ES2437110T3 - Moduladores de la regeneración neuronal - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un antagonista de PirB/LILRB que comprende poner en contacto un agente candidatocon un complejo que comprende PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de lamisma, y detectar la capacidad de dicho agente candidato para inhibir la interacción entre PirB/LILRB y dicha mielinao proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en la que el agente candidato se identifica como unantagonista si se inhibe la interacción.

Description

Moduladores de la regeneración neuronal

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al desarrollo neural y trastornos neurológicos. La invención se refiere específicamente a la identificación de nuevos moduladores del sistema inhibidor asociado a mielina y diversos usos de los moduladores así identificados.

Antecedentes de la invención

Mielina y proteínas asociadas a mielina

15 Se sabe que los axones de las neuronas del SNC de adultos tienen una capacidad muy limitada para regenerarse después de una lesión, mientras que los axones en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran rápidamente. La capacidad limitada de las neuronas del SNC para regenerarse es en parte una propiedad intrínseca de los axones del SNC, pero también se debe a un ambiente no permisible. La mielina del SNC, aunque no es la única fuente de señales inhibidoras para la extensión de neuritas, contiene numerosas moléculas inhibidoras que bloquean activamente el crecimiento axonal y de este modo constituye una barrera significativa a la regeneración. Se han identificado tres de dichas proteínas asociadas a mielina (MAP): Nogo (también conocida como NogoA) es un miembro de la familia de proteínas Reticulón que tienen dos dominios transmembrana; la glicoproteína asociada a mielina (MAG) es una proteína transmembrana de la superfamilia de la Ig; y OMgp es una proteína con repeticiones ricas en leucina (LRR) con un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Chen et al., Nature 403: 434-39 (2000);

25 GrandPre et al., Nature 417: 439-444 (2000); Prinjha et al., Nature 403: 383-384 (2000); McKerracher et al, Neuron

13: 805-11 (1994); Wang et al, Nature 417: 941-4 (20020: Kottis et al J. Neurochem 82: 1566-9 (2002)). Se ha descrito una parte de NogoA, Nogo66, como un polipéptido extracelular de 66 aminoácidos que se encuentra en las tres isoformas de Nogo.

A pesar de sus diferentes estructurales, se ha mostrado que las tres proteínas inhibidoras (también Nogo66) se unen al mismo receptor anclado en GPI, llamado receptor de Nogo (NgR; también conocido como Receptor de Nogo 1 o NgR1), y se ha propuesto que podría requerirse NgR para mediar en las acciones inhibidoras de Nogo, MAG y OMgp. Fournier et al., Nature 409: 341-346 (2001). También se han identificado dos homólogos de NgR1 (NgR2 y NgR3). Documento US 2005/0048520 A1 (Strittmatter et al.), publicado el 3 de marzo de 2005. Dado que NgR es

35 una proteína de superficie celular anclada a GPI, es poco probable que sea un transductor de señal directo (Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1205-1210 (2005)). Otros han sugerido que el receptor de neurotrofina p75NTR actúa como un correceptor para NgR y proporciona el resto transductor de señal en un complejo receptor (Wang et al., Nature 420: 74-78 (2002); Wong et al., Nat. Neurosci. 5: 1302-1308 (2002)).

Sin embargo, recientes estudios del complejo receptor NgR/p75NTR ha planteado interrogantes acerca del papel del NgR en el sistema inhibidor asociado a mielina. Zheng et al. han mostrado que la supresión genética de NgR no reduce la inhibición de neuritas in vitro ni promueve la regeneración del tracto corticoespinal (CST) in vivo. Zheng et al. (2005), mencionado anteriormente. Coherentemente con estos resultados, otro estudio no consiguió detectar ninguna regeneración potenciada del CST en ratones mutantes para NgR. Kim et al., Neuron 44: 439- 451 (2004).

45 Estos hallazgos contradicen la hipótesis de que el complejo receptor NgR/p75NTR representa el punto de convergencia clave para múltiples señales inhibidoras. La incapacidad de regeneración del CST en ratones mutantes para NgR contrasta con la regeneración del CST observada con animales de tipo silvestre tratados con un péptido antagonista de la interacción Nogo66/NgR (GrandPre et al. Nature 417: 5470551 (2002) y Li y Strittmatter, Nature 23: 4219- 4227 (2002)). Otro estudio ha mostrado que la expresión de un fragmento negativo dominante de NgR conduce a la regeneración potenciada de axones del nervio óptico en combinación con una lesión condicional. Ninguno de estos experimentos consiguió ensayar directamente la implicación de NgR, ya que ambos péptidos antagonistas tienen el potencial de interferir con otros ligandos/receptores inhibidores.

Estas inconsistencias con los resultados experimentales son una fuerte indicación de que NgR, o el complejo

55 receptor NgR/p75NTR, podrían desempeñar un papel limitado en la inhibición asociada a mielina de la regeneración del SNC, y otros componentes, tales como receptores adicionales o compañeros de unión, podrían participar en la transmisión de la señal inhibidora.

PirB y ortólogos humanos

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I se identificó originalmente como una región que codifica una familia de moléculas que son importantes para el sistema inmunitario. Recientes pruebas han indicado que las moléculas del MHC de clase I tienen funciones adicionales en el SNC en desarrollo y del adulto. Boulanger y Shatz, Nature Rev Neurosci. 5: 521-531 (2004); documento US 2003/0170690 (Shatz y Syken), publicado el 11 de 65 septiembre de 2003. Se ha descubierto que muchos de los miembros del MHC de clase I y sus compañeros de unión se expresan en neuronas del SNC. Recientes estudios genéticos y moleculares se han centrado en las

funciones fisiológicas del MHC de clase I del SNC, y los resultados iniciales sugieren que las moléculas del MHC de clase I podrían estar implicadas en plasticidad sináptica dependiente de actividad, un proceso durante el cual la fuerza de las conexiones sinápticas existentes aumenta o se reduce en respuesta a la actividad neuronal, seguido de alteraciones estructurales a largo plazo en los circuitos. Además, la región codificante del MHC de clase I también

5 se ha ligado genéticamente a una amplia diversidad de trastornos con síntomas neurológicos, y se cree que las funciones anómalas de las moléculas del MHC de clase I contribuyen a la alteración del desarrollo y la plasticidad normales del cerebro.

Uno de los receptores del MHC de clase I conocidos en el ambiente inmunitario es PirB, un polipéptido murino que se describió por primera vez por Kubagawa et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 5261- 6 (1997). El PirB de ratón tiene varios ortólogos humanos, que son miembros de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos (LILRB), y también se denominan “transcritos de tipo inmunoglobulina” (ILT). Los ortólogos humanos muestran homología significativa con la secuencia murina, en el siguiente orden de mayor a menor: LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3, LILRB2/ILT4, y, al igual que PirB, son todos receptores inhibidores. LILRB3/ILT5 (NP_ 15 006855) y LILRB1/ILT2 (NP_ 006660) se describieron en primer lugar por Samaridis y Colonna, Eur. J. Immunol. 27 (3): 660- 665 (1997). LILRB5/ILT3 (NP_ 006831) se ha identificado por Borges et al., J. Immunol. 159 (11): 51925196 (1997). LILRB2/ILT4 (también conocido como MIR10), se ha identificado por Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997). PirB y sus ortólogos humanos muestran un alto grado de variabilidad estructural. Las secuencias de diversas formas cortadas y empalmadas de forma alternativa están disponibles de EMBL/GenBank, incluyendo, por ejemplo, los siguientes números de referencia para ADNc de ILT4 humano: ILT4-c11 AF009634; ILT4-c117 AF11566; ILT4-c126 AF11565. Como se ha observado anteriormente, los polipéptidos de PirB/LILRB son receptores inhibidores del MHC de Clase I (MHCI), y se conocen por su papel en la regulación de la activación de células inmunitarias (Kubagawa et al., mencionado anteriormente; Hayami et al., J. Biol. Chem. 272: 7320 (1997); Takai et al., Immunology 115: 433 (2005); Takai et al., Immunol. Rev. 181: 215 (2001); Nakamura et al. Nat. Immunol. 5: 623

25 (2004); Liang et al., Eur. J. Immunol. 32: 2418 (2002)).

Un reciente estudio de Syken et al. Science 313: 1795-800 (2006)) indicó que PirB se expresa en subconjuntos de neuronas por todo el cerebro. En ratones mutantes sin PirB funcional, la plasticidad de dominancia ocular cortical (OD) se potencia significativamente a todas las edades, lo que sugiere función del PirB en la restricción de la plasticidad dependiente de actividad en el córtex visual.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente hallazgo de que PirB/LILRB son compañeros de unión para Nogo (Nogo66) y MAG, y que los antagonistas de PirB/LILRB y la actividad de PirB/LILRB reducida alteran significativamente la ruta inhibidora asociada a mielina, promoviendo de este modo la regeneración neuronal.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar un antagonista de PirB/LILRB que comprende poner en contacto un agente candidato con un complejo receptor que comprende PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma, y detectar la capacidad del agente candidato para inhibir la interacción entre PirB/LILRB y la proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en el que el agente candidato se identifica como un antagonista si se inhibe la interacción.

En una realización, la interacción detectada es unión.

45 En otra realización, la interacción detectada es señalización celular.

En una realización adicional, la señalización celular da como resultado la inhibición del crecimiento de axones o la regeneración neuronal.

En una realización adicional más, la proteína asociada a mielina se selecciona del grupo que consiste en Nogo, MAG, OMgp y fragmentos de las mismas.

En otra realización, PirB/LILRB es una proteína LILRB humana, tal como LILRB1, LILRB2, LILRB3 o LILRB5.

55 En ciertas realizaciones específicas, PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2), LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14), LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10), LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11), LILRB 1, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 12), LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13), LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15), LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16), LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17). LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18) y LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19).

En una realización adicional, el complejo receptor comprende además NgR.

65 En diferentes realizaciones, el agente candidato se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas pequeñas, polisacáridos y polinucleótidos, y preferentemente es un anticuerpo o un ARN de interferencia corto (ARNip). El anticuerpo preferentemente se une de forma específica a PirB/LILRB, tal como LIRB2, e incluye, sin limitación, anticuerpo y fragmentos de anticuerpo quiméricos, humanizados y humanos.

5 En una realización particular, el fragmento de anticuerpo se elige del grupo que consiste en fragmentos Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2.

En una realización adicional, al menos uno de PirB/LILRB y la mielina o la proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, se inmoviliza.

En una realización adicional más, el ensayo es un ensayo basado en células.

En una realización particular, el ensayo basado en células comprende cultivar células neuronales con la mielina o proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en presencia y ausencia de un agente candidato y determinar

15 el cambio en la longitud de las neuritas, en el que el agente candidato se identifica como un antagonista cuando la longitud de las neuritas es mayor en presencia del agente candidato.

En el ensayo basado en células anterior, las células neuronales pueden ser principalmente neuronas, o pueden, por ejemplo, derivar de células o líneas celulares, incluyendo células madre, por ejemplo células madre embrionarias (ES) no humanas. En otras realizaciones, las neuronas pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en neuronas granulares cerebelares, neuronas de ganglios de la raíz dorsal y neuronas corticales.

En una realización, los métodos descritos anteriormente comprenden además la etapa in vitro de usar un anticuerpo antagonista anti-PirB/LILRB que se ha identificado que potencia la extensión de neuritas, y/o promover el

25 crecimiento, reparación y/o regeneración neuronal.

La invención también proporciona un anticuerpo antagonista anti-PirB/LILRB identificado anteriormente, para su uso en el tratamiento de lesión neuronal o un trastorno neurológico, que puede caracterizarse por un nervio dañado físicamente, o puede seleccionarse del grupo que consiste en daño a los nervios periféricos provocado por lesión física, o diabetes; daño físico al sistema nervioso central; daño cerebral asociado con ictus, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de discos intervertebrales herniados, rotos y prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de

35 Huntington y enfermedad de Parkinson.

En otro aspecto más, la invención se refiere al uso de un complejo de PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma, para identificar un antagonista de PirB/LILRB.

En un aspecto diferente, la invención se refiere al uso de un antagonista de PirB/LILRB como se define en las reivindicaciones en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico, en el que el trastorno neurológico puede caracterizarse por un nervio dañado físicamente, o puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en daño a los nervios periféricos provocado por lesión física, o diabetes; daño físico al sistema nervioso central; daño cerebral asociado con ictus, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis

45 de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de discos intervertebrales herniados, rotos y prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra actividad Alcalina Fosfatasa en células COS transfectadas después de incubación con AP-Nogo66. AP-Nogo66 se une a PirB y LILRB2.

55 La Figura 2 muestra inmunorreactividad en células COS transfectadas después de incubación con MAG-Fc. MAG se une a PirB y LILRB2. La Figura 3 muestra resultados de RT-PCR que demuestran la expresión de SMAGP, PAN-PirA y PirB en diversas partes del sistema nervioso. Las Figuras 4A-4C confirman, mediante hibridación in situ, la expresión de PirB en el prosencéfalo del adulto (A), cerebelo del adulto (B) y Ganglio de la Raíz Dorsal P 10 (C). La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de PirB de ratón (SEC ID Nº: 1) y una secuencia de aminoácidos de variante de transcrito 1 de LILRB2 humano (SEC ID Nº: 2). La Figura 6 ilustra la inhibición por Nogo66 del crecimiento de los axones, y la inversión de dicha inhibición por PirB ECD (tanto PirBFc como PirBHis). Se usaron neuronas granulares cerebelares para el ensayo.

65 La Figura 7 muestra inmunoprecipitación conjunta de PirB y NgR. NgR se precipita conjuntamente de forma robusta con PirB (panel izquierdo). El panel derecho muestra la proteína total de lisados celulares completos

inmunotransferidos con anti-NgR. Las múltiples bandas (flechas) representan NgR procesado por glicosilación en diversos grados. La Figura 8 muestra que la inhibición por Nogo66 del crecimiento de los axones se rescata parcialmente por anticuerpos anti-PirB en neuronas granulares cerebelares.

5 La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10). La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11). La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB1, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 12). La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13). La Figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14). La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15). La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16). La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17). La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18). La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19).

Descripción detallada de la invención

A. Definiciones

Las expresiones “receptor de tipo inmunoglobulina emparejada B” y “PirB” se usan de forma intercambiable en la presente memoria, y se refieren a una proteína inhibidora de ratón de 841 aminoácidos, de secuencia nativa, de SEC ID Nº: 1 (Figura 5) (NP_ 035225), y sus homólogos de secuencia nativa en rata y otros mamíferos no humanos, incluyendo todas las variantes de origen natural, tales como variantes de transcrito de corte y empalme alternativo y variantes alélicas e isoformas, así como formas solubles de las mismas.

25 Los términos “LILRB”, “ILT” y “MIR,” se usan de forma intercambiable en la presente memoria, y se refieren a todos los miembros de la “subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos” humana, incluyendo todas las variantes de origen natural, tales como variantes de transcrito de corte y empalme alternativo y variantes alélicas e isoformas, así como formas solubles de las mismas. Los miembros individuales dentro de esta familia se designan por números después del acrónimo, tal como, por ejemplo, LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3 y LIRB2/ILT4, en los que una referencia a cualquier miembro individual, a no ser que se indique de otro modo, también incluye referencia a todas las variantes de origen natural, tales como variantes de transcrito de corte y empalme alternativo y variantes alélicas e isoformas, así como formas solubles de las mismas. Por lo tanto, por ejemplo, “LILRB1” se usa en la presente memoria para incluir específicamente las variantes de transcrito 1-4 (SEC ID Nº: 10, 11, 12 y 13,

35 mostradas en las Figuras 9-12), así como todas las otras variantes de origen natural, tales como otras variantes de transcrito de corte y empalme alternativo, variantes alélicas e isoformas, y formas solubles de las mismas. El término “LILRB2” se usa en la presente memoria para incluir específicamente LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2, mostrada en la Figura 5) y variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14, mostrada en la Figura 13), así como todas las otras variantes de origen natural, tales como otras variantes de transcrito de corte y empalme alternativo, variantes alélicas e isoformas, y formas solubles de las mismas. El término “LILRB3” se usa en la presente memoria para incluir específicamente LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15, mostrado en la Figura 14) y variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16, mostrado en la Figura 15), así como todas las otras variantes de origen natural, tales como otras variantes de transcrito de corte y empalme alternativo, variantes alélicas e isoformas, y formas solubles de las mismas. El término “LILRB5” incluye específicamente las variantes de transcrito 1-3 (SEC ID Nº: 17-19,

45 mostradas en las Figuras 16-18), así como todas las otras variantes de origen natural, tales como otras variantes de transcrito de corte y empalme alternativo, variantes alélicas e isoformas, y formas solubles de las mismas.

El término “PirB/LILRB” se usa en la presente memoria como una descripción abreviada para hacer referencia a cualquiera de las proteínas PirB de ratón y LILRB humanas individuales y homólogos de secuencias nativas en otros mamíferos no humanos, incluyendo todas las variantes de origen natural, tales como variantes de transcrito de corte y empalme alternativo y alélicas e isoformas, así como formas solubles de las mismas.

La expresión “proteína asociada a mielina” se usa en el sentido más amplio e incluye todas las proteínas presentes en la mielina del SNC que inhiben la regeneración neuronal, incluyendo Nogo, MAG y OMgp.

55 “Aislado”, cuando se usa para describir las diversas proteínas desveladas en la presente memoria, significa una proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que normalmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria o

(2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata, o (3) hasta la homogeneidad mediante técnicas de espectroscopia de masas o mapeo de péptidos. La proteína aislada incluye proteína in situ dentro de células recombinantes, puesto

65 que al menos un componente del ambiente natural de la proteína en cuestión no estará presente. De forma habitual, sin embargo, la proteína aislada se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico en cuestión. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta a la de la forma o situación en la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen por lo tanto de las moléculas

5 de ácido nucleico como existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye moléculas de ácido nucleico contenidas en células que expresan habitualmente dicho ácido nucleico cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “antagonista de PirB/LILRB” se usa para hacer referencia a un agente capaz de bloquear, neutralizar, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de PirB/LILRB. Particularmente, el antagonista de PirB/LILRB interfiere con actividades inhibidoras asociadas con mielina, potenciando de este modo la extensión de neuritas y/o promoviendo el crecimiento, reparación y/o regeneración neuronal. En una realización preferida, el antagonista de PirB/LILRB inhibe la unión de PirB/LILRB con Nogo66 y/o

15 MAG y/u OMgp uniéndose a PirB/LILRB. Los antagonistas de PirB/LILRB incluyen, por ejemplo, anticuerpos para PirB/LILRB y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, fragmentos truncados o solubles de PirB/LILRB, Nogo 66, MAG u OMgp que son capaces de secuestrar la unión entre PirB/LILRB y Nogo 66, o entre PirB/LILRB y MAG, o entre PirB/LILRB y OMgp y moléculas pequeñas inhibidoras de la ruta inhibidora relacionada con PirB/LILRB. Los antagonistas de PirB/LILRB también incluyen moléculas de ARN de interferencia corto (ARNip) capaces de inhibir o reducir la expresión de ARNm de PirB/LILRB.

El termino “anticuerpo” en la presente memoria se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos intactos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo,

25 siempre que muestren la actividad biológica deseada.

La expresión “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminación por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” indica que el carácter del

35 anticuerpo se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el método del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624- 628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581- 597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular

45 o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es idéntico a u homólogo de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos privatizados que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo Monos del Viejo Mundo, Simios etc.) y secuencias de región constante humana.

Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente que comprende la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos

55 Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento o fragmentos de anticuerpo.

Un anticuerpo “intacto” es uno que comprende una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo roedores) son anticuerpos quiméricos que

65 contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan restos de la región marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se

5 encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Esas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv), en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

La expresión “región hipervariable” cuando se usa en la presente memoria se refiere a las regiones de un dominio

15 variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir los restos 24-34, 50-56 y 89-97 en el dominio variable de cadena ligera y 31-35, 50-65 y 95-102 en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un “bucle hipervariable” (es decir los restos 26-32, 50-52 y 91-96 en el dominio variable de cadena ligera y 26-32, 53-55 y 96-101 en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). En ambos casos, los restos de dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., mencionado anteriormente, como se analiza en más detalle posteriormente. Los restos de “marco” o “FR” son los restos de dominio variable distintos de los restos de las regiones hipervariables como se definen en la presente memoria.

25 Un “anticuerpo parental” o anticuerpo de “tipo silvestre” es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que carece de una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos en comparación con una variante de anticuerpo como se desvela en la presente memoria. Por lo tanto, el anticuerpo parental generalmente tiene al menos una región hipervariable que difiere en su secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la región hipervariable correspondiente de una variante de anticuerpo como se desvela en la presente memoria. El polipéptido parental puede comprender un anticuerpo de secuencia nativa (es decir uno de origen natural) (incluyendo una variante alélica de origen natural), o un anticuerpo con modificaciones de secuencia de aminoácidos preexistentes (tales como inserciones, deleciones y/u otras alteraciones) de una secuencia de origen natural. A lo largo de la divulgación, se usan de forma intercambiable anticuerpo “de tipo silvestre”, “WT”, “wt” y “parental”.

35 Como se usa en la presente memoria, “variante de anticuerpo” o “anticuerpo variante” se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo parental. Preferentemente, la variante de anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada o un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza. Dichas variantes necesariamente tienen menos del 100 % de identidad o similitud de secuencia con el anticuerpo parental. En una realización preferida, la variante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 75 % a menos del 100 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo parental, más preferentemente de aproximadamente el 80 % a menos del 100 %, más preferentemente de aproximadamente el 85 % a menos del 100 %, más

45 preferentemente de aproximadamente el 90 % a menos del 100 %, y más preferentemente de aproximadamente el 95 % a menos del 100 %. La variante de anticuerpo es generalmente una que comprende una o más alteraciones de aminoácidos en o adyacente a una o más regiones hipervariables del mismo.

Una “alteración de aminoácidos” se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Las alteraciones a modo de ejemplo incluyen inserciones, sustituciones y deleciones. Una “sustitución de aminoácidos” se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada; con otro resto de aminoácido diferente.

Un resto de aminoácido “de reemplazo” se refiere a un resto de aminoácido que reemplaza o sustituye otro resto de

55 aminoácido en una secuencia de aminoácidos. El resto de reemplazo puede ser un resto de aminoácido de origen natural o de origen no natural.

Una “inserción de aminoácidos” se refiere a la introducción de uno o más restos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos predeterminada. La inserción de aminoácidos puede comprender una “inserción peptídica” en cuyo caso se introduce un péptido que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos por enlace o enlaces peptídicos en la secuencia de aminoácidos predeterminada. Cuando la inserción de aminoácidos implica inserción de un péptido, el péptido insertado puede generarse por mutagénesis aleatoria de modo que tenga una secuencia de aminoácidos que no existe en la naturaleza. Una alteración de aminoácidos “adyacente a una región hipervariable” se refiere a la introducción o sustitución de uno o más restos de aminoácidos en el extremo N terminal

65 y/o C terminal de una región hipervariable, de modo que al menos uno del resto o los restos de aminoácidos insertados o de reemplazo formen un enlace peptídico con el resto de aminoácido N terminal o C terminal de la región hipervariable en cuestión.

Un “resto de aminoácido de origen natural” es uno codificado por el código genético, generalmente seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys);

5 glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val).

Un “resto de aminoácido de origen no natural” en la presente memoria es un resto de aminoácido distinto de los

10 restos de aminoácidos de origen natural enumerados anteriormente, que puede unirse covalentemente al resto o restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. Los ejemplos de restos de aminoácidos de origen no natural incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de restos de aminoácidos tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991). Para generar dichos restos de aminoácidos de origen no natural, pueden usarse los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y Ellman et al.,

15 mencionado anteriormente. Brevemente, estos procedimientos implican activar químicamente un ARNt supresor con un resto de aminoácido de origen no natural mediante transcripción y traducción in vitro del ARN.

A lo largo de la presente divulgación, se hace referencia al sistema de numeración de Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)). En estos 20 compendios, Kabat enumera muchas secuencias de aminoácidos para anticuerpos para cada subclase, y enumera el aminoácido que aparece más habitualmente para cada posición de resto en esa subclase. Kabat usa un método para asignar un número de resto a cada aminoácido en una secuencia enumerada, y este método para asignar los números de resto se ha convertido en un patrón en este campo. En la presente descripción se sigue el sistema de numeración de Kabat. Para fines de la presente invención, para asignar números de restos a una secuencia de 25 aminoácidos de anticuerpo candidato que no está incluida en el compendio de Kabat, se siguen las siguientes etapas. Generalmente, la secuencia candidata se alinea con cualquier secuencia de inmunoglobulina o cualquier secuencia consenso en Kabat. El alineamiento puede realizarse manualmente, o mediante ordenador usando programas informáticos habitualmente aceptados; un ejemplo de dicho programa es el programa Align 2. El alineamiento puede facilitarse usando algunos restos de aminoácidos que son habituales para la mayoría de 30 secuencias de Fab. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada tienen normalmente cada una dos cisteínas que tienen los mismos números de restos; en el dominio VL las dos cisteínas están normalmente en los números de resto 23 y 88, y en el dominio VH los dos restos de cisteína se numeran normalmente 22 y 92. Los restos marco generalmente, pero no siempre, tienen aproximadamente el mismo número de restos, sin embargo las CDR variarán de tamaño. Por ejemplo, en el caso de una CDR de una secuencia candidata que es mayor que la CDR en la secuencia de

35 Kabat con la que se alinea, normalmente se añaden sufijos al número del resto para indicar la inserción de restos adicionales (véase, por ejemplo restos 100abc en la Figura 1B). Para secuencias candidatas que, por ejemplo, se alinean con una secuencia de Kabat para los restos 34 y 36 pero no tienen restos entre ellos para alinearse con el resto 35, el número 35 simplemente no se asigna a un resto.

40 Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo con una “alta afinidad” es un anticuerpo que tiene una KD, o constante de disociación, en el intervalo nanomolar (nM) o mejor. Una KD en el “intervalo nanomolar o mejor” puede indicarse por X nM, en el que X es un número menor de aproximadamente 10.

La expresión “fago filamentoso” se refiere a una partícula viral capaz de presentar un polipéptido heterogéneo en su

45 superficie, e incluye, sin limitación, f1, fd, Pf1 y M13. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable tal como tetraciclina (por ejemplo, “fd-tet”). Los expertos en la materia conocen bien diversos sistemas de presentación de fagos filamentosos (véase, por ejemplo, Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980), Smith et al. Science

228: 1315-1317 (1985); y Parmley y Smith Gene 73: 305-318 (1988)).

50 El término “selección” se usa para referirse a los múltiples ciclos de procedimiento de exploración en la identificación y aislamiento de fagos que portan compuestos, tales como anticuerpos, con alta afinidad y especificidad por una diana.

La expresión “ARN de interferencia corto (ARNip)” se refiere a ARN bicatenarios pequeños que interfieren con la

55 expresión génica. Los ARNip son un intermedio de interferencia de ARN, el proceso por el que el ARN bicatenario silencia genes homólogos. Los ARNip normalmente están comprendidos por dos ARN bicatenarios de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud que forman un complejo, que puede incluir un saliente o salientes monocatenarios. El procesamiento del ARN bicatenario por un complejo enzimático, por ejemplo por polimerasas, da como resultado la escisión del ARN bicatenario para producir ARNip. La cadena antisentido del ARNip se usa por un

60 complejo de silenciamiento de interferencia de ARN (ARNi) para guiar la escisión de ARNm, promoviendo de este modo la degradación de ARNm. Para silenciar un gen específico usando ARNip, por ejemplo en una célula de mamífero, la región que forma pares de bases se selecciona para evitar complementariedad aleatoria con un ARNm no relacionado. Se han identificado en la técnica complejos de silenciamiento de ARNi, tal como, por ejemplo, por Fire et al., Nature 391: 806- 811 (1998) y McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3 (10): 737- 47 (2002).

65 La expresión “ARN de interferencia (ARNi)” se usa en el presente documento para referirse a un ARN bicatenario que da como resultado degradación catalítica de ARNm específicos, y por lo tanto puede usarse para inhibir/reducir la expresión de un gen particular.

5 El término “polimorfismo” se usa en la presente memoria para referirse a más de una forma de un gen o una parte (por ejemplo, variante alélicas) del mismo. Una parte de un gen de la que hay al menos dos formas diferentes se denomina “región polimórfica” del gen. Una secuencia genética específica en una región polimórfica de un gen es un “alelo”. Una región polimórfica puede ser de un único nucleótido, que difiere en diferentes alelos, o puede ser de varios nucleótidos de longitud.

Como se usa en la presente memoria, el término “trastorno” en general se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con los compuestos de la presente invención, incluyendo cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse mediante cantidades eficaces de antagonistas de PirB/LILRB. Los ejemplos no limitantes de trastornos para tratar en la presente memoria incluyen, sin limitación, enfermedades y afecciones que 15 se benefician de la potenciación de la extensión de neuritas, promoción del crecimiento, reparación o regeneración neuronal, incluyendo trastornos neurológicos, tales como nervios dañados físicamente y enfermedades neurodegenerativas. Dichos trastornos incluyen específicamente daño a los nervios periféricos causado por lesión física, o patologías tales como diabetes; daño físico al sistema nervioso central (médula espinal y cerebro); daño cerebral asociado con ictus; y trastornos neurológicos que se relacionan con la neurodegeneración, tales como, por ejemplo, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de discos intervertebrales herniados, rotos o prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas tales como las provocadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad

25 de Parkinson.

Los términos “tratar”, “tratamiento” y “terapia” como se usan en la presente memoria se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica, y terapia preventiva. El tratamiento o la administración consecutiva se refieren al tratamiento al menos diariamente sin interrupción en el tratamiento de uno o más días. El tratamiento o la administración intermitente, o tratamiento o administración de manera intermitente, se refieren al tratamiento que no es consecutivo, sino de naturaleza cíclica.

La expresión “que previene neurodegeneración”, como se usa en la presente memoria incluye (1) la capacidad para inhibir o prevenir la neurodegeneración en pacientes a los que se acaba de diagnosticar que tienen una enfermedad

35 neurodegenerativa o en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa y (2) la capacidad para inhibir o prevenir neurodegeneración adicional en pacientes que ya padecen, o tienen síntomas de, una enfermedad neurodegenerativa.

El término “mamífero” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, primates no humanos superiores, roedores, animales domésticos y de granja tales como vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.

La administración “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración 45 simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para efectuar resultados terapéuticos beneficiosos o deseados (incluyendo preventivos). Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen descendencia. Por lo tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. El término “descendencia” se refiere a todos y

55 cada uno de los descendientes de cada generación posterior a una célula o línea celular transformada originalmente. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se explora en la célula transformada originalmente está incluida. Cuando se pretenden designaciones distintas, resultará evidente a partir del contexto.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias identificadas de la presente memoria se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que están dentro de 65 la experiencia de la técnica. Se pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo asignar algoritmos necesarios para conseguir el máximo alineamiento a lo largo de las secuencias de longitud

completa que se comparan. Para fines de la presente memoria, los valores de porcentaje de identidad de aminoácidos pueden obtenerse usando el programa informático de comparación de secuencias, ALIGN-2, que fue creado por Genentech, Inc. y cuyo código fuente se ha registrado con la documentación de usuario en la Oficina de Copyright de Estados Unidos, Washington, DC, 20559, registrado con el Nº de Registro de Copyright de Estados

5 Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación la puede determinar fácilmente un experto habitual en la materia, y

10 generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas mayores para hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridar cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseada entre la sonda y

15 la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se entiende que las temperaturas relativas mayores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas de reacción las harían menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

20 Las “condiciones de alta rigurosidad”, como se definen en la presente memoria se identifican por las que: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado; cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico 0,1 % a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante; formamida 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino 0,1 %/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0.1 %/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5

25 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean formamida al 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1 %, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 μg/ml), SDS 0,1 % y dextrán sulfato 10 % a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida 50 % a 55 ºC, seguido de lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 ºC.

30 Las “condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen incubación durante una noche a 37 ºC en una solución que comprende: formamida 20 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, dextrán sulfato 10 x y ADN de esperma de salmón cortado

35 desnaturalizado 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 ºC. El experto en la materia reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia

40 codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

45 El ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente con una secuencia codificante si se posiciona de modo que

50 facilite la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan los adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

55 Se define en la presente memoria que una “molécula pequeña” tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 1000 Dalton, preferentemente por debajo de aproximadamente 500 Dalton.

B. Ensayos de exploración para identificar estimuladores de la regeneración neuronal

60 Los ensayos primarios de la presente invención se basan al menos en parte en el reconocimiento de que PirB/LILRB es un receptor de las proteínas de mielina Nogo (Nogo66) y MAG, y que los antagonistas de PirB/LILRB, interfieren con la asociación de PirB/LILRB con Nogo y/o MAG, son capaces de potenciar la extensión de neuritas, y/o promover el crecimiento, reparación y/o regeneración neuronal. Brevemente, dichos agentes se denominarán en la

65 presente memoria estimuladores de la regeneración neuronal.

Pueden diseñarse ensayos de exploración para candidatos farmacológicos antagonistas para identificar compuestos que se unan o formen complejo con PirB/LILRB, o interfieran de otro modo con la interacción de PirB/LILRB con Nogo, MAG u otros miembros del sistema inhibidor asociado a mielina. Los ensayos de exploración proporcionados en la presente memoria incluyen ensayos susceptibles de exploración de alto rendimiento de bibliotecas químicas,

5 haciéndolos adecuados para identificar moléculas pequeñas candidatas farmacológicas. Generalmente, se proporcionan ensayos de unión y ensayos de actividad.

Los ensayos pueden realizarse en diversos formatos, incluyendo, sin limitación, ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de exploración bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Todos los ensayos para antagonistas son comunes porque requieren poner en contacto el candidato farmacológico con un polipéptido de PirB/LILRB en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir que estos dos componentes interaccionen.

15 En los ensayos de unión, la interacción es de unión, y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido PirB/LILRB o el candidato farmacológico está inmovilizado en una fase sólida, por ejemplo, una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se consigue recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido de PirB/LILRB y secando. Como alternativa, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido de PirB/LILRB para inmovilizar puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que puede marcarse con un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa, se retiran los componentes que no han reaccionado, por ejemplo, lavando, y se detectan los

25 complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se ha producido la formación de complejo. Cuando el componente no inmovilizado originalmente no porta un marcador, puede detectarse la formación de complejos, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente con el complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato es un polipéptido que interacciona con pero no se une a PirB/LILRB, la interacción de PirB/LILRB con el polipéptido respectivo puede ensayarse por métodos bien conocidos para detectar las interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, entrecruzamiento, inmunoprecipitación conjunta y purificación conjunta a través de gradientes o columnas de 35 cromatografía. Además, las interacciones proteína-proteína pueden controlarse usando un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres), 340: 245- 246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578- 9582 (1991)) como se desvela en Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5789- 5793 (1991). Muchos activadores de la transcripción, tales como GAL4 de levadura consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión a ADN, el otro que actúa como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente denominado el “sistema de dos híbridos”) aprovecha esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada con el dominio de unión a ADN de GAL4, y otra, en la que se fusionan proteínas activadoras candidatas con el dominio de activación. La expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad

45 de GAL4 mediante interacción proteína-proteína. Se detectan colonias que contienen polipéptidos que interaccionan con un sustrato cromogénico para β-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKER ™) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de dos híbridos está disponible en el mercado de Clontech. Este sistema también puede extenderse para mapear dominios proteicos implicados en interacciones proteicas específicas así como para señalar restos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.

Los compuestos que interfieren con la interacción de PirB/LILRB y otros componentes intra o extracelulares, en particular Nogo o MAG pueden ensayarse como sigue. Habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene PirB/LILRB y el componente intra o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permiten la interacción de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la interacción

55 de PirB/LILRB y Nogo o MAG, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para actuar como un control positivo.

Se enfatiza que los ensayos de exploración analizados específicamente en la presente memoria son solamente para ilustración. Se conocen bien por parte de los expertos en la materia otros diversos ensayos que pueden seleccionarse dependiendo del tipo de los candidatos antagonistas explorados (por ejemplo, polipéptidos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas no peptídicas, ácidos nucleicos, etc.) y son igualmente adecuados para los fines de la presente invención.

Los ensayos de la presente memoria pueden usarse para explorar bibliotecas de compuestos, incluyendo, sin

65 limitación, bibliotecas químicas, bibliotecas de productos naturales (por ejemplo colecciones de microorganismos, animales, plantas, etc.) y bibliotecas combinatorias comprendidas por péptidos aleatorios, oligonucleótidos o

moléculas orgánicas pequeñas. En una realización particular, los ensayos en la presente memoria se usan para explorar bibliotecas de anticuerpo, incluyendo, sin limitación, bibliotecas de anticuerpos humanos vírgenes, recombinantes, sintéticos y semisintéticos. La biblioteca de anticuerpos puede, por ejemplo, ser una biblioteca de presentación de fagos, incluyendo bibliotecas monovalentes, que presentan de media un anticuerpo monocatenario 5 o fragmento de anticuerpo por partícula de fago, y bibliotecas multivalentes, que presentan, de media, dos o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo por partícula viral. Sin embargo, las bibliotecas de anticuerpo para explorar de acuerdo con la presente invención no se limitan a bibliotecas de presentación de fagos. Otra técnica de presentación incluye, por ejemplo, presentación de ribosomas o ARNm (Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

91: 9022=9026 (1994); Hanes y Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-4942 (1997)), presentación de

10 células microbianas, tales como presentación bacteriana (Georgiou et al., Nature Biotech. 15: 29-34 (1997)), o presentación de células de levadura (Kieke et al., Protein Eng. 10: 1303-1310 (1997)), presentación en células de mamífero, presentación en esporas, presentación viral, tal como presentación retroviral (Urban et al., Nucleic Acids Res. 33: e35 (2005), presentación basada en enlace de proteína-ADN (Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA

101: 2806-2810 (2004); Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33: e10 (2005)), y presentación en microperlas (Sepp et 15 al., FEBS Lett. 532: 455-458 (2002)).

Los resultados obtenidos en los ensayos de interacción/unión primaria en la presente memoria pueden confirmarse en ensayos in vitro y/o in vivo de regeneración neuronal. Como alternativa, pueden usarse ensayos in vitro y/o in vivo de regeneración neuronal como ensayos primarios para identificar los antagonistas de PirB/LILRB en la

20 presente memoria.

Se conocen bien en la técnica ensayos in vitro de extensión de neuritas y se describen, por ejemplo, en Jin y Strittmatter, J Neurosci 17: 6256-6263 (1997); Fournier et al., Methods Enzymol. 325: 473-482 (2000); Zheng et al., Neuron 38: 213-224 (2003); Wang et al., Nature 417: 941-944 (2002), y Neumann et al., Neuron 34: 885-893 (2002)). 25 Están disponibles en el mercado kits para medir y cuantificar la extensión de neuritas. Por lo tanto, por ejemplo, el Kit de Ensayo de Extensión de Neuritas de CHEMICON (número de Catálogo NS200) usa tecnología de filtro microporoso para el ensayo cuantitativo de compuestos que influyen en la formación y repulsión de neuritas. Con este sistema, es posible explorar agentes biológicos y farmacológicos simultáneamente, evaluar directamente las funciones de receptor de adhesión y guía responsables de la extensión y repulsión de neuritas, así como el análisis

30 de la función génica en células transfectadas. El filtro microporoso permite la separación bioquímica y purificación de neuritas y cuerpos celulares para análisis molecular detallado de la expresión proteica, procesos de transducción de señal e identificación de dianas farmacológicas que regulan los procesos de extensión o retracción de neuritas.

En un protocolo típico, se cultivan neuronas primarias aisladas de tejido neural de roedor (incluyendo neuronas

35 granulares cerebelares, neuronas de los ganglios de las raíces dorsales y neuronas corticales) en placas de cultivo de 96 pocillos recubiertas con mielina completa o proteínas asociadas a mielina (por ejemplo, Nogo66, MAG y/o OMgp). Después de un tiempo definido en cultivo, normalmente 24-48 horas, las neuronas se fijan con paraformaldehído al 4 % y se tiñen con un marcador neuronal (anti tubulina de clase III b, Covance). Se realizan después adquisición y análisis de imágenes usando el sistema de captura de imágenes automático ImageXpress

40 (Molecular Devices). Los datos se analizan con respecto a cambios en la longitud de neuritas total o máxima por neurona.

Los ensayos in vivo incluyen modelos animales de diversas enfermedades neurodegenerativas, tales como modelos de lesión de la médula espinal, modelos de plasticidad en córtex visual y otros modelos conocidos en la técnica. Por

45 lo tanto, la regeneración y plasticidad pueden estudiarse en modelos de plasticidad siguiendo piramidotomía unilateral y modelos de lesión cerebral traumática. Otros modelos de neurodegeneración incluyen modelos de ratón de esclerosis múltiple, tales como encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE), modelos de esclerosis lateral amilotrófica (ELA), tal como el ratón mutante de SODI, modelos de animales transgénicos de enfermedad de Alzheimer y modelos animales de enfermedad de Parkinson.

C. Preparar anticuerpos que actúan como estimuladores de la regeneración neuronal

Los anticuerpos identificados por los ensayos de unión y actividad de la presente invención pueden producirse mediante métodos conocidos en este campo, incluyendo técnicas de tecnología de ADN recombinante.

(i) Preparación de antígenos

Pueden usarse antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembrana, tales como receptores, pueden

60 usarse fragmentos de estos (por ejemplo el dominio extracelular de un receptor) como el inmunógeno. Como alternativa, pueden usarse células que expresen la molécula transmembrana como el inmunógeno. Dichas células pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia.

(ii)

Anticuerpos policlonales

Preferentemente se inducen anticuerpos policlonales en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc)

o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una

5 proteína que es inmunogénica en la especie para inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante restos de cisteína), Nhidroxisuccinimida (mediante restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2 o R1N=C=NR en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.

10 Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund

15 mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después se extrae sangre de los animales y el suero se ensaya con respecto a título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que el título alcanza una meseta. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante como fusiones proteicas. Además, se usan de forma adecuada agentes

20 agregantes tales como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando el método de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et

25 al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o un macaco, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en la presente memoria para inducir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína usada para inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después los linfocitos se fusionan con

30 células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59- 103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de

35 mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

40 Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficazmente, apoyan la producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, son líneas celulares de mieloma preferidas líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Centro de Distribución Celular del Instituto Salk, San Diego, California, Estados Unidos y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección Americana de Cultivos

45 Tipo, Rockville, Md. Estados Unidos. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

50 Se ensaya un medio de cultivo en el que se cultivan células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

55 Después de identificarse las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por métodos convencionales (Goding, MonoclonalAntibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de líquido ascítico en un animal.

60 Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se preparan de forma adecuada a partir del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

65 El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma actúan como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que

5 después se usan para transfectar células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Se describirá en más detalle posteriormente la producción recombinante de anticuerpos.

En una realización adicional, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990).

Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones

15 posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) mediante redistribución de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos, 81: 6851 (1984)), o uniendo covalentemente con la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no

25 inmunoglobulina.

Normalmente dichos polipéptidos no inmunoglobulina sustituyen los dominios constantes de un anticuerpo, o sustituyen los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es

35 humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos “importados”, que normalmente se toman de un dominio variable “importado”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,

332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpo quiméricos (Patente de Estados Nº 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un domino variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

45 La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado “de mejor ajuste”, la secuencia de dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta después como el marco conservado (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol.,

151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método usa un marco conservado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras

o pesadas. El mismo marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).

55 Es importante además que los anticuerpos se humanicen con conservación de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Están disponibles habitualmente modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la materia están familiarizados con ellos. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse de las

65 secuencias receptoras importadas de modo que se consigue la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el antígeno o los antígenos diana. En general, los restos de CDR están directamente y más

sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión a antígenos.

Como alternativa, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden, tras su inmunización, producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de 5 inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión a cadena pesada del anticuerpo (J.sub.H) en ratones mutantes de línea quimérica y germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la serie génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras su exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255- 258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355: 258 (1992). Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al, J. MoL Biol.,

222: 581- 597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14: 309 (1996)). La generación de anticuerpos humanos a partir

de bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpos se describe adicionalmente posteriormente. 15

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab’-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). En otra realización

25 como se describe en el ejemplo posterior, el F(ab’)2 se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab’)2. De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab’)2 directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo elegido es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véase documento WO 93/16185.

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, cuando los epítopos son habitualmente de antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente se unirán solamente a

35 dos epítopos diferentes (es decir anticuerpos biespecíficos, BsAb), cuando se usa en la presente memoria esta expresión abarca anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos. Los ejemplos de BsAb incluyen los de una rama dirigida contra PirB/LILRB y otra rama dirigida contra Nogo o MAG u OMgp. Un ejemplo adicional de BsAb incluye los de una rama dirigida contra PirB/LILRB y otra rama dirigida contra NgR.

Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una 45 tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien incómoda, y los rendimientos de producto son bajos. Se desvelan procedimiento similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991). De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. El ADN que codifica las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se inserta en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo hospedador

55 adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en las que relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales dé como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no sean de importancia particular.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra 65 rama. Se descubrió que esta estructura simétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de

inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se desvela en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

5 De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede modificarse por ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. El interfaz preferido comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

15 Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede estar acoplado con avidina, el otro con biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980), y para el tratamiento de infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados se conocen bien en la técnica y se desvelan en la Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980, junto con varias técnicas de entrecruzamiento.

También se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo en la bibliografía. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al.,

25 Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que se escinden anticuerpos intactos de forma proteolítica para generar fragmentos F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejo con ditiol arsenita sódica para estabilizar ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados se convierten después a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab’-TNB se reconvierte después al Fab’-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos de Fab’-SH también pueden recuperarse directamente de E. coli, y pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217- 225 (1992) describe la producción de

35 una molécula F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547- 1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las partes Fab’ de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de “diacuerpos” descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA,

45 90: 6444- 6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, se obliga a los dominios VH y VL de un fragmento a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha presentado otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruber et al, J. Immunol, 152: 5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Modificación por ingeniería genética de la función efectora

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a su función efectora, para potenciar la eficacia del anticuerpo. Por ejemplo pueden introducirse restos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) aumentadas. Véase Caron et al., J. Exp Med. 176: 11911195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando entrecruzadores heterobifuncionales como se describe 65 en Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Como alternativa, puede obtenerse por ingeniería genética un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y pueda tener de este modo lisis de complemento y capacidades de

ADCC potenciadas. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

(viii) Fusiones de epítopos de unión a receptor de recuperación de anticuerpos

5 En ciertas realizaciones de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración tumoral, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para aumentar su semivida en suero. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión a receptor de recuperación en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en un marcador peptídico que se fusiona después con el fragmento de anticuerpo en uno de los extremos o en el medio, por ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos).

El epítopo de unión de receptor de recuperación preferentemente constituye una región en la que uno cualquiera o más restos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del

15 fragmento de anticuerpo. Aún más preferentemente, se transfieren tres o más restos de uno o dos bucles del dominio Fc. Aún más preferentemente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o V.sub.H, o más de una región tal, del anticuerpo. Como alternativa, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

(ix) Otras modificaciones covalentes de anticuerpos

Se incluyen modificaciones covalentes de anticuerpos dentro del alcance de la presente invención. Pueden realizarse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de

25 modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos diana del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N o C terminales. Se describen ejemplos de modificaciones covalentes en la Patente de Estados Unidos Nº 5.534.615, incorporada específicamente en la presente memoria por referencia. Un tipo preferido de modificación covalente del anticuerpo comprende unión del anticuerpo con uno de diversos polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

(x) Generación de anticuerpos de bibliotecas de fagos de anticuerpos sintéticos

35 En una realización preferida, la invención proporciona un método para generar y seleccionar nuevos anticuerpos usando un único enfoque de presentación de fagos. El enfoque implica generación de bibliotecas de fagos de anticuerpos sintéticos basándose en molde de un único armazón, diseño de suficientes diversidades dentro de los dominios variables, presentación de polipéptidos que tienen los dominios variables diversificados, selección de anticuerpos candidatos con alta afinidad para dirigirse al antígeno, y aislamiento de los anticuerpos seleccionados.

Pueden encontrarse detalles de los métodos de presentación de fagos, por ejemplo, en el documento WO03/102157 publicado el 11 de diciembre de 2003, cuya divulgación completa se incorpora expresamente en la presente memoria por referencia.

45 En un aspecto, las bibliotecas de anticuerpo usadas en la invención pueden generarse mutando las posiciones accesibles al disolvente y/o altamente diversas en al menos una CDR de un dominio variable de anticuerpo. Algunas

o todas las CDR pueden mutarse usando los métodos proporcionados en la presente memoria. En algunas realizaciones, puede ser preferible generar diversas bibliotecas de anticuerpos mutando las posiciones en CDRH1, CDRH2 y CDRH3 para formar una única biblioteca o mutando las posiciones en CDRL3 y CDRH3 para formar una única biblioteca o mutando las posiciones en CDRL3 y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 para formar una única biblioteca.

Puede generarse una biblioteca de dominios variables de anticuerpo, por ejemplo, que tiene mutaciones en las posiciones accesibles al disolvente y/o altamente diversas de CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Puede generarse otra biblioteca que tenga mutaciones en CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Estas bibliotecas también pueden usarse juntas entre

55 sí para generar agentes de unión de afinidades deseadas. Por ejemplo, después de uno o más ciclos de selección de bibliotecas de cadena pesada para unión con un antígeno diana, una biblioteca de cadena ligera puede reemplazarse en la población de agentes de unión de cadena pesada para ciclos adicionales de selección para aumentar la afinidad de los agentes de unión.

Preferentemente, se crea una biblioteca mediante sustitución de los aminoácidos originales con aminoácidos variantes en la región CDRH3 de la región variable de la secuencia de cadena pesada. La biblioteca resultante puede contener una pluralidad de secuencias de anticuerpo, en la que la diversidad de secuencias está principalmente en la región CDRH3 de la secuencia de cadena pesada.

65 En un aspecto, la biblioteca se crea en el contexto de la secuencia de anticuerpo humanizado 4D5, o la secuencia de los aminoácidos flanqueantes de la secuencia de anticuerpo humanizado 4D5. Preferentemente, la biblioteca se

crea por sustitución de al menos los restos 95-100a de la cadena pesada con aminoácidos codificados por el conjunto de codones DVK, en la que el conjunto de codones DVK se usa para codificar un conjunto de aminoácidos variantes para cada una de estas posiciones. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK)7. En algunas realizaciones, se crea una biblioteca mediante 5 sustitución de los restos 95-100a con aminoácidos codificados por los conjuntos de codones tanto DVK como NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK)6 (NNK). En otra realización, se crea una biblioteca por sustitución de al menos los restos 95-100a con aminoácidos codificados por los conjuntos de codones tanto DVK como NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK)5 (NNK). Otro ejemplo de

10 un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (NNK)6. Otros ejemplos de secuencias oligonucleotídicas adecuadas pueden determinarse por un experto en la materia de acuerdo con los criterios descritos en la presente memoria.

En otra realización, se utilizan diseños de CDRH3 diferentes para aislar agentes de unión de alta afinidad y para

15 aislar agentes de unión para diversos epítopos. El intervalo de longitudes de CDRH3 generadas en esta biblioteca es de 11 a 13 aminoácidos, aunque también pueden generarse longitudes diferentes a esta. La diversidad H3 puede expandirse usando conjuntos de codones NNK, DVK y NVK, así como diversidad más limitada en el extremo N y/o C terminal.

20 También puede generarse diversidad en CDRH1 y CDRH2. Los diseños de las diversidades de CDR-H1 y H2 siguen la estrategia de dirigirse a imitar el repertorio de anticuerpos naturales descrito con modificación que se centra en la diversidad más cercanamente coincidente con la diversidad natural que el diseño previo.

Para la diversidad en CDRH3, pueden construirse múltiples bibliotecas por separado con diferentes longitudes de H3

25 y después combinarse para seleccionar agentes de unión para dirigirse a antígenos. Las múltiples bibliotecas pueden agruparse y clasificarse usando métodos de selección de soporte sólido y clasificación de solución como se ha descrito previamente y en la presente memoria posteriormente. Pueden emplearse múltiples estrategias de clasificación. Por ejemplo, una variación implica clasificar en diana unida a un sólido, seguido de clasificar un marcador que puede estar presente en el polipéptido de fusión (por ejemplo marcador anti gD) y seguido de otra

30 clasificación en diana unida a sólido. Como alternativa, las bibliotecas pueden clasificarse en primer lugar en diana unida a una superficie sólida, los agentes de unión eluidos se clasifican después usando unión de fase de solución con concentraciones decrecientes de antígeno diana. La utilización de combinaciones de diferentes métodos de clasificación posibilita la minimización de la selección de secuencias solo altamente expresadas y posibilita la selección de varios clones de alta afinidad diferentes.

35 Pueden aislarse de las bibliotecas agentes de unión de alta afinidad para el antígeno diana. La limitación de la diversidad en la región H1/H2 reduce la degradación de aproximadamente 104 a 105 veces y permitir más diversidad H3 posibilita más agentes de unión de alta afinidad. La utilización de bibliotecas con diferentes tipos de diversidad en CDRH3 (por ejemplo la utilización de DVK o NVT) posibilita el aislamiento de agentes de unión que pueden unirse a

40 diferentes epítopos de un antígeno diana.

De los agentes de unión aislados de las bibliotecas agrupadas como se ha descrito anteriormente, se ha descubierto que la afinidad puede mejorarse adicionalmente proporcionando diversidad limitada en la cadena ligera. La diversidad de cadena ligera se genera en esta realización como sigue en CDRL1: la posición de aminoácido 28 se 45 codifica por RDT; la posición de aminoácido 29 se codifica por RKT; la posición de aminoácido 30 se codifica por RVW; la posición de aminoácido 31 se codifica por ANW; la posición de aminoácido 32 se codifica por THT; opcionalmente, la posición de aminoácido 33 se codifica por CTG; en CDRL2: la posición de aminoácido 50 se codifica por KBG; la posición de aminoácido 53 se codifica por AVC; y opcionalmente, la posición de aminoácido 55 se codifica por GMA; en CDRL3: la posición de aminoácido 91 se codifica por TMT o SRT o ambos; la posición de

50 aminoácido 92 se codifica por DMC; la posición de aminoácido 93 se codifica por RVT; la posición de aminoácido 94 se codifica por NHT; y la posición de aminoácido 96 se codifica por TWT o YKG o ambos.

En otra realización, se genera una biblioteca o bibliotecas con diversidad en las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3. En esta realización, se genera diversidad en CDRH3 usando diversas longitudes de regiones H3 y usando 55 principalmente los conjuntos de codones XYZ y NNK o NNS. Pueden formarse bibliotecas usando oligonucleótidos individuales y agrupados o los oligonucleótidos pueden agruparse para forma un subconjunto de bibliotecas. Las bibliotecas de la presente realización pueden clasificarse frente a diana unida a sólido. Pueden explorarse clones aislados de múltiples clasificaciones con respecto a especificidad y afinidad usando ensayos de ELISA. Para especificidad, los clones pueden explorarse frente a los antígenos diana deseados así como otros antígenos no

60 diana. Los agentes de unión para el antígeno diana pueden explorarse después con respecto a afinidad en ensayo ELISA de competición de unión en solución o ensayo de competición puntual. Los agentes de unión de alta afinidad pueden aislarse de la biblioteca utilizando conjuntos de codones XYZ preparados como se ha descrito anteriormente. Estos agentes de unión pueden producirse fácilmente como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno en alto rendimiento en cultivo celular.

65 En algunas realizaciones, puede ser deseable generar bibliotecas con una mayor diversidad de longitudes de la región CDRH3. Por ejemplo, puede ser deseable generar bibliotecas con regiones CDRH3 que varíen de 7 a 19 aminoácidos.

5 Se producen fácilmente agentes de unión de alta afinidad aislados de las bibliotecas de estas realizaciones en cultivo bacteriano y de células eucariotas con alto rendimiento. Los vectores pueden diseñarse para retirar fácilmente secuencias tales como marcadores gD, secuencia componente de proteína de recubrimiento viral y/o para añadir secuencias de región constante para proporcionar producción de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión a antígeno en alto rendimiento.

Puede combinarse una biblioteca con mutaciones en CDRH3 con una biblioteca que contenga versiones variantes de otras CDR, por ejemplo CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 I y/o CDRH2. Por lo tanto, por ejemplo, en una realización, una biblioteca de CDRH3 se combina con una biblioteca de CDRL3 creada en el contexto de la secuencia del anticuerpo 4D5 humanizado con aminoácidos variantes en las posiciones 28, 29, 30,31 y/o 32 usando

15 conjuntos de codones predeterminados. En otra realización, una biblioteca con mutaciones para la CDRH3 puede combinarse con una biblioteca que comprende dominios variables de cadena pesada CDRH1 y/o CDRH2 variantes. En una realización, la biblioteca de CDRH1 se crea con la secuencia 4D5 de anticuerpo humanizado con aminoácidos variantes en las posiciones 28, 30, 31, 32 y 33. Puede crearse una biblioteca de CDRH2 con la secuencia del anticuerpo humanizado 4D5 con aminoácidos variantes en las posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58 usando los conjuntos de codones predeterminados.

(xi) Mutantes de anticuerpos

Los nuevos anticuerpos generados de bibliotecas de fagos pueden modificarse adicionalmente para generar

25 mutantes de anticuerpos con mejores propiedades físicas, químicas y/o biológicas que el anticuerpo parental. Cuando el ensayo usado sea un ensayo de actividad biológica, el mutante de anticuerpo preferentemente tiene una actividad biológica en el ensayo elegido que es al menos aproximadamente 10 veces mejor, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces mejor, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces mejor, y en ocasiones al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mejor, que la actividad biológica del anticuerpo parental en ese ensayo. Por ejemplo, un mutante de anticuerpo anti-PirB/LILRB preferentemente tiene una afinidad de unión por PirB/LILRB que es al menos aproximadamente 10 veces más fuerte, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces más fuerte, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces más fuerte, y en ocasiones al menos aproximadamente 100 o 200 veces más fuerte, que la afinidad de unión del anticuerpo parental.

35 Para generar el anticuerpo mutante, se introducen una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo sustituciones) en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo parental. Como alternativa, o además, pueden introducirse una o más alteraciones (por ejemplo sustituciones) de restos de región marco conservada en el anticuerpo parental cuando estas den como resultado una mejora de la afinidad de unión del mutante de anticuerpo para el antígeno de la segunda especie de mamífero. Los ejemplos de restos de región marco conservada para modificar incluyen los que se unen de forma no covalente directamente con el antígeno (Amit et al. (1986) Science

233: 747-753); interaccionan con/efectúan la conformación de una CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901917) y/o participan en la interfaz VL - VH (documento EP 239 400B1). En ciertas realizaciones, la modificación de uno

o más de dichos restos de región marco conservada da como resultado una potenciación de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Por ejemplo, de aproximadamente uno a

45 aproximadamente cinco restos de marco conservado pueden alterarse en esta realización de la invención. En ocasiones, esto puede ser suficiente para producir un mutante de anticuerpo adecuado para su uso en ensayos preclínicos, incluso cuando no se ha alterado ninguno de los restos de región hipervariable. Normalmente, sin embargo, el mutante de anticuerpo comprenderá una alteración o alteraciones de región hipervariable adicionales.

Los restos de región hipervariable que se alteran pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente cuando la afinidad de unión de partida del anticuerpo parental sea tal que dichos mutantes de anticuerpo producidos de forma aleatoria puedan explorarse fácilmente.

Un procedimiento útil para generar dichos mutantes de anticuerpo se denomina “mutagénesis de exploración de

55 alanina” (Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085). Aquí, se reemplazan uno o más de los restos de región hipervariable por resto o restos de alanina o polialanina para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la segunda especie de mamífero. Ese resto o restos de región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan después introduciendo mutaciones adicionales u otras en o para los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí misma esté predeterminada. Los mutantes de ala producidos de este modo se exploran con respecto a su actividad biológica como se describe en la presente memoria.

Normalmente se comenzaría con una sustitución conservativa tal como las mostradas posteriormente bajo el título

65 de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión), entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la siguiente tabla, o como se describe adicionalmente posteriormente en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos explorados.

Sustituciones preferidas:

Resto Original

Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones Preferidas

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gln; asn lys

Asn (N)

gln; his; lys; arg gln

Asp (D)

glu glu

Cys (C)

ser ser

Gln (Q)

asn asn

Glu (E)

asp asp

Gly (G)

pro; ala ala

His (H)

asn; gln; lys; arg arg

Ile (I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)

norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K)

arg; gln; asn arg

Met (M)

leu; phe; ile leu

Phe (F)

leu; val; ile; ala; tyr leu

Pro (P)

ala ala

Ser (S)

thr thr

Thr (T)

ser ser

Trp (W)

tyr; phe tyr

Tyr (Y)

trp; phe; thr; ser phe

Val (V)

ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Se consiguen aún más modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de los anticuerpos seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la

10 carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr, asn, gln; 15 (3) ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: his, lys, arg;

(5)

restos que influyen en la orientación de cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

20 Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

En otra realización, los sitios seleccionados para modificación se maduran por afinidad usando la presentación de fagos (véase anteriormente).

25 Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de secuencias de aminoácidos se preparan por diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida), mutagénesis por PCR y mutagénesis de casete de una versión mutante preparada anteriormente o una no mutante del anticuerpo parental. El método preferido para preparar mutantes es mutagénesis dirigida (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488).

30 En ciertas realizaciones, el mutante de anticuerpo tendrá solamente un único resto de región hipervariable sustituido. En otras realizaciones, se habrán sustituido dos o más de los restos de región hipervariable del anticuerpo parental, por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente diez sustituciones de región hipervariable.

5 Habitualmente, el mutante de anticuerpo con propiedades biológicas mejoradas tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 75 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del domino variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo parental, más preferentemente al menos 80 %, más preferentemente el menos 85 %, más preferentemente al menos 90 % y más preferentemente al menos 95 %. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir el mismo resto) o similares (es decir resto de aminoácido del mismo grupo basado en propiedades de cadena lateral comunes, véase anteriormente) a los restos de anticuerpos parentales, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. No se interpretará que ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N terminales, C terminales o internas en la secuencia de anticuerpos fuera del domino

15 variable afecta a la identidad o similitud de secuencia.

Después de la producción del mutante de anticuerpo, se determina la actividad biológica de esa molécula en relación con el anticuerpo parental. Como se ha observado anteriormente, esto puede implicar determinar la afinidad de unión y/u otras actividades biológicas del anticuerpo En una realización preferida de la invención, se prepara un panel de mutantes de anticuerpo y se explora con respecto a afinidad de unión por el antígeno o un fragmento del mismo. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados de esta exploración inicial se someten opcionalmente a uno o más ensayos de actividad biológica adicionales para confirmar que el mutante o los mutantes de anticuerpo con afinidad de unión potenciada son de hecho útiles, por ejemplo para estudios preclínicos.

25 El mutante o los mutantes de anticuerpo seleccionados de este modo pueden someterse a modificaciones adicionales, con frecuencia dependiendo del uso pretendido del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden implicar alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión con polipéptido o polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes tales como las elaboradas posteriormente. Con respecto a alteraciones de secuencia de aminoácidos, se han elaborado anteriormente modificaciones a modo de ejemplo. Por ejemplo, cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del mutante de anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, pueden añadirse un enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv). Otro tipo de mutante de aminoácido tiene un patrón de glicosilación alterado. Esto puede conseguirse suprimiendo uno o

35 más restos de carbohidratos hallados en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos está normalmente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas

45 anteriormente descritas (para sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligados a O).

(xii) Producción recombinante de anticuerpos

Para la producción recombinante de un anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera

55 del anticuerpo). Estas disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción (por ejemplo como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.534.615, incorporada específicamente en la presente memoria por referencia).

Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente memoria son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, 65 Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P desvelado en el documento DD

266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.

5 Además de los procariotas, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadero común, es la usada más habitualmente entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, están disponibles habitualmente y son útiles en la presente memoria varios otros géneros, especies y cepas, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como,

15 por ejemplo, huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Derivan de organismos multicelulares células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insectos. Se ha identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están disponibles públicamente diversas cepas virales para transfección, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa california y la cepa Bm-5 de Bombyx mori, y dichos virus pueden usarse como los virus de la presente memoria de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como hospedadores cultivos de células

25 vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Son ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de cercopiteco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA,

35 ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para producción de anticuerpos y se cultivan en medio nutriente convencional según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo de la presente invención pueden cultivarse en diversos

45 medios. Son adecuados medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) para cultivar las células hospedadoras. Además, puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/D0195; o Patente de Estados Unidos Nº de Re. 30.985 como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a

55 concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que conocerían los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y resultará evidente para el experto habitual en la materia,

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de forma intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, los residuos en partículas, bien de células hospedadoras o de células lisadas, se retira, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración proteica disponible en el 65 mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse

antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la 5 técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basen en cadenas pesadas gamma 1, gamma 2 o gamma 4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para gamma 3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad 10 es con más frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) es útil para purificación. También están disponibles otras técnicas para purificación proteica tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación

15 de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHAROSE™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo para recuperar.

D. Usos de estimuladores de la regeneración neuronal

20 Se cree que las moléculas identificadas en los ensayos de exploración de la presente invención encuentran uso como agentes para potenciar la supervivencia o inducir el crecimiento de células nerviosas. Son, por lo tanto, útiles en la terapia de trastornos degenerativos del sistema nervioso (“enfermedades neurodegenerativas”), incluyendo, por ejemplo, daño a los nervios periféricos provocado por lesión física (por ejemplo, quemaduras, heridas) o

25 patologías tales como diabetes; disfunción renal o por los efectos tóxicos de productos quimioterapéuticos usados para tratar el cáncer y el SIDA; daño físico al sistema nervioso central (médula espinal y cerebro); daño cerebral asociado con ictus; y trastornos neurológicos relacionados con neurodegeneración, tales como, por ejemplo, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, Parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de

30 discos intervertebrales herniados, rotos y prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas tales como las provocadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Huntington o enfermedad de Parkinson.

35 Los compuestos identificados en la presente memoria también son útiles como componentes de medio de cultivo para su uso en el cultivo de células nerviosas in vitro.

Finalmente, las preparaciones que comprenden compuestos identificados por los ensayos en la presente memoria son útiles como patrones en ensayos de unión competitiva cuando se marcan con radioyodo, enzimas, fluoróforos,

40 marcadores de espín y similares.

Las formulaciones terapéuticas de los compuestos de la presente memoria se preparan para almacenamiento mezclando el compuesto identificado (tal como un anticuerpo) que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 45 mencionado anteriormente), en forma de una torta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como

50 glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o PEG.

55 Los compuestos para usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril, antes de o después de liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas pueden colocarse en un recipiente que tenga un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección

60 hipodérmica.

Los compuestos identificados por los ensayos de la presente invención pueden combinarse opcionalmente con o administrarse de forma concertada con factores neurotróficos incluyendo NGF, NT-3 y/o BDNF y usarse con otras terapias convencionales para trastornos nerviosos degenerativos.

65 La vía de administración es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración tópica

o por sistemas de liberación prolongada como se observa posteriormente.

5 Para su uso intracerebral, los compuestos pueden administrarse de forma continua por infusión en los depósitos de fluido del SNC, aunque es aceptable una inyección de embolada. Los compuestos se administran preferentemente en los ventrículos del cerebro o se introducen de otro modo en el SNC o líquido cefalorraquídeo. La administración puede realizarse mediante un catéter interno usando un medio de administración continua tal como una bomba, o puede administrarse por implantación, por ejemplo, implantación intracerebral, de un vehículo de liberación prolongada. Más específicamente, los compuestos pueden inyectarse a través de cánulas implantadas de forma crónica o infundirse de forma crónica con la ayuda de minibombas osmóticas. Están disponibles bombas subcutáneas que suministran proteínas a través de un tubo pequeño a los ventrículos cerebrales. Bombas altamente sofisticadas pueden recargarse a través de la piel y su velocidad de suministro puede establecerse sin intervención quirúrgica. Son ejemplos de protocolos de administración y sistemas de suministro adecuados que implican un

15 dispositivo de bomba subcutáneo o infusión intracerebroventricular continua a través de un sistema de suministro farmacológico implantado totalmente los usados para la administración de dopamina, agonistas de dopamina y agonistas colinérgicos para pacientes de Alzheimer y modelos animales para enfermedad de Parkinson descritos por Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24: 271 (1987); y DeYebenes, et al., Mov. Disord. 2: 143 (1987).

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman, et al., 1983, Biopolymers 22: 547), poli(2hidroxietil-metacrilato) (Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167; Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98),

25 etilen vinil acetato (Langer, et al., Id.) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988A). Las composiciones de liberación prolongada también incluyen compuestos atrapados en liposomas, que pueden prepararse por métodos conocidos por sí mismos (Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); Patentes de Estados Unidos Nº 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324A). Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstrom) en el que el contenido lipídico es mayor de aproximadamente 30 % molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima.

Una cantidad eficaz de un compuesto activo para emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la condición del paciente. En consecuencia, será necesario para el

35 terapeuta titular la dosificación y modificar la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 μg/kg hasta 100 μg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el especialista químico administrará un compuesto activo hasta que se alcance una dosificación que repare, mantenga y, óptimamente, restablezca la función neuronal. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por ensayos convencionales.

Se ilustran detalles adicionales de la invención por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

45 LILRB2 de clonación de expresión

Para identificar nuevos receptores para proteínas de mielina inhibidoras, se tomó un enfoque de clonación de la expresión. Como cebo, se generaron construcciones que fusionaban Alcalina Fosfatasa (AP) con el extremo N y/o C terminal de los siguientes inhibidores de mielina caracterizados (ADNc humano usado): Nogo66, dos dominios inhibidores adicionales de NogoA (NiR<delta>D2 y NiG<delta>20) (Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393-406), MAG, y OMgp. Estas construcciones se transfectaron en células 293 para producir medio acondicionado (en DMEM/FBS 2%) que contenía las proteínas cebo. La biblioteca de ADNc usada en la exploración estaba comprendida por clones de ADNc humanos de longitud completa en vectores listos para expresión generados por Origene. Estos ADNc se compilaron, dispusieron y agruparon. Se transfectaron de forma transitoria grupos de

55 aproximadamente 100 ADNc en células COS7.

En particular, el Día 1, las células COS7 se sembraron en placas a una densidad de 85.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos. El Día 2, se transfectó 1 mg de ADNc agrupados por pocillo usando el reactivo de transfección basado en lípidos FuGENE 6 (Roche). El Día 4, se realizó exploración. Brevemente, el medio de cultivo se retiró de las células y se reemplazó con 0,5 ml de medio acondicionado para células 293 que contenía proteínas cebo de fusión con AP (20-50 nM). Se incubaron células a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las células se lavaron después 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron durante 7 minutos con paraformaldehído al 4%, se lavaron 3 veces en solución salina tamponada con HEPES (HBS), y se inactivaron por calor a 65 ºC durante 90 minutos para destruir la actividad AP endógena. Las células se lavaron una vez en Tampón 65 de AP (NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, Tris 100 mM pH 9,5), y se incubaron en sustrato cromogénico (Azul de Western, Promega), y se analizaron con respecto a la presencia de producto de reacción 1 hora después de la incubación, y

de nuevo después de la incubación durante una noche. Las células positivas se identificaron por la presencia de precipitado azul oscuro sobre la superficie de la membrana. Los grupos positivos se degradaron adicionalmente para identificar clones positivos individuales por ciclos posteriores de exploración.

5 A partir de la exploración, se identificaron los siguientes aciertos positivos:

El cebo de MAG-AP produjo 4 aciertos positivos. Uno fue el Receptor de Nogo caracterizado previamente (Fournier et al., Nature 409, 342- 346 (2001). Dos de estos aciertos fueron enzimas de procesamiento glicolítico, y se consideró poco probable que fueran importantes. El cuarto se anotó como “proteína hipotética de Homo sapiens del clon 643 (LOC57228), ARNm”. Un análisis más preciso del ADNc reveló una ORF alternativa que era homóloga de la proteína previamente descrita SMAG.

El cebo de AP-Nogo66 produjo 2 aciertos positivos. Uno fue el Receptor de Nogo previamente caracterizado. El otro fue “receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos de Homo sapiens, subfamilia B (con dominios TM e ITIM),

15 miembro 2 (LILRB2), ARNm” (SEC ID Nº: 2). Este gen también se conoce por múltiples nomenclaturas alternativas, incluyendo MIG10, ILT4 y LIR2 (Kubagawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5261-6 (1997); Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997)).

Ejemplo 2

AP-Nogo66 se une a PirB y LILRB2

Para confirmar la unión de Nogo66 con LILRB2 (SEC ID Nº: 2), y para ensayar si Nogo66 se une a PirB ortólogo murino (SEC ID Nº: 1), se llevaron a cabo ensayos de unión similares a los descritos en el Ejemplo 1. Brevemente,

25 se transfectaron células COS7 con ADNc que codificaban PirB, LILRB2 o NgR como un control positivo. 48 horas después de la transfección, las células se incubaron con medio acondicionado para células 293 que contenía AP-Nogo66 durante 90 minutos a TA. Las células se lavaron exhaustivamente, se fijaron y se neutralizó la actividad AP endógena por inactivación por calor. Las células se hicieron reaccionar después con sustrato cromogénico (Azul de Western, Promega).

Como se muestra en la Figura 1, se detectó una fuerte señal positiva en células que expresaban tanto PirB como LILRB2.

Ejemplo 3

35 MAG se une a PirB y LILRB2

Para ensayar si MAG también se une o no a PirB y LILRB2, se realizaron ensayos de unión con MAG-Fc, que se cree que es más bioactivo que MAG-AP. Las células COS7 se transfectaron con ADNc que codificaban PirB, LILRB2, o mSMAGP como un control positivo. 48 horas después de la transfección, las células se incubaron con medio acondicionado para células 293 que contenía MAG-Fc durante 90 minutos a TA. Las células se lavaron cuatro veces con Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS), se fijaron durante cinco minutos con paraformaldehído al 2%, se lavaron cuatro veces con HBSS, y se bloquearon durante 15 minutos con suero de cabra inactivado por calor al 10% (HIGS) en HBSS. Las células se incubaron después durante una hora con anticuerpo anti Fc humano (1:

45 500, Jackson Immunochemicals), se lavaron con HIGS 10% en PBS, y se incubaron con anticuerpo secundario (anti ratón de cabra conjugado con 568 AlexaFluor, Molecular Probes). Las células se lavaron con PBS, se cubrieron con cubreobjetos, y se detectó inmunofluorescencia usando un microscopio de fluorescencia invertido.

Los resultados se muestran en la Figura 2. En comparación con las células de control, las células que expresan tanto PirB como LILRB2 muestran unión con MAG-Fc. En este ejemplo, las células que expresaban mSMAGP actuaron como un control positivo para la unión.

Ejemplo 4

55 PirbB se expresa en el sistema nervioso

Para abordar si PirB se expresa o no en el sistema nervioso se realizó análisis de RT-PCR en ARNm aislado de diferentes tejidos neurales. Se diseccionaron cerebelo P7, Ganglios de las Raíces Dorsales P10 (GRD), cerebro del adulto y bazo del adulto (control positivo) de ratones CD1 y se colocaron inmediatamente en RNAlater (Ambion), se extrajo ARNm usando el kit de aislamiento RNEasy (Qiagen). Se generó ADNc a partir de ARNm usando el sistema de Síntesis de Primera Cadena Superscript III de Invitrogen. Después se realizó RT-PCR usando los cebadores específicos para PirB 5’TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3’ (SEC ID Nº: 20) y 5’GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3’ (SEC ID Nº: 3), cebadores que reaccionan de forma cruzada con diferentes miembros de la subfamilia de PirA (5’GTCTCAGAAACCATTGAATCC3’ (SEC ID Nº: 4) y

65 5’GACAGAAAACTTTGGGTCATCAG3’ (SEC ID Nº: 5)), o cebadores específicos para SMAGP de ratón (5’CCCTCAGCAACGATGAACAACC3’ (SEC ID Nº: 6) y 5’TGGACCCTGGAGTCAGTGATTC3’ (SEC ID Nº: 7)).

Como se muestra en la Figura 3, el análisis de RT-PCR reveló que las isoformas tato PirB como PirA podían detectarse en cerebelo, GRD y cerebro.

Ejemplo 5 5 Resultados de la hibridación in situ

Para analizar la expresión neuronal de PirB en más detalle, se realizaron análisis de hibridación in situ. Se perfundieron ratones adultos o post natales, y después el cerebro y los GRD se diseccionaron y se postfijaron durante una noche. Los tejidos se crioprotegieron posteriormente en sacarosa al 30%, y se incluyeron y congelaron en compuesto de O.C.T (Tissue-Tek). Los tejidos congelados se seccionaron a un grosor de 12 micrómetros. Se prepararon sondas radiactivas usando el kit de transcripción in vitro MAXIscript (Ambion), siguiendo los protocolos de fabricante. Se llevó a cabo hibridación in situ usando el kit localizador de ARNm ISH (Ambion), de acuerdo con los protocolos del fabricante.

15 La sonda de PirB se diseñó para hibridar con los nucleótidos Nº 1922-2385, que están en el dominio transmembrana e intracelular único de PirB. Los cebadores usados para amplificar esta región fueron 5’TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3’ (SEC ID Nº: 8) y 5’GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3’ (SEC ID Nº: 9). El fragmento de 464 pb se clonó en pCRII-TOPO (Invitrogen).

Los resultados de la hibridación in situ se muestran en las Figuras 4A-4C. Se ve señal de hibridación positiva en todo el córtex, en el hipocampo, en el cerebelo y en células de los GRD.

Ejemplo 6

25 Inhibición por Nogo66 del crecimiento de los axones y su rescate por PirB ECD en neuronas granulares cerebelares

En este experimento, se confirmó la capacidad de Nogo-66 para inhibir el crecimiento de los axones. Además, las construcciones de dominio extracelular de PirB se ensayaron con respecto a su capacidad para interferir en la actividad inhibidora de Nogo-66.

AP-Nogo66 se generó clonando el bucle inhibidor de 66 aminoácidos de NogoA cadena abajo del gen de fosfatasa alcalina (AP) placentaria humana. La construcción se marcó con FLAG en el extremo N terminal para permitir la purificación, y se insertó en una cadena principal de vector pRK (Genentech). Para generar proteínas de dominio

35 extracelular (ECD) de PirB, los aminoácidos Nº 1- 638 de PirB se clonaron en vectores de expresión pRK cadena arriba de un marcador de 8-His (PirBHis) o Fc humano (PirBFc). Estas construcciones de expresión se transfectaron de forma transitoria en células CHO, y las proteínas secretadas se purificaron a partir del medio acondicionado por cromatografía de afinidad.

Se aislaron neuronas granulares cerebelares (CGN) de ratones P7 CD1, y se cultivaron en proteína AP-Nogo66 inmovilizada para ensayos de inhibición. Brevemente, se aplicaron puntualmente en placas de 96 pocillos previamente recubiertas con poli-D-lisina (Biocoat, Becton Dickinson) AP-Nogo66 recombinante (180 o 300 ng/3 μl por punto). La AP-Nogo66 se aplicó sola, o se mezcló con un exceso de PirBFc (850 ng/3 μl por punto) o PirBHis (1000 ng/3 μl por punto). Esto dio como resultado puntos que contenían un exceso molar de 2-4 veces de PirB ECD.

45 Se permitió que las proteínas aplicadas puntualmente se adhirieran durante 2 horas, y después las placas se trataron con laminina 10 μg/ml (Invitrogen) durante 2 horas. Las células cerebelares P7 de ratón se prepararon como se ha descrito (Zheng et al., 2005) y se sembraron en placas a una densidad de 2 X 104 células/pocillo. Los cultivos se incubaron a 37 ºC durante 22 horas, se fijaron con paraformaldehído 4%/sacarosa 4%, y se tiñeron con un anticuerpo antitubulina (TuJ1, Covance). Las imágenes se capturaron con el sistema de captura de imágenes ImageXpress (Molecular Devices).

Como se muestra en la Figura 6, AP-Nogo66 inhibe fuertemente la extensión de axones de neuronas cerebelares P7. La presencia de un exceso de PirB ECD, con PirBFc o PirBHis, redujo significativamente esta inhibición. La inclusión de otras proteínas de control (Fc o Robo4Fc) con AP-Nogo66 no redujo la inhibición.

55 Ejemplo 7

Co-inmunoprecipitación de PirB y NgR

Este experimento explora la relación e interacción potencial de PirB y NgR cuando se coexpresan en células hospedadoras in vitro.

Las células COS7 se transfectaron de forma transitoria con un vector de control, PirB de longitud completa, o una mezcla de PirB de longitud completa y NgR de longitud completa. 48 horas después de la transfección, las células 65 se lisaron con Tampón de Lisis Celular (Cell Signaling Technology) y los lisados se inmunoprecipitaron con antiPirA/B (6C1, Pharmingen). Las muestras se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se

exploraron con anti-NgR (Alpha Diagnostics International).

Como se muestra en la Figura 7, NgR se coprecipitó de forma robusta con PirB (panel izquierdo). El panel derecho muestra proteína total de lisados celulares completos inmunotransferidos con anti-NgR. Las bandas múltiples 5 (flechas) representan NgR procesado por glicosilación en diversos grados.

Ejemplo 8

Anticuerpos de PirB y su uso para interferir con la actividad inhibidora del crecimiento de axones de Nogo66

10 En este experimento, se ensayaron anticuerpos contra PirB con respecto a su capacidad para interferir con inhibición inducida por Nogo-66 del crecimiento de los axones.

Se aislaron neuronas granulares cerebelares (CGN) de ratones P7 CD1 y se cultivaron en proteína AP-Nogo66

15 inmovilizada para ensayos de inhibición, como se ha descrito en los ejemplos previos. Se generaron anticuerpos de bloqueo de función explorando PirB ECD frente a una biblioteca de fagos de anticuerpo sintético humano, esencialmente como se describe en Liang et al., J. Mol. Biol. 366 (3): 815- 819 (2006). Los clones se seleccionaron con respecto a su capacidad para competir con la unión de AP-Nogo66 con PirB. En este experimento, se incubaron anticuerpos anti-PirB o de control con neuronas cultivadas en AP-Nogo66. Como se muestra en la Figura 8, los

20 anticuerpos anti-PirB condujeron a una reducción significativa en la inhibición por AP-Nogo66.

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se considera que son las realizaciones específicas, debe entenderse que la invención no se limita a dichas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende abarcar diversas modificaciones y equivalentes incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones

25 adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Genentech, Inc.

30 Atwal, Jasvinder Tessier-Lavigne

<120> MODULADORES DE LA REGENERACIÓN NEURONAL

35 <130> 39766-0209.PCT

<140> Todavía no se ha asignado

<141> Adjunto

40 <150> 60/865.772

<151>

<150> 60/890.416

<151> 45

<160> 20

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

50 <210> 1

<211> 841

<212> PRT

<213> Mus Musculus

55 <400> 1

<210> 2

<211> 598

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

5

<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> cebador <400> 3 ggcataggtc acatcctggg ac 22

15

<210> 4 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Cebador <400> 4 gtctcagaaa ccattgaatc c 21

<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15

<220> <223> Cebador

<400> 5 gacagaaaac tttgggtcat cag

23

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> Cebador

<400> 6 ccctcagcaa cgatgaacaa cc

22

35

<210> 7 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador

<400> 7 tggaccctgg agtcagtgat tc

22

45

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 8 tgaaggctct cattggagtg tctg

24

55

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

<400> 9 ggcataggtc acatcctggg ac

22

65

<210> 10 <211> 650 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 652

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 651

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 12 <210> 13

<211> 651

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 597

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 14 <210> 15

<211> 632

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 631

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 16 <210> 17

<211> 591

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 590

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 18 <210> 19

<211> 491

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 19

5

<210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador

10

<400> 20 tgaaggctct cattggagtg tctg 24

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar un antagonista de PirB/LILRB que comprende poner en contacto un agente candidato

   con un complejo que comprende PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la 5 misma, y detectar la capacidad de dicho agente candidato para inhibir la interacción entre PirB/LILRB y dicha mielina

   o proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en la que el agente candidato se identifica como un antagonista si se inhibe la interacción.
2. 2. El método de la reivindicación 1 en el que la interacción es unión o señalización celular, opcionalmente en el que

   10 dicha señalización celular da como resultado la inhibición de la extensión de los axones o de la regeneración neuronal.
3. 3. El método de la reivindicación 1 en el que la proteína asociada a mielina se selecciona del grupo que consiste en

   Nogo, MAG y OMgp. 15
4. 4. El método de la reivindicación 3 en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB1, LILRB2, LILRB3 y LILRB5, opcionalmente en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2), LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14), LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10), LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11), LILRB1, variante de transcrito 3

   20 (SEC ID Nº: 12), LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13), LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15), LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16), LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17), LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18) y LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19), adicionalmente opcionalmente en el que dicho PirB es LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) o LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14).

5. 5.

   El método de la reivindicación 3 en el que el complejo comprende además NgR.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1 en el que el agente candidato se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, ARN de interferencia cortos (ARNip), moléculas orgánicas

   30 pequeñas, polisacáridos y polinucleótidos, opcionalmente en el que el agente candidato es un anticuerpo o un ARN de interferencia corto (ARNip).
7. 7. El método de la reivindicación 6 en el que dicho anticuerpo se une específicamente a PirB/LILRB, opcionalmente

   en el que dicho anticuerpo se une específicamente a un LILRB2. 35
8. 8. El método de la reivindicación 7 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno, en el que dicho fragmento de anticuerpo se secciona opcionalmente del grupo que consiste en fragmentos Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2.

   40 9. El método de la reivindicación 1 en el que al menos uno de dicho PirB/LILRB y dicha mielina o proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, se inmoviliza.
9. 10. El método de la reivindicación 1 que es un ensayo basado en células, opcionalmente en el que dicho ensayo basado en células comprende cultivar células neuronales con dicha mielina o proteína asociada a mielina, o

   45 fragmento de la misma, en presencia y ausencia de dicho agente candidato y determinar el cambio de la longitud de las neuritas, en el que dicho agente candidato se identifica como un antagonista cuando la longitud de la neurita es mayor en presencia de dicho agente candidato.
10. 11. El método de la reivindicación 10 en el que dichas células neuronales son neuronas primarias o derivan de

    50 células o líneas de células madre embrionarias no humanas (ES), o en el que dichas células neuronales derivan de neuroblastoma, o se seleccionan del grupo que consiste en neuronas granulares cerebelares, neuronas de ganglios de las raíces dorsales y neuronas corticales.
11. 12. Un método in vitro para potenciar la extensión de neuritas y/o promover el crecimiento, la reparación y/o la

    55 regeneración neuronales, comprendiendo el método identificar un antagonista de PirB/LILRB de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y usar el antagonista identificado para potenciar la extensión de neuritas y/o promover el crecimiento, la reparación y/o la regeneración neuronales, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB.

    60 13. Un antagonista de PirB/LILRB identificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un método para tratar lesión neural en un sujeto, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB.
12. 14. Uso de un complejo de PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma, 65 para identificar un antagonista de PirB/LILRB.
13. 15. Uso de un antagonista de PirB/LILRB en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB e inhibe la interacción entre PirB/LILRB y mielina o una proteína asociad a mielina, o un fragmento de la misma.

    5 16. Un antagonista de PirB/LILRB en el tratamiento de un trastorno neurológico, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB e inhibe la interacción entre PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma.
14. 17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con la 10 reivindicación 16, en el que el tratamiento es curativo, profiláctico o preventivo.
15. 18. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el trastorno neurológico se caracteriza por un nervio dañado físicamente o es una enfermedad neurodegenerativa.

16. 19.

    El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el tratamiento es la prevención de neurodegeneración.

17. 20.

    El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en

    20 el que el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste en daño a los nervios periféricos provocado por lesión física o diabetes; daño físico al sistema nervioso central; daño cerebral asociado con ictus, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de discos intervertebrales herniados, rotos y prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción

    25 de salida torácica, neuropatías periféricas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.
18. 21. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en

    el que la interacción es unión o señalización celular, opcionalmente en el que dicha señalización celular da como 30 resultado la inhibición de la extensión de los axones o de la regeneración neuronal.
19. 22. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en el que la proteína asociada a mielina se selecciona del grupo que consiste en Nogo, MAG y OMgp.

    35 23. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB1, LILRB2, LILRB3 y LILRB5, opcionalmente en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2), LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14), LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10), LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11), LILRB1, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 12), LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13),

    40 LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15), LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16), LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17), LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18) y LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19), adicionalmente opcionalmente en el que dicho PirB es LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) o LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14).

    FIG. 5

    Secuencia de PirB (de ratón) (SEC ID Nº: 1)

    Secuencia de LILRB2 (humana) (SEC ID Nº:2)

    LILRB1, variante de transcrito 1:

    FIGURA 9

    LILRB 1, variante de transcrito 2:

    FIGURA 10

    LILRB1, variante de transcrito 3:

    FIGURA 11

    LILRBl, variante de transcrito 4:

    FIGURA 12

    LILRB2, variante de transcrito 2:

    FIGURA 13

    LILRB3, variante de transcrito 1:

    FIGURA 14

    LILRB3, variante de transcrito 2:

    FIGURA 15

    LILRB5, variante de transcrito 1:

    FIGURA 16

    LILRB5, variante de transcrito 2:

    FIGURA 17

    LILRB5, variante de transcrito 3:

    FIGURA 18