB1 (see Table 1) <400> 23 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 20 25 30 Gln Asp Thr 35 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT IB (generic) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(40) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (41)..(41) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (42)..(42) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 24 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa Xaa 35 40 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT-IB1 (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(35) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 25 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys 20 25 30 Lys Arg Gly 35 <210> 26 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT IB (generic) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(42) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (3)..(42) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 26 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s1) (see Table 1) <400> 27 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg Pro 1 5 10 15 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 28 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Arg Pro Lys Arg Pro 1 5 10 15 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 29 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Arg Pro Lys Arg Pro Thr 1 5 10 15 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s1) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(30) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 30 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(30) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 31 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(29) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 32 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 20 25 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s1) (see Table 1) <400> 33 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s2) (see Table 1) <400> 34 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s3) (see Table 1) <400> 35 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s4) (see Table 1) <400> 36 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s5) (see Table 1) <400> 37 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s6) (see Table 1) <400> 38 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s7) (see Table 1) <400> 39 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s8) (see Table 1) <400> 40 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s9) (see Table 1) <400> 41 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s10) (see Table 1) <400> 42 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s11) (see Table 1) <400> 43 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s12) (see Table 1) <400> 44 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s13) (see Table 1) <400> 45 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s14) (see Table 1) <400> 46 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s15) (see Table 1) <400> 47 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s16) (see Table 1) <400> 48 Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s17) (see Table 1) <400> 49 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s18) (see Table 1) <400> 50 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s19) (see Table 1) <400> 51 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s20) (see Table 1) <400> 52 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s21) (see Table 1) <400> 53 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s22) (see Table 1) <400> 54 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s23) (see Table 1) <400> 55 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s24) (see Table 1) <400> 56 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s25) (see Table 1) <400> 57 Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s26) (see Table 1) <400> 58 Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s27) (see Table 1) <400> 59 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s28) (see Table 1) <400> 60 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s29) (see Table 1) <400> 61 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s30) (see Table 1) <400> 62 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s31) (see Table 1) <400> 63 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s32) (see Table 1) <400> 64 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s33) (see Table 1) <400> 65 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s34) (see Table 1) <400> 66 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s1) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 67 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 68 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 69 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s4) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 70 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s5) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 71 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s6) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 72 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s7) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 73 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s8) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 74 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s9) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 75 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s10) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 76 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s11) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 77 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s12) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 78 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s13) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 79 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s14) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 80 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s15) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 81 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s16) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 82 Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s17) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 83 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s18) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 84 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s19) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 85 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s20) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 86 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s21) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 87 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s22) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 88 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s23) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 89 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s24) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 90 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s25) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 91 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s26) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 92 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s27) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 93 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s28) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 94 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s29) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 95 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s30) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 96 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s31) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 97 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s32) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 98 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s33) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 99 Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s34) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 100 Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: ap-1 doubled labeled probe (see p. 66) <400> 101 cgcttgatga gtcagccgga a 21 <210> 102 <211> 2953 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> description of sequence: rat IB1 cDNA sequence and its predicted amino acid sequence (see Figure 1) <220> <221> CDS <222> (108)..(2252) <400> 102 ccgccccagc tcagtccgaa ccccgcggcg gcggcggcct cctccacacg cctccacctc 60 cgccgccgcc gccgccgccg ccgcctcccg cgccgctctc cgcccgg atg gcc agg 116 Met Ala Arg 1 ctg agc ccg gga atg gcg gag cga gag agc ggc ctg agc ggg ggt gcc 164 Leu Ser Pro Gly Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Leu Ser Gly Gly Ala 5 10 15 gcg tcc cca ccg gcc gct tcc cca ttc ctg gga ctg cac atc gcg tcg 212 Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His Ile Ala Ser 20 25 30 35 cct ccc aat ttc agg ctc acc cat gat atc agc ctg gag gag ttt gag 260 Pro Pro Asn Phe Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu Glu Phe Glu 40 45 50 gat gaa gac ctt tcg gag atc act gat gag tgt ggc atc agc ctg cag 308 Asp Glu Asp Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile Ser Leu Gln 55 60 65 tgc aaa gac acc ttg tct ctc cgg ccc ccg cgc gcc ggg cta ctg tct 356 Cys Lys Asp Thr Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly Leu Leu Ser 70 75 80 gcg ggt agc agc ggt agc gcg ggg agc cgg ctg cag gcg gag atg ctg 404 Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala Glu Met Leu 85 90 95 cag atg gac ctg atc gac gcg gca agt gac act ccg ggc gcc gag gac 452 Gln Met Asp Leu Ile Asp Ala Ala Ser Asp Thr Pro Gly Ala Glu Asp 100 105 110 115 gac gaa gag gac gac gac gag ctc gct gcc caa cgg cca gga gtg ggg 500 Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg Pro Gly Val Gly 120 125 130 cct tcc aaa gcc gag tct ggc cag gag ccg gcg tct cgc agc cag ggt 548 Pro Ser Lys Ala Glu Ser Gly Gln Glu Pro Ala Ser Arg Ser Gln Gly 135 140 145 cag ggc cag ggc ccc ggc aca ggc tgc gga gac acc tac cgg ccc aag 596 Gln Gly Gln Gly Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys 150 155 160 agg cct acc acg ctc aac ctt ttc ccg cag gtg ccg cgg tct cag gac 644 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 165 170 175 acg ctg aat aat aac tct tta ggc aaa aag cac agt tgg cag gac cgt 692 Thr Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg 180 185 190 195 gtg tct cga tca tcc tcc cct ctg aag aca ggg gag cag acg cct cca 740 Val Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro 200 205 210 cat gaa cat atc tgc ctg agt gat gag ctg ccg ccc cag ggc agt cct 788 His Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Gly Ser Pro 215 220 225 gtt ccc acc cag gat cgt ggc act tcc acc gac agc cct tgt cgc cgt 836 Val Pro Thr Gln Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg 230 235 240 act gca gcc acc cag atg gca cct cca agt ggt ccc cct gcc act gca 884 Thr Ala Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Ser Gly Pro Pro Ala Thr Ala 245 250 255 cct ggt ggc cgg ggc cac tcc cat cga gat cgg tcc ata tca gca gat 932 Pro Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ser Ile Ser Ala Asp 260 265 270 275 gtg cgg ctc gag gcg act gag gag atc tac ctg acc cca gtg cag agg 980 Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln Arg 280 285 290 ccc cca gac cct gca gaa ccc acc tcc acc ttc ttg cca ccc act gag 1028 Pro Pro Asp Pro Ala Glu Pro Thr Ser Thr Phe Leu Pro Pro Thr Glu 295 300 305 agc cgg atg tct gtc agc tcg gat cct gac cct gcc gct tac tct gta 1076 Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Ser Val 310 315 320 act gca ggg cga ccg cac cct tcc atc agt gaa gag gat gag ggc ttc 1124 Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Asp Glu Gly Phe 325 330 335 gac tgt ctg tca tcc cca gag caa gct gag cca cca ggt gga ggg tgg 1172 Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Gln Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly Trp 340 345 350 355 cgg gga agc ctc ggg gag cca cca ccg cct cca cgg gcc tca ctg agc 1220 Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu Ser 360 365 370 tcg gac acc agc gca ctg tcc tac gac tct gtc aag tac aca ctg gtg 1268 Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu Val 375 380 385 gtg gat gag cat gcc cag ctt gag ttg gtg agc ctg cgg cca tgt ttt 1316 Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys Phe 390 395 400 gga gat tac agt gac gaa agc gac tct gcc act gtc tat gac aac tgt 1364 Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn Cys 405 410 415 gcc tct gcc tcc tcg ccc tac gag tca gcc att ggt gag gaa tat gag 1412 Ala Ser Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr Glu 420 425 430 435 gag gcc cct caa ccc cgg cct ccc acc tgc ctg tca gag gac tcc aca 1460 Glu Ala Pro Gln Pro Arg Pro Pro Thr Cys Leu Ser Glu Asp Ser Thr 440 445 450 ccg gat gag cct gac gtc cac ttc tct aag aag ttt ctg aat gtc ttc 1508 Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val Phe 455 460 465 atg agt ggc cgc tct cgt tcc tcc agt gcc gag tcc ttt ggg ctg ttc 1556 Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu Phe 470 475 480 tcc tgt gtc atc aat ggg gag gag cat gag caa acc cat cgg gct ata 1604 Ser Cys Val Ile Asn Gly Glu Glu His Glu Gln Thr His Arg Ala Ile 485 490 495 ttc agg ttt gtg cct cgg cat gaa gat gaa ctt gag ctg gaa gtg gac 1652 Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val Asp 500 505 510 515 gac cct ctg ctg gtg gag ctg cag gca gaa gac tat tgg tat gag gcc 1700 Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu Ala 520 525 530 tat aac atg cgc act gga gcc cgt ggt gtc ttt cct gcc tac tat gcc 1748 Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr Ala 535 540 545 att gag gtc acc aag gag cct gag cac atg gca gcc ctt gcc aaa aac 1796 Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys Asn 550 555 560 agc gac tgg att gac cag ttc cgg gtg aag ttc ctg ggc tct gtc cag 1844 Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Gln 565 570 575 gtt cct tat cac aag ggc aat gat gtc ctc tgt gct gct atg caa aag 1892 Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln Lys 580 585 590 595 atc gcc acc acc cgc cgg ctc acc gtg cac ttt aac ccg ccc tcc agc 1940 Ile Ala Thr Thr Arg Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro Ser Ser 600 605 610 tgt gtc ctt gaa atc agc gtt agg ggt gtc aag ata ggt gtc aaa gct 1988 Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val Lys Ala 615 620 625 gat gaa gct cag gag gcc aag gga aat aaa tgt agc cac ttt ttc cag 2036 Asp Glu Ala Gln Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe Phe Gln 630 635 640 cta aaa aac atc tct ttc tgt ggg tac cat cca aag aac aac aag tac 2084 Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn Lys Tyr 645 650 655 ttt ggg ttt atc act aag cac cct gct gac cac cgg ttt gcc tgc cat 2132 Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala Cys His 660 665 670 675 gtc ttt gtg tct gaa gat tcc acc aaa gcc ctg gca gag tct gtg ggg 2180 Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser Val Gly 680 685 690 cgt gca ttt cag cag ttc tac aag caa ttt gtg gaa tat acc tgt cct 2228 Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr Cys Pro 695 700 705 aca gaa gat atc tac ttg gag tag cagcaacccc cctctctgca gcccctcagc 2282 Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu 710 cccaggccag tactaggaca gctgactgct gacaggatgt tgtactgcca cgagagaatg 2342 ggggagtgag ggctgttggg gtcggggggc aggggtttgg ggagaggcag atgcagttta 2402 ttgtaatata tggggttaga ttaatctatg gaggacagta caggctctct cggggctggg 2462 gaagggcagg gctggggtgg gggtcaggca tctggccaca aaggggtccc ctagggacag 2522 aggcgctgca ccatcctggg cttgtttcat actagaggcc ctggctttct ggctcttggg 2582 tcctgccttg acaaagccca gccacctgga agtgtcacct tcccttgtcc acctcaccca 2642 gtgccctgag ctcatgctga gcccaagcac ctccgaagga ctttccagta aggaaatggc 2702 aacatgtgac agtgagaccc tgttctcatc tgtggggctc cggcagctcc gacccccagc 2762 ctggccagca cgctgaccct ggcaagcttg tgtgttcaaa gaaggagagg gccacagcaa 2822 gccctgcctg ccagggaagg ttccctctca gctggcccca gccaactggt cactgtcttg 2882 tcacctggct actactatta aagtgccatt tcttgtctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2942 aaaaactcga g 2953 <210> 103 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> description of sequence: Protein encoded by Exon-Intron Boundary of the rIB1 Gene - Splice donor <400> 103 Met Ala Arg Leu Ser Pro Gly Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His 20 25 30 Ile Ala Ser Pro Pro Asn Phe Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu 35 40 45 Glu Phe Glu Asp Glu Asp Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile 50 55 60 Ser Leu Gln Cys Lys Asp Thr Leu Ser 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His Glu Gln Thr His 485 490 495 Arg Ala Ile Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu 500 505 510 Glu Val Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp 515 520 525 Tyr Glu Ala Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala 530 535 540 Tyr Tyr Ala Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu 545 550 555 560 Ala Lys Asn Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly 565 570 575 Ser Val Gln Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala 580 585 590 Met Gln Lys Ile Ala Thr Thr Arg Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro 595 600 605 Pro Ser Ser Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly 610 615 620 Val Lys Ala Asp Glu Ala Gln Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His 625 630 635 640 Phe Phe Gln Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn 645 650 655 Asn Lys Tyr Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe 660 665 670 Ala Cys His Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu 675 680 685 Ser Val Gly Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr 690 695 700 Thr Cys Pro Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu 705 710 <210> 104 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> description of sequence: human IB1 protein sequence <400> 104 Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Gly Leu Gly Gly Gly Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Pro Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His Ile Ala Ser Pro Pro Asn 20 25 30 Phe Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu Glu Phe Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile Ser Leu Gln Cys Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala Glu Met Leu Gln Met Asp Leu 85 90 95 Ile Asp Ala Thr Gly Asp Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asp Glu Glu Asp 100 105 110 Asp Asp Glu Glu Arg Ala Ala Arg Arg Pro Gly Ala Gly Pro Pro Lys 115 120 125 Ala Glu Ser Gly Gln Glu Pro Ala Ser Arg Gly Gln Gly Gln Ser Gln 130 135 140 Gly Gln Ser Gln Gly Pro Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg 145 150 155 160 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 165 170 175 Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg Val 180 185 190 Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro His 195 200 205 Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Ser Gly Pro Ala 210 215 220 Pro Thr Thr Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg Ser 225 230 235 240 Thr Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ala Pro Pro 245 250 255 Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln Ala Asp 260 265 270 Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln Arg 275 280 285 Pro Pro Asp Ala Ala Glu Pro Thr Ser Ala Phe Leu Pro Pro Thr Glu 290 295 300 Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Glu Glu Gly Phe 325 330 335 Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly Trp 340 345 350 Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu Ser 355 360 365 Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu Val 370 375 380 Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys Phe 385 390 395 400 Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn Cys 405 410 415 Ala Ser Val Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr Glu 420 425 430 Glu Ala Pro Arg Pro Gln Pro Pro Ala Cys Leu Ser Glu Asp Ser Thr 435 440 445 Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val Phe 450 455 460 Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu Phe 465 470 475 480 Ser Cys Ile Ile Asn Gly Glu Glu Gln Glu Gln Thr His Arg Ala Ile 485 490 495 Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val Asp 500 505 510 Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu Ala 515 520 525 Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr Ala 530 535 540 Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys Asn 545 550 555 560 Ser Asp Trp Val Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Gln 565 570 575 Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln Lys 580 585 590 Ile Ala Thr Thr Arg Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro Ser Ser 595 600 605 Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val Lys Ala 610 615 620 Asp Asp Ser Gln Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe Phe Gln 625 630 635 640 Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn Lys Tyr 645 650 655 Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala Cys His 660 665 670 Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser Val Gly 675 680 685 Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr Cys Pro 690 695 700 Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu 705 710 <210> 105 <211> 2136 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> description of sequence: nucleic acid sequence encoding human IB1 protein <400> 105 atggcggagc gagaaagcgg cggcctggga gggggggccg cgtccccgcc cgccgcctcc 60 ccgttcctgg ggctgcacat cgcttcgcct cccaatttca ggctcaccca tgacatcagc 120 ctggaggagt ttgaggatga agacctctcg gagatcactg atgagtgtgg catcagctta 180 cagtgcaaag acaccctgtc cttacggccc ccgcgcgccg ggctgctctc tgcgggcggc 240 ggcggcgcgg ggagccggtt gcaggccgag atgctgcaga tggacctgat cgacgcgacg 300 ggggacactc ccggggccga ggacgacgag gaggacgacg acgaggagcg cgcggcccgg 360 cggccgggag cggggccgcc caaggccgag tccggccagg agccggcgtc ccgcggccag 420 ggccagagcc aaggccagag ccagggcccg ggcagcgggg acacgtaccg gcccaagcgg 480 cccaccacgc tcaacctctt tccgcaggtg ccgcggtctc aggacacact gaataataat 540 tctctgggca aaaagcacag ttggcaggat cgggtgtctc gatcatcctc acccctgaag 600 acaggggagc agacaccacc gcatgaacac atctgcctga gcgatgagct gcccccccag 660 agcggccccg cccccaccac agatcgaggc acctccaccg acagcccttg ccgccgcagc 720 acagccaccc agatggcacc tccgggtggt ccccctgctg ccccgcctgg gggtcggggc 780 cactcgcatc gagaccgaat ccactaccag gccgatgtgc gactagaggc cactgaggag 840 atctacctga ccccagtgca gaggccccca gacgctgcag agcccacctc cgccttcctg 900 ccgcccactg agagccggat gtcagtcagc tccgatccag accctgccgc ctacccctcc 960 acggcagggc ggccgcaccc ctccatcagt gaagaggaag agggcttcga ctgcctgtcg 1020 tccccagagc gggctgagcc cccaggcgga gggtggcggg ggagcctggg ggagccgccg 1080 ccacctccac gggcctctct gagctcggac accagcgccc tgtcctatga ctctgtcaag 1140 tacacgctgg tggtagatga gcatgcacag ctggagctgg tgagcctgcg gccgtgcttc 1200 ggagactaca gtgacgagag tgactctgcc accgtctatg acaactgtgc ctccgtctcc 1260 tcgccctatg agtcggccat cggagaggaa tatgaggagg ccccgcggcc ccagccccct 1320 gcctgcctct ccgaggactc cacgcctgat gaacccgacg tccatttctc caagaaattc 1380 ctgaacgtct tcatgagtgg ccgctcccgc tcctccagtg ctgagtcctt cgggctgttc 1440 tcctgcatca tcaacgggga ggagcaggag cagacccacc gggccatatt caggtttgtg 1500 cctcgacacg aagacgaact tgagctggaa gtggatgacc ctctgctagt ggagctccag 1560 gctgaagact actggtacga ggcctacaac atgcgcactg gtgcccgggg tgtctttcct 1620 gcctattacg ccatcgaggt caccaaggag cccgagcaca tggcagccct ggccaaaaac 1680 agtgactggg tggaccagtt ccgggtgaag ttcctgggct cagtccaggt tccctatcac 1740 aagggcaatg acgtcctctg tgctgctatg caaaagattg ccaccacccg ccggctcacc 1800 gtgcacttta acccgccctc cagctgtgtc ctggagatca gcgtgcgggg tgtgaagata 1860 ggcgtcaagg ccgatgactc ccaggaggcc aaggggaata aatgtagcca ctttttccag 1920 ttaaaaaaca tctctttctg cggatatcat ccaaagaaca acaagtactt tgggttcatc 1980 accaagcacc ccgccgacca ccggtttgcc tgccacgtct ttgtgtctga agactccacc 2040 aaagccctgg cagagtccgt ggggagagca ttccagcagt tctacaagca gtttgtggag 2100 tacacctgcc ccacagaaga tatctacctg gagtag 2136

Claims (31)

  1. 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위하여 150개 아미노산 길이 미만을 포함하며, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 하기 그룹의 염증성 또는 비염증성 질병으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도:
    (a) 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD), 특히 연령 관련 황반 변성의 습윤 또는 건조 형태, 및 백내장,
    (b) 안 염증성 질병(eye inflammatory diseases), 특히 포도막염(uveitis), 공막염(scleritis), 각막 수술(corneal surgery), 결막염(conjunctivitis), 비전염성 각막염(non-infectious keratitis), 홍채염(iritis), 맥락막 염증(chorioretinal inflammation), 눈의 망막을 손상시키는 염증성 질병(망막증(retinopathy)), 특히 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 동맥성 고혈압 유발성 고혈압 망막증(arterial hypertension induced hypertensive retinopathy), 방사선 유발성 망막증(radiation induced retinopathy), 태양 유발성 태양 망막증(sun-induced solar retinopathy), 트라우마 유발성 망막증(trauma-induced retinopathy), 예를 들어 퍼쳐 망막증(Purtscher's retinopathy), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity, ROP) 및 과점도 관련 망막증(hyperviscosity-related retinopathy)으로부터 선택된 것,
    (c) 에디슨병(Addison's disease), 무감마글로불린혈증(Agammaglobulinemia), 원형탈모(Alopecia areata), 근위축성 측삭 경화증(Amytrophic lateral sclerosis), 항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome), 아토피성 알러지(Atopic allergy), 자가면역성 무형성 빈혈(Autoimmune aplastic anemia), 자가면역성 심근증(Autoimmune cardiomyopathy), 자가면역성 장질환(Autoimmune enteropathy), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 내이병(Autoimmune inner ear disease), 자가면역성 림프증식 증후군(Autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역성 다발내분비성 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome), 자가면역성 프로게스테론 피부염(Autoimmune progesterone dermatitis), 특발 혈소판감소 자색반증(Idiopathic thrombocytopenic purpura), 자가면역성 두드러기(Autoimmune urticarial), 발로 동심성 경화증(Balo concentric sclerosis), 수포성 류천포창(Bullous pemphigoid), 캐슬만병(Castleman's disease), 반흔성 유천포창(Cicatricial pemphigoid), 한랭 응집소병(Cold agglutinin disease), 보체 성분 2 결핍 관련 질병(Complement component 2 deficiency associated disease), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 다고스병(Dagos disease), 동통성 지방증(Adiposis dolorosa), 호산구성 폐렴(Eosinophilic pneumonia), 후천성 표피 수포증(Epidermolysis bullosa acquisita), 신생아 용혈성 질환(Hemolytic disease of the newborn), 한성글로불린혈증(Cryoglobulinemia), 에반스 증후군(Evans syndrome), 진행성 골화성 섬유이형성(Fibrodysplasia ossificans progressive), 위장성 유천포창(Gastrointestinal pemphigoid), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 하시모토 뇌병증(Hashimoto's encephalopathy), 임신 유천포창(Gestational pemphigoid), 휴-스토빈 증후군(Hughes-stovin syndrome), 저감마글로불린혈증(Hypogammaglobulinemia), 램버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-eaton myasthenic syndrome), 경화성 태선(Lichen sclerosus), 반상경피증(Morphea), 급성태선상두진상비강진(Pityriasis lichenoides et varioliformis acuta), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 기면증(Narcolepsy), 신경근 긴장증(Neuromyotonia), 안구간대경련 근간대경련 증후군(Opsoclonus myoclonus syndrome), 방종양성 소뇌 변성(Paraneoplastic cerebellar degeneration), 발작성야간혈색소뇨증(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 안면편측 위축증(Parry-romberg syndrome), 악성 빈혈(Pernicious anemia), POEMS 증후군, 괴저성 농피증(Pyoderma gangrenosum), 순수 적혈구 무형성증(Pure red cell aplasia), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 하지불안증후군(Restless legs syndrome), 후복막 섬유증(Retroperitoneal fibrosis), 제2형 자가면역성 다발성내분비 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome type 2), 스티프 퍼슨 증후군(Stiff person syndrome), 수삭 증후군(Susac's syndrome), 열성 호중구 피부병(Febrile neutrophilic dermatosis), 시드남 무도병(Sydenham's chorea), 혈소판 감소(Thrombocytopenia), 및 백반(vitiligo),
    (d) 관절염(arthritis) 특히 청소년 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 건선 관절염(psoriastic arthritis) 및 류마티스성 관절염, 및 관절증(arthrosis), 및 골관절염(osteoarthritis),
    (e) 피부 질환 특히 건선(psoriasis), 습진(eczema), 피부염(dermatitis), 여드름(acne), 구강염(mouth ulcers), 홍반(erythema), 편평 태선(lichen plan), 유육종증(sarcoidose), 혈관염(vascularitis), 성인 성형 IgA 질병(adult linear IgA disease)으로부터 선택된 것,
    (f) 타우증(tauopathies), 아밀로이드증(amyloidosis) 및 프리온 질병(prion diseases),
    (g) 용종(polypes),
    (h) 구강 또는 턱뼈 염증성 질병, 특히 치수염(pulpitis), 임플란트 주위염(periimplantitis), 치주염(periodontitis), 치은염(gingivitis), 구내염(stomatitis), 점막염(mucositis), 낙설성 질환(desquamative disorders), 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder),
    (i) 골괴사(osteonecrosis)
    (j) , 뇌척수염(encephalomyelitis), 특히 급성 산재성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 척추염(spondylitis), 특히 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항합성효소 증후군(antisynthetase syndrome), 피부염(dermatitis), 특히 아토피 피부염(atopic dermatitis) 또는 접촉성 피부염(contact dermatitis), 간염(hepatitis), 특히 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 말초신경 병증(autoimmune peripheral neuropathy), 췌장염(pancreatitis), 특히 자가면역 췌장염(autoimmune pancreatitis), 베체트 병(Behcet's disease), 비커스테프(Bickerstaff's), 뇌염(encephalitis), 블라우 증후군(Blau syndrome), 만성 소화 장애증(Coeliac disease), 샤가스 병(Chagas disease), 다발성 신경장애(polyneuropathy), 특히 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경장애(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 골수염(osteomyelitis), 특히 만성 순환성 다초점 골수염(chronic recurrent multifocal osteomyelitis), 처그 스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 코간 증후군(Cogan syndrome), 거대 세포 동맥염(giant-cell arteritis), CREST 증후군, 맥관염(vasculitis), 특히 피부 소형 도관 맥관염(cutaneous small-vessel vasculitis) 및 두드러기 맥관염(urticarial vasculitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 피부근염(dermatomyositis), 전신성 공피증(systemic scleroderma), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 약물 유발성 홍반성 낭창(drug-induced lupus erythematosus), 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 골부착 부위염(enthesitis), 호산성 근막염(eosinophilic fasciitis), 호산구성 위장염(eosinophilic gastroenteritis), 결절성 홍반(erythema nodosum), 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis), 위염(gastritis), 그레이브 질병(Grave's disease), 기엥 바레 증후군(Guillain-barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa), 특발성 염증 탈수병(Idiopathic inflammatory demyelinating diseases), 근염(myositis), 특히 봉입체 근염(inclusion body myositis), 방광염(cystitis), 특히 간질성 방광염(interstitial cystitis), 가와사키병(Kawasaki disease), 편평태선(Lichen planus), 루포이드 간염(lupoid hepatitis), 마지드 증후군(Majeed syndrome), 메니에르 질병(Meniere's disease), 미세다발성 맥관염(microscopic polyangiitis), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 척수염(myelitis), 특히 시속신경수염(neuromyelitis optica), 갑상선염(thyroiditis), 특히 오드 갑상선염(Ord's thyroiditis), 류머티즘(rheumatism), 특히 재발성 류마티즘(palindromic rheumatism), 파서니즈-터너 증후군(Parsonage-Turner syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 정맥주위 뇌척수염(perivenous encephalomyelitis), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 다발성 근육통(polymyalgia), 특히 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatic), 다발성근염(polymyositis), 간경변(cirrhosis), 특히 원발담즙성 간경병(primary biliary cirrhosis), 담관염(cholangitis), 특히 원발 경화 쓸개관염(primary sclerosing cholangitis), 점진성 염증 신경장해(progressive inflammatory neuropathy), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 재발성 다발 연골염(relapsing polychondritis), 관절염(arthritis), 특히 반응성 관절염(reactive arthritis) (라이터 증후군(Reiter disease)) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 류마티스성 열(rheumatic fever), 유육종증(sarcoidosis), 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome), 혈청병(serum sickness), 척추관절증(spondyloarthropathy), 타까야수동맥염(Takayasu's arteritis), 톨로사 헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단성 척수염(transverse myelitis), 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis),
    (k) 섬유증 질병 및/또는 질환 특히 폐, 심장, 간, 골수, 종격, 복막후강, 피부, 창자, 관절, 및 어깨 섬유증으로부터 선택된 것,
    (l) 신장 질병 및/또는 질환 특히 일반적인 사구체신염(glomerulonephritis), 특히 막성증식성사구체신염(membrano-proliferative glomerulonephritis), 메산지오증식성사구체신염(mesangio-proliferative glomerulonephritis), 급속진행성사구체신염(rapidly progressive glomerulonephritis), 일반적인 신증(nephrophathies), 특히 막성신증(membranous nephropathy) 또는 당뇨병성신증(diabetic nephropathy), 일반적인 신염(nephritis), 특히 홍반성신염(lupus nephritis), 신우신염(pyelonephritis), 간질성신염(interstitial nephritis), 세뇨관간질성 신염(tubulointerstitial nephritis), 만성 신장염(chronic nephritis) 또는 급성 신장염(acute nephritis), 및 미세변화질병(minimal change disease) 및 국소분절사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis)으로부터 선택된 것,
    (m) 교감성 안염(sympathetic ophthalmia)
    (n) 피부, 신장, 심장, 폐, 췌장, 간, 혈액 세포, 골수, 각막, 사고로 절단된 사지(accidental severed limb), 특히 손가락, 손, 발, 얼굴, 코, 뼈, 분문판(cardiac valve), 혈관 또는 장기 이식 거부 반응,
    (o) 피질기저 퇴행(Corticobasal degeneration), 점진성 핵상 마비(progresive supranuclear palsy), 정신 분열증(schizophrenia), 유전 크로이츠펠트 야곱병(inherited Kreutzfeld Jacob), 운동 뉴런증(motor neurone disease), 척수소뇌실조증/위축증(spinocerebellar ataxia/atrophie), 치매(dementia), 특히 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with lewy bodies), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 유전적 경련성 하반신 마비(hereditary spastic paraparesis), 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxiea), 샤르코 마리투스(Charcot Marie toot), 및
    (p) 유전성 또는 비 유전성 대사성 질병인 질병, 특히 탄수화물 대사의 대사성 질환의 그룹, 예를 들어, 당원저장증(glycogen storage disease), 아미노산 대사 질환, 예를 들어, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 단풍나무시럽뇨병(maple syrup urine disease), 제1형 글루타린산혈증(glutaric acidemia type 1), 요소회로질환(urea Cycle Disorder) 또는 요소회로결핍(urea Cycle Defects), 예를 들어, 카바모일 인산 합성효소 I 결핍증(carbamoyl phosphate synthetase I deficiency), 유기산 대사의 질환(유기성 산성뇨(organic acidurias)), 예를 들어, 알캅톤요증(alcaptonuria), 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사의 질환, 예를 들어, 중쇄 아실-코엔자임 A 디하이드로게나아제 결핍(medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency) (종종 MCADD로 축약), 포르피린 대사의 질환, 예를 들어 급성간헐성포르피린증(acute intermittent porphyria), 퓨린 또는 피리미딘 대사의 질환, 예를 들어, 레쉬니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 스테로이드 대사의 질환, 예를 들어, 선천 지질 부신 과다형성(lipoid congenital adrenal hyperplasia), 또는 선천성 부신 과형성(congenital adrenal hyperplasia), 미토콘드리아 기능의 질환, 예를 들어, 컨즈-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 퍼옥시좀 기능의 질환. 예를 들어, 젤 웨거 증후군(Zellweger syndrome), 또는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders), 예를 들어, 고셰병(Gaucher's disease) 또는 니만피크병(Niemann Pick disease)으로부터 선택된 것.
  2. 제1항에 있어서, 상기 질환/질병은 AMD 또는 백내장인 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 질환/질병은 망막증, 특히 당뇨병성 망막증인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제1항에 있어서, 상기 질병/질환은 건선(psoriasis)인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제1항에 있어서, 상기 질환/질병은 장기 이식편 거부(graft rejection) 또는 장기 이식 거부 반응(transplant rejection reaction), 특히 신장, 췌장, 피부 또는 심장 장기 이식편 거부(transplant graft rejection)인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 질병/질환은 사구체 신염(glomerulonephritis)인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 이식(transplantation) 전에 조직 또는 장기 이식의 처리(treatment)를 위한 150개 아미노산 길이 미만을 포함하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이식(transplantation)은 신장, 심장, 폐, 췌장, 간, 혈액 세포, 골수, 각막, 사고로 절단된 사지(limb), 특히 손가락, 손, 발, 얼굴, 코, 뼈, 분문판(cardiac valve), 혈관 또는 장(intestine) 이식인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 5 내지 150개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게 10 내지 100개 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게 10 내지 75개 아미노산 잔기의 범위 및 가장 바람직하게 10 내지 50개 아미노산 잔기 범위를 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 c-jun 아미노 말단 키나아제 (JNK)에 결합하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 JNK 억제자 서열이 JNK 발현 세포에 존재할 때, 적어도 하나의 JNK 표적된(targeted) 전사 인자의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 표적된 전사 인자는 c-Jun, ATF2, 및 Elkl로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 펩타이드가 JNK 발현 세포에 존재할 때 JNK 효과를 변화시키는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자 서열의 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 양자의 조합으로 구성되며, 적어도 1개 또는 2개까지, 바람직하게 적어도 3개, 4개 또는5개, 더욱 바람직하게 적어도 6개, 7개, 8개 또는 9개 및 더욱 더 바람직하게 적어도 10개 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 바람직하게 포함하며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 단위(blockwise), 비-블록 단위 또는 다른 방법으로 JNK 억제자 서열에 정렬될 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 SEQ　ID　NO:　102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 또는 SEQ ID NO: 105에 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 코딩된 인간 또는 랫 IB1 서열의 절편, 변이체, 또는 이러한 절편의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열은 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100, 또는 이의 절편, 유도체 또는 변이체에 따르는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 공유 결합에 의해 연결된 적어도 하나의 첫번째 도메인 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하며, 상기 첫번째 도메인은 트래피킹(trafficking) 서열을 포함하며, 상기 두번째 도메인은 제1항 내지 제16항 중 어느 하나에 정의된 JNK 억제자 서열을 포함하며, 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것이며, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  18. 제14항에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 양자의 조합으로 구성되며, 적어도 1개 또는 2개까지, 바람직하게 적어도 3개, 4개 또는 5개, 더욱 바람직하게 적어도 6개, 7개, 8개 또는 9개 및 더욱 더 바람직하게 적어도 10개 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 바람직하게 포함하며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 단위, 비-블록 단위 또는 다른 방법으로 키메라 펩타이드에 정렬될 수 있는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  19. 제17항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트래피킹 서열은 인간 면역결핍 바이러스 TAT 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트래피킹 서열은 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 또는 22의 아미노산 서열로 이루어지거나 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트래피킹 서열은 펩타이드의 세포 흡수(cellular uptake)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트래피킹 서열은 펩타이드의 핵 국재화(nuclear localization)를 지시하는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 아미노산 서열, 또는 이의 절편, 또는 변이체로 이루어지거나 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어지거나 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 펩타이드의 용도.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 JNK 억제자 서열 또는 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 키메라 펩타이드를 코딩하며, 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것이며, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 동정된 핵산의 용도.
  26. 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것으로, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 제25항에 정의된 핵산을 포함하는 벡터의 용도.
  27. 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것으로, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 제26항에 정의된 벡터를 포함하는 세포의 용도.
  28. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 정의된 JNK 억제자 서열에 또는 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따라 정의된 키메라 펩타이드에 면역 특이적으로 결합하며, 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것으로, 상기 개체의 JNK 시그널링과 강하게 관련된 질병 또는 질환은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 항체의 용도.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내, 경피를 포함하는 비경구 경로, 구강 또는 직장을 포함하는 장관(enteral) 경로, 비강, 또는 비강 내를 포함하는 국소 경로, 및 상피 또는 패치 전달을 포함하는 다른 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택된 투여 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 투여량(체중 kg 당)은 10 mmol/kg까지, 바람직하게 1 mmol/kg까지, 더욱 바람직하게 100 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 10 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 1 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게 100 nmol/kg까지, 가장 바람직하게 50 nmol/kg까지의 범위인 것을 특징으로 하는 용도.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 투여량은 약 1 pmol/kg 내지 약 1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,01 mmol/kg, 약 50 pmol/kg 내지 약 1 μmol/kg, 약 100 pmol/kg 내지 약 500 nmol/kg, 약 200 pmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 약 300 pmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 약 500 pmol/kg 내지 약 50 nmol/kg, 약 750 pmol/kg 내지 약 30 nmol/kg, 약 250 pmol/kg 내지 약 5 nmol/kg, 약 1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 또는 상기 값의 어느 둘의 조합의 범위인 것을 특징으로 하는 용도.
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