CN102573855A - 轴突变性的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及神经障碍和神经系统损伤的治疗。本发明具体地提供了使用特定靶蛋白的调节剂调节神经元或其部分(如轴突)的变性的方法。

Description

轴突变性的调节
技术领域
本发明一般涉及神经障碍和神经系统损伤的治疗。本发明尤其涉及特定靶蛋白和过程的调节剂在抑制神经元和轴突变性的方法中的应用。
背景技术
神经元或轴突变性在神经系统的正确发育中起关键作用，并且是许多神经变性疾病的标志，所述神经变性疾病包括例如，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和帕金森病(Parkinson’s disease)，以及脑和脊髓的外伤。这些疾病和损伤对患者和看护者具有破坏性，并还产生极大的经济负担，目前仅在美国年度费用就超过几千亿美元。用于这些疾病和病症最近的治疗是不足够的。增加这些疾病产生的问题紧急性的是这样的事实：许多此类疾病与年龄相关，因此它们的发病率随人口统计学改变而快速升高。极其需要开发有效的方法来治疗神经变性疾病和神经系统损伤。
发明内容
本发明提供了用于抑制神经元或其部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)的变性的方法。所述方法包括：向神经元或其部分施用这样的试剂，其调节：(i)神经元或其部分中靶蛋白的活性或表达，或(ii)神经元或其部分中的过程。
可在本发明方法中靶向的蛋白的实例包括：双亮氨酸拉链激酶(dualleucine zipper-bearing kinase，DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、β-联蛋白、转录因子4(TCF4)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体、转录因子4(TCF4)或β-联蛋白，而可靶向的过程的实例是转录和蛋白合成。
神经元或其部分可由选自以下的神经元组成，或可以在选自以下的神经元内：小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元、交感神经元和海马神经元。
试剂可以是例如，靶蛋白或过程的抑制剂。此外，所述试剂例如可以选自：抗体、多肽、肽、肽体(peptibodies)、核酸分子、短的干扰RNA(siRNA)、多核苷酸、适配体(aptamer)、小分子和多糖。在抗体的情况下，抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段(例如，Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)。在小分子的情况下，所述试剂例如可以选自：MG132、SB 415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、SB 202190、SB239063、SB 239069、SB 203580、SB 203580HCl、AG 556、AG 555、AG494、PD168393、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B42(AG490)、LY 294022、茴香霉素(Anisomycin)、放线菌酮(Cycloheximide)、Roscovitine、毛喉素(Forskolin)、NKH 477、放线菌素D(Actinomycin D)、SP600125、Bax通道阻断剂、ZD7288、STO-609、bortezomid、双硫仑(disulfiram)、pamapimod、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、盐酸地美环素(demeclocyclinehydrochloride)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、硫酸新霉素(neomycinsulfate)、硫酸巴龙霉素(paromomycin sulfate)及其药学上可接受的盐。
神经元或其部分可存在于受试者，如人受试者中。所述受试者可以例如患有或处于发生疾病或病症的风险中，所述疾病或病症选自：(i)神经系统的病症，(ii)在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗继发的神经系统病症，(iii)由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关的神经变性，(vi)记忆丧失和(vii)精神疾病。
神经系统病症的实例包括：肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)、三叉神经痛(trigeminal neuralgia)、舌咽神经痛(glossopharyngeal neuralgia)、贝耳麻痹(Bell’s Palsy)、重症肌无力(myasthenia gravis)、肌营养不良(muscular dystrophy)、进行性肌萎缩(progressive muscular atrophy)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis，PLS)、假延髓性麻痹(pseudobulbar palsy)、进行性延髓性麻痹(progressivebulbar palsy)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、遗传性肌萎缩(inherited muscular atrophy)、椎间盘综合征(invertebrate disk syndromes)、颈椎病(cervical spondylosis)、神经丛病症(plexus disorders)、胸廓出口破坏综合征(thoracic outlet destruction syndromes)、外周神经病(peripheralneuropathies)、卟啉病(prophyria)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、帕金森叠加病(Parkinson’s-plus diseases)、多系统萎缩(multiple system atrophy)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、雷维小体痴呆(dementia with Lewy bodies)、额颞痴呆(frontotemporal dementia)、脱髓鞘病(demyelinating diseases)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、多发性硬化(multiple sclerosis)、进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、朊病毒病(prion disease)、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、格-施-沙综合征(Gerstmann-
Figure BDA0000155526810000031
-Scheinker syndrome，GSS)、致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia，FFI)、牛海绵样脑病(bovine spongiformencephalopathy)、皮克病(Pick’s disease)、癫痫(epilepsy)和艾滋病痴呆综合征(AIDS demential complex)。
疼痛的实例包括：慢性痛(chronic pain)，纤维肌痛(fibromyalgia)，脊柱痛(spinal pain)，腕管综合征(carpel tunnel syndrome)，来自癌症、关节炎的疼痛、坐骨神经痛(sciatica)，头痛(headaches)，来自手术、肌肉痉挛的疼痛，背痛(back pain)，内脏痛(visceral pain)，来自损伤的疼痛，牙痛(dentalpain)，神经痛(neuralgia)如神经源性疼痛(neuogenic pain)或神经性疼痛(neuropathic pain)，神经炎症或损伤，带状疱疹(shingles)，椎间盘突出(herniated disc)，韧带撕裂(torn ligament)和糖尿病(diabetes)。
继在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗之后的神经系统病症的实例包括：由糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎(hepatitis)、肾功能异常(kidneydysfunction)、科罗拉多蜱传热(Colorado tick fever)、白喉(diphtheria)、HIV感染、麻风病(leprosy)、莱姆病(lyme disease)、结节性多动脉炎(polyarteritisnodosa)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、结节病(sarcoidosis)、舍格伦综合征(Sjogren syndrome)、梅毒(syphilis)、系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus)和淀粉样变性(amyloidosis)引起的外周神经病或神经痛。
由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤的实例包括：由暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化学治疗剂、氨苯砜、HIV药物、降低胆固醇的药物、心脏或血压药物、和甲硝唑引起的神经损伤。额外的实例包括：烧伤、创伤、手术、意外伤害、局部缺血、对冷温度的延长暴露、中风、颅内出血和脑出血。
精神疾病(psychiatric disorders)的实例包括：精神分裂症(schizophrenia)、妄想性障碍(delusional disorder)、情感分裂性精神障碍(schizoaffectivedisorder)、精神分裂症(schizopheniform)、分享性精神障碍(shared psychoticdisorder)、精神病(psychosis)、偏执型人格障碍(paranoid personalitydisorder)、精神分裂样人格障碍(schizoid personality disorder)、边缘型人格障碍(borderline personality disorder)、反社会性人格障碍(anti-socialpersonality disorder)、自恋性人格障碍(narcissistic personality disorder)、强制性障碍(obsessive-compulsive disorder)、妄想(delirium)、痴呆(dementia)、心境障碍(mood disorders)、双相性精神障碍(bipolar disorder)、抑郁(depression)、应激障碍(stress disorder)、惊恐性障碍(panic disorder)、广场恐怖症(agoraphobia)、社会恐怖(social phobia)、创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder)、焦虑障碍(anxiety disorder)和冲动控制障碍(impulse control disorders)。
眼相关的神经变性的实例包括：青光眼(glaucoma)、格子状营养不良(lattice dystrophy)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、与湿性或干性AMD相关的光受体变性(photoreceptor degeneration associated with wet or dry AMD)、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣(optic nerve drusen)、视神经病(opticneuropathy)和视神经炎(optic neuritis)。青光眼的实例包括：原发性青光眼(primary glaucoma)、低眼压性青光眼(low-tension glaucoma)、原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma)、急性闭角型青光眼(acuteangle-closure glaucoma)、慢性闭角型青光眼(chronic angle-closureglaucoma)、间歇性闭角型青光眼(intermittent angle-closure glaucoma)、慢性开角闭角型青光眼(chronic open-angle closure glaucoma)、色素性青光眼(pigmentary glaucoma)、脱落性青光眼(exfoliation glaucoma)、发育性青光眼(developmental glaucoma)、继发性青光眼(secondary glaucoma)、晶状体溶解性青光眼(phacogenic glaucoma)、眼内出血(intraocular hemorrhage)继发的青光眼、外伤性青光眼(traumatic glaucoma)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、药物诱导的青光眼(drug-induced glaucoma)、中毒青光眼(toxic glaucoma)和眼内瘤(intraocular tumors)相关性青光眼、视网膜脱离(retinal deatchments)、眼睛的严重化学灼伤和虹膜萎缩(iris atrophy)。
根据本发明的方法使神经元或其部分与试剂接触可以包括：向受试者施用包括所述试剂的药物组合物。例如通过静脉内输注；通过静脉内的、腹膜内的、大脑内的、肌肉内的、眼内的、动脉内的或损害内的途径注射；或通过局部或眼睛应用，可进行施用。此外，本发明的方法可以包括：向受试者施用一种或多种另外的药物试剂。
在其它实施例中，根据本发明的方法治疗的神经元或其部分是离体(ex vivo)或体外的(in vitro)(例如神经移植物或神经移植体)。
在上述的本发明方法中，所述DLK信号传导抑制剂会导致：JNK磷酸化的减少(例如，JNK2和/或JNK3磷酸化的减少)、JNK活性的降低(例如，JNK2和/或JNK3活性的降低)和/或JNK表达的降低(例如，JNK2和/或JNK3表达的降低)。在这些方法中，所述DLK信号传导抑制剂可以是本文所述的DLK信号传导抑制剂中的任一种(例如，小分子，诸如JNKV或JNKVII或siRNA)。
在上述的本发明方法中，所述试剂可以是G-蛋白抑制剂。所述G-蛋白抑制剂可以是本文所述的G-蛋白抑制剂中的任一种(例如，小分子)。
本发明还包括鉴定试剂的方法，所述试剂用于抑制神经元或其部分的变性。这些方法包括：在轴突或神经元变性的测定(例如，抗-神经生长因子(NGF)抗体、血清剥夺/KCl减少和/或鱼藤酮治疗)中，使神经元或其部分与候选试剂接触。在候选试剂存在下对神经元或其部分相对于对照的变性减少的检测，指示用于抑制神经元或其部分变性的试剂的鉴定。所述候选试剂例如可以选自：抗体、多肽、肽、肽体、核酸分子、短的干扰RNA(siRNA)、多核苷酸、适配体、小分子和多糖。
本发明还包括药物组合物和试剂盒，其含有如上述用于抑制神经元或其部分变性的一种或多种试剂。所述药物组合物和试剂盒可以包括例如选自以下的一种或多种试剂：MG132、SB 415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、SB 202190、SB 239063、SB 239069、SB 203580、SB 203580HCl、AG 556、AG 555、AG 494、PD168393、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B42(AG 490)、LY 294022、茴香霉素、放线菌酮、Roscovitine、毛喉素、NKH 477、放线菌素D、SP600125、Bax通道阻断剂、ZD7288、STO-609、bortezomid、双硫仑、pamapimod、吉非替尼、厄洛替尼、二甲苯磺酸拉帕替尼、盐酸地美环素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素、及其药学上可接受的盐。所述药物组合物和试剂盒可任选地包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。此外，所述药物组合物和试剂盒可任选地包括在抑制神经元或其部分变性的方法中使用所述药物组合物和试剂盒的说明书。
在本发明的任何方法、组合物和试剂盒中，所述试剂可以是：DLK信号传导抑制剂(例如，靶向DLK的siRNA分子，其包含例如想要的GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ ID NO：1)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、GACATCGCCTCCGCTGATTT(SEQ ID NO：3)、ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQ ID NO：5)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)或TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列；抗体，例如抗体317、抗体318、抗体319、抗体320、抗体321、抗体322，靶向TTGGATGAAGCCATTAGACTA(SEQ ID NO：9)的JNK1序列的siRNA分子，靶向ACCTTTAATGGACAACATTAA(SEQ ID NO：10)或AAGGATTAGCTTTGTATCATA(SEQ ID NO：11)的JNK2序列的siRNA分子，靶向CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(SEQ ID NO：12)的JNK3序列的siRNA分子，SP600125，JNKV抑制剂，JNKVIII抑制剂，SC-202673，SY-CC-401，SP600125，As601245，XG-102，杨梅黄酮，T278ADLK，S281ADLK，K152A DLK，和DLK的亮氨酸拉链结构域)，GSK3β抑制剂(例如，SB415287、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII和氯化锂)，EGFR途径抑制剂(例如，厄洛替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B42/AG490、AG555、AG494、PD168393、SB203580、SB239063、SB202190、SB239069、STO-609和SP600125)，或G-蛋白抑制剂(例如，SCG292676和百日咳毒素)。
在任何上述方法中，施用试剂导致以下疾病的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)症状减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗继发的神经系统病症；由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。这些症状的非限制性实例包括：震颤(tremors)、运动缓慢(slowness of movement)、运动失调(ataxia)、平衡缺失(loss of balance)、抑郁(depression)、降低的认知功能(decreased cognitive function)、短期记忆丧失(short-term memory loss)、长期记忆丧失(long-term memory loss)、意识错乱(confusion)、人格改变(changes in personality)、语言困难(languagedifficulties)、感知觉丧失(loss of sensory perception)、对触觉灵敏(sensitivityto touch)、四肢麻木(numbness in extremities)、肌无力(muscle weakness)、肌肉麻痹(muscle paralysis)、肌肉痛性痉挛(muscle cramps)、肌痉挛(musclespasms)、饮食习惯的明显改变、过度恐惧或忧愁、失眠(insomnia)、妄想(delusions)、幻觉(hallucinations)、疲劳(fatigue)、背痛(back pain)、胸痛(chestpain)、消化问题(digestive problems)、头痛(headache)、快速的心率(rapid heartrate)、头晕(dizziness)、视力模糊(blurred vision)、视力区域的阴影或缺失(shadows or missing areas of vision)、视物变形症(metamorphopsia)、色觉损伤(impairment in color vision)、暴露于强光后视觉功能的降低恢复和视觉对比敏感性丧失。
在任何上述方法中，与不施用所述试剂的受试者的对照群体相比，施用导致患以下疾病的可能性降低至少10％(例如，降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗继发的神经系统病症；由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。
本发明还提供了用于激活神经元或其部分变性的方法。这些方法包括向神经元或其部分施用试剂，所述试剂调节：(i)神经元或其部分中靶蛋白的活性，或(ii)神经元或其部分中的过程。靶蛋白例如可以选自：双亮氨酸拉链激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体、转录因子4(TCF4)或β-联蛋白，而所述过程可以是例如转录或蛋白合成。此外，所述试剂例如可以是靶蛋白或过程的激活剂(在上文列出的靶标情况下，排除腺苷酸环化酶)。在激活上述神经元或其部分变性的方法中，靶蛋白的调节可以是GSK3β的活性或表达升高、β-联蛋白的活性或表达降低和/或TCF4的活性或表达丧失。
本发明还提供了特异性结合DLK的磷酸化形式的纯化的抗体(例如，抗体318、抗体319、抗体320、抗体321或抗体322)和抑制性核酸(例如siRNA)，其包含期望的GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ ID NO：1)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(SEQ ID NO：3)、ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQID NO：5)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)或TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列，所述序列介导DLK表达的降低。
本发明另外提供了调节神经元(例如，小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元或交感神经元)的生长、细胞大小和/或增殖的方法，其中使神经元接触DLK信号传导抑制剂。在这些方法中使用的DLK信号传导抑制剂可以是本文所述的任意DLK信号传导抑制剂(例如，靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、T278ADLK、S281ADLK、K152ADLK和DLK的亮氨酸拉链结构域)。
在某些实施例中，本发明提供了用于抑制或预防中枢神经系统(CNS)神经元或其部分(例如，CNS神经元的轴突或细胞体部分)的变性的方法。这些方法可以包括：向CNS神经元施用抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性(例如，信号传导活性)或表达的试剂。在某些实施例中，所述CNS神经元或其部分是例如选自下述的CNS神经元：小脑颗粒神经元、皮质神经元和海马神经元。在不同的实施例中，所述CNS神经元不是多巴胺能神经元。根据本发明的方法，所述施用可以导致：例如，与未用所述试剂治疗的神经元群体相比，神经元群体的变性减少了至少10％(例如，减少了至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)。
上述试剂可以选自：例如，抗体、短的干扰RNA(siRNA)、多肽、肽体、反义多核苷酸、适配体、小分子和多糖。在抗体的情况下，所述抗体例如可以选自：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。在更具体的实施例中，所述试剂可以选自：靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、DLK的显性失活形式(dominant negative form)、DLK的激酶死亡形式(kinase-dead form)和它们的组合。
本发明的方法可以包括：将试剂施用给离体的CNS神经元。这样的方法可以另外包括：在所述试剂施用后，将所述CNS神经元移植或植入到人患者中。在本发明的方法的其它实施例中，所述CNS神经元存在于人患者中。在这样的方法中，可以在药学上可接受的载体中施用所述试剂。此外，可以通过例如选自下述的途径，进行试剂的施用：肠胃外的、皮下的、静脉内的、腹膜内的、大脑内的、损害内的、肌肉内的、眼内的和动脉内的途径，或通过间质输注，或使用植入式递送装置。此外，本发明的方法可以包括：施用一种或多种另外的药物试剂。
上面关于本发明的方法指出的患者可以具有神经变性疾病或病症(诸如在上面或在本文别处列出的一种或多种神经变性疾病或病症)，或处于发展所述病症的风险中。
根据本发明的方法施用一种或多种试剂，可以导致：(i)JNK磷酸化、JNK活性和/或JNK表达的降低，(ii)cJun磷酸化、cJun活性和/或cJun表达的降低，和/或(iii)p38磷酸化、p38活性和/或p38表达的降低。
本发明还提供了用于减轻或预防神经变性疾病或病症(诸如在上面或在本文别处列出的一种或多种神经变性疾病或病症)的一种或多种症状或减少其进展的方法。这些方法包括：给患者施用本文所述的抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性或表达的试剂。
此外，本发明包括，抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性或表达的一种或多种试剂(参见，例如，在上面或在本文别处列出的试剂)在药物生产中的应用，所述药物抑制或预防中枢神经系统(CNS)神经元或其部分的变性。所述药物可以，例如，减轻神经变性疾病或病症(例如，在上面或在本文别处列出的一种或多种神经变性疾病或病症)的一种或多种症状或发展所述病症的可能性。所述药物可以配制成通过例如选自下述的途径来施用：肠胃外的、皮下的、静脉内的、腹膜内的、大脑内的、损害内的、肌肉内的、眼内的和动脉内的途径，或通过间质输注，或使用植入式递送装置。此外，所述药物还可以包括一种或多种另外的药物试剂。本文所述的一种或多种试剂根据本发明的应用，可以导致：(i)JNK磷酸化、JNK活性和/或JNK表达的降低，(ii)cJun磷酸化、cJun活性和/或cJun表达的降低，和/或(iii)p38磷酸化、p38活性和/或p38表达的降低。
附图说明
图1显示利用抗-NGF抗体处理神经元20小时，导致轴突变性。上排中的两个图像显示在利用和不利用抗-NGF抗体治疗20小时的情况下，利用Tuj1(神经元特异性的β-微管蛋白)抗体显示的神经元。下排的两个图像显示与或不与(对照)50μg/ml抗-NGF抗体温育的情况下，利用肌动蛋白抗体显示的神经元。
图2显示用抗-NGF抗体培养1、3、6、9、12或16小时的神经元中的膨体(varicosity)形成。
图3显示用抗-NGF抗体培养16小时的轴突缺少伸长的线粒体，并显示线粒体在膨体中的累积。
图4显示，在用抗-NGF抗体培养0到48小时的轴突中，微管网络在肌动蛋白或神经丝网络前不进行分解。
图5阐明了沃勒变性(Wallerian degeneration)，其在从神经元细胞体分离的轴突中发生(上图；Raff等人，Science(科学)296(5569)：868-871，2002)，并且表明，与对照(下图；Araki等人，Science(科学)305(5686)：1010-1013，2004)相比，缓慢沃勒变性(WldS)突变体中损伤后的轴突变性的显著延迟。
图6A-6D表明，在基于抗-NGF抗体的NGF撤除测定中，蛋白酶体抑制剂和GSK抑制剂防止轴突变性。
图7A-7D表明，在基于抗-NGF抗体的NGF撤除测定中，p38MAPK抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂防止轴突变性。
图8A-8D表明，在基于抗-NGF抗体的NGF撤除测定中，转录抑制剂和EGFR激酶抑制剂防止轴突变性。
图9A-9D表明，在基于抗-NGF抗体的NGF撤除测定中，JNK抑制剂和Bax通道阻断剂防止轴突变性。
图10A-10D表明，在基于抗-NGF抗体的NGF撤除测定中，Ih通道阻断剂和CAMKK抑制剂防止轴突变性。
图11的图显示了当在NGF撤除(t＝0)或在NGF撤除后3、6、9或12小时加入时，GSK3(30μM SB415286)、EGFR激酶(10μMAG555)、p38MAPK(30μM SB239063)、CAMKK(15μM STO-609)和JNK(10μM SP600125)的抑制剂活性。
图12阐明Campenot室，其中体环境(细胞体环境)与轴突环境是分开的。
图13表明，轴突变性在Campenot室研究中定位，并且在无细胞凋亡的情况下进行，在所述Campenot室研究中，NGF撤除发生在含轴突的室中。通过微管蛋白免疫荧光显示变性。
图14表明，在图13阐明的基于Campenot室的测定中，细胞体区室中没有变性迹象。
图15表明，在存在30μM SB415(GSK抑制剂；GSKi)或15μM ActD(转录抑制剂；TXNi)的情况下，细胞体(左图)而非轴突(右图)受到保护免于局部变性。
图16表明，在存在10μM AG555(EGFR抑制剂；EGFRi)或30μMSB239(p38抑制剂；p38i)的情况下，暴露在抗-NGF抗体中的轴突(右图)而非细胞体(左图)受到保护免于局部变性。
图17的图显示了Campenot室中轴突变性的定量，其中在轴突环境(轴突)或体环境(细胞)中存在或缺少(DMSO)15μM放线菌素D(ActD)、30μM SB415286(SB415)、10μM AG555或30μM SB239063(SB239)的情况下，向轴突环境中加入抗-NGF抗体。
图18是基于来自本文描述的筛选的数据的模型。
图19表明，当在Campenot室中从轴突区室去除NGF时，细胞体显得更小。
图20表明，轴突区室中NGF被剥夺的许多神经元具有增加的胱天蛋白酶-3(caspase-3)切割，并显示核凝缩。(神经元健康可能受膜染料DiI的影响)。
图21的图显示了在细胞体或轴突区室中NGF撤除开始(t＝0)和NGF撤除1、3、6、9和12小时后GSK3的活性(通过磷酸化的GSK3β的水平降低来测定)。
图22的图显示了在细胞体或轴突区室中NGF撤除开始(t＝0)和NGF撤除1、3、6、9和12小时后JNK的活性(通过磷酸化的JNK的水平增加来测定)。
图23表明，当向细胞体区室中加入细胞体抑制剂(30μM SB415(GSKi)和15μM Act D(TXNi))时，观察到具有膨体的大量轴突，以及片段化的轴突。向轴突区室中加入轴突抑制剂(10μM AG555(EGFRi)和30μM SB239(p38i))显示较少的膨体，并且所述轴突似乎直接进行片段化。
图24表明，在用GSK、EGFR和p38抑制剂处理的NGF剥夺神经元中可能具有更多的功能线粒体，但仍然没有伸长的线粒体。
图25表明，GSK抑制剂SB415可在损伤后延迟轴突变性。
图26表明，整体NGF撤除后，10μM或25μM GSK抑制剂阻断轴突变性，但不阻断细胞死亡。
图27表明，与非转基因对照(NTG；左图)相比，EGFR表达在用抗-EGFR抗体(右图)染色的SOD1小鼠(Tg)脊髓切片中增加。
图28表明，EGFR通常在神经元(运动神经元)中表达，并且与非转基因对照(非-Tg)相比，磷酸化的EGFR(pEGFR)的水平在ALS SOD1小鼠模型(SOD1-Tg)中增加。
图29表明，与非转基因对照(非-Tg)相比，轴突数量在ALS SOD1小鼠模型(SOD1-Tg)中减少，并且ALS SOD1模型中磷酸化的EGFR(pEGFR)与轴突部分地共定位。
图30表明，JNK(5μM SP600125)、CaMKK(5μM STO-609)、EGFR(1μM或10μM AG555)、p38(5μM SB239063)和GSK(10μMSB415286)的小分子抑制剂保护小脑颗粒神经元免于血清剥夺/KCl减少。
图31表明，EGFR、GSK、CaMKK、JNK和p38的小分子抑制剂保护海马神经元免于10μM鱼藤酮(rotenone)损害。
图32表明，EGFR、GSK、CaMKK、JNK和p38的小分子抑制剂保护皮质神经元免于10μM鱼藤酮损害。
图33表明，使用对EGFR(左上图)、Her2(右上图)、Her3(左下图)和Her4(右下图)特异性的抗体，通过免疫细胞化学检测背根神经节神经元中轴突上的ErbB受体。
图34表明，使用免疫细胞化学，EGFR在背根神经节神经元的轴突中表达。
图35表明，当加给背根神经节神经元时100μg/mL EGF不诱导轴突变性，而在处理的神经元中加入100μg/mL EGF会诱导ERK的磷酸化。
图36表明，EGFR胞外结构域(50μg/mL)不阻断在背根神经节神经元中的NGF撤除诱导的轴突变性。
图37表明，3.4μM、11.1μM、33.3μM和100μM特罗凯
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(厄洛替尼)阻断在背部脊髓外植体中的变性。
图38表明，在轴突变性中双亮氨酸拉链激酶(DLK)在JNK上游起作用。与用对照质粒或编码激酶死亡DLK(DLK-KD)的质粒模拟品转染的细胞相比，293细胞中编码野生型DLK的质粒的转染导致JNK激活(如通过磷酸化的JNK的升高水平测定)。背根神经节、周边系统神经元中siRNA对DLK表达的敲降(knockdown)，会保护轴突免于NGF撤除诱导的变性。使用定量PCR证实了与对照siRNA(右下图)相比，使用DLKsiRNA对DLK表达的敲降。
图39表明，DLK信号传导的siRNA敲降会延迟局部轴突变性。
图40A和40B描述了这样的实验的结果，所述实验使用相差显微术观察神经元，以评估DLK敲降对NGF撤除诱导的交感神经元变性的影响。
图41表明，与对照siRNA(NT)处理的神经元相比，使用DLK siRNA(DLK)敲降DLK表达，会保护交感神经元免于喜树碱和长春新碱诱导的细胞凋亡。
图42表明，与用编码野生型DLK(DLK)的质粒转染的神经元相比，用编码激酶死亡DLK(KD)的质粒转染交感神经元，会保护神经元免于NGF撤除诱导的细胞凋亡。
图43A-43D显示了这样的实验的结果，所述实验评估实施例15A中描述的抗-pDLK抗体的结合特异性。图43A显示在显性失活DLK和对照激酶MLK3存在下，本文描述的每种抗-pDLK抗体与DLK的结合的蛋白印迹分析。图43B显示抗-pDLK抗体318和319与培养的293T细胞的结合的免疫荧光显微图像，所述293T细胞被DLK(上面两个图像)或对照激酶MLK3(下面两个图像)转化。图43C显示了在用DLK和缺少活性的DLK突变体(T278A和S281A)转染的293细胞中的JNK和磷酸-JNK抗体的蛋白印迹检测。图43D的蛋白印迹表明，与未处理的(对照)皮质神经元相比，用长春新碱处理的皮质神经元中的磷酸化的DLK水平升高。
图44A和44B显示在野生型和SOD1突变体小鼠中疾病末期(图43A)和症状发作(图44B)时抗-pDLK抗体(抗体318)与脊髓切片的结合。图44C描述了在人阿尔茨海默病患者皮质样品中pDLK、pJNK和pcJUN水平的蛋白印迹分析。
图45A和45B描述了这样的实验的结果，所述实验评估DLK沉默对JNK磷酸化的影响，所述影响响应于交感神经元和背根神经节神经元中的NGF撤除应激和皮质神经元中的长春新碱诱导的应激，如实施例15C和实施例14B所述。
图46显示JNK抑制剂对经受NGF撤除应激的DRG外植体的保护效果，如实施例15C所述。
图47描述了这样的实验的结果，所述实验评估在DRG神经元中分别沉默JNK1、JNK2、JNK3以及一起沉默JNK2与JNK3对NGF撤除应激后观察到的轴突变性的影响，如实施例15C中所述。
图48A显示DLK siRNA和对照siRNA对皮质神经元存活的影响。图48B显示DLK siRNA和对照siRNA对交感神经元存活的影响。
图49是一组免疫显微照片，它们显示G偶连蛋白受体的抑制剂(SCH202676；10μM或100μM)的防止DRG中的NGF撤除诱导的变性的能力。
图50是一组免疫显微照片，它们显示SCH 202676(0.1μM或1μM)的防止DRG中的NGF撤除诱导的变性的能力。
图51是一组免疫显微照片，它们显示0.01μg/mL、0.1μg/mL或1μg/mL百日咳毒素(G-蛋白信号传导的抑制剂)的防止DRG中的NGF撤除诱导的变性的能力。
图52是大鼠海马神经元的一组免疫显微照片，它们显示活性突变体GSK(GSK3S9A)、野生型TCF4和突变体失活的TCF4的表达对变性的影响。
图53显示了如在实施例18中所述的N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)处理引起的DLK敲除小鼠中皮质神经元变性的减少。具体地，图53(A)的蛋白印迹显示了在有或没有NMDA处理下，在来自野生型小鼠(WT)、DLK杂合的小鼠(dlk+/-)(HET)和DLK敲除小鼠(DLK KO)的皮质神经元中的DLK、磷酸化的cJun(P CJUN)、磷酸化的p38(P P38)和磷酸化的JNK(P JNK)的水平。图53(B)的图显示了LDH释放测定的结果。与WT和HET神经元相比，观察到在NMDA处理后来自DLK敲除小鼠的皮质神经元的存活增加。
图54显示了DLK的显性失活形式对cJun活化的影响，如实施例19所述。简而言之，给小鼠注射表达GFP(AAV GFP)或DLK的显性失活形式(AAV DLK-LZ)的腺伴随病毒载体。使用免疫组织化学和荧光显微术方法，定量表达磷酸化的cJun(p-cJun)或p-cJun和GFP的神经元。
图55显示了实验的结果，在所述实验中，给小鼠注射AAV GFP或AAV DLK-LZ，然后进行卡英酸诱导的癫痫发作，如在实施例20中所述。在3小时时段内，测量癫痫发作的严重性。
具体实施方式
A.定义
术语“靶标”在本文中用于指这样的蛋白和过程：当受影响其活性的试剂调节时，其抑制或降低轴突变性。当与抑制其活性的试剂接触时，本文描述的大多数靶标抑制或降低轴突变性，但是本发明的靶标还包括当被激活时抑制或降低轴突变性的蛋白和过程。本发明的示例性靶标如下：双亮氨酸拉链激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(Cdk5)、腺苷酸环化酶、c-JunN-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体、转录因子4(TCF4)、β-联蛋白、转录和蛋白合成。在表1中列出了这些靶标中的几种的通用备选命名的选择。所述靶标包括天然的人序列和来自猴子、小鼠、大鼠和其它非人哺乳动物的这些序列的同源物，包括所有天然存在的变体，如可变剪接的和等位的变体与同种型，及其可溶形式。在表1中还提供了示例性的非限制性的序列参照。也可认为额外的序列(包括多种靶标同种型、变体、同源物和片段的序列)是根据本发明的靶标。
表1
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当用于描述本文公开的多种蛋白时，“分离的”表示已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的蛋白。其天然环境的污染物组分是干扰蛋白用途(例如在治疗或抗体制备中的用途)的物质，并可以包括酶、激素和其它蛋白性质的或非蛋白性质的溶质。在不同的实施方案中，将蛋白纯化至：(i)足以通过使用旋杯式序列分析仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，和/或(ii)使用考马斯兰或银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE得到的同质性，和/或(iii)通过质谱或肽谱技术得到的同质性。分离的蛋白包括在重组细胞内的原位蛋白，因为正在讨论的蛋白的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白。本文描述的分离的靶蛋白(或其片段)可用于制备如本文所示的针对所述靶蛋白的抗体。
“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，其在所讨论的核酸的天然来源中通常结合所述至少一种污染物核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现的形式或背景。分离的核酸分子因此与天然细胞中存在的核酸分子区分开。然而，分离的核酸分子包括在通常表达该核酸分子的细胞中含有的核酸分子，其中例如所述核酸分子处于不同于天然细胞的染色体位置中。分离的核酸分子的实例是缺少在天然环境中与其邻近的5′和/或3′侧翼序列的核酸分子。
本文使用的术语“拮抗剂”和“抑制剂”指这样的试剂，其能够阻断、中和、抑制、取消、降低和/或干扰靶标的一种或多种活性，和/或降低本文所述的一种或多种靶蛋白的表达(或编码一种或多种靶蛋白的核酸的表达)。它们包括例如，抗体、多肽、肽、核酸分子、短的干扰RNA(siRNA)和其它抑制性RNA、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、适配体和肽体。本文所述的特定靶标(即除腺苷酸环化酶以外的靶标)的拮抗剂或抑制剂一般抑制或降低轴突变性(例如与未用抑制剂处理的对照相比，降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)，如本文所述。与未用抑制剂处理的靶蛋白的表达和/或活性相比，抑制剂可降低靶蛋白的活性和/或表达至少10％(例如降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至100％)。“DLK信号传导抑制剂”是这样的试剂，其能够降低DLK蛋白(或编码DLK蛋白的核酸)的活性(例如激酶活性)或表达，和/或降低参与DLK信号传导途径的一种或多种蛋白(例如，JNK1、JNK2、JNK3、cJun(例如，cJun-63和cJun-73)、MKK4和MKK7)的活性和/或表达。DLK信号传导抑制剂的实例包括：siRNA分子，其降低编码以下物质的核酸的表达：DLK(例如，期望的，GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ ID NO：1)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(SEQ ID NO：3)、ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQ ID NO：5)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)或TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列)、JNK1(例如靶向TTGGATGAAGCCATTAGACTA(SEQ ID NO：9)的JNK1序列的序列)、JNK2(例如靶向ACCTTTAATGGACAACATTAA(SEQ ID NO：10)或AAGGATTAGCTTTGTATCATA(SEQ ID NO：11)的JNK2序列的序列)、JNK3(例如靶向CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(SEQ ID NO：12)的JNK3序列的序列)、cJun(例如cJun-63和cJun-73)、MKK4和MKK7。DLK抑制剂的额外实例包括：结合DLK蛋白的抗体(例如，识别未磷酸化的或磷酸化的DLK的抗体，如本文描述的317、318、319、320、321和322抗体)、JNK1、JNK2、JNK3、cJun(例如，cJun-63和cJun-73)、MKK4和/或MKK7；JNK活性的抑制剂(例如SC-202673、SY-CC-401、SP600125、JNKV抑制剂、JNKVIII抑制剂、AS601245和XG-102，以及来自EMD BioSciences的目录号420119、420130、420131、420123、420116、420118、420136、420129、420135、420134、420133、420140和420128)；MKK4活性的抑制剂(例如，在WO 04/058764中描述的杨梅黄酮和抑制剂)和MKK7活性的抑制剂(例如在美国专利号7,195,894和WO 04/002532中描述的抑制剂)。DLK抑制剂还可以是DLK蛋白的显性失活形式或激酶死亡形式(例如编码DLK蛋白的显性失活形式或激酶死亡形式的核酸)，如T278A DLK、S281ADLK、S152A DLK和DLK的亮氨酸拉链结构域。
抑制剂的另一实例是“GSK3β抑制剂”。GSK3β抑制剂指这样的试剂，其能够降低GSK3β(或编码GSK3β的核酸)的活性和/或表达，和/或降低一种或多种蛋白(或编码一种或多种蛋白的核酸)的活性和/或表达，所述一种或多种蛋白激活GSK3β，或激活GSK3β的一种或多种底物的表达或活性。GSK3β抑制剂的非限制性实例包括：SB415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII和氯化锂。
抑制剂的额外实例是“G蛋白抑制剂”。G蛋白抑制剂指这样的试剂，其能够降低一种或多种G蛋白或G蛋白偶联受体(GPCR)的活性和/或表达(或编码G蛋白或GPCR的一种或多种核酸的表达)，和/或降低G蛋白或GPCR下游的一种或多种蛋白的活性和/或表达。G蛋白抑制剂的非限制性实例包括：降低编码G蛋白或GPCR的核酸的表达水平的siRNA分子，结合G蛋白或GPCR的抗体或肽体，或抑制G蛋白或GPCR活性的小分子或肽(例如SCH202676和百日咳毒素)。
抑制剂的另一实例是“EGFR途径抑制剂”。EGFR途径抑制剂指这样的试剂，其能够降低EGFR蛋白(或编码EGFR的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中EGFR下游起功能的一种或多种蛋白(例如，p38MAPK、CAMKK和JNK)的活性和/或表达。EGFR途径抑制剂的非限制性实例包括：EGFR的抑制剂(例如，厄洛替尼、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B42/AG 490、AG555、AG494和PD168393)、p38MAPK的抑制剂(例如，SB203580、SB239063、SB202190和SB239069)、CAMK的抑制剂(例如，STO-609)和JNK的抑制剂(例如，SP600125)。EGFR途径抑制剂的额外实例包括：结合EGFR、p38MAPK、CAMKK和/或JNK的抗体和肽体；和降低一种或多种核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码在细胞中EGFR下游起功能的蛋白(例如，EGFR、p38MAPK、CAMKK和/或JNK)。
抑制剂的额外实例是“CAMKβ抑制剂”。CAMKβ抑制剂指这样的试剂，其能够降低CAMKβ蛋白(或编码CAMKβ的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中CAMKβ下游起功能的一种或多种蛋白的活性和/或表达。CAMKβ抑制剂的非限制性实例包括：特异性结合CAMKβ的抗体和肽体，和降低一种或多种核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码CAMKβ或在CAMKβ下游起功能的蛋白。
抑制剂的另一实例是“cdk5抑制剂”。cdk5抑制剂指这样的试剂，其能够降低cdk5蛋白(或编码cdk5的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中cdk5下游起功能的一种或多种蛋白的活性和/或表达。cdk5抑制剂的非限制性实例包括：特异性结合cdk5的抗体和肽体，和降低一种或多种核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码cdk5或在cdk5下游起功能的蛋白。
抑制剂的额外实例是“TCF4抑制剂”。TCF4抑制剂指这样的试剂，其能够降低TCF4蛋白(或编码TCF4的核酸)的活性和/或表达，和/或降低受TCF4蛋白调节的基因的活性和/或表达。TCF4抑制剂的非限制性实例包括：特异性结合TCF4或受TCF4调节的基因编码的蛋白的抗体和肽体，和降低编码TCF4的一种或多种核酸表达或降低受TCF4调节的基因编码的mRNA表达的siRNA分子。
抑制剂的额外实例是“β-联蛋白抑制剂”。β-联蛋白抑制剂指这样的试剂，其能够降低β-联蛋白(或编码β-联蛋白的核酸)的活性和/或表达，和/或降低受β-联蛋白调节的基因的活性和/或表达。β-联蛋白抑制剂的非限制性实例包括：特异性结合β-联蛋白或受β-联蛋白调节的基因编码的蛋白的抗体和肽体，和降低编码β-联蛋白的一种或多种核酸表达或降低受β-联蛋白调节的基因编码的mRNA表达的siRNA分子。
抑制剂的另一实例是“腺苷酸环化酶抑制剂”。腺苷酸环化酶抑制剂指这样的试剂，其能够降低腺苷酸环化酶蛋白(或编码腺苷酸环化酶的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中腺苷酸环化酶下游起功能的一种或多种蛋白的活性和/或表达。腺苷酸环化酶抑制剂的非限制性实例包括：特异性结合腺苷酸环化酶的抗体和肽体，和降低一种或多种核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码腺苷酸环化酶或在腺苷酸环化酶下游起功能的蛋白。腺苷酸环化酶抑制剂的额外实例包括：抑制腺苷酸环化酶活性的小分子(例如，毛喉素和NKH 477)。
本文使用的术语“激动剂”或“激活剂”指这样的试剂，其能够提高或激活本文所述靶标的一种或多种活性，并包括例如，抗体、多肽、肽、核酸分子、短的干扰RNA(siRNA)或其它抑制性RNA、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、适配体和肽体。本文所述的腺苷酸环化酶的激动剂或激活剂一般抑制或降低轴突变性，而认为本文所述的其它特定靶标的激动剂或激活剂可以激活轴突变性。
术语“抗体”在本文中以本领域理解的最广泛意义上使用，并具体地涵盖例如，完整抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段(条件是它们显示希望的生物学活性)和胞内抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即包含在所述群体的各抗体除少量存在的可能天然存在的突变外，是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其指向单抗原位点或表位。此外，与多克隆抗体制剂(其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)不同，每一单克隆抗体指向抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体是有利的，因为可以合成它们，从而它们不受其它抗体的污染。修饰词“单克隆的”表示从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，通过Kohler等人，Nature(自然)256：495，1975首次描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，可以制备根据本发明使用的单克隆抗体。也可使用例如在Clackson等人，Nature(自然)352：624-628，1991和Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597，1991中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的抗体中对应序列相同或同源或属于特定抗体种类或亚类，而链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示想要的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)81：6851-6855，1984)。本文的目的嵌合抗体包括灵长类抗体，其包含来自非人灵长类(例如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，如其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体；线性抗体；和单链抗体分子。
术语“多特异性抗体”在最广泛意义上使用，并具体地涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性(即，能够结合一种或多种生物分子上的超过一个不同表位)。如果所述多特异性抗体结合两个表位，其可命名为“双特异性抗体”。多特异性抗体包括、但不限于，全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体、双特异性双体和三体、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶标上两个或更多不同表位的能力。
“完整”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。在一个实施例中，所述完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区的残基替代，所述人源化抗体具有想要的特异性和亲和力。在某些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。可进行这些修饰，以进一步精炼抗体性能。一般而言，所述人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)，其中所有的或基本上所有的高变环对应非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。所述人源化抗体任选地还包含至少部分免疫球蛋白恒定域(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定域。对于其它细节，参见，例如，Jones等人，Nature(自然)321：522-525，1986；Riechmann等人，Nature(自然)332：323-329，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.(现代结构生物学观点)2：593-596，1992。
当用于本文时，术语“高变区”指抗体可变域的区域，其在序列上是高变的和/或形成结构上确定的环。所述高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的残基24-34、50-56和89-97位残基和重链可变域中的31-35、50-65和95-102位残基；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变域中的26-32、50-52和91-96位残基和重链可变域中的26-32、53-55和96-101位残基；Chothia等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917，1987)。在两种情况下，如下文更详细讨论的，根据Kabat等人(同上)编号可变域残基。“框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区中的残基外的那些可变域残基。
“亲本抗体”或“野生型”抗体是与本文公开的抗体变体相比，包含缺少一种或多种氨基酸序列改变的氨基酸序列的抗体。因此，所述亲本抗体一般具有至少一个高变区，其在氨基酸序列上不同于抗体变体的相应高变区的氨基酸序列。所述亲本多肽可包括：天然序列(即，天然存在的)抗体(包括天然存在的等位变体)，或具有天然存在的序列的预先存在的氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其它改变)的抗体。术语“野生型”、“WT”、“wt”和“亲本”或“亲本的”抗体可互换使用。
本文使用的“抗体变体”或“变体抗体”指具有不同于亲本抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。在一个实施例中，所述抗体变体包含重链可变域或轻链可变域，其具有在自然界中没有发现的氨基酸序列。此类变体与亲本抗体必定具有低于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，所述抗体变体具有这样的氨基酸序列，其与亲本抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有约75％至低于100％，例如约80％至低于100％、约85％至低于100％、约90％至低于100％或约95％至低于100％的氨基酸序列同一性或相似性。所述抗体变体一般是在其一种或多种高变区中或其附近包含一种或多种氨基酸改变的抗体变体。
“氨基酸改变”指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。示例性改变包括插入、替代和缺失。“氨基酸替代”指预定氨基酸序列中现有的氨基酸残基替换成另一个不同的氨基酸残基。
“替换”氨基酸残基指在氨基酸序列中替换或替代另一氨基酸残基的氨基酸残基。所述替换残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。
“氨基酸插入”指向预定氨基酸序列中引入一个或多个氨基酸残基。所述氨基酸插入可包含“肽插入”，在所述情况下向预定氨基酸序列中引入包含肽键连接的一个或多个氨基酸残基的肽。其中所述氨基酸插入包括插入肽，可通过随机诱变产生插入的肽，从而其具有在自然界中不存在的氨基酸序列。“邻近高变区”的氨基酸改变指在高变区的N末端和/或C末端引入或替代一个或多个氨基酸残基，从而至少一个插入的或替换氨基酸残基与正在讨论的高变区的N末端或C末端氨基酸残基形成肽键。
“天然存在的氨基酸残基”是一般选自以下的遗传密码编码的氨基酸残基：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；门冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。
“非天然存在的氨基酸残基”在本文中指除上文列出的那些天然存在的氨基酸残基外的氨基酸残基，其能够共价结合多肽链中邻近的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括：正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如在Ellman等人，Meth.Enzym.202：301-336，1991中描述的那些。为了产生此类非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等人，Science(科学)244：182，1989，和Ellman等人(同上)的方法。简而言之，那些方法包括：利用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制型tRNA，接着进行RNA的体外转录和翻译。
在整个公开内容中，参考Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)(National Institutes ofHealth(国立卫生研究所)，Bethesda，MD，1987和1991)的编号系统。在这些一览表中，Kabat列出了每一亚类抗体的许多氨基酸序列，并列出了该亚类中每一残基位置上最常出现的氨基酸。Kabat使用向列出的序列中每一氨基酸分配残基编号的方法，并且用于分配残基编号的这种方法在本领域中成为了标准。在该说明书中遵循所述Kabat编号方案。为了本发明的目的，向Kabat一览表中不包括的候选抗体氨基酸序列分配残基编号，遵循以下步骤。一般而言，所述候选序列与Kabat中的任何免疫球蛋白序列或任何共有序列比对。可手工地或通过计算机使用通常接受的计算机程序(如Align 2程序)完成比对。可通过使用大多数Fab序列常见的一些氨基酸残基，便利比对。例如，轻链和重链各自通常具有两个半胱氨酸，其具有相同的残基编号；在VL结构域中，两个半胱氨酸通常在残基编号23和88上，而在VH结构域中，两个半胱氨酸通常在编号22和92上。构架残基一般、但不总是具有大概相同数量的残基，然而CDR的大小将是变化的。例如，在来自候选序列的CDR(其比与其比对的Kabat序列中的CDR长)的情况下，通常向残基编号添加后缀，以表示额外残基的插入。对于例如与Kabat序列比对残基34和36，但在它们之间没有残基来与残基35比对的候选序列中，编号35简单地不分配给残基。
本文使用的具有“高亲和力”的抗体是具有纳摩尔(nM)范围或更高范围的KD或解离常数的抗体。“纳摩尔范围或更高”的KD可表示为X nM，其中X是低于约10的数字。
术语“丝状噬菌体”指能够在其表面上展示异源多肽的病毒颗粒，并包括、但不限于：f1、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可含有选择标记，如四环素(例如，“fd-tet”)。多种丝状噬菌体展示系统为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Zacher等人，Gene(基因)9：127-140，1980，Smith等人，Science(科学)228：1315-1317，1985；和Parmley等人，Gene(基因)73：305-318，1988)。
术语“淘选”用于指多轮筛选过程，其用于鉴定和分离携带化合物(如对靶标具有高亲和力和特异性的抗体)的噬菌体。
术语“短的干扰RNA(siRNA)”指干扰基因表达的小的双链RNA。siRNA是RNA干扰的介质，通过所述过程双链RNA沉默同源基因。siRNA通常由长度为约15-25个核苷酸的两条单链RNA(其形成双链体)组成，其可以包括单链突出端。酶促复合体，例如聚合酶对双链RNA的加工导致切割双链RNA，产生siRNA。RNA干扰(RNAi)沉默复合体使用siRNA的反义链来指导mRNA切割，由此促进mRNA降解。例如在哺乳动物细胞中，为了使用siRNA沉默特异基因，选择碱基配对区来避免与不相关mRNA的偶然互补。在本领域中，例如Fire等人，Nature(自然)391：806-811，1998，和McManus等人，Nat.Rev.Genet.3(10)：737-747，2002已经鉴定了RNAi沉默复合体。
术语“干扰RNA(RNAi)”在本文中用于表示双链RNA，其导致特异mRNA的催化降解，并因此可用于抑制/降低特定基因的表达。
本文使用的术语“病症”一般指得益于本发明的试剂或抑制剂治疗的任何病症，包括本文所述靶标的有效量的抑制剂(或激活剂，在腺苷酸环化酶的情况下)治疗的任何疾病或病症。在本文中待治疗的病症的非限制性实例包括：在下文本申请E部分中列出的那些。
本文使用的术语“治疗”和“疗法”指治愈性治疗、预防性治疗和预防性治疗。连续治疗或施用指在至少每日基础上的治疗，在治疗中不中断一天或更多天。间歇治疗或施用或间断方式的治疗或施用指不连续，但自然循环的治疗。本发明方法的治疗可导致疾病或病症的完全缓解或治愈或疾病或病症的一种或多种症状的部分改善，并且可以是暂时性的或永久性的。
本文使用的短语“预防轴突变性”、“预防神经元变性”、“抑制轴突变性”或“抑制神经元变性”包括：(i)在新诊断患有神经变性疾病或处于发生新的神经变性疾病的风险中的患者中抑制或防止轴突或神经元变性的能力，和(ii)在早已患有或具有神经变性疾病症状的患者中抑制或防止其它轴突或神经元变性的能力。防止轴突或神经元变性包括降低或抑制轴突或神经元变性，其特征在于轴突或神经元变性的完全或部分抑制。这可通过例如神经系统功能的分析来评估。上文列出的术语也包括体外和离体方法。此外，短语“防止神经元变性”和“抑制神经元变性”包括完整神经元或其部分，如神经元细胞体、轴突和树突方面的这种抑制。施用本文描述的一种或多种试剂可导致受试者或群体与不接受本文描述的一种或多种试剂的对照受试者或群体相比，以下疾病的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9)症状减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；继在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗之后的神经系统病症；由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病(例如，震颤、运动缓慢、运动失调、平衡缺失、抑郁、降低的认知功能、短期记忆丧失、长期记忆丧失、意识错乱、人格改变、语言困难、感知觉丧失、对触觉灵敏、四肢麻木、肌无力、肌肉麻痹、肌肉痛性痉挛、肌痉挛、食习惯的明显改变、过度恐惧或忧愁、失眠、妄想、幻觉、疲劳、背痛、胸痛、消化问题、头痛、快速的心率、头晕、视力模糊、视力区域的阴影或缺失、视物变形症、色觉损伤、暴露于强光后视觉功能的降低恢复和视觉对比敏感性丧失)。与不施用本文描述的一种或多种试剂的神经元群体或受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量相比，施用本文描述的一种或多种试剂可导致神经元群体或受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)。与不用本文描述的一种或多种试剂治疗的对照受试者或群体相比，施用本文描述的一种或多种试剂可导致受试者或受试者群体中发生以下疾病的可能性降低至少10％(例如，降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；继在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗之后的神经系统病症；由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。
本文使用的术语“施用”指使神经元或其部分与本文描述的抑制剂接触。这包括向存在神经元或其部分的受试者中施用抑制剂，以及向培养神经元或其部分的培养基中引入抑制剂。
本文使用的术语“神经元”表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或体细胞和两种类型的伸展或突出：树突，大多数神经元信号一般通过所述树突传递到细胞体，和轴突，大多数神经元信号一般通过所述轴突从细胞体传递到效应细胞，如靶神经元或肌肉。神经元可将信息从组织和器官传递到中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传入神经元或运动神经元)。命名为中间神经元的其它神经元连接中枢神经系统(大脑和脊柱)内的神经元。经受本发明治疗的神经元类型的某些特定实例包括：小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮质神经元。
本文使用的术语“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、高等非人灵长类、啮齿动物和家畜及耕畜，如奶牛、马、狗和猫。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(同时发生)和以任何顺序连续施用。
“有效量”是足以实现有益的或想要的治疗(包括预防)结果的量。可以一次或多次施用来施用有效量。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，并且所有这些命名包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来自其的培养物，而不考虑传代的次数。也应理解，因为刻意或无意突变，所有后代在DNA含量上不精确地相同。术语“后代”指最初转化的细胞或细胞系随后的每一代的任何和所有后代。包括突变体后代，其具有在最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物学活性。
本文将“小分子”定义为具有低于约1000道尔顿、例如低于约500道尔顿的分子量。小分子可以是有机分子或无机分子，并例如可以从化合物库或天然来源中分离或可以通过已知化合物的衍生获得。
“适配体”是形成特异性结合靶分子(如本文描述的靶标)的三级结构的核酸分子。在本领域中很好地确定了适配体的生产和治疗用途(参见，例如，美国专利号5,475,096)。用于本发明的适配体可以包括修饰的核苷酸(例如，核酸类似物或衍生物)，其在体内是稳定的而不被降解。至少将核酸分子设计成在体内足够稳定充分长的时间，以允许在降解和/或消除前发生治疗作用。作为非限制性实例，这样的核苷酸类似物可选自：硫代磷酸酯、硼代磷酸酯(boranophosphate)、膦酸甲酯和2’-O-甲基类似物，及其类似物。作为特定实例，所述类似物可以是2’-脱氧-2’-氟-RNA(2’-F-RNA)。
“肽体”是连接编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列的肽序列。所述肽序列可来自通过任何方法选择的用于特异性结合的随机化序列，所述方法包括：不但限于，噬菌体展示技术。在一个实施方案中，所选择的多肽可连接编码免疫球蛋白Fc部分的氨基酸序列。特异性结合并调节本文描述的靶标的肽体(导致对神经元变性的抑制)也可用于本发明的方法中。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”指那些盐，其在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触，而没有过分的毒性、刺激、变态反应等，并且与合理的收益/风险比相当。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，Berge等人在J.Pharm.Sci.66：1-19，1977中详细描述了药学上可接受的盐。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过用合适的有机酸与游离碱基反应分离。代表性的酸加成盐包括：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴化物、氢氯化物、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括、但不限于：铵、四甲铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
B.用于鉴定并表征神经元变性的抑制剂的筛选测定
本发明部分地基于这样的发现，在上文A部分中表1列出的靶蛋白和活性(双亮氨酸拉链激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(Cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体、转录因子4(TCF4)、β-联蛋白、转录和蛋白合成)的某些调节剂是神经元(如轴突)变性的有效抑制剂。所述调节剂作为靶蛋白和活性的抑制剂起作用，除腺苷酸环化酶的调节剂外，其为激活剂。神经元或轴突变性的抑制剂在本文中称为“抑制剂”，不管它们对其各自靶标的影响，因为它们是神经元或轴突变性的抑制剂。在本文中它们还称为“试剂”，其调节靶蛋白的活性或神经元或轴突中的活性，导致对神经元或轴突变性的抑制。
本发明包括通过使用本文描述的抑制剂抑制神经元或轴突变性的方法。如下文进一步详细描述，可在体内、如在神经病症或神经系统损伤的治疗中进行所述方法。所述方法还可以在体外或离体进行，如在神经元功能的实验室研究和神经移植物或移植体的治疗中进行。描述了用于鉴定并检测用于本发明的抑制剂后，在下文进一步描述了这些方法。
可用于本发明的抑制剂包括在表2(C部分，下文)中列出的那些(已经在本文描述的测定中显示其防止神经元或轴突变性)，以及本文所述靶标的额外已知抑制剂(参见，例如，表3)。可使用对每一靶标特异性的标准筛选方法鉴定用于本发明的额外抑制剂，如下文概述。这些测定也可用于验证发现具有想要活性的化合物的衍生物的活性，可根据标准的药物化学方法设计所述测定。抑制剂(或激活剂，在腺苷酸环化酶的情况下)被验证为对特定靶标有活性后，可在如本文描述的神经元或轴突变性模型以及适当的动物模型系统中检测所述抑制剂。
如下简单描述了用于鉴定表1列出的靶标的抑制剂，以及用于鉴定并表征神经元或轴突变性的额外抑制剂(其可用于本发明的方法中)的示例性测定。
i)神经元或轴突变性的抑制剂的基于细胞的和体外的测定
在下文实施例中详细描述，并如下简单概述了这样的测定，其用于验证本文所述靶标的抑制剂也抑制神经元或轴突变性，还用于鉴定神经元或轴突变性的额外抑制剂。这些测定包括：(i)抗-神经生长因子(抗-NGF)抗体测定，(ii)血清剥夺/氯化钾(KCl)减少测定，(iii)鱼藤酮变性测定，和(iv)长春新碱变性测定。本领域已知的用于评估神经元或轴突变性的额外测定也可用于本发明中。
NGF是参与靶神经元分化和存活的小的分泌蛋白。利用NGF处理培养的神经元导致轴突增殖，而利用抗-NGF抗体处理这些神经元导致轴突变性。利用抗-NGF抗体处理神经元也导致若干不同的形态变化，其可通过显微镜检测到，并且可监测所述变化以观察候选抑制剂的效果。在实施例1中进一步描述和例如在图1-4中阐明的这些变化包括膨体形成、伸长的线粒体丢失、膨体中线粒体的累积、细胞骨架分解和轴突片段化。认为对抗抗-NGF抗体诱导的任何形态变化的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，需要时，可以在额外系统(如本文描述的那些系统)中检测所述试剂。
血清剥夺/KCl减少测定基于使用从小鼠(例如，P7小鼠)脑中分离的小脑颗粒神经元(CGN)的培养物。在该测定中，在包含KCl的培养基中培养所述神经元，然后转换到含有更少KCl的培养基中(包含5mM KCl的Eagles基本培养基)，其诱导神经元变性。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂在KCl撤除后阻断或降低神经元变性(例如可通过神经元标志物(例如，抗类型IIIβ-微管蛋白)染色的固定神经元的图像分析检测所述KCl撤除后神经元变性的阻断或降低)，需要时，可以在额外系统(如本文描述的那些系统)中检测所述试剂。
神经元或轴突变性的另一模型包括：将培养的神经元与鱼藤酮((2R，6aS，12aS)-1，2，6，6a，12，12a-六氢-2-异丙烯基-8，9-二甲氧基苯并吡喃并[3，4-b]呋喃并(2，3-h)苯并吡喃-6-酮)接触，所述鱼藤酮是在若干植物的根和茎中天然存在的灭害剂和杀虫剂，当注射到大鼠中时，其干扰线粒体电子传递，并引起帕金森病样症状。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂阻断或降低在鱼藤酮存在下培养的神经元变性，例如可通过例如神经元特异性的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像分析，检测在鱼藤酮存在下培养的神经元变性的阻断或降低，需要时，可以在额外系统(如本文描述的那些系统)中检测所述试剂。
神经元或轴突变性的额外模型包括：将培养的神经元与长春新碱接触，所述长春新碱是结合微管蛋白二聚体并防止微管结构装配的生物碱。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂阻断或降低在长春新碱存在下培养的神经元变性，例如可通过例如针对神经元特异性的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像分析检测长春新碱存在下培养的神经元变性的阻断或降低，需要时，可以在额外系统(如本文描述的那些系统)中检测所述试剂。
除了上文描述的测定(其读出是神经元或轴突变性的抑制)，本发明还使用针对检测表1中列出的靶标的抑制剂的测定，其读出是例如靶结合或靶活性。因此，本发明包括使用用于表1中列出的靶标的抑制剂的筛选测定，可设计所述测定来鉴定结合靶标或与靶标形成复合体或以其它方式干扰其活性的化合物。所述筛选测定包括易于高通量筛选化学文库的测定，使得它们适合用于鉴定小的分子药物候选物。一般地，使用结合测定和活性测定。可以多种形式，包括、但不限于激酶测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定，如测定为合适的基于主题靶标，进行所述测定。
在结合测定中，相互作用是结合，并且可在反应混合物中分离或检测形成的复合体。在特定实施方案中，靶多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着一般通过用多肽溶液包被固体表面并干燥来完成。或者，固定的抗体，例如对待固定的靶多肽特异性的单克隆抗体可用于将其锚定到固体表面上。通过向固定组分，例如含有锚定组分的包被表面加入未固定组分进行测定，可通过可检测的标记来标记所述未固定组分。当反应完成时，例如通过洗涤去除不反应的组分，并检测锚定在固体表面上的复合体。当最初未固定的组分携带可检测标记时，对固定在表面上的标记的检测表明形成了复合体。当最初未固定的组分不携带标记时，例如可通过使用特异性结合固定复合体的标记抗体检测复合体形成。
如果候选化合物是与靶标相互作用但不结合靶标的多肽，可通过众所周知用于检测蛋白-蛋白相互作用的方法测定所述靶标与各多肽之间的相互作用。此类测定包括常规方法，如交联、共免疫沉淀和通过梯度或层析柱的共纯化。此外，可通过使用Chevray等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)89：5789-5793，1991公开的Fields和同事(Fields等人，Nature(自然)(London)340：245-246，1989；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)88：9578-9582，1991)描述的基于酵母的遗传系统，监测蛋白-蛋白相互作用。许多转录激活子，如酵母GAL4由两个物理上分离的模块结构域组成，一个作为DNA结合域起作用，另一个作为转录激活域行使功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(一般称为“双杂交系统”)利用该性质优势，并使用两个杂合蛋白，其中一个靶蛋白融合到GAL4的DNA结合域上，另一个候选物激活蛋白融合到激活域上。GAL1-lacZ报告基因在GAL4-激活启动子控制下的表达依赖于GAL4活性通过蛋白-蛋白相互作用的重建。利用β-半乳糖苷酶的生色底物，检测含有相互作用多肽的菌落。可通过商业途径从Clontech获得完整试剂盒(MATCHMAKERTM)，其使用双杂交技术鉴定两种特异蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。该系统还可延伸到定位涉及特定蛋白相互作用的蛋白结构域，并精确找到对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
可如下检测干扰靶标与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物。一般在允许两种产物相互作用的条件下和时间里制备含有靶标与细胞内或细胞外组分的反应混合物。为了检测候选化合物抑制靶标相互作用的能力，在缺少和存在测试化合物的情况下进行反应。此外，可向第三种反应混合物中加入安慰剂，以作为阳性对照。
用于测量候选抑制剂对蛋白激酶活性的影响的测定为本领域所知，并包括直接磷酸化测定，通常通过放射性标记的磷酸盐、针对底物的磷酸化特异性抗体和测量激酶活性下游影响(例如报告基因的激活)的基于细胞的测定解释。除基于荧光偏振的备选测定外，这些主要的策略中的两个可用于以小规模或高通量形式鉴定、验证或表征抑制剂(参见，例如，Favata等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)273：18623-18632，1998；Parker等人，J.Biomol.Screening 5：77-99，2000；Singh等人，Comb.Chem.High Throughput Screen 8：319-325，2005；Garton等人，Meth.Enz.(酶学方法)439：491-500，2008；和Kupchko等人，Anal.Biochem.317：210-217，2003)。
本文特别讨论的筛选测定仅为阐明目的。可根据筛选的拮抗剂候选物的特定靶标和类型(例如，抗体、多肽、肽、非肽有机小分子、核酸分子等)选择的多种其它测定为本领域技术人员所熟知，并也可以用于本发明中。
本文描述的测定可用于筛选化合物文库，其包括、但不限于：化学文库、天然产物文库(例如，微生物、动物、植物等的集合)，以及由随机肽、寡核苷酸或有机小分子组成的组合文库。在特定的实施方案中，本文的测定用于筛选抗体文库，其包括、但不限于：首次用于实验的人的、重组的、合成的和半合成的抗体文库。所述抗体文库例如可以是噬菌体展示文库，包括单价文库，其在每个噬菌体颗粒上展示平均一个单链抗体或抗体片段和多价文库，其在每个病毒颗粒上展示平均两个或更多抗体或抗体片段。然而，待根据本发明筛选的抗体文库不限于噬菌体展示文库。其它展示技术包括例如，核糖体或mRNA展示(Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)91：9022-9026，1994；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院报)94：4937-4942，1997)、微生物细胞展示如细菌展示(Georgiou等人，Nature Biotech.(自然生物技术)15：29-34，1997)或酵母细胞展示(Kieke等人，Protein Eng.10：1303-1310，1997)、在哺乳动物细胞上的展示、孢子展示、病毒展示如逆转录病毒展示(Urban等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)33：e35，2005)、基于蛋白-DNA连接的展示(Odegrip等人，Proc.Acad.Natl.Sci.U.S.A.101：2806-2810，2004；Reiersen等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)33：e10，2005)和微珠展示(Sepp等人，FEBS Lett.532：455-458，2002)。
可在轴突变性的体外和/或体内测定中证实在本文的初级结合/相互作用测定中获得的结果。或者，轴突变性的体外和/或体内测定可用作初级测定来鉴定本文所述的抑制剂和拮抗剂。
ii)神经元或轴突变性的动物模型
用于本发明的体内测定包括多种神经变性疾病的动物模型，如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化(例如，小鼠中的实验性自身免疫性脑炎(EAE))的动物模型。此外，可使用脊髓和外伤性脑损伤模型。如下描述了可用于表征用于本发明的抑制剂的体内测定的非限制性实例。
在肌萎缩性侧索硬化(ALS)的情况下，表达突变形式的超氧化物歧化酶1(SOD1)的转基因小鼠概括了ALS的表型和病理学(Rosen等人，Nature(自然)362(6415)：59-62，1993)。除SOD1小鼠外，已经开发了肌萎缩性侧索硬化(ALS)的若干小鼠模型，并且其可用于本发明中。这些包括运动神经元变性(Mnd)、进行性运动神经病(pmn)、摇晃者(wobbler)(Bird等人，Acta Neuropathologica 19(1)：39-50，1971)和TDP-43突变体转基因小鼠(Wegorzewska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，2009年10月15日电子公开)。此外，已经产生了犬模型，并且其可用于本发明中(犬遗传性脊髓性肌萎缩(HCSMA))。
刺激帕金森病的病原性、组织学、生物化学和临床特征的动物模型(可用于表征用于本发明方法的抑制剂)包括利舍平(兔；Carlsson等人，Nature(自然)180：1200，1957)；甲基苯丙胺(啮齿动物和非人灵长类；Seiden等人，Drug Alcohol Depend 1：215-219，1975)；6-OHDA(大鼠；Perese等人，Brain Res.(脑研究)494：285-293，1989)；MPTP(小鼠和非人灵长类；Langston等人，Ann.Neurol.46：598-605，1999)；百草枯/代森锰(小鼠；Brooks等人，Brain Res.(脑研究)823：1-10，1999，和Takahashi等人，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.66：167-170，1989)；鱼藤酮(大鼠；Betarbet等人，Nat.Neurosci.(自然神经科学)3：1301-1306，2000)；3-硝基酪氨酸(小鼠；Mihm等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)21：RC149，2001)；和突变的α-突触核蛋白(小鼠和果蝇；Polymeropoulos等人，Science(科学)276：2045-2047，1997)模型。
遗传修饰的动物，包括小鼠、苍蝇、鱼和蠕虫，已经用于研究阿尔茨海默病背后的致病机制。例如，对β-淀粉状蛋白转基因的小鼠发生了与阿尔茨海默病一致的记忆缺陷(
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等人，Mol.Psychiatry 9：664-683，2004)。这些模型可用于表征抑制剂。
本领域使用若干动物模型来研究中风，包括小鼠、大鼠、沙鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪和猴子。大多数局部脑缺血模型涉及一条主要的大脑血管(如大脑中动脉)阻塞(参见，例如，Garcia，Stroke 15：5-14，1984，和Bose等人，Brain Res.(脑研究)311：385-391，1984)。任何这些模型也可用于本发明中。
C.神经元或轴突变性的抑制剂
如下文实施例中进一步描述，下文表2中列出的化合物鉴定为神经元或轴突变性的抑制剂。抑制(或激活，在腺苷酸环化酶的情况下)表2中列出的靶标和过程的这些化合物以及其它试剂(参见，例如，表3)可用于本发明抑制神经元或轴突变性的方法中。
表2
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表3
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D.制备神经元或轴突变性的抗体抑制剂
可通过本领域已知的方法(包括重组DNA技术)生产通过本发明的结合和活性测定鉴定的抗体。
(i)抗原制备
任选地缀合其它分子的可溶性抗原或其片段可用作生产抗体的免疫原。对于跨膜分子，如受体，这些分子的片段(例如，受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达所述跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可来自天然来源(例如，癌细胞系)或可以是已经通过重组技术转化以表达所述跨膜分子的细胞。在表1中涉及到本发明的靶标的示例性序列，并且其可用于抗原的制备中，用于制备用于本发明的抗体。用于制备抗体的其它抗原及其形式对本领域技术人员而言是显而易见的。
(II)多克隆抗体
通常在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生产多克隆抗体。可使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCI2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原缀合到蛋白上，所述蛋白在待免疫的物种中是具有免疫原性的，例如钥孔戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并在多个位点经皮内注射溶液，将动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。1个月后，利用弗氏完全佐剂中1/5到1/10初始量的肽或缀合物在多个位点经皮下注射加强动物。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体效价。对动物进行加强，直至效价达到平台。用相同抗原的缀合物(但缀合到不同的蛋白和/或通过不同的交联试剂)对动物进行加强。缀合物也可在重组细胞培养物中制备为蛋白融合物。同样，凝集剂(如明矾)适合用于增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
使用Kohler等人，Nature(自然)256：495，1975首次描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，可以制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)，以引发淋巴细胞，其生产或能够生产特异性结合用于免疫的蛋白的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页，Academic Press，1986)。
在含有一种或多种物质的合适培养基中接种并培养如此制备的杂交瘤细胞，所述物质抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
示例性骨髓瘤细胞是通过所选抗体产生细胞有效融合、支持稳定高水平抗体生产，并对培养基如HAT培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。其中，认为使用的特定骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，如来自从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Salk Institute Cell Distribution Center可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和从美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)可得到的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.(免疫学杂志)133：3001，1984；Brodeur等人，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术和应用)，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
测定其中生长杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的生产。通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))，测定杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。
鉴定杂交瘤细胞后，可通过有限稀释方法亚克隆所述克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，第59-103页，Academic Press，1986)，所述杂交瘤细胞生产具有想要的特异性、亲和力和/或活性的抗体。用于该目的的合适培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为动物中的腹水肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)，从培养基、腹水或血清中适当分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规方法(例如通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因)，容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为该DNA的来源。一旦分离，将DNA置于表达载体中，其然后转移到宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不生产免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在下文更详细地描述抗体的重组生产。
在另一个实施方案中，可从使用例如McCafferty等人，Nature(自然)348：552-554，1990描述的技术生产的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。
Clackson等人，Nature(自然)352：624-628，1991和Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597，1991描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类和人类抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology 10：779-783，1992)以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)21：2265-2266，1993)来生产高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选。
也可修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替换同源鼠类序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)81：6851，1984)，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接免疫球蛋白编码序列。
通常，此类非免疫球蛋白多肽替换成抗体的恒定域或它们替换成抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合的二价抗体，其包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。可基本根据Winter及其同事(Jones等人，Nature(自然)321：522-525，1986；Riechmann等人，Nature(自然)332：323-327，1988；Verhoeyen等人，Science(科学)239：1534-1536，1988)的方法，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变域已经被替换成非人物种的相应序列。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基替换为啮齿动物抗体中类似位点上的残基。
待用于制备人源化抗体中的人轻链和重链可变域的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体可变域的序列。然后接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296，1993；Chothia等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901，1987)。另一方法使用特定的构架，其来自轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)89：4285，1992；Presta等人，J.Immnol.(免疫学杂志)151：2623，1993)。
更重要的是，抗体进行人源化，对抗原保持高的亲和力和其它有用的生物学性质。为了实现该目标，根据示例性方法，通过分析亲本序列和多种概念上的人源化产物的过程，使用亲本和人源化序列的三维模型制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，并且其为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其阐明并展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现想要的抗体特征，如对靶抗原提高的亲和力。一般而言，CDR残基直接并最实质地参与影响抗原结合。
或者，目前可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在缺少内源免疫球蛋白产生的情况下生产人抗体的所有组成成分。例如，已经描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体生产的完全抑制。该种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因排列的转移将导致在抗原攻击时生产人抗体。参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)90：2551，1993；Jakobovits等人，Nature(自然)362：255-258，1993；Bruggermann等人，Yearin Immunol.7：33，1993；和Duchosal等人，Nature(自然)355：258，1992。人抗体也可来自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227：381，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597，1991；Vaughan等人，Nature Biotech.(自然生物技术)14：309，1996)。在下文中进一步描述了从抗体噬菌体文库生产人抗体。
(v)抗体片段
已经开发了多种技术用于生产抗体片段。通常，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化得到(参见，例如，Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Meth.24：107-117，1992和Brennan等人，Science(科学)229：81，1985)。然而，现在可通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，并经化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等人，Bio/Technology10：163-167，1992)。在下文实施例中描述的另一实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的装配来形成F(ab′)2。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。用于生产抗体片段的其它技术对技术人员而言是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见WO 93/16185)。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两个不同表位具有结合特异性，其中所述表位一般来自不同的抗原。尽管此类分子通常仅结合两个不同表位(即，双特异性抗体，BsAb)，当在本文中使用时，该表述也包括具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域所知。全长双特异性抗体的常规制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature(自然)305：537-539，1983)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)生产10种不同抗体分子的潜在混和物，其中仅一个具有正确的双特异性结构。一般通过亲和层析步骤完成正确分子的纯化是非常繁琐的，并且产物产量也低。在WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659，1991中公开了类似的方法。根据不同的方法，具有想要的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变域融合到免疫球蛋白恒定域序列上。融合可以是与免疫球蛋白重链恒定域，其包含至少部分铰链、CH2和CH3区。在至少一个融合中存在第一个重链恒定区(CH1)，其含有轻链结合必需的位点。编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当用于构建的不等比例的三条多肽链提供最佳产量时，这在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例中提供极大的灵活性。然而，当等比例的至少两条多肽链表达导致高产量或当比例没有特别重要性时，可以在一个表达载体中插入两条或所有三条多肽链的编码序列。
在该方法的一个实施例中，双特异抗体由在一条臂中具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现该不对称结构促进想要的双特异性化合物从不想要的免疫球蛋白链组合中分离，因为仅一半双特异性分子中免疫球蛋白轻链的存在提供容易的分离方式。在WO 94/04690中公开了该方法。对于生产双特异性抗体的其它详细信息，参见，例如，Suresh等人，Methods Enzymol.(酶学方法)121：210，1986。
根据WO 96/27011中描述的另一方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比达到最大。所述界面可包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，来自第一个抗体分子的界面的一条或更多小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链来在第二个抗体分子的界面上产生与所述大侧链相同或相似大小的互补“腔”。这为相对于其它不想要的终产物(如同源二聚体)提高异源二聚体的产量提供了机理。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的抗体之一可偶联抗生物素蛋白，另一个偶联生物素。例如已经提议此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360和WO 92/200373)。可使用任何便利的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂为本领域所熟知，并与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
已经在文献中描述了从抗体片段生产双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等人，Science(科学)229：81，1985描述了这样的方法，其中将完整抗体经蛋白水解切割产生F(ab′)2片段。在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠下将这些片段还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键形成。所产生的Fab′片段然后转化成硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物之一然后通过巯基乙胺还原转化成Fab′-硫醇并与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定化酶的试剂。
Fab′-SH片段也可以直接从大肠杆菌中回收，并可进行化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)175：217-225，1992描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的制备。每一Fab′片段分别从大肠杆菌分泌并在体外进行直接化学偶联，以形成所述双特异性抗体。
也已经描述了直接从重组细胞培养物中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)148(5)：1547-1553，1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接两个不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区进行还原形成单体，然后被重新氧化形成抗体异源二聚体。也可利用该方法生产抗体同源二聚体。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)90：6444-6448，1993描述的“双体”技术已经为制备双特异性抗体片段提供了备选机制。所述片段包含通过接头连接轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，所述接头太短以致于不能在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。也已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略(参见Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)152：5368，1994)。
预见到多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tuft等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60，1991)。
(vii)效应子功能改造
期望修饰用于本发明的抗体的效应子功能，以增强抗体的有效性。例如，可在Fc区引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域中形成链间二硫键。因此产生的同源二聚体抗体可能具有提高的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC；参见Caron等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)176：1191-1195，1992和Shopes，J.Immunol.(免疫学杂志)148：2918-2922，1992)。使用如Wolff等人，Cancer Research(癌症研究)53：2560-2565，1993中描述的异双功能交联剂，也可制备具有提高的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。或者，可改造抗体，其具有二元Fc区，并由此具有增强的补体裂解和ADCC能力(参见Stevenson等人，Anti-CancerDrugDesign(抗癌药物设计)3：219-230，1989)。
(viii)抗体-补救受体结合表位融合
在本发明的某些实施方案中，期望使用抗体片段，而不是完整抗体，例如来提高血脑屏障穿透。在该情况下，期望修饰所述抗体片段，以提高其血清半衰期。这例如可通过向抗体片段中掺入补救受体结合表位(例如通过在抗体片段中适当区域的突变或通过向肽标签中掺入表位，然后例如通过DNA或肽合成将所述肽标签在任一末端或中间融合到所述抗体片段上)来实现。
所述补救受体结合表位可构成这样的区域，其中来自Fc结构域的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置中。在另一实施例中，转移来自Fc结构域的一个或两个环的三个或更多氨基酸残基，而在其它实施例中，从(例如IgG的)Fc区的CH2结构域获取表位，并转移到抗体的CH1、CH3或VH区或多于一个这样的区域中。或者，可从Fc区的CH2结构域获取表位，并转移到抗体片段的CL区或VL区或两个区域中。
(ix)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。它们可通过化学合成或通过酶促或化学切割抗体(如果适用)来生产。通过使抗体的靶定氨基酸残基与有机衍生试剂反应来向分子中引入抗体的其它类型的共价修饰，所述有机衍生试剂能够与所选的侧链或N或C末端残基反应。共价修饰的实例描述于美国专利号5,534,615中，其明确引入作为参考。抗体的一种类型共价修饰的一个实例包括：以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中阐明的方式将抗体连接到多种非蛋白性的聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)之一上。
(x)从合成的抗体噬菌体文库生产抗体
在其它实施方案中，本发明可使用这样的方法，其使用噬菌体展示方法生产并选择新的抗体。所述方法包括：基于单个构架模板生产合成的抗体噬菌体文库，在可变域内设计足够的多样性，展示具有多元化可变域的多肽，选择对靶向抗原具有高亲和力的候选抗体，并分离所选的抗体。
噬菌体展示方法的细节例如可见于WO 03/102157中，其完整公开内容特别地通过引用并入本文。
在一个实施例中，可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂易接近的和/或高度不同的位置来生产用于本发明的抗体文库。可使用本文提供的方法突变一些或所有CDR。在有些实施方案中，可通过突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单一文库，或通过突变CDRL3和CDRH3中的位置形成单一文库，或通过突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单一文库，从而产生不同的抗体文库。
例如可产生抗体可变域的文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3的溶剂易接近的和/或高度不同的位置中具有突变。可产生另一文库，其在CDRL1、CDRL2和CDRL3中具有突变。这些文库也可用于彼此结合来产生具有期望亲和力的结合子。例如，一轮或更多轮选择重链文库对靶抗原的结合后，轻链文库可替换到重链结合子的群体中，用于其它轮的筛选，以提高结合子的亲和力。
可通过用重链序列的可变区的CDRH3区中的变体氨基酸替代原始氨基酸来产生文库。所得文库可含有多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区域中。
在一个实施例中，在人源化抗体4D5序列或人源化抗体4D5序列的构架氨基酸序列的背景中产生文库。可通过用具有DVK密码子组编码的氨基酸替换重链的至少95-100a位残基来产生文库，其中DVK密码子组用于编码每一个这些位置的一组变体氨基酸。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)7。在有些实施方案中，通过用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸替代95-100a位残基来产生文库。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)6(NNK)。在另一实施方案中，通过用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸替代至少95-100a位残基来产生文库。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)5(NNK)。用于产生这些替代的寡核苷酸组的另一实例包含序列(NNK)6。可通过本领域技术人员根据本文描述的标准确定合适寡核苷酸序列的其它实例。
在另一实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力的结合子并分离多种表位的结合子。在该文库中产生的CDRH3的长度范围在11到13个氨基酸，尽管也可产生不同于该长度范围的长度。可通过使用NNK、DVK和NVK密码子组，以及N和/或C末端的更多有限多样性扩展H3多样性。
也可在CDRH1和CDRH2中产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循靶向模拟本文所述的具有修饰的天然抗体所有组成成分的策略，所述设计与先前的设计相比将多样性聚焦在更密切匹配天然多样性上。
对于CDRH3中的多样性，可分别构建具有不同长度H3的多个文库，然后进行组合以选择靶抗原的结合子。可使用先前和下文描述的固相支持体选择和溶液分选方法混和并分选多个文库。可使用多种分选策略。例如，一种变型包括在结合固体的靶标上分选，然后分选在融合多肽上存在的标签(例如，抗-gD标签)，并且随后在结合固体的靶标上进行另一次分选。或者，可在结合固体表面的靶标上第一次分选文库，然后使用结合降低浓度的靶抗原的溶液相分选洗脱的结合子。利用不同分选方法的组合提供了使仅高度表达序列选择的最小化，并提供选择大量不同的高亲和力克隆。
可从文库中分离靶抗原的高亲和力结合子。H1/H2区域中的有限多样性降低简并性约104到105倍，并且允许更多的H3多样性提供更高亲和力的结合子。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(例如利用DVK或NVT)提供分离结合子，其可结合靶抗原的不同表位。
在从如上所述合并文库分离的结合子中，已经发现可通过在轻链中提高有限的多样性进一步提高亲和力。在该实施方案中如下产生轻链多样性，在CDRL1中：28位氨基酸由RDT编码；29位氨基酸由RKT编码；30位氨基酸由RVW编码；31位氨基酸由ANW编码；32位氨基酸由THT编码；任选地，33位氨基酸由CTG编码；在CDRL2中：50位氨基酸由KBG编码；53位氨基酸由AVC编码；任选地，55位氨基酸由GMA编码；在CDRL3中：91位氨基酸由TMT或SRT或两者编码；92位氨基酸由DMC编码；93位氨基酸由RVT编码；94位氨基酸由NHT编码；并且96位氨基酸由TWT或YKG或两者编码。
在另一实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区域中具有多样性的文库或多个文库。在该实施方案中，使用多种长度的H3区和使用最初密码子组XYZ和NNK或NNS产生CDRH3中的多样性。可使用各寡核苷酸形成文库并混和或者可混和寡核苷酸以形成文库亚组。可针对结合固体的靶标分选该实施方案的文库。可使用ELISA测定筛选从多次分选分离的克隆的特异性和亲和力。对于特异性，可针对想要的靶抗原以及其它非靶抗原筛选克隆。然后在溶液结合竞争ELISA测定或点竞争测定中筛选靶抗原的那些结合子的亲和力。可利用如上文描述制备的XYZ密码子组从文库中分离高亲和力结合子。这些结合子可在细胞培养中容易地产生为高产量的抗体或抗原结合片段。
在有些实施方案中，期望产生CDRH3区的长度具有更大多样性的文库。例如，期望产生CDRH3区在约7到19个氨基酸之间变化的文库。
在细菌和真核细胞培养物中以高产量容易地生产从这些实施方案的文库中分离的高亲和力结合子。可设计载体，以容易地去除序列如gD标签、病毒外壳蛋白组成序列，和/或在恒定区序列中添加，以提供全长抗体或抗原结合片段的高产量生产。
在CDRH3中具有突变的文库可与含有变体形式的其它CDR，例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，CDRH3文库与在人源化4D5抗体序列的背景中使用预定密码子组产生的CDRL3文库组合，所述人源化4D5抗体序列在位置28、29、30、31和/或32上具有变体氨基酸。在另一实施方案中，CDRH3具有突变的文库可与包含变体CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，利用在位置28、30、31、32和33上具有变体氨基酸的人源化抗体4D5序列产生CDRH1文库。使用预定密码子组，利用在位置50、52、53、54、56和58上具有变体氨基酸的人源化抗体4D5的序列产生CDRH2文库。
(xi)抗体突变体
可进一步修饰从噬菌体文库产生的抗体，以产生具有优于亲本抗体的提高的物理、化学和/或生物学性质的抗体突变体。其中所用的测定是生物学活性测定时，在所选的测定中抗体突变体可具有这样的生物学活性，其比该测定中亲本抗体的生物学活性高至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、有时候至少约100倍或200倍。例如，抗-靶标抗体突变体可对靶标具有这样的结合亲和力，其比亲本抗体的结合亲和力强至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、有时候至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，可在亲本抗体的一种或多种高变区中引入一种或多种氨基酸改变(例如替代)。或者或此外，可在亲本抗体中引入构架区残基的一种或多种改变(例如替代)，其中这些改变导致抗体突变体对来自第二种哺乳动物物种的抗原的结合亲和力提高。待修饰的构架区残基的实例包括：直接非共价结合抗原(Amit等人，Science(科学)233：747-753，1986)；与CDR的构象相互作用/影响CDR的构象(Chothia等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917，1987)；和/或参与VL-VH界面(EP 239400B1)的那些。在某些实施方案中，一种或多种此类构架区残基的修饰导致抗体对来自第二种哺乳动物物种的抗原的结合亲和力增强。例如，在本发明的该实施方案中可改变约1到约5个构架残基。有时候，这足以产生适合于临床前试验的抗体突变体，即使其中没有高变区残基被改变。然而通常，抗体突变体将包含额外的高变区改变。
可随机改变经改变的高变区残基，尤其是其中亲本抗体的初始结合亲和力是使得可容易地筛选此类随机产生的抗体突变体。
用于产生此抗体突变体的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham等人，Science(科学)244：1081-1085，1989)。在这里，用丙氨酸或聚丙氨酸残基替换一个或多个高变区残基，以影响氨基酸与第二种哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在替换位点上引入进一步的或其它突变改进对替换显示功能敏感性的那些高变区残基。因此，尽管预定了用于引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质不需要预定。筛选如此产生的丙氨酸突变体的本文所述的生物学活性。
通常以保守置换，如在下面标题“优选置换”下显示的那些保守置换开始。如果此类置换导致生物学活性(例如，结合亲和力)的改变，那么引入更实质性改变(表4中命名为“示例性置换”或下文参考氨基酸类别进一步描述)并筛选产物。
表4
通过选择置换完成抗体生物学性质的甚至更多实质性修饰，所述置换在其维持以下的效果上显著不同：(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点上分子的电荷或疏水性或(c)侧链体积。根据共有的侧链性质，天然存在的残基划分为以下组：
(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳族的：trp、tyr、phe。
非保守置换将使得这些类别之一的成员交换成另一类别的成员。
在另一实施方案中，使用噬菌体展示使选择用于修饰的位点变成亲和力成熟的(参见上文)。
通过本领域已知的多种方法制备编码氨基酸序列突变体的核酸分子。这些方法包括、但不限于：寡核苷酸介导(或定点)诱变(参见，例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)82：488，1985)、PCR诱变和表达盒诱变早期制备突变体或非突变体形式的亲本抗体。
在某些实施方案中，抗体突变体将仅具有置换的单个高变区残基。在其它实施方案中，亲本抗体的两个或更多高变区残基已经被例如约2到约10个高变区置换所置换。
通常，具有提高的生物学性质的抗体突变体将具有这样的氨基酸序列，其与亲本抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列同一性或相似性，例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性或相似性。该序列的同一性或相似性本文定义为，比对序列并在需要时引入空位以实现最大百分比序列同一性后，相同(即，相同残基)或相似(即，基于共有侧链性质的相同组的氨基酸残基，参见上文)的候选序列中氨基酸残基与亲本抗体残基的百分比。可变域外抗体序列的N末端、C末端或中间延伸、缺失或插入都不理解为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上指出，这涉及测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选其对抗原或其片段的结合亲和力。从该初次筛选中选择的一种或多种抗体突变体任选地经受一种或多种其它生物学活性测定，以证实具有增强的结合亲和力的抗体突变体对于例如临床前研究的确有用。
通常根据抗体的期望用途，对如此选择的抗体突变体可进行进一步的修饰。此类修饰可以包括氨基酸序列的进一步改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰，如下文详细说明的那些。对于氨基酸序列改变，上文详细说明了示例性修饰。例如，不参与维持抗体突变体正确构象的任何半胱氨酸残基一般也被丝氨酸所置换，以提高分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反地，可向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性(特别是其中所述抗体是抗体片段，如Fv片段时)。另一类型的氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过消除抗体中的一个或多个碳水化合物部分和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点来实现。抗体的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因而，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在，会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖与羟氨基酸、最通常为丝氨酸或苏氨酸的连接，尽管还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列，使得它含有一个或多个上述的三肽序列，可以方便地向抗体添加糖基化位点(对于N-连接的糖基化位点)。通过向原始抗体的序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，也可以做出改变(对于O-连接的糖基化位点)。
(xii)抗体的重组生产
对于抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸并将其插入复制载体中用于进一步的克隆(扩增DNA)或用于表达。使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括、但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列(例如，在美国专利号5,534,615中描述的，其特别地通过引用并入本文)。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适的原核生物包括：真细菌属(eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratiamarcescans、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一个示例性大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，尽管其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株是在本文中通常可获得并且有用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、K.wickeramii(ATCC 24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、K.drosophilarum(ATCC 36，906)、K.thermotolerans和K.marxianus；子囊菌酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentali)；和丝状真菌，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium和曲霉菌属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于糖基化抗体表达的合适的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括：植物和昆虫细胞。已经从宿主，如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(果蝇)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)中鉴定了许多杆状病毒菌株和变体，以及相应的许可性昆虫宿主细胞。可公开获得用于转染的多种病毒菌株，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且此类病毒可用作本文本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，并且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为了常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen.Virol.36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)77：4216，1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-25，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猿肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于抗体生产，并且在适当时改良的常规营养培养基中进行培养，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码想要的序列的基因。
可在多种培养基中培养用于生产本发明使用的抗体的宿主细胞。市售培养基，如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，在下述文献中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基：Ham等人，Meth.Enz.(酶学方法)58：44，1979、Barnes等人，Anal.Biochem.102：255，1980，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利号Re.30,985。必要时，可用激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM)、痕量元素(定义为一般以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源，补充这些培养基中的任一种。也包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充物。培养条件(如温度、PH等)是选择用于表达的宿主细胞使用的那些条件，并对普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、周质空间内产生或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去特定的细胞碎片(宿主细胞或裂解的细胞)。当抗体分泌到培养基中时，一般首先使用市售蛋白浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：1-13，1983)。推荐G蛋白用于全部小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.5：1567-1575，1986)。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但也可获得其它基质。与使用琼脂糖可实现的相应值相比，机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可获得用于蛋白纯化的其它技术，如在离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的层析、在肝素SEPHAROSETM上的层析、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
E.神经元或轴突变性的抑制剂的应用
本文描述的靶标的抑制剂，如在本文描述的筛选测定中鉴定或表征的抑制剂(例如，上文描述的特定抑制剂)可用于抑制神经元或轴突变性的方法中。所述抑制剂因此用于以下的治疗中，例如：(i)神经系统的病症(例如，神经变性疾病)，(ii)继在神经系统外具有主要效果的疾病、病症或治疗之后的神经系统病症，(iii)由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关的神经变性，(vi)记忆丧失和(vii)精神疾病。下文提供了这些疾病、病症和损伤中的一些的非限制性实例。
可根据本发明预防或治疗的神经变性疾病和病症的实例包括：肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝耳麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征(例如，突出的、破裂的和脱垂的圆盘综合征)、颈椎病、神经丛病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉病、轻度认知缺损、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、帕金森叠加病(例如，多系统萎缩、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性)、雷维小体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病(例如，吉兰-巴雷综合征和多发性硬化)、进行性神经性腓骨肌萎缩症(CMT；也称作遗传性运动和感觉神经病(HMSN)、遗传性感觉运动神经病(HSMN)和腓侧肌萎缩)、朊病毒病(例如，克-雅病、格-施-沙综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)和牛海绵样脑病(BSE，通常称为疯牛病))、皮克病、癫痫和艾滋病痴呆综合征(也称作HIV痴呆、HIV脑病和HIV-相关的痴呆)。
本发明的方法也可用于预防和治疗眼相关的神经变性和相关疾病和病症，如青光眼、格子状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光感受器变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病和视神经炎。可根据本发明的方法预防或治疗的不同类型的青光眼的非限制性实例包括：原发性青光眼(也称为原发性开角型青光眼、慢性开角型青光眼、慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼)、低眼压性青光眼、原发性闭角型青光眼(也称为原发性闭角型青光眼、狭角性青光眼、瞳孔阻滞青光眼和急性充血性青光眼)、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角闭角型青光眼、色素性青光眼、脱落性青光眼(也称为假性脱落性青光眼或囊膜性青光眼)、发育性青光眼(例如，原发性先天性青光眼和婴儿青光眼)、继发性青光眼(例如，炎性青光眼(例如，眼色素层炎和Fuchs异色性虹膜睫状体炎))、晶状体溶解性青光眼(例如，具有成熟白内障的闭角型青光眼、继晶状体囊破裂后的晶状体过敏性青光眼、因对晶状体有毒的网眼阻塞引起的晶状体溶解性青光眼和晶状体不全脱位)、眼内出血继发的青光眼(例如，眼前房出血和溶血性青光眼，也称为红细胞破碎青光眼)、外伤性青光眼(例如，房角退缩性青光眼、前房角上的外伤性萎缩、术后青光眼、无晶状体性瞳孔阻滞和睫状体阻滞性青光眼)、新生血管性青光眼、药物诱导的青光眼(例如，皮质类固醇诱导的青光眼和α-糜蛋白酶青光眼)、中毒青光眼和眼内瘤相关性青光眼、视网膜脱离、眼睛的严重化学灼伤和虹膜萎缩。
可根据本发明的方法治疗的疼痛类型的实例包括与以下病症相关的那些：慢性痛，纤维肌痛，脊柱痛，腕管综合征，来自癌症、关节炎的疼痛、坐骨神经痛，头痛，来自手术、肌肉痉挛的疼痛，背痛，内脏痛，来自损伤的疼痛，牙痛，神经痛如神经源性疼痛或神经性疼痛，神经炎症或损伤，带状疱疹，椎间盘突出，韧带撕裂和糖尿病。
在神经系统外具有主要效果的某些疾病和病症可导致对神经系统的损伤，可根据本发明的方法治疗所述损伤。此类病症的实例包括：例如由糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎、肾功能异常、科罗拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、结节病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮和淀粉样变性引起的外周神经病或神经痛。
此外，本发明的方法可用于治疗神经损伤，如外周神经病，其由暴露于有毒化合物引起，所述有毒化合物包括重金属(例如，铅、砷和汞)和工业溶剂以及药物，包括化学治疗剂(例如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(例如，齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、利托那韦和氨普那韦)、降胆固醇药(例如，洛伐他汀、吲达帕胺和吉非贝齐)、心脏或血压药物(例如胺碘酮、肼屈嗪、哌克昔林)和甲硝唑。
本发明的方法也可用于治疗由物理、机械或化学损伤引起的神经系统损伤。因此，所述方法可用于治疗由物理损伤(与例如烧伤、创伤、手术和意外伤害相关的)、局部缺血、冷温度的延长暴露(例如，冻伤)引起的外周神经损伤，以及因例如中风或颅内出血(如脑出血)对中枢神经系统的损伤。
此外，本发明的方法可用于预防或治疗记忆丧失，例如年龄相关性记忆丧失。受丧失影响并因此根据本发明治疗的记忆类型包括情节记忆、语义记忆、短时记忆和长时性记忆。可根据本发明治疗的与记忆丧失相关的疾病和病症包括轻度认知缺损、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、化学疗法、应激、中风和外伤性脑损伤(例如，震荡)。
本发明的方法也可用于治疗精神病症，包括例如，精神分裂症、妄想性障碍、情感分裂性精神障碍、精神分裂症、分享性精神障碍、精神病、偏执型人格障碍、精神分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、自恋性人格障碍、强制性障碍、妄想、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社会恐怖、创伤后应激障碍、焦虑障碍和冲动控制障碍(例如，偷窃狂、病理性赌博、放火狂和拔毛发狂)。
除了上文描述的体内方法，本发明的方法可用于治疗离体的神经，其可在神经移植物或神经移植体的背景中有用。因此，本文描述的抑制剂可用作培养基的成分，用于在体外培养神经细胞。
通过将具有想要程度的纯度的抑制剂(如小分子或抗体)与任选的冻干饼或水溶液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混和(参见，例如，参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版)，A.Gennaro编，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，制备本文描述的抑制剂的治疗制剂用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对接受者无毒，并可以包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、BHA和BHT；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；盐形成平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如Tween、Pluronics或PEG。
待用于体内施用的抑制剂必须无菌，其可在冻干和重建之前或之后通过无菌过滤膜进行过滤来完成。可将治疗组合物置于具有无菌存取口的容器中，例如，静脉内溶液包或小瓶，其具有可用皮下注射针头刺穿的塞子。
抑制剂可任选地彼此或与已知用于治疗相关疾病或病症的其它试剂组合或施用。因此，在治疗ALS中，例如，抑制剂可与利鲁唑(力如太)、米诺环素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和/或甲基钴胺素组合施用。在另一实施例中，在治疗帕金森病中，抑制剂可与L-多巴、多巴胺激动剂(例如，溴隐亭、培高利特、普拉克索、罗匹尼罗、卡麦角林、阿扑吗啡和利舒脲)、多巴脱羧酶抑制剂(例如，左旋多巴、苄丝肼和卡比多巴)和/或MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰和雷沙吉兰)组合施用。在其它实施例中，在治疗阿尔茨海默病中，抑制剂可与乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、加兰他敏和利斯的明)和/或NMDA受体拮抗剂(例如，美金刚)组合施用。组合治疗可以包括同时或连续施用，通过本领域技术人员确定为合适的相同或不同途径。本发明还包括药物组合物和试剂盒，其包括本文描述的组合。
除了上文指出的组合，本发明中包括的其它组合是不同神经元区变性的抑制剂的组合。因此，本发明包括这样的试剂的组合，其：(i)抑制神经元细胞体的变性，并(ii)抑制轴突变性。如下文进一步描述，发现GSK和转录的抑制剂防止神经元细胞体变性，而EGFR和p38MAPK的抑制剂防止轴突变性。因此，本发明包括GSK和EGFR(和/或p38MAPK)的抑制剂的组合、转录抑制剂和EGFR(和/或p38MAPK)的组合，以及下述物质的抑制剂的其它组合：双亮氨酸拉链激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38MAPK、EGFF、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、In通道、钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体、转录因子4(TCF4)和β-联蛋白。用于这些组合的抑制剂可以是本文描述的那些抑制剂的任一种或这些靶标的其它抑制剂。
根据已知方法选择施用抑制剂的途径，例如通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌肉内、眼内、动脉内或损害内途径注射或输注、局部施用或通过如下描述的缓释系统。
对于大脑内使用，可通过向CNS的流体贮器中输注来连续施用化合物，尽管快速浓注也可以接受。可向脑室中施用抑制剂或向CNS或脊髓液中引入抑制剂。可通过使用留置导管和连续施用工具(如泵)来进行施用，或其可以通过植入、例如大脑内植入缓释的载体来施用。更尤其是，可通过长期植入的插管或在渗透微泵的帮助下长期输注来注射抑制剂。可获得皮下泵，其通过小的管道向脑室中递送蛋白。高度复杂的泵可通过皮肤重新填入，并且可在没有外科手术的情况下设置其递送速率。合适的施用方案和递送系统的实例是，用于向如Harbaugh，J.Neural Transm.Suppl.24：271，1987；和DeYebenes等人，Mov.Disord.2：143，1987描述的阿尔茨海默病患者和帕金森病的动物模型施用多巴胺、多巴胺激动剂和胆碱能激动剂的那些，所述实施方案和递送系统涉及皮下泵装置或通过全植入递药系统连续脑室内输注。
缓释制剂的合适实例包括：成形物品形式的半透性聚合物基质，例如膜或微囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547，1983)、聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167，1981；Langer，Chem.Tech.12：98，1982)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988A)。缓释组合物也包括脂质体包被的化合物，其可通过本身已知的方法制备(Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)82：3688，1985；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)77：4030，1980；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324A)。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单室类型，其中脂含量高于约30摩尔％胆固醇，调整所选比例用于最佳治疗。
治疗上使用的活性化合物的有效量将取决于例如，治疗目标、施用途径和患者的病症。因此，如需要获得最佳的治疗效果，治疗学家必须滴定剂量并改进施用途径。取决于上文提及的因素，典型的每日剂量可在例如约1μg/kg至100mg/kg或更高范围内(例如，约1μg/kg至1mg/kg、约1μg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约5mg/kg至约200mg/kg、约50mg/kg至约150mg/mg、约100mg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约400mg/kg和约200mg/kg至约400mg/kg)。通常，临床医师将施用活性抑制剂，直至达到这样的剂量，其导致治疗的疾病或病症的一种或多种症状改善或最好消除。可通过常规测定容易地监测该治疗的进程。本文提供的一种或多种试剂可一起施用或在不同时间施用(在施用第二种试剂之前施用一种试剂)。使用不同技术向受试者施用一种或多种试剂(例如经口施用一种试剂，而经过肌肉内注射或鼻内施用第二种试剂)。可施用一种或多种试剂，从而所述一种或多种试剂同时对受试者具有药理学效果。或者，可施用一种或多种试剂，从而在施用一种或多种种第二次施用的试剂(例如，1、2、3或4种第二次施用的试剂)之前，第一次施用的试剂的药理学活性失效。
可通过任何合适的手段，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和需要时用于局部治疗的损害内施用，施用本发明的抗体(和辅助治疗剂)。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下施用。此外，可通过脉冲输注，尤其是以减少剂量的抗体施用所述抗体。可通过任何合适途径，例如部分根据施用是暂时的还是长期的，通过注射，如静脉内或皮下注射进行给药。
可在制备和施用抗体的过程中考虑用于本发明的抗体结合靶标的定位。当所述结合靶标是细胞内分子时，本发明的某些实施方案提供待引入细胞中的抗体或其抗原结合片段，所述结合靶标位于所述细胞中。在一个实施方案中，本发明的抗体可在细胞内表达为胞内抗体。本文使用的术语“胞内抗体”指这样的抗体或其抗原结合部分，其在细胞内表达并能够选择性结合靶分子，如在下述文献中所述：Marasco，Gene Therapy(基因治疗)4：11-15，1997；Kontermann，Methods 34：163-170，2004；美国专利号6,004,940和6,329,173；美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO 03/077945。可通过向靶细胞中引入核酸来实现胞内抗体的细胞内表达，所述核酸编码想要的抗体或其抗原结合部分(缺少与编码该抗体或抗原结合片段的基因正常结合的野生型前导序列和分泌信号)。可使用向细胞中引入核酸的任何标准方法，其包括、但不限于：显微注射、轰击注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体，和利用反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和携带目的核酸的疫苗载体进行的转染。
在另一实施方案中，提供中和抗体。抗体可具有某些特征，其增强向细胞中递送抗体，或可以进行修饰以具有此类特征。用于实现此目的的技术为本领域所知。例如，已知抗体的阳离子化促进其吸收到细胞中(参见，例如，美国专利号6,703,019)。脂转染或脂质体也可用于向细胞递送抗体。在使用抗体片段的情况下，特异性结合靶蛋白的结合域的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计肽分子，其保留结合靶蛋白序列的能力。可化学合成和/或通过重组DNA技术生产此类肽(参见，例如，Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)90：7889-7893，1993)。
可通过本领域已知的方法增强调节剂多肽向靶细胞的进入。例如，某些序列，如来自HIV Tat或Antennapedia同源结构域蛋白的那些序列，能够指导异源蛋白穿过细胞膜的有效吸收(参见，例如，Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)96：4325-4329，1999)。
当结合靶标定位在脑中时，本发明的某些实施方案提供抗体或其抗原结合片段穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障的渗透性增加相关，从而所述抗体或其抗原结合片段可容易地被引入脑中。当所述血脑屏障保持完整时，存在几种技术领域已知的方法用于转运分子通过所述血脑屏障，其包括、但不限于：物理方法、基于脂类的方法和基于受体和通道的方法。
转运抗体或其抗原结合片段通过血脑屏障的物理方法包括、但不限于：完全包围所述血脑屏障或通过在所述血脑屏障中产生开口。包围方法包括、但不限于：向脑直接注射(参见，例如，Papanastassiou等，Papanastassiou等人，Gene Therapy(基因治疗)9：398-406，2002)、间隙输注/对流增强递送(参见，例如，Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)91：2076-2080，1994)和在脑中植入递送装置(参见，例如，Gill等人，Nature Med.9：589-595，2003；和Gliadel WafersTM、GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括、但不限于：超声(参见，例如，美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and itsManipulation(血脑屏障的意义及其处理)，第1卷和第2卷，Plenum Press、N.Y.，1989))、通过例如缓激肽或透化剂A-7的透化(参见，例如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)和利用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨立血脑屏障的神经元(参见，例如，美国专利公开号2003/0083299)。
转运抗体或抗原结合片段穿过血脑屏障的基于脂类的方法包括、但不限于：在偶联抗原结合片段的脂质体中包装抗体或抗原结合片段，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0025313)，和在低密度脂蛋白颗粒中包被抗体或抗原结合片段(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0204354)或载脂蛋白E(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0131692)。
转运抗体或抗原结合片段穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括、但不限于：使用糖皮质类固醇阻断剂以增加血脑屏障的渗透性(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾离子通道(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0073713)；利用转铁蛋白包被抗体和调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0129186)，和使抗体阳离子化(参见，例如，美国专利号5,004,697)。
以与良好学实践一致的方式配制、给药和施用用于本发明方法的抗体组合物。在该上下文中考虑的因素包括被治疗特定病症、治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病症、病症的原因、试剂的递送位点、施用方法、施用的安排和医学从业者已知的其它因素。抗体不需要是，但任选地，以目前用于预防或治疗正在讨论的病症的一种或多种试剂配制。此类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明的抗体的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其它因素。这些通常以相同剂量、本文所述的施用途径或本文描述的约1-99％的剂量或以任何剂量和通过经验/临床测定为合适的任何途径使用。
对于疾病的预防或治疗，抗体(当单独使用或与其它试剂组合使用时)的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程、施用抗体用于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医师的考虑。一次性地或在系列治疗过程中适当地向患者施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或更多次单独施用或通过连续输注。一次典型的日剂量根据上文提及的因素从约1μg/kg到100mg/kg或更高范围内变化。对于在若干天或更长时间里的重复施用，根据病症，一般维持治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)的一次或多次剂量。可间歇地，例如每周或每三周(例如，从而所述患者接受约两份至约二十份、或例如约六份剂量的抗体)施用此类剂量。可施用初始较高的负荷剂量，然后是一份或更多份较低的剂量。示例性剂量方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，然后是约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。可通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。
F.神经元或轴突变性的激活
本发明还包括用于激活或增强神经元或轴突变性的方法。这可通过使用上文表2中列出的一种或多种试剂的激活剂或激动剂来完成(除腺苷酸环化酶外，所述抑制剂可用于激活神经元或轴突变性)。因此，下述物质的激动剂可用于激活或增强轴突变性的方法中：双亮氨酸拉链激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性的激酶5(Cdk5)、c-Jun N-端激酶(JNK)、BCL2-相关的X蛋白(Bax)、Ih通道和钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶激酶(CaMKK)。可在如本文描述的轴突变性的测定中鉴定或表征此类激动剂。因此，例如，候选激动剂可存在于这样的培养基中，其中在存在神经生长因子下培养神经元并评估其对变性的影响。神经元或轴突变性的激动剂可用于预防和治疗疾病或病症(包括癫痫和自闭症)，以及可通过轴突修剪和变性的自然过程的失败表征的任何疾病或病症。可配制激动剂，并使用如上文E部分中描述的那些方法向需要该治疗的受试者施用。
G.制成品
在本发明的另一方面，提供制成品(例如，药物组合物或试剂盒)，其含有用于治疗或预防上文描述的障碍和病症的材料。所述制成品包括容器和容器上面或结合容器的标签或包装插页。合适的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器等。可从多种材料如玻璃或塑料制造容器。所述容器装有组合物，其自身或当与另一组合物组合时对治疗或预防所述病症有效，并可具有无菌存取口(例如，该容器可以是静脉内溶液包或小瓶，其具有可用皮下注射针头刺穿的塞子)。所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的抑制剂。所述标签或包装插页说明所述组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制成品可以包括：(a)其中含有组合物的第一个容器，其中所述组合物包括本发明的抑制剂；和(b)其中含有组合物的第二个容器，其中所述组合物包括另一治疗剂。本发明该实施方案中的制成品还可以包括包装插页，其说明所述组合物可用于治疗特定病症。或者或此外，所述制成品还可以包括第二个(或第三个)容器，其包括药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其还包括从商业和用户角度希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
通过以下非限制性实施例阐明了本发明的其它细节。
H.实施例
如以上所讨论的，神经元或轴突变性是许多神经退行性疾病的常见特征，并且还作为神经系统损伤或创伤的结果而发生。然而，才刚开始了解调节该活动过程的机制。根据使用不同的神经元或轴突变性模型的研究，似乎依赖于病症或损伤的本质，不同机制可能参与了该过程。为了进一步对调节神经元或轴突变性的事件进行表征，筛选了靶向于神经元或轴突变性模型中已知的信号途径的小分子化合物的文库。鉴定到了多种信号途径对于神经元或轴突变性是必需的。值得注意的是，鉴定到大量激酶是神经元或轴突变性的介质，并且进一步的机制研究将不同激酶的功能定位到轴突或胞体区室上。在其它变性范例中研究这些途径也得到了相似的结果，说明共同的分子机制导致了神经元或轴突的自破坏。在以下实施例中描述了这些实验。
实施例1
神经元或轴突变性模型
在下文描述的实验(包括抗-NGF抗体、血清剥夺/KCl减少和鱼藤酮处理测定)中使用本文描述的神经元或轴突变性的三个模型，在上文中引入所述模型与测定的描述相结合，所述测定可用于鉴定并表征神经元或轴突变性的抑制剂。
如上描述，用NGF处理培养的神经导致轴突增殖，而用抗-NGF抗体处理此类神经导致轴突变性(图1)。用抗-NGF抗体处理神经元导致可通过显微镜检测到的若干不同形态变化。例如，在轴突片段化之前，在与抗-NGF抗体一起培养的神经中形成膨体，并且，在某些情况下会出现破裂(图2)。在另一实施例中，与抗-NGF抗体一起培养的轴突缺少伸长的线粒体并且在膨体中显示线粒体累积，提示轴突运输受到阻断。在轴突片段化的数小时中显著数目的线粒体仍具活性(图3)。其它实例涉及细胞支架分解。轴突切断术后，微管网络在肌动蛋白和神经微丝网络解体前发生解体。相反，在NGF撤除模型中，微管网络在肌动蛋白或神经微丝网络前不发生解体(图4)。
轴突变性的另一模型为沃勒变性，其由轴突中损伤的发生诱导，该损伤发生将轴突与细胞体分开(图5)(参见，例如，Raff等人，Science(科学)296(5569)：868-871，2002)。与野生型对照相比，在缓慢沃勒变性(Wlds)突变体中，轴突变性显著延迟(图5；Araki等人，Science(科学)305(5686)：1010-1013，2004)。Wlds突变体的效应是轴突自毁机制存在的证据，该机制在Wlds突变体中被削弱。Wlds在NGF撤除后保护轴突，但不阻止细胞凋亡。
在实施例2-4(抗-NGF抗体)、实施例7(血清剥夺/KCl减少)和实施例8和9中(鱼藤酮处理)提供关于抗-NGF抗体、血清剥夺/KCl减少和鱼藤酮处理测定的额外信息。
实施例2
筛选神经元或轴突变性的抑制剂
在神经元或轴突变性的抑制剂的筛选中，使用上文实施例1中描述的抗-NGF抗体模型。检测超过400个小分子的文库(Tocris BioScience)，来观察哪一个(如果有的话)调节在抗-NGF抗体存在下观察到的变性。
方法和材料
解剖小鼠E13.5胚并将其置于L15培养基(Invitrogen)中。从胚上切下附着DRG的脊髓。将附着DRG的脊髓置于冰上的L15培养基+5％山羊血清(Gibco)中。用钨针取出DRG，并去除剩余的脊髓。用加有25ng/mlNGF(Roche)的N3-F12溶液(23ml Ham’s F12、1ml N3补充物和1ml 1M葡萄糖)填充八孔载玻片。(通过稀释N3100X浓缩液制备N3补充物，通过如下顺序混合以下成分来制备浓缩液：5.0ml汉克缓冲盐水溶液(HBSS；无Ca、Mg；Invitrogen)、1.0ml牛血清白蛋白(10mg/ml，在HBSS中＝150μm)、2.0ml转铁蛋白(T1147-1G，人，100mg/ml，在HBSS中＝1.1mM)、1.0ml亚硒酸钠(S9133-1MG，0.01mg/ml，在HBSS中＝58μM)、0.4ml二盐酸腐胺(P5780-5G，80mg/ml，在HBSS中＝500mM)、0.2ml黄体酮(P8783-5G，0.125mg/ml，在无水乙醇中＝400μM)、0.02ml皮质酮(C2505-500MG，2mg/ml，在无水乙醇中＝5.8mM)、0.1mltriiodothyonine钠盐(T6397-100MG，0.2mg/ml，在0.01N NaOH中＝300μM)、0.4ml胰岛素(I6634-250MG，牛胰腺，241U/mg，25mg/ml，在20mM HCl中＝4.4mM)，总体积为10.02ml(可储存于-20℃)。通过混合下述物质，制备N3补充物贮存液：10ml Pen/Strep(100X，Gibco)、10ml谷氨酰胺(200mM，Gibco)、10ml MEM维生素(100X，Gibco)、10ml N3浓缩液(100X，参见上文)，总体积为40ml。使用0.22μm滤器将混合物过滤除菌，并将l-2ml等分试样储存于-20℃)。
将DRG对半切开，并放置在8室载玻片(BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃，Becton Dickinson)的每个孔中心。在室温允许DRG附着到载玻片上5-10分钟，随后在37℃温育过夜。加入抗-NGF抗体之前，以100μM(上排)或10μM(下排)的浓度加入所选的抑制剂。将抗-NGF抗体以25μg/ml的浓度加入到载玻片的右半边(4个孔)。37℃温育20小时后，通过将250μl的固定溶液直接加入到250μl的培养基中，用30％蔗糖/8％低聚甲醛(PFA)固定载玻片。(为了制备30％蔗糖/8％PFA溶液，将以下成分加入到包括搅拌棒的600ml烧杯中：250ml 16％PFA(目录号15710-S，Electron Microscopy Sciences)、50ml 10X PBS pH 7.4和150g蔗糖。在低热下混合溶液直至溶解，随后加入6-8滴1M NaOH，使pH达到7.4。在刻度量筒中用水将体积补充为500ml。充分混合溶液，放入等分试样中，并冷冻)。固定载玻片30分钟，随后用PBS洗涤一次。在室温用在0.1％Triton和1％山羊血清中的肌动蛋白染料(Alexa-568缀合的鬼笔环肽；1∶40；Invitrogen)、膜染料(DiO；1∶200；Invitrogen)和DNA染料(Hoechst 33258；1∶10,000；Invitrogen)标记所有细胞2小时。去除染色液，并用PBS洗涤载玻片一次，并用130μl封固剂(Fluoromount G；Electron Microscopy Sciences)和24x 60mm no.1盖玻片(VWR)封片。
结果
在这些实验中，NGF撤除后对照神经元(如肌动蛋白染色所见)经历显著变性。相比而言，在某些小分子存在下，NGF撤除后仍维持轴突的完整性。图6-10显示了对蛋白酶体抑制剂和GSK抑制剂(图6)、p38MAPK抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂(图7)、转录抑制剂和EGFR激酶抑制剂(图8)、JNK抑制剂和Bax通道阻断剂(图9)和Ih通道阻断剂和CaMKK抑制剂(图10)的这些研究结果。在表5中显示了发现保护免于神经变性的特定化合物和相应靶标的实例，其与上文表2相似，只是它还包括对关于一些化合物进行的观察结果的评论列。
表5
Figure BDA0000155526810000781
Figure BDA0000155526810000791
实施例3
生长因子撤除后对抑制剂添加时间的表征
进行研究来评估当在NGF撤除后不同时间点添加时抑制剂的活性。具体而言，进行实验来确定开始NGF剥夺后的最后一个时间点，在所述时间点上候选激酶可被抑制以终止轴突变性。
方法和材料
在本研究中使用的原代细胞为Charles River CD-1E13背根神经节(DRG)。在N3/F12(+25ng/ml NGF)培养基(Ham’s F12(23ml)、N3补充物(1ml)、葡萄糖(1ml 1M葡萄糖贮存液)、25ng/ml神经生长因子2.5S、于Ham’s F12中的小鼠(Roche 11362348001)(贮存液：50μg/ml，-80℃)，使用前过滤除菌)中维持细胞。所述实验也使用BDBiocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃8孔室的载玻片(BD 354688)和24x60mm No.1盖玻片(VWR48393106)。
在L15培养基中解剖胚(解剖工具浸泡于70％的异丙醇中，并且将盘放置于冰上：10cm盘(每盘四个胚)及一个用于脊髓的6cm盘)。将E13.5脊髓取出到DMEM+10％FBS中。从脊髓上分离下＞128个DRG，并用钨针将其对半切开。用250μl N3/F12(25ng/ml NGF)填充8孔载玻片。将切开的DRG置于5μl体积中(约4个/孔)。在室温允许附着～10分钟，随后将DRG于37℃温育过夜。使用以下条件检测抑制剂。在22小时时加入25μg/ml抗-NGF抗体。在加入抗-NGF后T＝0、1、3、6、9和12小时加入抑制剂(加入1.25μl抑制剂；来自总混合物的5μl等分试样至-20℃；在12μl DMSO中的18μl；在24μl DMSO中的6μl；在12μl DMSO中的18μl；在21μl DMSO中的9μl；在24μl DMSO中的6μl)。通过加入抑制剂并轻轻摇动，进行混合。对照为+/-抗-NGF(+1.25μl DMSO)，并且一式两份进行实验。
25小时后，向250μl培养基中加入250μl 30％蔗糖/8％PFA保持30分钟。用1x PBS洗涤载玻片(终止：4℃)。如下进行免疫荧光检测。首先，在室温在5％BSA/0.2％Triton中进行封闭30分钟。在4℃在2％BSA中用第一抗体(Tuj1(1∶1,000))温育载玻片过夜。用lx PBS洗涤载玻片，并加入第二抗体(山羊抗-小鼠488；1∶200)。在室温在黑暗中用第二抗体温育载玻片1小时。用在PBS中的1∶10,000Hoescht洗涤载玻片10分钟，在玻璃copland中用PBS洗涤5分钟，在毛巾上敲打至中度干燥，用200μl的fluoromount G封片，并保存于4℃。在所有相同设置(即曝光时间)下拍照。也基于轴突从细胞体上脱离来评估变性速率。
结果
这些研究表明，即使在NGF撤除后几小时(3、6、9和12小时)内加入，抑制剂依然具有保护作用(图11)。轴突得分为从1至10刻度上的轴突健康得分(0＝看起来像抗-NGF对照；10＝看起来像NGF对照；5＝看起来像0小时时加入激酶抑制剂)。在这些研究中使用的抑制剂列于表6中。
表6
Figure BDA0000155526810000811
实施例4
化合物关于定位变性的表征
使用Campenot室进一步分析在实施例2中鉴定为抑制轴突变性的化合物。Campenot室允许体环境和轴突环境分开，并允许诱导定位变性(见图12和，例如Zweifel等人，Nat.Rev.Neurosci.6(8)：615-625，2005)。在此室中，轴突变性定位并进行，而没有细胞凋亡(图13和图14)。
材料和方法
通过在水中洗涤来清洁特氟隆分隔器(Tyler Research)，并擦拭干净不残留任何油脂。随后在Nochromix(Godax Laboratories)/硫酸中将分隔器浸润过夜，在高压灭菌的蒸馏水(SQ水)中冲洗5次，煮沸30分钟，并在风干后使用。
将小鼠层粘连蛋白(5μg/ml，于无菌过滤水中；Invitrogen)加入到PDL包被的35mm盘(BD BioSciences)中，并将它们在37℃温育1小时，随后在SQ水中冲洗两次。将盘真空干燥，随后在层流通风橱中风干15分钟。随后用pin rake(Tyler Research)在准备好的盘上刻痕。应用含NGF的50微升NBM+MC溶液穿过所得的计分刻痕(如下制备溶液：将1750mg的甲基纤维素与480ml Neurobasal(Invitrogen)组合，向其加入4.5ml青霉素/链霉素、7.5ml L-谷氨酰胺、10ml B-27无血清补充物(Invitrogen)；在室温混合溶液1小时，在4℃过夜，并在室温再一小时；随后将溶液过滤除菌，并在使用前加入50ng/ml NGF(Roche))。在解剖范围下向每一特氟隆分隔器中添加高真空油脂(VWR)。将层粘连蛋白包被的PDL盘反转，并放到特氟隆分隔器上，并通过在不含刻痕区中使用牙签来增加额外压力。将盘在37℃温育1小时。向每一侧室中加入500微升NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液，并在中心细胞槽前添加油脂屏障。
从小鼠胚解剖游离的E13.5脊髓，并置于NBM+MC(25ng/ml NGF)溶液中。用钨针从脊髓上剥离DRG。使用NBM+MC润滑的P200移液器，将DRG转移到1.5ml管中。用台式离心机离心30秒，沉淀DRG。丢弃上清液，并加入0.05％胰蛋白酶/EDTA(冷的)。用移液器将沉淀再溶解，并在恒定震荡(650RPM)下在37℃温育15分钟。再次对样品离心，并丢弃上清液。用温热的NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液将沉淀重悬浮，并用烧过的玻璃吸管研磨20次，随后用火焰烧孔的玻璃吸管再研磨20次。再次对样品离心，并在0.5ml NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液中重悬浮所得沉淀。将细胞稀释至2.5x 106细胞/ml的终浓度。将细胞悬浮液装到具有22计量注射针的1ml注射器中。使用该注射器填充Campenot分隔器的中心槽(至体积至少50μl)。在37℃过夜温育Campenot室。向中心室中加入2.5ml NGF+MC(50ng/ml NGF)溶液，并去除油脂门。三天后，用2.5ml NBM+MC培养基(含25ng/ml NGF)置换外周培养基(细胞体区室)。培养五天后，用温热的NBM+MC(无NGF)溶液洗涤一个远端区室三次。在第三次洗涤后，将500μl NBM+MC(无NGF)溶液与0.5％DMSO或抑制剂组合地加入到轴突区室中。用含0.5％DMSO或抑制剂的2.5ml NBM+MC培养基(含有25ng/ml NGF)置换细胞体区室。
在抗-NGF抗体处理28小时后，以1∶1稀释度向培养基中直接加入8％PFA/30％蔗糖溶液(见上文)，并温育30分钟。在添加的前15分钟以后，去除特氟隆分隔器。在免疫染色之前用2.5ml PBS洗涤系统一次。用在PBS中的5％BSA/0.2％triton封闭神经元30分钟。将第一抗体Tuj1(Covance)加入含2％BSA的PBS中，至1∶1000的最终稀释度，并在4℃温育过夜。用PBS洗涤盘一次。以1∶200的最终稀释度，加入在2％BSA(在PBS中)中的第二抗体(Alexa 488山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen))，并在室温温育1小时。用PBS洗涤盘两次，并添加22x 22mm盖玻片(VWR)和350μl fluoromount G(Electron Microscopy Sciences)。使用荧光显微镜使神经元显影。
结果
如上所述，分离E13.5DRG，并在Campenot室中生长5天。向实验轴突区室中加入50μg/ml的抗-NGF，并将抑制剂加入到轴突区室(与NGF抗体一起)或细胞体区室中，并允许轴突变性28小时。在NGF中维持另一轴突区室作为对照。如图15和图16所示，当细胞体暴露于SB415(GSKi)或Act D(转录抑制剂)时，或当轴突暴露于AG555(EGFRi)或SB239(p38i)时，剥夺NGF的轴突不变性。相反，NGF剥夺的轴突区室中的SB415(GSKi)或Act D(转录抑制剂)处理，或细胞体区室中的AG555(EGFRi)或SB239(p38i)处理，不能防止变性，这提示，局部轴突变性中的信号不局限于正在消失的轴突区段；当应用到细胞体、其它抑制剂应用到轴突时，一些抑制剂是最有效的。这些结果的量化显示于图17中。表7提供了来自Campenot室的轴突变性数据的汇总。
表7
Figure BDA0000155526810000831
(注：表7中的IC50信息来自发表来源，并且用非神经元细胞类型产生一些值)
a-Cross等人，J.Neurochem.77(1)：94-102，2001；小脑颗粒神经元中通过体外肽测定的总GSK-3活性。
b-Fry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)95(20)：12022-12027，1998；MDA-MB-453细胞中神经生长因子诱导的酪氨酸磷酸化。
c-Bose等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)103(26)：9773-9778，2006；3T3-Her2细胞中的蛋白酪氨酸磷酸化。
d-Barone等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.296(2)：312-321，2001；人单核细胞中LPS-诱导的TNF-α生产。
e-Tokumitsu等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)277(18)：15813-15818，2002；转染的HeLa细胞中离子霉素刺激后的CaMKK活性。
基于来自上文所述筛选的数据的模型显示于图18中。初步研究表明当从轴突区室中去除NGF时，细胞体显得更小(图19)，并且许多局部剥夺NGF的神经元为胱天蛋白酶-3阳性切割，并且显示细胞核凝聚(图20)。其它研究表明，GSK3(图21)和JNK(图22)活性在NGF撤除后6小时达到峰值。
实施例5
关于神经元变性的特定表型来表征化合物
当上文鉴定为细胞体抑制剂(SB415(GSKi)和Act D(转录抑制剂))的化合物应用于细胞体时，并且鉴定为轴突抑制剂(AG555(EGFRi)和SB239(p38i))的化合物应用于轴突时，使用上文描述的Campenot室测定观察局部剥夺的轴突的膨体形成。使用细胞体抑制剂观察到大量具有膨体的轴突以及片段化的轴突(图23)。轴突抑制剂显示出更少的膨体，并且用这些抑制剂处理后轴突看起来继续直接发生片段化(图23)。这些观察说明，EGFR和P38可能处于膨体形成的上游。用GSK、EGFR和p38抑制剂研究了线粒体功能障碍和轴突运输的阻断。如图24所示，观察到有功能的线粒体，但没有线粒体伸长。
还研究了轴突变性范例中的抑制性GSK，其中不发生经细胞体的信号传导。损伤后50μM SB415轻微延迟了变性，因此抑制性GSK3最可能是经轴突微管网络的稳定来对轴突具有直接作用。该效应可能促进整体NGF撤除后所观察到的轴突变性的延迟，但GSK3b在细胞体中的作用看起来更为显著(图25)。此外，由于GSK抑制剂阻断了轴突变性但不阻断细胞死亡，因此整体NGF撤除后轴突的保护似乎不依赖于GSK在神经元死亡中的作用(图26)。
实施例6
针对患者中外周神经病的保护
特罗凯
Figure BDA0000155526810000851
(厄洛替尼)是EGFR激酶抑制剂。已知使用紫杉醇和其它化学治疗剂治疗患者会导致外周神经病(综述见Wilkes，Semin.Oncol.Nurs.23(3)：162-173，2007)。与使用安慰剂+紫杉醇组相比，使用特罗凯
Figure BDA0000155526810000852
和紫杉醇的组合治疗的患者表现出明显更少的外周神经病(p＝0.012；Fisher精确检验)(16.3％的患者相比于26.4％的患者；登记了最初的400名患者；普通有害事件的分析)。
实施例7
肌萎缩性侧索硬化(ALS)模型中EGFR激酶水平的分析
肌萎缩性侧索硬化(“ALS”)是严重使人虚弱并致死的神经变性疾病，其病理学的特征在于缺少运动神经元。在含有超氧化物歧化酶(“SOD”)基因突变的ALS小鼠模型(SOD(G93A))中发生相似的病理。EGF受体的磷酸化与轴突变性相关。EGFR水平在SOD(G93A)小鼠中发生改变，并且进行了实验来测定磷酸化EGFR水平在SOD(G93A)小鼠中是否也发生改变。
将来自处死后的SOD(G93A)和非转基因的同窝小鼠的脊髓冷冻切片(20μm厚)至载玻片上，并保存于-80℃。将载玻片解冻至室温，并在PBS中水化两次，每次冲洗5分钟。在过氧化氢(0.3％，在PBS中)中封闭载玻片5分钟，随后在PBS中冲洗两次，每次冲洗5分钟。在PBS-T(含0.1％Triton X100的PBS)中洗涤载玻片两次，每次冲洗10分钟。在含5％BSA和0.3％Triton X100的PBS中在室温封闭载玻片约1小时。在含1％BSA和0.3％Triton X100的PBS中按1∶500稀释兔单克隆抗-磷酸化的EGFR第一抗体(Novus Biologicals)，并在4℃与载玻片温育过夜。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤10分钟。在含1％BSA和0.3％TritonX100的PBS中按1∶300稀释生物素化的山羊抗-兔第二抗体(Vector Labs)，并与载玻片温育30分钟-1小时。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤5分钟。将洗涤后的载玻片在抗生物素蛋白-生物素复合物溶液(VectorLaboratories)中在室温温育30分钟。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤5分钟。随后将载玻片与过氧化物酶底物(二氨基联苯胺(DAB)；Sigma)一起温育，直至显现出所希望的强度。在水中冲洗载玻片，封片并观察。
如图27和图28所示(其显示用EGFR抗体染色的脊髓切片)，与对照小鼠相比，在SOD小鼠中磷酸化的EGFR水平升高。该观察结果显示，EGFR激酶抑制可能在体内ALS的治疗中有益。
还进行了SOD1样品的免疫组织化学研究。将载玻片加热至室温，用ImmEdge笔画出轮廓，在室温在PBS中两次10分钟洗涤进行水化，并在室温在PBSTx中洗涤两次各10分钟。在室温进行抗体封闭1-2小时(5％BSA、0.3％Tx在PBS中；(在500ml PBS中25mg BSA+1.5ml 10％Tx))。在含1％BSA、0.3％Tx的PBS中将样品与第一抗体(NF(小鼠，Millipore)1∶200；SMI32(小鼠，Covance)1∶300))一起在4℃温育过夜。第一抗体温育后，在室温在PBSTx(0.1％)中洗涤样品4x10分钟。应用第二抗体(Molecular Probes，Alexa缀合的；驴抗-小鼠Alexa-488；在含1％BSA、0.3％Tx的PBS中按1∶500稀释)，并在室温温育样品2小时。第二抗体温育后，在PBSTx中洗涤样品2x10分钟，并在PBS中洗涤2x10分钟。任选地，在第二次洗涤过程中，通过应用在PBS中按1∶10,000稀释的DAPI，进行细胞核复染。用Vectashield封固剂(Vector Labs)进行封片。
图29显示在SOD ALS模型中pEGFR保留在轴突上。如该图所示，在SOD1-tg脊髓中轴突数目下降，并且在SOD1-tg动物中pEGFR与轴突部分地共定位。因此，相比于非转基因对照，在SOD1转基因小鼠中轴突损失，并且许多残留的轴突对pEGFR具有免疫反应。
实施例8
保护小脑颗粒神经元免于血清剥夺/KCl减少诱导的变性
检测在血清剥夺/KCl减少后激酶抑制剂(GSK3、JNK、EGFR、p38和CaMKK的抑制剂)保护培养的小脑颗粒神经元(CGN)的能力。简而言之，在PDL和层粘连蛋白包被的96孔组织培养皿上，在含血清和钾的培养基(包括29mM KCl和10％FBS的Eagles基本培养基)中，在37℃培养从P7小鼠脑中分离的CGN。培养24小时后，将细胞单独地或与表8中显示的不同小分子抑制剂组合地转到“剥夺”培养基中(含5mM KCl的Eagles基本培养基)。培养另外24小时后，用4％低聚甲醛固定神经元，并用神经元标志物(抗-III类β-微管蛋白，Covance)染色。使用ImageXpress自动成像系统(Molecular Devices)获取图像。在表8中总结了所用的平板设置。
表8
Figure BDA0000155526810000871
Figure BDA0000155526810000881
JNK抑制剂＝SP600125
CAMKK抑制剂＝STO-609
EGFR抑制剂＝AG 555
P38抑制剂＝SB 239063
GSK3抑制剂＝SB 415286
第1-6列：细胞密度＝5x 104/孔
第7-12列：细胞密度＝2.5x 104/孔
如图30所示，发现激酶抑制剂对保护CGN免于变性有效，这与实施例2和实施例3中对DRG的发现类似。
实施例9
保护海马神经元免于鱼藤酮诱导的变性
检测激酶抑制剂(GSK3、JNK、EGFR、p38和CaMKK的抑制剂)保护海马神经元免于鱼藤酮依赖性变性的能力。如下进行测定。首先，解剖海马神经元。简而言之，从麻醉的怀孕大鼠中取出E18-E19胚，置于含冷HBSS的Petri盘中(见上文)，并在新鲜冷的HBSS中洗涤。使用标准技术从其囊中取出胚，置于新鲜冷的HBSS中，并分离脑，置于新鲜冷的HBSS中。从每一个胚中分离海马和皮质，并将脑矢向切成两半来分离脑半球。去除残留的小脑/脑干、嗅球、组织下的腹侧非皮质、以及脑脊膜。从残留组织中取出海马并转移到冰上的1.5ml管中。将皮质组织移到冰上单独的1.5ml管中。尽可能多地去除HBSS，并向每管中剩余的组织中加入在HBSS中的胰蛋白酶(Hyclone)/0.1％DNA酶(Sigma)。使用烧边移液管将组织分别打碎。在37℃温育组织10分钟，并每两分钟轻敲管一次。尽可能多地从组织中去除溶液，并每次用0.05％DNA酶(Sigma)溶液洗涤组织。用以下中的一种在0.05％DNA酶(Sigma)中研磨样品约20次：(1)2/3内径处烧边的移液管，和(2)在1/3内径下烧边的移液管。允许样品沉降5分钟，随后收集上清液(碎片沉降下去，并用移液管取出上清液)，并在血球计数器上对细胞计数。
在分离的海马神经元上进行核转染(nucleofection)。简而言之，通过离心分离所需数目的细胞(每次核转染0.5-1x106细胞)。尽可能多地去除上清液，并在20μl室温的核转染溶液(Amaxa)中，重悬浮来自每管的沉淀的细胞。将每一重悬液加入预等分的β-肌动蛋白-GFP“pCAGGS-AFP”DNA(每次400ng)，并轻轻敲打。将混合物转移到96孔穿梭板的核比色杯(nucleocuvette)孔中，并将板插入到核转染设备中。使用预设的Amaxa程序CU110，核转染神经元。核转染后，立即加入100μl预热的CNBM(10ml B27(无血清补充物；Invitrogen)、5ml 100XPen-Strep、5ml 100X Glutamax、480ml NBM(神经基质培养基；Invitrogen))，随后将细胞以70,000细胞/孔的密度接种在8孔PDL包被的室载玻片中。加入鱼藤酮之前，使神经元生长5-14天，每3-5天更换培养基。
在存在或不存在载体或实验化合物的情况下，向神经元加入10μM的鱼藤酮(重悬于DMSO中；VWR)。加入鱼藤酮17-18小时后，在4％低聚甲醛/15％蔗糖溶液中在室温固定神经元40分钟。用PBS洗涤神经元一次，并以1∶1000稀释度(于PBS中，0.1％Triton X-100、2％山羊血清)加入小鼠抗-Tuj1抗体(Covance)，在4℃温育过夜。用PBS洗涤神经元4次，并以1∶200稀释度(于PBS中，2％山羊血清)加入缀合到Alexa-568(Alexa)上的山羊抗-小鼠抗体30分钟。再次用PBS洗涤神经元4次，并在Vectashield封固剂(Vector Labs)中固定在载玻片上。利用Tuj1使所有神经元显影，用GFP使个别神经元显影。
如图31所示，发现激酶抑制剂可以保护海马神经元免于鱼藤酮依赖性变性。用皮质神经元进行了类似的研究，并证实，皮质神经元也受激酶抑制剂保护而免于鱼藤酮依赖性变性(图32)。
实施例10
轴突上ErbB受体的显影
为了观察ErbB受体在轴突上的表达，如上文关于筛选所述，培养DRG。生长24小时后，通过向培养基中加入1∶1比例的8％PFA/30％蔗糖30分钟，对细胞进行固定，并用PBS洗涤1次。在含5％BSA和0.2％TritonX100的PBS中温育固定的细胞30分钟，随后在含2％BSA的PBS中与以下抗体一起在4℃温育过夜：(1)50μg/ml抗-EGFR(D1-5，Genentech)，(2)1∶500抗-ErbB2(Abcam)，(3)24μg/ml抗-ErbB3(57.88，Genentech)，和(4)1∶500ErbB4(Abcam)。用PBS洗涤细胞1次，随后与荧光缀合的第二抗体(1∶200，Invitrogen)在室温温育30分钟，用含Hoechst 33258(1μg/ml，Invitrogen)的PBS洗涤一次，随后是最后一次PBS洗涤，并用250μl Fluoromount G(Electron MicroscopySciences)盖片。如图33所示，通过免疫组织化学在轴突上检测ErbB。
实施例11
使用EGFR配体对轴突上表达的EGFR进行表征
进行实验以评估通过配体(包括EGF)的EGFR激活的作用。
材料和方法
如下制备背根神经节(DRG)免疫印迹。实验中使用的原代细胞为Charles River CD-1E13背根神经节(DRG)。在N3/F12(+25ng/ml NGF)培养基(Ham’s F12(23ml)、N3补充物(1ml)、葡萄糖(1ml 1M葡萄糖贮存液)、25ng/ml神经生长因子2.5S、于Ham’s F12中的小鼠(Roche11362348001)(贮存液：50μg/ml，-80℃)，使用前过滤除菌)中维持细胞。所述实验也使用Triton裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.1％Triton-X100、100x磷酸酶抑制剂混合液I(新鲜加入)、100x磷酸酶抑制剂混合液II(新鲜加入)、1片/10ml的蛋白酶抑制剂片剂(新鲜加入))。
在第0天制备DRG外植体。在L15培养基中进行胚胎解剖(解剖工具浸润于70％异戊醇中，并在冰上准备盘：10cm盘(每盘4个胚胎)和一个用于脊髓的6cm盘)。提取E13.5脊髓至DMEM+10％FBS中。从脊髓上分离下5x 20DRG。用250μl N3/F12(25ng/ml NGF)+7μM胞嘧啶阿糖胞苷填充8孔载玻片。每孔中放置约20个DRG(总计五孔)，并允许在室温贴壁约10分钟。在第2天，将培养基更换为N3/F12+25ng/mlNGF。在第3天，加入ErbB配体(1000x；100μg/ml；按1∶10稀释于SQ水中)30分钟至1小时(SQ水(对照)；EGF(ErbBl)；神经调节蛋白-l(ErbB3)；β-动物纤维素(ErbB 1/4)；表皮调节素(ErbB 1/4)；抗-NGF(25μg/ml))，并轻柔摇动载玻片。
利用移液器吸头抽吸培养基，用冰冷无菌的PBS洗涤两次，并使用具有移液器吸头的抽吸器或kimwipes纸巾去除所有PBS，进行免疫印迹。在冰上用40μl Triton裂解缓冲液裂解细胞。收集裂解物，在4℃旋转30分钟，在最高速旋转5分钟，并保存上清液(终止：-80℃)。装载约20μl样品。通过加入lx SDS样品缓冲液和NuPAGE还原剂(10X)，制备样品，并将裂解物煮沸。通过10％SDS-PAGE(于120伏特)(用于两张膜)，利用标准物(1μl MWM；1μl和2μl脊髓裂解物)分级分离样品。使用iBlot程序3(Nitrocellulose)对凝胶印迹，并在98kDa处切下印迹。在含5％BSA的TBST中封闭顶膜1小时。将第一抗体置于含5％BSA的2ml TBST中1小时(Calbiochem抗P酪氨酸HR缀合物(PY20)1∶10，000)。用TBST洗涤印迹3x5分钟，并用ECL显影。在含5％奶的PBS中封闭底膜一小时。将第一抗体置于真空袋中含5％BSA的2ml TBST中，在4℃放置两天。所用抗体为CS抗-P-Erk兔(42/44kDa)1∶1000；C抗-TUJ1兔(55kDa)1∶5000(在单独的膜上)和SC抗-Erk1兔(42/44kDa)1∶1000(在单独的膜上)。在TBST中洗涤印迹3x5分钟。按1∶5000将第二抗体加入到10ml含5％奶的TBST中，在室温温育1小时(Red(680)抗-兔)。用TBST洗涤印迹3x5分钟，并用Odyssey在PBS中扫描。通过选择背景法，和将负/违反直觉的值最小化的标准条带，进行定量，所述值即上/下、右/左、用户定义(用户定义)。浓度标准品的强度越低，负值越小。
结果
这些实验的目标是观察通过EGF激活EGFR是否足以驱动变性。如图34所示，EGFR在轴突上表达。图35显示向维持于NGF中的神经元加入EGF不引起变性。为了确保EGF能够激活在这些测定中使用的神经元培养物中的EGFR/ErbB，评估了ERK激活作用(ERF是EGFR的下游靶标)。如图35中图所示，加入EGF提高了ERK活性，如通过蛋白印迹确定。这些数据显示激活EGFR不足以驱动变性。
实施例12
使用EGFR胞外结构域表征轴突上表达的EGFR
进行实验以评估EGFR胞外结构域对EGFR激活的影响。
材料和方法
在这些研究中使用的材料包括：BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃8孔室载玻片(BD 354688)；L15培养基(Invitrogen 11415114)；来自牛血清的白蛋白(BSA)(Sigma A7906-500g)；胎牛血清(SigmaF2442-100ml)；N3补充物(见上文)；Fluoromount G(Electron MicroscopySciences 17984-25)；24x 60mm No.1盖玻片(VWR 48393106)；单克隆抗神经元III类β-微管蛋白(Covance MMS-435P)；在Ham′s F12中的神经生长因子2.5S，小鼠(Roche 11362348001)；和Triton X-100(SigmaT8787-100ml)。在这些实验中使用的溶液包括：25ml N3/F12培养基(23ml的Ham′s F12；1ml的N3补充物；1ml的1M葡萄糖；25ng/ml的NGF)和30％蔗糖/8％PFA(见上文)。
在无菌过滤的含0.1％BSA的PBS中将胞外结构域(R&D Systems)重悬浮至1mg/ml。解剖小鼠E13.5胚胎，并将其置于L15培养基中。用镊子打开胚胎的腹侧区，去除器官，切掉肋骨，切割附着DRG的脊髓。将附着DRG的脊髓置于冰上的L15培养基+5％山羊血清中。用钨针取出DRG，并去除剩余的脊髓。用N3-F12+25ng/ml NGF填充8孔载玻片。将DRG对半切开。将切开的DRG置于8室载玻片的每一孔的中央，并允许DRG在室温附着5-10分钟。在上排中加入胞外结构域至终浓度为50μg/ml。将载玻片置于37℃培养箱中过夜。将胞外结构域加入到下排中至终浓度为50μg/ml。以25μg/ml的浓度向孔中加入抗-NGF抗体。以10μM浓度，加入EGFR抑制剂AG555作为阳性对照。
抗-NGF抗体处理24小时后，直接向培养基中加入1∶1稀释的8％PFA/30％蔗糖30分钟。在最初15分钟后，除去特氟隆分隔器，并用PBS洗涤载玻片一次。
在5％BSA/0.2％Triton中封闭载玻片30分钟，并与在2％BSA中的第一抗体(Tuj1(1∶1,000))温育过夜。用PBS洗涤载玻片一次，并加入第二抗体(山羊抗-小鼠488；1∶200)。在室温温育载玻片1小时，用PBS洗涤两次，用250μl的fluoromount G封片，并在4℃保存。
结果
除了EGF以外，还有可以激活EGFR的许多配体。为了检测变性过程中EGFR激活是否是配体依赖性的，以50μg/ml的浓度加入来自R&DSystems的EGFR胞外结构域，其应该足以结合可能激活EGFR的任何自由配体。在加入抗-NGF前24小时或同时地加入的EGFR胞外结构域不能阻止变性。这提示，变性过程中的EGFR激活可能独立于配体。
实施例13
背脊髓(DSC)外植体是神经变性的另一种模型。经过一些天，DSC从轴突上生长出来，但如果不通过加入存活因子来拯救它们，它们最终将变性。如图37所示，特罗凯
Figure BDA0000155526810000931
(厄洛替尼)可以延迟该变性程序。
实施例14
A.双亮氨酸拉链激酶的抑制
材料和方法
293细胞系中的DLK转染
将293细胞以30％汇合接种于6孔板上的3个孔中。用以下任一种物质转染细胞：对照质粒DNA、表达野生型DLK的DNA构建体或两种质粒，其中一种质粒表达野生型DLK，另一种质粒表达277位苏氨酸已突变为丙氨酸(T278A)的DLK(其产生不具有活性的蛋白形式(Fugene 6，Roche))。转染24小时后，用PBS洗涤细胞，从每一板上刮下细胞，并转移至eppendorf管。随后将细胞离心，并去除过量的培养基。在20mMTris、150mM NaCl、0.1％Triton X-100中裂解沉淀的细胞，并置于4℃30分钟。随后旋转样品以去除不可溶的颗粒，并在双金鸡宁酸(BCA)测定(Promega)中检测蛋白浓度。
在10％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上电泳样品，并使用iBlot装置(Invitrogen)按生产商说明书进行转移。在含5％牛血清白蛋白(BSA)的TBST(Tris缓冲盐水+1％吐温20)中封闭印迹1小时。封闭后，在TBST+1％BSA中，用针对JNK的第一抗体(Cell Signaling Technologies)或针对JNK磷酸化形式的第一抗体(Cell Signaling Technologies)温育印迹过夜。温育后，用TBST洗涤印迹3次，随后与HRP-缀合的抗-兔第二抗体在室温温育1小时。再洗涤印迹三次，随后与ECL(Promega)温育1分钟。随后在胶片上曝光印迹，并分析。
DLK siRNA后的DRG变性
解剖小鼠E13.5胚胎，并将其置于L15培养基(Invitrogen)中。从胚胎上切下附着DRG的脊髓。将附着DRG的脊髓置于冰上的L15培养基+5％山羊血清(Gibco)中。用钨针取出DRG，并处理剩余的脊髓。用N3-F12溶液(23ml Ham’s F12、1ml N3补充物和1ml 1M葡萄糖)填充8孔载玻片，并向其加入25ng/ml NGF(Roche)(通过稀释N3100X浓缩液制备N3补充物，其通过将以下组分以以下顺序混合来制备：5.0ml汉克缓冲盐水溶液(HBSS；无Ca、Mg；Invitrogen)、1.0ml牛血清白蛋白(10mg/ml，在HBSS中＝150μm)、2.0ml转铁蛋白(T1147-1G，人，100mg/ml，在HBSS中＝1.1mM)、1.0ml亚硒酸钠(S9133-1MG，0.01mg/ml，在HBSS中＝58μM)、0.4ml二盐酸腐胺(P5780-5G，80mg/ml，在HBSS中＝500mM)、0.2ml黄体酮(P8783-5G，0.125mg/ml，在无水乙醇中＝400μM)、0.02ml皮质酮(C2505-500MG，2mg/ml，在无水乙醇中＝5.8mM)、0.1mltriiodothyonine，钠盐(T6397-100MG，0.2mg/ml，在0.01N NaOH中＝300μM)、0.4ml胰岛素(I6634-250MG，牛胰腺，241U/mg，25mg/ml，在20mM HCl中＝4.4mM)，总体积为10.02ml(可储存于-20℃)。通过混合下述物质，制备N3补充物贮存液：10ml Pen/Strep(100X，Gibco)、10ml谷氨酰胺(200mM，Gibco)、10ml MEM维生素(100X，Gibco)、10ml N3浓缩液(100X，参见上文)，总体积为40ml。使用0.22μm滤器将混合物过滤除菌，并将l-2ml等分试样储存于-20℃。
使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)，在37℃将神经元进行胰蛋白酶处理30分钟、沉降，并计数。使用Amaxa 96-孔核转染器，用400ngDLK siRNA对照(程序DC100)电穿孔二十万个细胞，随后等分至8室载玻片(BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃，Becton Dickinson)的两个孔中。允许神经元在室温附着到载玻片上5-10分钟，随后在37℃温育3天。然后以25μg/ml的浓度，加入抗-NGF抗体至载玻片(4孔)的右半部分。在37℃温育20小时后，通过向250μl培养基中直接加入250μl固定液，利用30％蔗糖/8％低聚甲醛(PFA)固定载玻片(为了制备30％蔗糖/8％PFA溶液，将以下成分加入至包括搅拌棒的600ml烧杯中：250ml16％PFA(目录号15710-S，Electron Microscopy Sciences)、50ml 10X PBSpH 7.4和150g蔗糖。在低热下混合溶液直至溶解。随后加入6-8滴1MNaOH，使pH达到7.4。然后在刻度量筒中用水将体积补充为500ml。充分混合溶液，放入等分试样中，并冷冻)。
固定载玻片30分钟，随后用PBS洗涤三次。用神经元特异性的β-微管蛋白抗体(Tuj1(1∶1000)在2％BSA中，0.1％Triton)在4℃标记所有细胞过夜。去除第一抗体，并用PBS洗涤载玻片三次。与山羊Alexa 488抗-兔第二抗体(1∶500)一起温育载玻片1小时，随后用PBS洗涤三次，随后用130μl封固剂(Fluoromount G；Electron Microscopy Sciences)和24x 60mm No.1盖玻片(VWR)盖片。
DLK的定量PCR(qPCR)
切开E13.5DRG，用对照siRNA或针对DLK的siRNA电穿孔，并如上文描述培养五天时间。然后使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒，根据生产商的方案，使用Purify Total RNA从神经元分离RNA。在定量PCR实验(Qiagen Quantifect SYBR Green RT-PCR)中，使用对DLK和GAPDH(对照)特异性的DNA引物(CATCATCTGGGTGTGGGAAG(正向引物)和AGTTGCAGCATGAGGGCATTC(反向引物)；SEQ ID NO：16和17)，一式三份地运行来自对照和DLK siRNA处理的细胞的10ng总RNA。分析扩增曲线，并计算每一样品相对于对照的相对RNA浓度。
结果
这些实验的结果显示于图38中。用编码野生型DLK的质粒瞬时转染293细胞导致JNK的磷酸化和激活，表明在信号级联中DLK是处于JNK上游的激酶。共转染编码激酶死亡DLK的质粒降低了JNK磷酸化水平。DLK表达通过siRNA的敲降导致保护神经元免于变性，如下游激酶JNK的抑制那样。在使用转染有针对DLK(Dharmicon)的siRNA的培养神经元的实验中，用对照siRNA转染的神经元(如通过肌动蛋白染色可见)在NGF撤除后进行了明显变性，如通过TuJI染色可见(图38和图39)。相反，在转染有靶向DLK的siRNA的神经元中，在NGF撤除后仍保持轴突的完整性。使用对DLK特异性的引物进行定量PCR，证实了这些实验中DLK表达的敲降。
B.DLK敲降会保护免于毒素诱导的神经元细胞死亡
进行实验以评估以上观察到的DLK抑制的保护效果是否更一般地保护免于其它损伤，如毒素暴露引起的轴突变性/神经元细胞凋亡。在对DLK特异性的siRNA存在或缺失下，将分离的神经元暴露在有丝分裂抑制剂长春新碱中。
使用以下程序分离皮质神经元。将缺少脑脊膜的大鼠E18皮质解剖到冰冷的神经基质培养基(Invitrogen)中。在0.1％胰蛋白酶/PBS(Worthington)的终浓度中在37℃解离皮质30分钟。向管中加入终浓度0.1％DNA酶(Roche)，并将组织在室温温育1分钟。用温热的神经基质培养基洗涤组织一次，并允许所述组织在管中沉降，然后加入1mL含有2％B27补充物(Invitrogen)的神经基质培养基。通过用P1000移液管(Rainin)研磨，解离组织。对细胞计数，并且对于一些实验，使用Biosystem 96-孔核转染器(Amaxa)，利用siRNA进行转染。
对于siRNA实验，分别以2x 106细胞/孔、1.25-2x 105细胞/孔或1x104细胞/孔的细胞密度(所述密度允许通常与电穿孔过程相关的一些细胞死亡)，将细胞接种在6或8孔室内或96孔聚-D-赖氨酸包被的盘(BDBioSciences)中。将神经元与20μL的核转染溶液(Amaxa)和600ng的siRNA(Qiagen或Dharmacon)混合。在接种后3-4天，通过定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)，测定基因沉默。简而言之，使用Rneasymini试剂盒(Qiagen)，从转染的神经元中分离RNA。使用Quantifect SYBRGreen RT-PCR试剂盒(Qiagen)，利用DLK-、JNK1-、JNK2-或JNK3-特异性的引物，一式三份进行含有10ng RNA的每个反应。持家基因GAPDH的引物用作对照(从Qiagen购买所有引物)。使用ΔCT分析扩增曲线，以分析每个样品中的相对RNA浓度。
利用300nM长春新碱(一种微管去稳定剂)处理平板接种了3-4天的皮质神经元6-72小时。在最终处理后4-36小时之间，测定NGF撤除诱导的细胞凋亡和变性。使用MTT试验和乳酸脱氢酶试验，测定细胞凋亡和变性。所述MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)试验基于线粒体功能来测量细胞活力。向各孔中加入总共1/10培养体积的MTT，并在5％CO2下在37℃温育90-120分钟。吸走含有MTT的培养基，并将细胞重悬浮于等体积的增溶溶液中(10％triton X-100，l滴HCl，50mL异丙醇)。使用分光光度计读取吸光度(570和690nm)。使用CytoTox非放射性LDH测定试剂盒(Promega)，测定乳酸脱氢酶(LDH)水平，以评估测定中细胞死亡的量。根据制造商的说明书，使用来自不同处理条件的50μL培养基。对于MTT和LDH测定，将细胞存活/细胞死亡相对于阳性对照归一化。
在表9中显示了结果。如先前在上述DLK敲降、NGF撤除实验中观察到的，在两个不同测定系统中，DLK表达的敲降也保护免于长春新碱诱导的皮质神经元死亡。该发现表明，在许多不同的神经元类型中，DLK敲降一般也保护免于应激诱导的神经元细胞死亡。
表9：通过LDH试验测得的、在长春新碱攻击后DLK敲降对皮质神经元存活的影响
  条件   ％细胞死亡(归一化)
  对照(未处理)   0
  20小时长春新碱处理   100
  DLK siRNA(未处理)   0
  DLK siRNA(20小时长春新碱)   11
  条件   ％存活(归一化)
  对照(未处理)   100
  12小时长春新碱处理   77
  DLK siRNA(12小时长春新碱)   95
C.DLK调节在交感神经元中的效果
上述分析证明，在皮质神经元和背根神经节神经元中，DLK抑制保护免于毒素诱导的或生长因子饥饿诱导的轴突变性/细胞凋亡。进行其它实验，以评估DLK抑制保护交感神经元免于这些攻击通常诱导的细胞凋亡的能力。
从出生后1天的Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs)中切下交感颈神经节，并收集在含有Ultraculture培养基(Lonza)与5％胎牛血清(Invitrogen)的盘子中。用无血清Ultraculture培养基洗涤神经节两次，加入终浓度0.1％的胰蛋白酶(Worthington)，并在37℃与组织温育30分钟。向所述神经节中加入1％DNA酶(Roche)的PBS溶液，并在室温温育1-2分钟。用Ultraculture洗涤神经节，并允许沉降到管底。去除所有的洗涤培养基，并向管中加入含有Ultraculture、5％大鼠血清、1％青霉素-链霉素、1％glutamax、7μM胞嘧啶阿糖胞苷(Sigma)和50ng/mL神经生长因子(2.5S，Cedarlane Laboratory)的1mL平板培养基。使用移液管(Rainin)，通过研磨解离神经节。在0.45μm细胞过滤网(Falcon)上过滤细胞浆，并对细胞数量计数。以5000-7500细胞/孔(96-孔盘)、200,000细胞/孔(6-孔板)或100,000细胞/孔(8-孔室载玻片)的密度，平板接种交感神经元，并在37℃在5％CO2中生长4-5天。每隔一天，用含有5-10ng/mL NGF的新鲜平板培养基饲喂神经元。
如实施例14A中所述，进行NGF撤除测定。如实施例14B中所述，进行长春新碱处理、MTT测定和LDH测定。
使用两种慢病毒载体：GCMV-MCS-IRES-eGFP和GCMV-MCS-IRES-dsRed，进行慢病毒实验。两种载体都是HIV1株，其缺少结构病毒基因gag、pol、env、rev、tat、vpr、vif、vpu和nef。此外，3′LTR内的启动子/增强子序列具有部分缺失，其使得整合后5′LTR/启动子自身灭活。为两种载体反向提供的基因是结构病毒蛋白Gag、Pol、Rev和Tat(通过质粒Delta8.9)和包膜蛋白VSV-G。通过共转染，将这些质粒引入HEK293-T细胞中，并瞬时表达产生病毒颗粒所需的不同病毒蛋白。产生野生型或致病慢病毒的可能性是极低的，因为其需要在三种质粒之间进行多次重组事件。此外，已经从两种载体中完全去除了致病因子(vpr、vif、vpu和nef)。
通过向含有5μg/mL聚凝胺的细胞培养基中加入病毒，在平板接种后立即感染神经元，或在平板接种后3-5天感染神经元。第二天，去除含有病毒的培养基，并用新鲜的培养基替换。允许细胞表达病毒48小时，然后进行实验。
与DLK敲降对皮质神经元和DRG的保护效果类似，DLK的敲降保护交感神经元免于NGF撤除诱导的细胞凋亡(图40A-40B和表10)和毒素诱导的细胞凋亡(图41和表11)。
表10：DLK敲降会保护交感神经元免于NGF撤除应激(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化)
  对照(具有NGF)   100
  NGF去除后24小时   46
  DLK siRNA对照   133
  DLK siRNANGF去除   93
表11：DLK敲降会保护交感神经元免于毒素诱导的变性(MTT测定)
 条件   ％存活(归一化的)
 对照(未处理的)   100
 24小时长春新碱处理   28
 24小时喜树碱处理   79
 DLK siRNA(24小时长春新碱)   47
 DLK siRNA(24小时喜树碱)   106
值得注意的是，引入过量的激酶死亡DLK，会类似地保护交感神经元免于NGF撤除诱导的细胞凋亡(图42和表12)。
表12：显性失活DLK会保护交感神经元免于NGF撤除诱导的变性(MTT测定)
 条件   ％存活(归一化的)
 GFP病毒对照(具有NGF)   77
 GFP病毒-NGF去除   36
 DLK病毒对照(具有NGF)   62
 DLK病毒-NGF去除   22
 DLK DN病毒对照(具有NGF)   104
 DLKDN病毒-NGF去除   60
该发现与实施例15中的发现一致，即引入293细胞中的激酶死亡DLK抑制这些细胞中的JNK磷酸化。一种非限制性可能性是，激酶死亡DLK可防止正常的DLK二聚体化和自身磷酸化。该发现提示，通过降低DLK表达，或通过引入缺少激酶活性的DLK变体，可以抑制DKL的JNK磷酸化能力，从而保护许多类型的神经元免于毒素暴露或生长因子撤除引起的轴突变性和细胞凋亡。
实施例15
已经确定，DLK的RNA沉默及激酶死亡DLK的引入，各自对NGF撤除触发的或毒素诱导的培养神经元变性具有保护性，进行其它实验以鉴定DLK在神经元变性途径中的作用。DLK是多谱系激酶(MLK)家族的MAP激酶激酶激酶。与MLK家族的其它成员相反，DLK的表达限制在神经系统中(Gallo等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3(9)：663-672，2002；Bisson等人，Cell Cycle 7(7)：909-916，2008；Holzman等人，J.Bio.Chem.269(49)：30808-30817，1994)。DLK是激活JNK 1-3和cJun的信号传导途径的成员，所述途径在某些情况下导致细胞凋亡/炎症。通过检查患者样品或在疾病动物模型中的实验，已经将增加的JNK/cJun活性与多种神经病症相联系，所述病症包括帕金森病、青光眼、阿尔茨海默病、ALS、中风和亨廷顿病(Oo等人，J.Neurochem.72(2)：557-564，1999；Ries等人，J.Neurochem.107(6)：1578-1588，2008；Vlug等人，Eur.J.Neurosci.(神经科学杂志)22(8)：1881-1894，2005；Morfini等人，Nat.Neurosci.(自然神经科学)12(7)：864-781，2009；Perrin等人，Exp.Neurol.215(1)：191-200，2009；Levkovitch-Verbin等人，Eye Res.80(5)：663-670，2005；Tezel等人，Brain Res.(脑研究)996(2)：202-212，2004；Kuan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)100(25)：15184-15189，2003；Yang等人，Nature(自然)389(6653)：865-870，1997；Hunot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)101(2)：665-670，2004；Thakur等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)Res.85(8)：1668-1673，2007)。研究了DLK与神经病症之间的可能相关性以及一种或多种JNK/cJun激活途径的参与。
A.对磷酸化DLK特异性的抗体
DLK是一种MAP激酶，并且像其它MAP激酶一样，其在激活状态的激活环内被磷酸化。为了能够容易地区分激活的和静息的(未激活的)DLK，制备了对磷酸化形式的DLK(″p-DLK″)特异性的抗体。为此，将活性位点中的特异残基突变成丙氨酸，其不能被磷酸化。然后使用实施例14的A部分(上文)中描述的相同方案，将这些构建体转染到293细胞中，并检测其磷酸化下游激酶JNK的能力(图43C)。该分析证实，苏氨酸278(T278)和丝氨酸281(S281)为活性所需。使用标准的体内免疫技术，在兔中针对含有这些残基的DLK蛋白活化环中的肽制备抗体。对于抗体317和318，用于免疫的肽序列是CKELSDKSpTKMpSFAG(SEQ IDNO：13)，对于抗体319和320，则是KMpSFAGTVAWMAKKC(SEQ ID NO：14)，对于抗体321和322，则是CGTSKELSDKSpTKM(SEQ ID NO：15)。使用“p-位点”方案，在Yenzym进行操作，所述方案包括在磷酸化的和非磷酸化的肽的柱子上纯化，以产生选择性。分离来自六只免疫的兔子的多克隆抗体，并筛选其与DLK和p-DLK的结合。
将六种获得的多克隆抗体进行蛋白印迹和免疫组织化学分析，以确定其检测p-DLK的能力，并将其与非磷酸化的DLK或其它磷酸化激酶和磷酸化的MLK3区分开。对于培养的细胞，去除培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞一次。将细胞刮到冷PBS中，并转移到冰上的eppendorf管中。快速沉淀细胞，并去除过量的缓冲液。在干冰上快速冷冻沉淀物并储存在-80℃，或立即在新鲜的裂解缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、0.1％Triton X-100)中裂解，所述裂解缓冲液含有磷酸酶(Sigma P5726和P2850)和蛋白酶抑制剂(Roche 11836153001)。在旋转器上在4℃裂解细胞30分钟，然后在4℃沉淀。使用BCA试验(Pierce)，确定蛋白浓度。
将蛋白裂解物与样品缓冲液(Invitrogen)混合，煮沸5分钟，然后装载到变性的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上。将样品转移到硝基纤维素(Invitrogen)上，并在5％奶/TBST封闭液(Tris-缓冲盐水+0.05％TritonX-100)中封闭1小时。与在含5％BSA的TBST中1∶1000稀释的磷酸-DLK抗体一起在振荡平台上在4℃温育印迹过夜。用TBST洗涤印迹三次各5分钟，并与兔第二辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗体(JacksonLabs，1∶5000)一起在室温温育1-2小时。在TBST中洗涤膜3次，并用Westdura化学发光底物(Pierce)显影。
将293T细胞铺到在12-孔培养皿中的盖玻片上，用于免疫染色。然后如前所述，利用mDLK或mMLK3转染所述细胞，然后在转染后，利用4％PFA、30％蔗糖固定24小时。用5％BSA、0.3％Triton X-100封闭并透化细胞1小时，然后将其与在1％BSA中1∶500浓度稀释的第一抗体温育过夜。然后，用PBS轻轻地冲洗细胞三次，并用Alexa488抗-兔第二抗体缀合1小时。该步骤后是三次PBS洗涤，最后一次洗涤含有DAPI(1∶5000)，以染色细胞核。然后小心地从培养物上抬起盖玻片，装到载玻片上，其中具有细胞的表面朝向载玻片，并使用荧光显微术观察所述载玻片。
抗体318、319、320、321和322各自检测p-DLK和p-DLK/DN-DLK，并不结合(抗体318和319)或非常有限地结合(抗体320、321和322)磷酸化的MLK3(图43A)。相反，抗体317识别所有的三种蛋白。抗体318和319显示与p-DLK的最强结合，伴随最小p-MLK3结合，因此用于进一步的分析。
通过免疫组织化学测得，在细胞的背景下，所述抗体也能够特异性结合p-DLK。抗体318和319染色DLK转染的293T细胞，其中在MLK3转染的293T细胞中观察到显著降低的结合(图43B)。在已经转染了DLK突变体的293细胞中，该结合显著降低，所述DLK突变体具有导致激酶活性近乎完全缺失的突变(图43C)。像其它混和谱激酶一样，认为当在异源系统中转染时，DLK会二聚体化，并自磷酸化，这些数据进一步证实，这些抗体的确识别磷酸化形式的DLK。
B.长春新碱诱导的皮质神经元变性期间DLK的激活
然后检测如上所述产生的抗体，以评估在已经受长春新碱应激的皮质神经元中DLK的磷酸化和活性是否增加。这是可以期望的，因为DLK活性的敲降促进存活。当如上所述培养，并用长春新碱处理1小时时，通过蛋白印迹(如上所述的相同方案)，使用抗体318、319和320分析，磷酸化的DLK的水平与对照培养物相比提高了(图43D)。这提供了进一步的验证，即磷酸化的DLK的水平与活性相关，并在神经元应激条件下升高。
C.神经元疾病模型中DLK的表达和活性
如下进行免疫组织化学测定。用4％低聚甲醛灌注SOD1转基因动物，小心地从脊柱中取出脊髓，并在4℃固定后过夜。然后在OCT中包埋用于冷冻切片之前将所述脊髓在30％蔗糖/PBS中进行平衡。切割冠状切片(20μm厚)，封固在冷的载玻片上，并保持在-80℃。在PBS中水化切片，并用H2O2(0.3％，在PBS中)封闭内源过氧化物酶活性10分钟，随后用PBST(0.1％Triton X-100)冲洗2次。在含有5％BSA、0.3％TritonX-100的PBS中封闭切片1小时，然后在含1％BSA、0.3％Triton X-100的PBS中与p-DLK的第一抗体一起在4℃温育过夜。在PBST中洗涤载玻片三次，然后在含1％BSA、0.3％Triton X-100的PBS中用生物素化的第二抗体(1∶300)标记1小时。用PBST冲洗所述载玻片，然后与含有ABS试剂(Vector labs)的抗生物素蛋白DH温育30分钟，最后在黑暗中在过氧化物酶底物(在10mM Tris、150mM NaCl、pH 7.6中0.05％二氨基联苯胺，即将使用前向其中加入30％H2O2)中温育10-15分钟。通过用水冲洗，终止反应，在载玻片上封固切片，并覆盖盖玻片。从US Biological购买阿尔茨海默病患者组织。将来自阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照的海马组织裂解物用于该分析中。通过蛋白印迹，使用与上述方案相同的方案进行分析。
图44A中的结果证明，ALS的SOD1小鼠中磷酸化DLK(p-DLK)的水平相对于疾病晚期的野生型小鼠升高。p-DLK的证据早在14周前在组织样品中就是明显的(图44B)，其先于这些动物中ALS样症状的发作。
在人阿尔茨海默病患者样品中观察到了类似结果。阿尔茨海默病患者皮质样品中p-DLK的水平相对于对照样品升高(图44C)。磷酸化JNK和磷酸化cJun63水平在阿尔茨海默病患者中相对于对照样品也升高(图44C)。因此，在症状发作之前和疾病末期，DLK在ALS的公认小鼠模型中被激活，并也在来自人阿尔茨海默病患者的皮质样品中被激活。
D.促进观察到的DLK抑制效果的信号传导
1.DLK沉默的分子效应
如在上文实施例14中证明的，DLK沉默保护神经元免于响应毒素暴露或生长因子撤除的降解，并且DLK激酶活性直接或间接参与JNK磷酸化。进行实验以评估NGF撤除应激和毒素依赖性应激条件下JNK和cJun的表达和活性。用于降低DLK(siRNA)的表达和用于免疫印迹的实验方案与上文描述的那些相同。
DLK沉默没有改变DRG或皮质神经元中基线JNK蛋白水平或JNK活性(图45)。然而在皮质神经元、DRG和交感神经节神经元中，NGF撤除或长春新碱依赖性应激后，DLK敲降降低了p-cJun的水平(图45)。在皮质神经元和DRG中，NGF撤除或长春新碱依赖性应激后，DLK敲降也降低了p-JNK的水平(图45)。应指出，p-JNK抗体识别各磷酸化形式的JNK1、JNK2和JNK3。JNK1磷酸化与应激诱导或cJun的磷酸化不相关。DLK敲降沉默了JNK2和JNK3的应激诱导的磷酸化。在这些数据中观察到的对照样品的背景信号，可能是由于基线磷酸化的JNK1。结果表明，DLK沉默或其它抑制不引起JNK或cJun的降解，但确实导致那些分子的应激诱导的磷酸化程度更低(并因此缺少激活)。
如果DLK抑制通过限制JNK2和JNK3的磷酸化而保护神经元免于变性，那么JNK2或JNK3的抑制剂应该也保护神经元免于细胞死亡和轴突变性。还评估了直接JNK抑制保护神经元免于NGF撤除依赖性变性的能力。在上述NGF撤除测定中进行评估之前，用抗-NGF和任一种泛-JNK(pan-JNK)抑制剂JNKV或JNKVIII处理DRG外植体。两种抑制剂都能够保护DRG外植体免于NGF依赖性变性(图46)：JNKV(Calbiochem)在5μM浓度处最具保护性，而JNKVIII(Calbiochem)在4μM浓度处最具保护性。
为了鉴定哪个JNK参与观察到的保护效果，使用上文描述的相同方法进行进一步敲降实验。单独沉默对JNK1特异性的RNA不能复制利用泛-JNK抑制剂观察到的效果(图47)。JNK2或JNK3的抑制性RNA(siRNA)不能单独在NGF撤除后保护DRG免于轴突变性(图47)。在JNK2和JNK3两者均沉默存在时观察到最有效的保护，尽管该保护与siDLK单独程度不相同(图47)。
JNK1是组成型活性分子，已知负责轴突维持和突触成熟，而已知JNK2和JNK3是应激诱导的，并参与cJun激活和细胞凋亡/轴突变性(Coffey等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)22(11)：4335-4345，2002；Coffey等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)20(20)：7602-7613，2000)。DLK抑制比JNK 1/2/3抑制导致更大的神经保护作用的事实强烈提示，DLK除了在JNK/cJUN途径中的作用外，对神经元生长和/或存活的一种或多种机制是抑制性的。
E.DLK的营养效果
先前的研究已经提示，显性失活激酶死亡的突变体形式的DLK(K152A)在黑质密部的多巴胺能神经元中引起营养效果，而仅含有亮氨酸拉链结构域的显性失活形式的DLK不引起此类效果(Chen等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)28(3)：672-680，2008)。然而，值得注意的是，通过DLK(K152A)感染的神经元(其表达特定标记)的数量增加，而不是感染的和未感染的神经元之间的任何功能或形态差异，定义在该研究中的营养作用。因此在皮质神经元和DRG中研究DLK沉默的影响。用于这些研究的方案与上文描述的那些方案相同。
证实了DLK敲降对皮质神经元和交感神经元具有显著的营养效果(观察到的细胞数量的增加)(图48A和48B)。尤其是，当用针对DLK的siRNA处理时，DRG、皮质和交感神经元在培养中显示提高的生长/存活(观察到的生长的增加)(表13)。
表13：DLK敲降后培养物中多种类型神经元的增加的生长(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化)
  皮质神经元对照   100
  皮质神经元+DLK siRNA   137
  交感神经元对照   100
  交感神经元+DLK siRNA   139
  DRG神经元   100
  DRG神经元+DLK siRNA   147
为了进一步检查DLK在神经元生长中的作用，测定了MAP2的水平，所述MAP2是特异性地定位在树突上的微管结合蛋白。培养的神经元中MAP2的表达会反映神经元成熟和表达，并在促生长条件下经常增加。在神经元中使用显性失活亮氨酸拉链形式的DLK或显性失活激酶死亡形式的DLK对DLK活性的抑制，会导致对MAP2蛋白生产的诱导。MAP2表达的诱导指示，正在发生神经元生长和成熟，并进一步证实，DLK敲降的确对神经元具有功能营养效果。
实施例16
本文描述的试验鉴定了G蛋白和G蛋白偶联受体(GPCR)的若干抑制剂，其降低神经元中的变性。在DRG中进行实验，以证实G蛋白和GPCR在变性途径中的作用。用于这些实验的实验方案与实施例14中描述的那些方案相同。从Tocris BioScience购买百日咳毒素和SCH 202676。
数据证明，SCH 202676(其为抑制结合G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂的巯基反应化合物)会降低DRG中的NGF撤除诱导的变性(图49和50)。百日咳毒素(G蛋白信号传导的另一抑制剂)也会降低在NGF撤除后的神经元变性(图51)。这些数据表明，G蛋白和G蛋白偶联受体在神经元变性中起作用。
实施例17
在本文所述试验中鉴定出的、在变性途径中起作用的额外细胞靶标是β-联蛋白信号传导途径的成员及其下游靶标(例如转录因子4，TCF4)。在海马神经元中进行实验，以证实β-联蛋白和TCF4在神经元变性中的作用。用于这些实验的实验方案与实施例14中描述的那些方案相同。
数据证实，组成型活性GSK3的表达(其可导致β-联蛋白丢失)会介导神经元活力的降低(图52；右上图)。显性失活形式的TCF4的表达也会介导神经元活力的降低(图52；右下图)。这些数据表明，β-联蛋白信号传导途径对神经元活力的维持是重要的。靶向β-联蛋白信号传导途径的抑制剂可用于促进神经元变性(例如，β-联蛋白表达的抑制剂和TCF4活性的抑制剂)。相反，激动剂或β-联蛋白和TCF4信号传导可防止轴突变性和神经元细胞死亡。
实施例18
在DLK敲除的神经元中减少神经元变性
由于DLK敲降会保护皮质神经元免于毒素诱导的细胞死亡(如在实施例14(B)中所证实)，进行实验以评估缺少DLK的神经元是否也会被保护免于由N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)造成的轴突变性/神经元细胞凋亡。已经证实，不同的应激应答途径可以调节神经元变性，这取决于神经元亚型或采用的毒性损伤。
NMDA是NMDA受体的一种激动剂，所述NMDA受体已经涉入急性神经变性(例如，中风)以及缓慢或慢性神经变性中的神经元死亡(例如，阿尔茨海默病和帕金森病(Loopuijt等人，Amino Acids 14：17-23，1998)。已经报道，NMDA受体介导的谷氨酸盐兴奋性中毒是引起Aβ-诱导的神经元死亡的主要原因(Sonkusare等人，Pharma.Res.51：1-17，2005)。谷氨酸盐兴奋性中毒诱导的神经元细胞死亡还已经与几种CNS障碍相关联，所述CNS障碍包括：脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病(同上)。
为了测试NMDA对缺少DLK的神经元的影响，如下所述，制备敲除的小鼠。通过胚胎干(ES)细胞中的同源重组，制备DLK敲除的小鼠，所述同源重组导致侧接含有DLK外显子2-5的基因组区域的新霉素抗性盒和LoxP位点的插入。然后通过Cre介导的ES细胞中的重组，与新霉素盒一起取出外显子2-5。然后将得到的ES细胞注射进小鼠胚泡中，以建立嵌合小鼠，使其与野生型小鼠交配，以制备杂合动物。使2个DLK杂合(dlk+/-)动物交配，以制备DLK敲除的胚胎用于实验。通过用两种抗-DLK多克隆抗体检查，证实DLK蛋白在DLK敲除小鼠中的缺失(Hirai等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)46：11992-12002，2006，和Genentech)。
使用下述规程，从DLK野生型(WT)、杂合的dlk+/-(HET)和敲除的(DLK KO)小鼠中分离出皮质神经元。从E15.5胚胎切下皮质，然后在0.1％胰蛋白酶、0.1％DNAse l HBSS中在37℃解离30分钟。然后使用P1000，在NBActive4(NbActiv4-100)中研磨组织15次，并接种到PDL层粘连蛋白包被的平板上的NBActive 4培养基中。每3-4天，用新鲜培养基更换细胞的一半培养基。
检查在DLK下游的途径，诸如JNK/cJun和p38途径，以便确定DLK敲除小鼠中DLK的下游靶标是否响应于NMDA暴露而受到影响。WT和HET皮质神经元用作对照。允许小鼠皮质神经元在培养物中成熟，并形成突触。在体外第18-19天(Div，体外天数)，用ECS培养基(无Mg2+的胞外溶液，其含有下述的：25mM HEPES酸、140mM NaCl、33mM葡萄糖、5.4mM KCl和1.3mM CaCl2，pH 7.35，渗透压320-330mOsm)或含有50μM NMDA和20μM甘氨酸的ECS培养基替换NBActive4培养基1小时。在NMDA甘氨酸处理后1小时，用冷PBS冲洗细胞，然后在裂解缓冲液(Tris 20mM、NaCl 150mM、0.1％Triton)中裂解，用于蛋白印迹分析。
对于蛋白印迹，将还原剂和SDS装载缓冲液加入20μg细胞裂解物中，并煮沸5分钟，然后上4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)。然后使用iBlot装置(Invitrogen)按生产商说明书转移凝胶。在含5％奶的TBST(Tris-缓冲盐水，1％吐温20)中封闭印迹1小时。封闭后，用针对磷酸JNK(9251LCell Signaling Technologies)、磷酸cJUN(9261L Cell SignalingTechnologies)、磷酸P38(4511 Cell Signaling Technologies)、单克隆β-微管蛋白(T5201 Sigma)和DLK(Genentech)的第一抗体温育印迹过夜。在含有5％BSA的TBST中，按1∶1000稀释所有抗体。温育后，用TBST洗涤印迹3次，随后与HRP-缀合的抗-兔第二抗体在室温温育1小时。再洗涤印迹三次，随后与ECL(Promega)温育1分钟。使用BioRad VersaDocTM凝胶成像系统，分析印迹。
为了测定DLK KO皮质神经元是否被更多地保护免于NMDA诱导的神经元变性，使用CytoTox非放射性的LDH试验试剂盒(Promega)测定乳糖酶脱氢酶(LDH)水平，以评估细胞死亡的量。如上所述，培养来自WT、HET和DLK KO小鼠的皮质神经元。允许小鼠皮质神经元在培养物中成熟，并形成突触。在体外第18-19天，用ECS培养基或含有50μMNMDA和20μM甘氨酸的ECS培养基替换NBActive4培养基1小时。在处理1小时后，用条件NBActive4培养基替换ECM。在12小时后，按照生产商的方案(CytoTox
Figure BDA0000155526810001091
非放射性的细胞毒性试验-Promega)，进行LDH试验。
根据生产商的说明书，将50μL来自每个神经元群体的培养基用于LDH试验中。定量释放的LDH的量，并针对最大LDH释放(从用生产商提供的裂解缓冲液裂解的孔读出)和最小LDH释放(从没有NMDA处理的孔读出)归一化。％细胞毒性＝(NMDA处理-未处理)/(最大裂解-未处理)X 100。
蛋白印迹和LDH试验二者的结果如图53所示。与WT或HET对照相比，来自DLK KO小鼠的皮质神经元被更多地保护免于NMDA诱导的变性。此外，来自DLK KO小鼠的神经元表现出JNK/cJun和p38途径的活化的减少。与未处理的神经元相比，在用NMDA处理的野生型和杂合神经元中，磷酸化的cJun、p38和JNK的水平升高，这指示不同途径的活化。但是，与未处理的DLK KO神经元相比，在用NMDA处理的DLK KO神经元中，磷酸化的cJun、p38和JNK的水平保持不变，这指示在敲除的小鼠中缺少这些途径的活化。这些结果进一步支持了DLK作为在JNK/cJun上游的、并是皮质神经元中的p38应激应答途径的主要激酶的作用，并提示，DLK是在NMDA介导的兴奋性中毒下游的神经元死亡的重要调节剂。
还值得注意的是，在用NMDA处理后，DLK蛋白水平显著增加(数据未显示)。该发现也暗示，DLK是针对NMDA诱导的神经元应激的响应的关键调节剂，因为DLK蛋白水平与神经元变性相关。
实施例19
注射了DN-DLK的脑缺少磷酸化的cJun神经元
为了进一步研究DLK在中枢神经系统神经元的神经保护中的作用，检查了磷酸化的cJun(p-cJun)在小鼠脑中的存在，所述小鼠脑被注射了表达GFP的腺伴随病毒(AAV GFP)或表达仅含有亮氨酸拉链结构域的DLK显性失活形式的腺伴随病毒(AAV DLK-LZ)，如在Chen等人，J.Neurosci.(神经科学杂志)28：672-680，2008中所述。
具体地，将1-2μL浓缩的(1012或1013病毒基因组/mi)AAV GFP或AAV DLK-LZ脑功能区定位地注射进皮质、海马和/或纹状体。5-7天后，处死小鼠，用PBS灌注，随后用4％低聚甲醛灌注。切开脑，在30％蔗糖/PBS中冷冻保存，并切片。通过在10％小羊血清和0.5％PBS TritonX-100中封闭切片，进行磷酸化的c-jun的免疫组织化学，然后用1∶200抗-磷酸化的c-jun抗体(Cell Signaling Technologies)在4℃温育切片过夜。次日，用PBS洗涤切片，并用荧光第二抗体在室温温育2小时，再用PBS洗涤，并盖上盖玻片，在荧光显微镜上分析。在整个脑切片中，定量单独磷酸c-jun阳性细胞和双标记的磷酸c-jun/GFP阳性细胞。
图54显示了神经元的数目，它们在用AAV GFP或AAV DLK-LZ注射的小鼠脑中是p-cJun阳性的。与AAV GFP感染的小鼠相比，AAVDLK-LZ感染的小鼠具有更少的c-jun阳性的神经元。我们接下来通过分析被AAV DLK-LZ双标记的细胞(其也表达GFP和磷酸c-jun)，检查了显性失活DLK过表达的细胞自发效应。在AAV DLK-LZ注射的小鼠中，没有检测到含有p-cJun和GFP二者的神经元，这指示，DLK显性失活形式抑制了磷酸化的c-jun表达。实际上，仅在被AAV GFP载体感染的小鼠中，观察到p-cJun和GFP阳性的神经元。我们的结论是，DLK显性失活形式的表达是保护性的，这至少部分地归因于c-jun磷酸化和活化(已知这在神经元细胞凋亡和变性中起作用)的抑制。
实施例20
显性失活的DLK会减轻癫痫发作强度
为了进一步检查DLK在神经元保护中的作用，在癫痫发作模型中检查了DLK的影响。具体地，如在前面部分中所述，给c57BL6小鼠注射2微升AAV GFP或AAV DLK-LZ。5-7天后，给小鼠注射25mg/kg的卡英酸，以诱导癫痫发作(Yang等人，Nature(自然)389：865-870，1997)。根据Racine癫痫发作评分指标，在3小时时间段内每5分钟评价癫痫发作强度。
来自这些实验的结果如图55所示。与对照AAV GFP感染的小鼠相比，被注射了AAV DLK-LZ的小鼠具有减轻的癫痫发作活动。我们的结果与以前用JNK3敲除的小鼠得到的观察结果(Yang等人，Nature(自然)389：865-870，1997)相一致，并强烈地提示，DLK是在该模型中引起癫痫发作活动减少的主要上游激酶。
该数据支持了DLK在兴奋性中毒诱导的体内变性中所起的关键作用，其已经涉入许多神经变性病症，包括中风和阿尔茨海默病。因而，DLK抑制会保护使用疾病相关应激的活成年动物的脑中的神经元。
其它实施方案
在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入，如同每一单个出版物或专利被明确和单独地指出通过引用并入一样。在本文中使用的单数形式，如“一个”和“该”不排除对应的复数形式，除非上下文相反地指出。尽管为清楚理解目的已经通过例证和实施例详细描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，按照本发明教导，可对其进行某些改变和修改，而不背离所附权利要求的精神或范围。
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Claims (34)

1.用于抑制或预防中枢神经系统(CNS)神经元或其部分的变性的方法，所述方法包括：向所述CNS神经元施用抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)活性或表达的试剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CNS神经元的轴突或细胞体部分中的变性受到抑制或得以预防。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述CNS神经元选自由以下各项组成的组：小脑颗粒神经元、皮质神经元和海马神经元。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述CNS神经元不是多巴胺能神经元。
5.如权利要求1所述的方法，其中，与未用所述试剂治疗的神经元群体相比，所述施用导致神经元群体的变性减少至少10％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述试剂是DLK信号传导的抑制剂。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述试剂是DLK表达的抑制剂。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述试剂选自由以下各项组成的组：抗体、短的干扰RNA(siRNA)、多肽、肽体、反义多核苷酸、适配体、小分子和多糖。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体选自由以下各项组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述试剂选自由以下各项组成的组：靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、DLK的显性失活形式、DLK的激酶死亡形式和它们的组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中向所述CNS神经元的施用离体进行。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：在所述试剂施用后，将所述CNS神经元移植或植入到人患者中。
13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述CNS神经元存在于人患者中。
14.如权利要求13所述的方法，其中向所述CNS神经元的施用包括施用在药学上可接受的载体中的所述试剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中向所述CNS神经元的施用通过选自由下述各项组成的组的施用途径进行：肠胃外的、皮下的、静脉内的、腹膜内的、大脑内的、损害内的、肌肉内的、眼内的、动脉内的、间质输注和植入式递送装置。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法还包括：施用一种或多种另外的药物试剂。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述试剂的施用导致：JNK磷酸化、JNK活性和/或JNK表达的降低。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述试剂的施用导致：cJun磷酸化、cJun活性和/或cJun表达的降低。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述试剂的施用导致：p38磷酸化、p38活性和/或p38表达的降低。
20.如权利要求12或13所述的方法，其中所述患者患有神经变性疾病或病症，或处于发生神经变性疾病或病症的风险中。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述神经变性疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、帕金森叠加病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、缺血、中风、颅内出血、脑出血、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝耳麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征、颈椎病、神经丛病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、雷维小体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、进行性神经性腓骨肌萎缩症、朊病毒病、克-雅病、格-施-沙综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)、牛海绵样脑病、皮克病、癫痫、艾滋病痴呆综合征；神经损伤，其由暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物或化学治疗剂引起；神经系统损伤，其由物理、机械或化学损伤引起；青光眼、格子状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光感受器变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病和视神经炎。
22.用于减轻或预防神经变性疾病或病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括：向患者施用抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性或表达的试剂。
23.用于减缓神经变性疾病或病症的进展的方法，所述方法包括：向患者施用抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性或表达的试剂。
24.抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的活性或表达的试剂在药物制备中的应用，所述药物抑制或预防中枢神经系统(CNS)神经元或其部分的变性。
25.如权利要求24所述的应用，其中所述药物减轻神经变性疾病或病症的一种或多种症状，或减少发生神经变性疾病或病症的可能性。
26.如权利要求25所述的应用，其中所述神经变性疾病或病症选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、帕金森叠加病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、缺血、中风、颅内出血、脑出血、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝耳麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征、颈椎病、神经丛病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、雷维小体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、进行性神经性腓骨肌萎缩症、朊病毒病、克-雅病、格-施-沙综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)、牛海绵样脑病、皮克病、癫痫、艾滋病痴呆综合征；神经损伤，其由暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物或化学治疗剂引起；神经系统损伤，其由物理、机械或化学损伤引起；青光眼、格子状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光感受器变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病和视神经炎。
27.如权利要求24-26中任一项所述的应用，其中所述试剂选自由以下各项组成的组：抗体、短的干扰RNA(siRNA)、多肽、肽体、反义多核苷酸、适配体、小分子和多糖。
28.如权利要求27所述的应用，其中所述抗体选自由以下各项组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
29.如权利要求27所述的应用，其中所述试剂选自由以下各项组成的组：靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、DLK的显性失活形式；DLK的激酶死亡形式；和它们的组合。
30.如权利要求24-29中任一项所述的应用，其中所述药物配制用于通过选自由下述各项组成的组的途径施用：肠胃外的、皮下的、静脉内的、腹膜内的、大脑内的、损害内的、肌肉内的、眼内的、动脉内的、间质输注和植入式递送装置。
31.如权利要求24-30中任一项所述的应用，其中所述药物还包含一种或多种另外的药物试剂。
32.如权利要求24-31中任一项所述的应用，其中所述药物减少JNK磷酸化、JNK活性和/或JNK表达。
33.如权利要求24-32中任一项所述的应用，其中所述药物减少cJun磷酸化、cJun活性和/或cJun表达。
34.如权利要求24-33中任一项所述的应用，其中所述药物减少p38磷酸化、p38活性和/或p38表达。
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