MXPA05012306A - Proteinas de fusion para el tratamiento del snc. - Google Patents

Proteinas de fusion para el tratamiento del snc.

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Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que se pueden usar en el tratamiento de lesiones en la medula espinal y enfermedades relacionadas en el sistema nervioso central (CNS), y, en particular, composiciones que incluyen moleculas de degradacion de proteoglican y composiciones capaces de bloquear y/o vencer la actividad de moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal, asi como proteinas de fusion que incluyen un dominio de degradacion de proteoglican y un dominio capaz de bloquear y vencer la actividad de moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal.

Description

PROTEINAS DE FUSION PARA EL TRATAMIENTO DEL SNC REFERANCIA CRUZADA A SOLUCITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio y prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de serie 60/471 ,239, Certificado de Abogado N° 127304.01200, presentada el 16 de mayo de 2003; Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de serie 60/471 ,300, Certificado de Abogado N° 127304.01400, presentada el 16 de mayo de 2003; Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de serie 60/474,372, Certificado de Abogado N° 127304.01700, presentada el 16 de mayo del 2003; Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de serie 60/471 ,240, Certificado de Abogado N° 127304.01300, presentada el 16 de mayo de 2003; y Solicitud de Patente de Estados Unidos titulada MUTANTES QUE DEGRADAN PROTEOGLICANOS PARA EL TRATAMIENTO DEL SNC, presentada simultáneamente con la misma el 17 de mayo de 2004, Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de serie [aún no asignado] Certificado de Abogado N° 127304.01301 , estando los contenidos de cada una de estas referencias incorporados en este documento como referencia en su totalidad. ANTECEDENTES Y SUMARIO Una lesión en la médula espinal (SCI) provoca traumatismo a las células y tejidos del sistema nervioso central (SNC) y provoca una afección grave y debilitante en el individuo. Después de SCI, la regeneración limitada de las neuronas lesionadas da como resultado una discapacidad permanente caracterizada por alguna perdida de sensación, parálisis y disfunción autonómica. Una razón de que las neuronas no logren regenerarse es su incapacidad de atravesar la cicatriz glial que se desarrolla después de SCI. La cicatriz glial contiene moléculas de matriz extracelular incluyendo proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG). Los estudios in vitro muestran que las neuronas no logran prologar protuberancias sobre superficies recubiertas con CSPG, mientras que los datos in vivo se correlacionan con el fallo de regeneración con áreas de expresión de CSPG. En la mielina del sistema nervioso central adulto (SNC) también hay varios compuestos inhibidores del crecimiento de axones identificados como la glicoproteina asociada a mielina (MAG), OMgp, y Reticulón 4 o Nogo que han demostrado ser inhibidores del crecimiento de neuronas. La enzima que degrada proteoglicanos condroitinasa ABC tipo I (SEC ID N° X) se ha usado para potenciar el crecimiento neurona! en un modelo de lesión de la columna dorsal de lesión de médula espinal. Se ha informado de que el tratamiento de la lesión de médula espinal con antagonista del receptor de Nogo promueve un cierto grado limitado de regeneración neuronal. Se ha informado adicionalmente de que creando un ratón knock out NOGO da como resultado ciertos grados limitados y no uniformes de regeneración neuronal después de hemisección dorsal de la médula espinal. Los tratamientos experimentales para lesión del SNC han utilizado la aplicación de condroitinasa al espacio extracelular, sin embargo, la enzima digiere CSPG en la matriz extracelular y no almacenes intracelulares. Además, la difusión de condroitinasa en el parénquima del tejido esencial y distintivo de un órgano o un crecimiento anormal distinguido de su ambiente de soporte o entre compartimientos anatómicos esta limitado. El acceso limitado de fármacos, agentes de formación de imágenes, y anestésicos, etc. a células y/o tejidos diana del Sistema Nervioso Central (SNC) puede reducir la utilidad o eficacia de cualquiera de estas sustancias. El suministro de moléculas terapéuticas o de diagnostico en células y tejidos es, en parte, dependiente de las matrices extracelulares así como de los carbohidratos y proteínas unidos a membranas celulares. La matriz extracelular está compuesta en parte de proteoglicanos, entre los que están proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG). Los CSPG son una familia de proteoglicanos compuestos por un núcleo proteico y glicosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente. Cada proteoglicano está determinado por las cadenas laterales de glicosaminoglicanos. Para CSPG estas cadenas laterales están compuestas de aproximadamente 40 a 100 disacáridos sulfatados compuestos de condroitín 4, 6 y dermatán sulfatas. El componente proteico de los CSPG se sintetiza ribosómicamente y la glicosilacion sucede en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. Las cadenas de azúcar después se sulfatan en las posiciones 4 ó 6 por varías glicosaminoglican sulfotransferasas. Pueden usarse proteínas de transduccion para transportar polipéptidos y polinucleótidos a través de las barreras anatómicas y en las células. Por ejemplo, la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) contiene un dominio de transduccion de proteínas (PTD) que está implicado en la transduccion de VIH en células. El PTD contiene un dominio de 11 aminoácidos (péptido TAT) que es responsable de la actividad del PTD. El Péptido TAT puede estar unido a proteínas y facilitar la transduccion de las proteínas en las células. El mecanismo de transduccion es independiente del peso molecular o propiedades químicas de las proteínas que están unidas al Péptido TAT. Los estudios in vivo muestran que si una proteína de fusión que consta del Péptido TAT unido a una enzima de 120 kd, beta galactosidasa (ß-Gal), se inyecta en ratones, entonces se observa un suministro fuerte de ß-Gal en una amplia diversidad de células. Cuando está unido al péptido de transducción TAT, se observó actividad ß-Gal en el cerebro; sin el Péptido TAT, no se observó ß-GaI en el cerebro. El transporte a través de la barrera hemato-encefálica está normalmente restringido a ciertas moléculas pequeñas hidrófobas y péptidos lipófilos de bajo peso molecular particulares. El transporte de proteínas tan grandes como ß-Gal en el cerebro habitualmente no es posible sin la alteración sustancial de la barrera hemato-encefálica, pero el Péptido TAT facilita el transporte dejando la barrera hemato-encefálica intacta. Las proteínas quiméricas, también llamadas proteínas de fusión, son proteínas híbridas que combinan al menos partes de dos o más proteínas o polipéptidos precursores. Las proteínas quiméricas pueden producirse por tecnología recombinante, es decir, fusionando al menos una parte de la secuencia codificante de un gen a al menos una parte de la secuencia codificante de otro gen. El gen fusionado entonces puede usarse para transformar un organismo adecuado que después expresa la proteína de fusión. Tat Peptide Complexes Frankel et al. (Patentes de Estados Unidos N° 5.804.604; 5.747.641 ; 5.674.980; 5.670.617; 5.652.122) describe el uso de péptidos Tat para transportar moléculas de carga unidas covalentemente biológicamente activas al citoplasma y núcleos de células. Frankel sólo describe restos de carga unidos covalentemente que son (terapéuticos, de diagnostico o profilácticos), y no analiza o sugiere la unión de moléculas que facilitan la difusión, plasticidad, extensión de neuritas, y regeneración de axones. Estas moléculas pueden incluir, aunque sin limitación, moléculas que superan la inhibición de la extensión de neuritas, o promueven el crecimiento de nervios tal como antagonistas de NOGO solubles como NgR27-3n , moléculas de adhesión de células neurales como L1 , factores neurotroficos, factores de crecimiento, inhibidores de fosfodiesterasa, e inhibidores de MAG o MOG. Adicionalmente, pueden combinarse mutantes de deleción con otros compuestos que promueven la remienilizacion tales como neuregulinas (GGF2) y anticuerpos que promueven la remienilizacion, o moléculas que degradan proteoglicanos con péptidos Tat. La regeneración después de SCI está limitada a causa de una diversidad de obstáculos que incluyen la deposición de CSPG en la cicatriz glial, desmienilizacion de axones, ausencia de soporte trófico y ausencia de guía axonal. Una terapia única dirigida frente a un aspecto de SCI puede no ser tan eficaz como un enfoque de combinación. Las proteínas de fusión con condroitinasa permitirán terapia de combinación con una proteína única. Los compañeros de fusión para condroitinasa que se construirán en esta propuesta se eligieron entre proteínas que tienen evidencia de eficacia en SCI. El uso de una molécula que tiene la capacidad tanto de degradar glicoproteínas de la matriz extracelular como de bloquear o superar la naturaleza inhibidora de los componentes de mielina, puede usarse para mejorar la capacidad de neuronas dañadas de crecer o regenerarse en comparación con tratamiento solo. Las moléculas que degradan proteoglicanos también pueden usarse de manera ventajosa para proporcionar un método para facilitar el acceso y difusión de sustancias al interior de células o tejidos a través del uso de al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos y preferiblemente degradar proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG). Las realizaciones de la presente invención incluyen composiciones que comprenden polipéptidos que escinden proteoglicanos, polipéptidos que bloquean y/o superan la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o una combinación de estos. Las composiciones que contienen la molécula que degrada proteoglicanos o moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal también pueden incluir moléculas para la transducción de los polipéptidos a través de las membranas celulares y la barrera hemato-encefálica. Las composiciones pueden usarse en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). Las composiciones pueden usarse en la regeneración de tejido neurológico dañado y facilitan la difusión y transporte de moléculas terapéuticas capaces de bloquear y/o superar la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal en tejido dañado o enfermo. Las realizaciones de la presente invención incluyen composiciones y métodos para su uso para facilitar el suministro y difusión de agentes terapéuticos o de diagnostico, y preferiblemente agentes que promueven la regeneración de nervios y axones, en células o tejidos. Preferiblemente, la composición incluye el uso de una enzima capaz de escindir proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG) para aumentar la difusión de estos agentes en células o tejidos del sistema nervioso central. Las composiciones de la presente invención pueden incluir proteínas quimérica o de fusión capaces de su uso sistémico en el tratamiento de lesiones de médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC), y en particular, proteínas de fusión capaces de cruzar la barrera hemato-encefálica. La proteína de fusión puede incluir un dominio de transducción de polipéptidos, un dominio pollpeptídico capaz de degradar un proteoglicano, preferiblemente un dominio que escinde proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG), un dominio polipeptídico que bloquea y/o supera la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o cualquier combinación de estos dominios polipeptídicos que pueden usarse en el tratamiento de lesiones de médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). Los diversos dominios polipeptídicos pueden unirse o enlazarse químicamente entre sí por enlazadores polipeptídicos. Las composiciones de la presente invención incluyen polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas o de fusión capaces de su uso sistémico en el tratamiento de lesiones de médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC), y en particular, codifican proteínas de fusión capaces de cruzar la barrera hemato-encefálica. Los polinucleótidos que codifican estas proteínas quiméricas o de fusión pueden incluir un dominio polinucleotídico que codifica un dominio de transducción de polipéptidos, un dominio polinucleotídico que codifica un dominio polipeptídico capaz de degradar un proteoglicano, preferiblemente que escinde proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG), un dominio polinucleotídico que codifica un dominio polipeptídico que bloquea y/o supera la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o cualquier combinación de estos dominios que pueden usarse en el tratamiento de lesiones de médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). El polinucleótido también incluye uno o más dominios polinucleotídicos que codifican polipéptidos que unen los dominios del polipéptido entre sí para formar la proteína de fusión. Una realización de la presente invención es una composición y un método para su uso que facilita el acceso y distribución de un agente terapéutico y de diagnostico en la composición en células, a través de membranas o en tejidos por el uso de una composición que incluye al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos, preferiblemente la composición incluye una proteína de fusión que tiene una enzima capaz de escindir CSPG. Las moléculas o agentes en la composición pueden incluir uno o más factores de crecimiento incluyendo, Factor Neurotrófico Derivado Cerebral, Factor de Crecimiento tipo Insulina, Factor de Crecimiento de Fibroblastos, Factor Neurotrófico Ciliar, Factor Neurotrófico Derivado Glial, Factor de Crecimiento de Transformación, Factor de Crecimiento Glial 2, L1 , GM1 , Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular, Factor de Crecimiento Nervioso, Inmunofilinas. Las moléculas en la composición pueden incluir agentes fluorescentes o de contraste para formación de imágenes. Los agentes pueden incluir células para el trasplante - células troncales, neuronas, otras células, como agentes de suministro, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, terapias de anticuerpo, antagonistas del receptor de Nogo, otras enzimas condroitinasa. La composición puede incluir un dominio de transducción, una enzima capaz de escindir proteoglicanos, o ambos. Preferiblemente, la composición incluye una proteína de fusión que tiene un dominio de transducción, un dominio enzimático capaz de escindir proteoglicanos, o ambos. La proteína de fusión puede facilitar el transporte o modificar el transporte de dichos agentes en células, tejidos, y/o localizaciones inaccesibles de otro modo; y/o potenciar las velocidades de penetración, distancia de penetración; o proporcionar distribución de concentración más uniforme. Preferiblemente, el transporte modificado sucede a través del uso de al menos una enzima capaz de escindir CSPG. Las composiciones pueden usarse para tratar una lesión del SNC, preferiblemente la composición se usa en el tratamiento de daño neuronal de una lesión por contusión. Las realizaciones de la presente invención incluyen proteínas quiméricas de un dominio que degrada proteoglicanos unido a un polipéptido que bloquea la acción de inhibidores del crecimiento neuronal tales como, aunque sin limitación, un dominio o variante del antagonista del receptor de Nogo (NgR27-3n) unido a una condroitinasa como condroitinasa ABC I o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales delecionados. El compuesto puede incluir proteínas quiméricas de un dominio que degrada proteoglicanos unido a un polipéptido que es un promotor de la adhesión de células neurales tal como un dominio promotor de la adhesión de células neurales L1 o variante unido a condroitinasa ABC I o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales delecionados. Las proteínas quiméricas pueden incluir proteínas quiméricas de un dominio que degrada proteoglicanos unido a un polipéptido que es un estimulador de las células gliales, tal como, aunque sin limitación, un estimulador de células gliales GGF2 o variante unido a condroitinasa ABC I o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales deleccionados. Puede usarse un sistema de expresión recombinante y proceso de purificación en E. Coli para producir condroitinasa ABC I esencialmente pura y catalíticamente activa. Estos métodos pueden modificarse para producir quimeras de moléculas que degradan proteoglicanos y otros agentes. La quimera puede ensayarse para la actividad enzimática condroitinasa y la actividad biológica específica de cada compañero de fusión. Los métodos para medir las actividades de la quimera pueden modificarse para los usados para medir la actividad condroitinasa incluyendo un ensayo espectrofotométrico, zimografía, un ensayo de HPLC para detectar productos de digestión de disacáridos CSPG y un ensayo de extensión de neuritas in vitro. Puede usarse un ensayo de colapso del cono de crecimiento de neuronas para evaluar los antagonistas del receptor de NOGO y puede usarse un ensayo de extensión de neuritas para medir la actividad L1. La actividad GGF2 puede medirse usando un ensayo de proliferación de células de Schwann. Las composiciones y método de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y en la promoción de regeneración de axones. Las composiciones de la presente invención también pueden usarse para promover la plasticidad, re-crecimiento, reparación, y/o regeneración de neuronas disfuncionales en el SNC que se han dañado como resultado de enfermedad, tal como enfermedades degenerativas incluyendo enfermedad de Alzheimer y Parkinson. De manera ventajosa, el uso de polipéptidos que degradan proteoglicanos o polipéptidos de transducción de membrana en las composiciones de la presente invención también promueve la difusión y acceso de tejido dañado o enfermo a otros agentes terapéuticos que promueven la regeneración de neuronas. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El archivo de esta patente contiene al menos un dibujo/fotografía ejecutado en color. Las copias de esta patente con dibujo o dibujos/fotografía o fotografías en color se proporcionarán por el bufete después de la petición y pago de la tasa necesaria. En parte, otros aspectos, características, beneficios y ventajas de las realizaciones de la presente invención serán evidentes con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y dibujos adjuntos en los que: La Figura 1 es un ejemplo ilustrativo de una construcción TAT-condroitinasa ABC I; la secuencia de ADN para el fragmento génico completo fusionado con la secuencia Tat seguido por el enlazador de 5 glicinas; los oligonucleótidos con sentido y antisentido que tienen las secuencias 5'-tatgtatggtc gtaaaaagcgtc gtcaacgtcgtcgtgg tggtggtggtca-3' y 5'-tatgaccaccaccaccaccacgac gacgttgacgac gcttttt acgaccataca-3' se hibridaron y ligaron en el sitio Ndel que está en el extremo 5' del gen de ABC I clonado en pET15b (Novagen) y los sitios Ndel y BamHI. La secuencia peptidíca Ta e-57 (GRKKRRQRR) está unida a la secuencia de ABC I por un enlazador de cinco glicinas. La Figura 2 son imágenes de sección cerebral; (I) ilustra los lóbulos de una trata adulta que se incubaron en beta-galactosidasa sola (B&D), o con la adicción de Condroitinasa ABC I (A, 0,5 U/ mi o C, 0,005 U/ml); (II) penetración de Eosina Y a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado Condroitinasa y control que muestra aproximadamente la misma penetración, la eosina Y es un compuesto zwitteriónico, que se usó con una carga negativa global a pH bajo, y es de 692 kDa; (lll)A una solución saturada de Rojo Congo demuestra una penetración superior a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Condroitinasa en comparación con cerebro no tratado, el rojo Congo es un colorante cargado negativamente de 697 kDa. La Figura 3 (A) es un diagrama que representa la proteína GGF de longitud completa (GGF2-M1-E422) y los tres fragmentos de GGF2 que contienen los dominios Ig y EGF y solos o en combinación; (B) una presentación esquemática de proteínas quiméricas de una molécula que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABC I y una isoforma GGF2 del gen de neuregulina 1.
La Figura 4 ¡lustra la estructura de (A) una proteína quimérica NgR27-3n-condroitinasa ABC I N terminal con o sin un espaciador peptídico o un grupo enlazador; (B) una proteína quimérica NgR27-3n-condroitinasa ABC I C terminal con o sin un péptido espaciador o grupo enlazador; (C) una proteína quimérica dominio extracelular L1-condroitinasa ABC I N-terminal con o sin un péptido espaciador o enlazador; (D) una proteína quimérica dominio extracelular L1-condroitinasa ABC I C-terminal con o sin un péptido espaciador o enlazador. Figura 5 (A) valores BBB de animales lesionados en la médula espinal tratados con condroitinasa (Condroitinasa ABC I), penicilinasa o fluido cerebromedular artificial (aCSF); (B) Secciones parasagitales de médulas espinales de animales lesionados tratados con condroitinasa (columna izquierda) o penicilinasa (columna derecha). Las secciones se cortaron a 30 micrómetros. Cada conjunto de imágenes contiene cuatro secciones parasagitales realineadas con la médula rostral a la izquierda y la médula caudal a la derecha. La sección más central de cada conjunto se ha retirado y reemplazado más abajo para ayudar a la visualización. Las parejas de imágenes están teñidas con Weil, anti-GFAP y tinción amino cúprica de degeneración neuronal (de la parte superior a la parte inferior). (C) y (D) Distribución de valores BBB individuales de acuerdo con el grupo de tratamiento. Los valores son valores BBB a las diez semanas después de la cirugía. Las medias de grupo se muestran por debajo de los datos puntuales, DESCRIPCION DETALLADA Antes de describir las presentes composiciones y métodos, debe entenderse que esta invención no está limitada a las moléculas, composiciones, metodologías o protocolos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la descripción es para el propósito sólo de describir las versiones o realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará solo limitado por las reivindicaciones adjuntas. También debe observarse que como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidos por los especialistas en la técnica, y etc. Salvo que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista en la técnica. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de las realizaciones de la presente invención, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en este documento se incorporan como referencia. Nada en este documento debe entenderse como una admisión de que la invención no da derecho a antedatar dicha descripción en virtud de la invención anterior. "Opcional" u "opcionalmente" significa que el acontecimiento o circunstancia descrito posteriormente puede o no puede suceder, y que la descripción incluye casos en los que el acontecimiento sucede y casos en los que no. Las enzimas adecuadas que escinden CSPG incluyen condroitinasa ABC tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamífero con actividad tipo condroitinasa tales como hialuronidasa 1 , hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, catepsinas, ADAMT y PH-20 o mezclas de las mismas. Los CSPG son una familia de proteoglicanos compuestos por una proteína central y glicosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente. Las cadenas de polisacáridos se escinden por varias enzimas, incluyendo una familia de condroitinasas. Hasta la fecha, esta familia de enzimas contiene al menos cuatro miembros, Condroitinasa ABC I, ABC II, AC y B. La Condroitinasa ABC I es una exo-liasa que escinde tanto condroitín como dermatán sulfates. Se ha usado extensivamente en el estudio de regeneración neuronal in vitro sobre sustratos cargados de CSPG y más recientemente en estudios in vivo después de lesión del SNC. Las proteínas y polipéptidos que pueden usarse en las composiciones y proteínas de fusión de la presente invención son las que promueven la plasticidad así como la regeneración de neuronas y axones lesionados o enfermos. Estas proteínas y polipéptidos de regeneración pueden incluir proteínas de adhesión celular, aquellas que estimulan las células gliales, y polipéptido que bloquea el efecto inhibidor de proteínas que funcionan como inhibidores del crecimiento de axones. La plasticidad del sistema nervioso se refiere a cualquier tipo de reorganización funcional. Esta reorganización sucede con el desarrollo, aprendizaje y memoria y reparación cerebral. Los cambios estructurales que suceden con la plasticidad pueden incluir formación de sinapsis, retirada de sinapsis, brote de neuritas e incluso pueden incluir fortalecimiento o debilitamiento de sinapsis existentes. La regeneración generalmente se diferencia de la plasticidad por el crecimiento de intervalo largo de axones en tractos alterados que es característico de la regeneración. Las proteínas y polipéptidos que son capaces de bloquear la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal pueden incluir péptidos y polipéptidos que bloquean las propiedades inhibidoras de péptidos tales como, aunque sin limitación, Nogo, AG, OMgp. Las composiciones adecuadas que superan la actividad de las moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal incluyen, aunque sin limitación, inhibidores de la familia de Proteína quinasa C, los inhibidores de la familia Rho quinasa y agentes, tales como inhibidores de fosfodiesterasa, que aumentan el AMP cíclico intracelular, y L1. El péptido (NgR27-3ii) ha demostrado inhibir la unión de Nogo66, OMgp, MAG, y MOG a NogoR unido a membrana y superar los efectos inhibidores de Nogo en la regeneración de procesos nerviosos. Las proteínas y polipéptidos que afectan a la adhesión celular o estimulan las células pueden incluir, aunque sin limitación, polipéptidos tales como L1 y GGF2. L1 es una proteína de adhesión celular neural que es un potente estimulador de la extensión de neuritas in vitro para la que se ha encontrado que el tratamiento de SCI agudo en roedores usando una forma soluble de L1 conduce a un aumento en la recuperación de función neurológica. GGF2 estimula células gliales y ha demostrado mejorar las medidas de resultados clínicos en un modelo murino de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) probablemente como resultado de la estimulación de oligodendrocitos para promover la remielinizacion. Las secuencias peptídicas permeable de membrana útiles para practicar la presente invención incluyen, aunque sin limitación, RQARRNRRRRWRERQR-51 (resto básico de la proteína Rev de VIH-1 ; (SEC ID N°: 51)); MPKTRRRPRRSQRKRPPTP-119 (resto básico de la proteína Rex de HTLV-1 ; (SEC ID N°:52)) (Kubota et al. 1989); la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia (Derossi, et al., J. Biol. Chem. 271 ; 18188-93, 1996) (43-RQlLlWFQNRRMKWLL-58 (SEC ID N°:53)); un péptido que se puede obtener de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal anti-ADN (Avrameas, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 95:5601-06, 1998) (VAYI S RG GVSTYYS DT VKGRFTRQKYN KRA (SEC ID N°:54)); y la proteína VP22 del virus del herpes simple (Elliot and O'Hare, Cell, 88:223-33, 1997)(1-MTSRRSVKSGPREVPRDEYEDLYYTPSSGMASPDSPPDTSRRGALQTRSRQRG EVRFVQYDESDYALYGGSSSEDDEHPEVPRTRRPVSGAVLSGPGARAPPPPAG SGGAGRTPTTAPRAPRTQRVATKAPAAPAAETTRGRKSAQPESAALPDAPASRA PTVQLWQMSRPRTDEDLNELLGITHRVTVCEGKNLLQRANELVNPDWQDVDAA TATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE-246 (SEC ID N°:55)). En una realización preferida, el péptido básico se puede obtener de la proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH 1) (Fawell et al., Proc. Acad. Sci., 91 :664-68, 1994). En particular, el péptido Tat puede comprender cualquier resto secuencial del resto 37-72 del péptido básico de la proteína Tat (Vives et al., 1997) (37-CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ-72 (SEC ID N°: 56)). La cantidad mínima de restos de aminoácidos puede estar en el intervalo de aproximadamente tres a aproximadamente seis, preferiblemente de aproximadamente tres a aproximadamente cinco, y más preferiblemente aproximadamente cuatro, es decir, el mínimo necesario para un giro de hélice alpha. Una realización preferida comprende los restos 48-57 de la proteína Tat (GRKKRRQRRR) (SEC ID N°: 57). Los dominios PTD adecuados incluyen los obtenidos de la proteína TAT. Las Proteínas Tat y Péptidos Tat son una proteína de 86 aminoácidos implicada en la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). La proteína de transactívacion de Tat de VIH-1 se capta eficazmente por células (Mann and Frankel 1991 ; Vives et al. 1994), y bajas concentraciones (nM) son suficientes para transactivar un gen informador expresado por el promotor de VI H-1 (Mann and Frankel 1991). La proteína Tat exógeno es capaz de translocarse a través de la membrana plasmática y alcanzar el núcleo para transactivar el genoma viral. Se cree que una región de la proteína Tat centrada en un grupo de aminoácidos básicos es responsable de esta actividad de translocacion (Vives et al. 1997). La captación celular mediada por el péptido Tat y la translocacion nuclear se han demostrado en varios sistemas (Vives, et al., J Biol Chem 272:16010-16017, 1997; Jones, Genes Dev 11 :2593-2599, 1997). Enlazando químicamente un péptido derivado de Tat (restos 37-72) a varias proteínas da como resultado su intemalizacion en varias líneas celulares o tejidos (FaweII, et al., Proc Nati Acad Sc¡ USA 91:664:668, 1994; Anderson, et al., Biochem Biophys Res Commun 194:876-8884, 1993; Fahraeus, et al., Curr Biol 6:84-91 , 1996; Nagahara, et al., Nat Med 4:1449-1452, 1998). Un péptido sintético que consta de los aminoácidos 48-60 básicos de Tat con un resto de cisteína en el extremo C-terminal acoplado a fluoresceína maleimida se transloca al núcleo celular como se determina por microscopía de fluorescencia (Vives et al. 1997). Además, una proteína de fusión (Tat-NLS-.beta.-Gal) que consta de los aminoácidos 48-59 de Tat fusionados por sus extremos amino-terminales a los aminoácidos 9-1023 de beta-galactosidasa se trasloca al núcleo celular de un modo dependiente de ATP, independiente de factor citosólico (Efthymiadis et al.1998). Las proteínas quiméricas, también mencionados en la técnica como proteínas de fusión, son proteínas híbridas que combinan al menos partes de dos o más proteínas o péptidos precursores. Las proteínas quiméricas pueden producirse por tecnología recombinante, es decir, fusionando al menos una parte de la secuencia codificarte de un gen con al menos una parte de la secuencia codificarte de otro gen. Cuando es deseable, pueden fusionarse uno o más genes mediante péptidos enlazadores a la secuencia codificante de genes de otros dominios polipeptídicos en la proteína de fusión. El gen fusionado después puede usarse para transformar un organismo adecuado tal como, aunque si limitación, células de E. coli o CHO que después expresan la proteína de fusión. Los genes que codifican mutantes de deleción N o C terminales de dominios polipeptídicos de las proteínas de fusión pueden usarse en construcciones para la expresión de las proteínas de fusión. Preferiblemente, los mutantes de deleción generados mantienen su actividad de degradación de proteoglicanos catalítica, actividad de bloqueo, actividad de crecimiento, o actividad de transducción. Los mutantes de deleción generados de las moléculas que degradan proteoglicanos como la enzima condroitinasa ABC I en los que el muíante pierde una cierta cantidad de aminoácidos del extremo N y/o C-terminal son los que mantiene alguna aclividad de degradación de proteoglicanos. Las deleciones N-terminales de condroiíinasa como condroilinasa ABC I maníienen una cola de hisíidina que está unida al extremo N-terminal. Se espera que una construcción de ADN de fusión TAT-mutaníe de deleción de condroiíinasa ABC I pueda expresarse sin la reíirada del polipépíido TAT duraníe la expresión. Por ejemplo, se fusiona el péptido TAT en el extremo N-terminal del muíante de deleción ABC1-NA20 o ABC1-NA60. Los fragmentos de polipéptidos, fales como los mostrados en la Figura 3 para GGF2, pueden usarse en la construcción de proteínas de fusión quiméricas. Los muíaníes de delección cafalíticamenle activos de condroitinasa ABC I pueden prepararse, por ejemplo, aunque sin limitación, delecionando 20, 40 y 60 aminoácidos respectivamente del extremo N-terminal de la proteína ABC I madura. La delección de 60 aminoácidos del extremo N terminal y 80 aminoácidos del extremo C íerminal íambién puede usarse para fabricar un muíanle de detección de una condroiíinasa ABC I que degrada proíeoglicanos. Estos muíaníes de delección y los de otras moléculas que degradan proteoglicanos pueden usarse para la construcción de proteínas quiméricas de fusión N-terminales. Pueden hacerse estudios bioquímicos comparativos detallados para determinar la eficacia de condroitinasa ABC I madura frente a diversos mutantes de deleción en composiciones y proteínas de fusión con respecto a la especificidad de sustrato, unión de sustrato y penetración en el tejido. Un mutante de condroitinasa ABC I que tiene estructura proteica nativa, pero que carece de actividad catalítica puede prepararse como nulo o control negativo para bioensayos y estudios de SCI. En base a la estructura cristalina de condroitinasa ABC I puede prepararse un mutante específico de sitio denominado H501a y Y508a para eliminar la actividad catalítica en el supuesto sitio activo. Dichos mutantes pueden ensayarse para la inactivación de la actividad catalítica y SEC para comparar la enzima de tipo silvestre. El mutante de actividad nula que se crea de manera exitosa proporcionará un control negativo para las diversas proteínas de fusión para su uso en bioensayos y finalmente en estudios animales de SCI. Un sistema de expresión de E. Coli puede ser para hacer una condroitinasa usando vectores de expresión PET (Novagen). La proteína de fusión GGF2-condroitinasa ABC I puede expresarse en E. Coli Las construcciones para proteínas de fusión Tat-mutante de deleción de condroitinasa, proteínas de fusión Tat-GGF2, o proteínas de fusión Tat-condroitinasa-GGF2 pueden expresarse en E. Coli. Otras proteínas de fusión pueden expresarse en líneas de células CHO. La Tabla 1 ilustra diversos componentes no limitantes que pueden usarse en composiciones de la presente invención como mezcla, y preferiblemente como molécula de fusión o quimérica. La composición o molécula quimérica descrita puede incluir una o más de las moléculas de la Tabla 1. En el caso de moléculas quiméricas se usa uno o más segmentos enlazadores, preferiblemente polipéptidos. Tabla 1 Componentes de Composiciones Moléculas de Moléculas que Moléculas terapéuticas, de transducción degradan diagnostico, antagonistas del proteoglicanos receptor Restos 48-57 de la Cualquier agente que Cualquier péptido que bloquea proteína Tat degrada las las propiedades inhibidoras de Restos básico de la glicoproteinas de Nogo, MAG, OMgp incluyendo: proteína Rev de VI H- matrices extracelular péptido Nogo 1 -40* 1 incluyendo: Cualquier componente del Resto básico de la Condroitinasa ABC I, péptido Nogo 1 - 40 que proteína Rev de VI H- Condroitinasa ABC II, mantiene la capacidad de 1 Condroitinasa AC, bloquear las propiedades proteína VP22 del Condroitinasa B, inhibidoras de Nogo virus del herpes Hialunoridasa 1 , Otros péptidos de bloqueo de simple hialunoridasa 2, Nogo hialunoridasa 3, Anticuerpos que reconocen hialunoridasa 4, PH20 Nogo mutantes de deleción Péptidos de bloqueo de MAG y/o sustitución de las Anticuerpos que reconocen moléculas enumeradas MAG anteriormente que Péptidos de bloqueo de OMgp mantienen la actividad Anticuerpos que reconocen enzimática. OMgp Anticuerpos que reconocen el receptor Nogo66 Péptidos de bloqueo del receptor p75 Anticuerpos que reconocen el receptor de neurotrofina p75 Péptidos o anticuerpos que bloquean otros receptores de Nogo, MAG y/u OMgp Péptido que supera las propiedades inhibidoras de Mielina, Nogo, MAG, OMgp incluyendo: Inhibidores de la familia de Proteína Quinasa C* Inhibidores de la familia Rho Quinasa Agentes que aumentan la concentración de AMPc intracelular L1 * Péptido Nogo 1 - 40: Los 40 aminoácidos humanos de NEP1-40 aa (Acetil-RIY KGV IQA IQK SDE GHP FRA YLE SEV AIS EEL VQK YSN S-amida) que corresponde a los aminoácidos 1-40 de Nogo 66 Se ¡lustra una ilustración esquemática de versiones no limitantes de proteínas de fusión quiméricas de la presente invención en la Figura 4A y Figura 4B. Un componente peptídico de cualquier columna de la Tabla 1 podría unirse por un enlazador oligopeptídico bien conocido en la técnica tal como un péptido rico en glicina, por ejemplo, puede usarse Gly-Gly-Gly-GIy-Gly, o enlazadores preparados incluyendo uno de aminoácidos de origen natural así como aminoácidos sustituidos o beta o gamma como ácido 4-aminobutírico o ácido 6-aminocaproico. También pueden usarse otros enlazadores incluyendo, aunque sin limitación, alquil diaminas, amino, o alquil dioles. Preferiblemente, el componente de transducción de la proteína de fusión está en una posición terminal en la proteína quimérica. Otros ejemplos de enlazadores habituales pueden incluir, aunque no se limitaría, a enlazadores Gly-Gly-Ala-Gly-Gly, enlazadores ricos en Gly/Ser (por ejemplo Gly4Ser3), o enlazadores ricos en Gly/Ala. Adicionalmente, los enlazadores pueden ser de cualquier longitud y diseño para promover o restringir la movilidad de componentes en la proteína de fusión. La incorporación de aminoácidos no naturales, incluyendo aminoácidos no nativos sintéticos, aminoácidos sustituidos, o uno o más D-aminoácidos en los péptidos (u otros componentes de los complejos) de la presente invención (posteriormente mencionados en este documento como "D-péptidos") es ventajosa en varios modos diferentes. Los péptidos que contienen D-aminoácidos muestran estabilidad aumentada in vitro o ¡n vivo en comparación con equivalentes que contienen L-aminoácidos. Por tanto, la construcción de péptidos que incorporan D-aminoácidos puede ser particularmente útil cuando se desea o necesita mayor estabilidad intracelular. Más específicamente, los D-péptidos son resistentes a peptidasas o proteasas endógenas, proporcionando de este modo un mejor suministro oral transepitelial y transdérmico de fármacos y conjugados unidos, biodisponibilidad mejorada de complejos permeables de membrana, y vidas medias ¡ntravasculares e intersticiales prolongadas cuando se desean dichas propiedades. El uso de D-péptidos también puede potenciar el suministro transdérmico y oral transepitelial de fármacos unidos y otras moléculas de carga.
En una lesión de médula espinal, los axones de neuronas sensoriales ascendentes y motoras descendentes se alteran, lo que puede dar como resultado la pérdida de sensación y parálisis. Estos axones no logran regenerarse exitosamente lo que conduce a una discapacidad permanente. Una cicatriz cubre el sitio de la lesión que se cree que tapia el área de tejido frágil, estabiliza la barrera hemato-encefálica, y evita una cascada incontenible de daño tisular incontrolado. Esta cicatriz está compuesta de células gliales hipertróficas y una matriz extracelular (ECM). Los proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG) son un componente importante de la cicatriz. Se expresan por células gliales y se depositan en la ECM en regiones de ruptura de la barrera hemato-encefálica. Evidencias in vitro demuestran que estos CSPG son potencialmente inhibidores del crecimiento de axones y sin desear unirse por la teoría, se cree que contribuyen al fallo de los axones de médula espinal para regenerarse y reformar sinapsis funcionales. Los estudios in vitro han demostrado que la regeneración de axones es capaz de crecer en e incluso más allá de la cicatriz. Los CSPG y componentes de la materia blanca están generalmente aceptados como barreras moleculares que las neuronas deben superar para regenerar y reestablecer conexiones funcionales después de una lesión. Neuronas sensoriales adultas transplantadas colocadas distales a una cicatriz en formación pueden regenerarse fuertemente incluso a lo largo de las vías de materia blanca en degeneración, sin embargo, la regeneración cesa bruscamente según los axones entran en la cicatriz glial que contiene proteoglicanos. El tratamiento de las vías de materia blanca del SNC con condroitinasa potencia la capacidad de las neuronas de crecer en estos sustratos. Los tejidos del sistema nervioso central están firmemente compactados con células y tienen espacio extracelular limitado. Las proteínas y carbohidratos de la matriz extracelular proporcionan fuerzas de carga y osmóticas así como sitios de unión específicos y no específicos que pueden evitar la penetración de agentes terapéuticos. La escisión enzimática de estos componentes de matriz y celulares pueden ralentizar o facilitar el acceso de compuestos o células a través de los tejidos. Una molécula que degrada proteoglicanos como Condroitinasa ABC I que es una enzima que digiere proteoglicanos de condroitín sulfato puede usarse para promover la difusión de moléculas terapéuticas en el SNC. Los péptidos Tat transportan moléculas de carga biológicamente activas unidas de manera covalente al citoplasma y núcleos de las células. En el caso de una proteína de difusión que tiene un dominio polipeptídico de transducción de proteínas como la proteína tat de VIH, pueden suministrarse moléculas terapéuticas para la regeneración de axones a través de la barrera hemato-encefálica. El tratamiento de lesiones del modelo SCI, preferiblemente lesión del modelo por contusión, puede usarse para determinar el grado de regeneración y recuperación funcional conseguida por composiciones y método de la presente invención. El grado de recuperación funcional puede demostrarse por mejora de la conducción del tracto corticoespinal, retirada de la cinta mejorada, caminar por una viga, caminar por una rejilla y colocación de la pata después de tratamiento con condroitinasa de una lesión de la columna dorsal. La mejora de la capacidad motora así como la función autonómica: intestino, vejiga, función sensorial y sexual también puede usarse como medidas de la mejora de la función y relacionarse con la estructura moléculas y componentes en las composiciones de la presente invención. Además de la capacidad de la condroitinasa para potenciar la regeneración, la condroitinasa digiere componentes de la malla perineuronal (PNN). La densidad de la PNN es variable en el SNC y es particularmente densa en las cortezas somatosensorial, auditiva, visual y el hipocampo. PNN también ha demostrado ser densa alrededor de las neuronas motoras medulares. Se ha descubierto la PNN densa en el cuerno dorsal de la médula. La digestión del PNN puede potenciar la plasticidad en el hipocampo y corteza visual. La plasticidad en los sistemas intactos SNC en SCI incompleta, especialmente en la región de generadores del patrón central o en el núcleo reticular, puede mantener la función de sistemas dañados o destruidos. La promoción de la plasticidad en estos sistemas puede ser un mecanismo distinto de o además de la regeneración por la que la condroitinasa puede mejorar la función después de lesión del SNC. Además, la regeneración y plasticidad puede funcionar en concierto con la recuperación afectada después de lesión; de hecho, el tracto corticoespinal ha demostrado ser crítico para la modulación de plasticidad de la médula espinal. La recuperación de la función neurológica después de lesión por contusión en el SNC o una patología puede promoverse administrando las proteínas de fusión o mezclas que incluyen uno o más de los componentes de la Tabla 1 , a células, a un tejido, o un sujeto que tiene neuronas dañadas o enfermas sea inmediata o de larga duración la lesión o enfermedad. Las proteínas de fusión en este documento se administran en una cantidad eficaz para degradar CSPG y por lo tanto promueven la recuperación de la función neurológica. Una vez que las proteínas o polipéptidos en las composiciones se han purificado hasta el grado deseado, pueden suspenderse o diluirse en un vehículo o excipiente fisiológico apropiado para tratamiento de SCI. En modelos de SCI, las dosis intratecales eficaces en ratas han sido aproximadamente 0,06 unidades en días alternos durante 14 días. Una dosis para un ser humano de 70 kg puede ser aproximadamente 17 Unidades. A aproximadamente 100 Unidades/miligramo, sería igual a aproximadamente 170 microgramos. Las dosis de hasta 20 Unidades parecen seguras en ratas. Las composiciones que incluyen una molécula que degrada proteoglicanos en una mezcla o como parte de una proteína de fusión diluida en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable pueden inyectarse, generalmente a concentraciones en el intervalo de 1 µg a 500 mg/kg de hospedador. La administración del agente puede ser por inyección en forma de bolo, suministro intravenoso, infusión continua, liberación sostenida desde implantes, o agentes farmacéuticos de liberación sostenida. La administración puede ser por inyección, tal como intramuscular, peritoneal, subcutánea, intravenosa. La administración oral puede incluir comprimidos o cápsulas, preferiblemente la dosificación oral es una formulación de liberación sostenida para administración una o dos veces al día. La administración percutánea puede ser una vez al día, y preferiblemente es de menos de una vez por día de administración. La administración al paciente humano u otro sujeto animal puede continuarse hasta que se consiga una mejora que se pueda medir en la función autonómica o motora en el paciente. Las proteínas de fusión de condroitinasa PTD pueden administrarse con un vehículo farmacéutico adecuado. La administración de las composiciones de de la presente invención como mezclas o proteínas quiméricas puede ser tópica, local, o sistémica. Las proteínas de fusión quiméricas también pueden secretarse por células modificadas genéticamente, preferiblemente una proteína de fusión quimérica que tiene una parte que degrada proteoglicanos como condroitinasa y una parte polipeptídica de transducción como TAT pueden secretarse por células genéticamente modificadas que se implantan, libres o en una cápsula, en o cerca del sitio de lesión del SNC. Una vez se han administrado las composiciones como mezclas o proteínas de fusión, la degradación de CSPG retira las moléculas inhibidoras que bloquean la extensión de neuritas, y permiten la regeneración de neuritas en el área afectada. Por ejemplo, la condroitinasa AC y condroitinasa B degrada CS y DS, respectivamente, dando como resultado disacáridos sulfatados insaturados. La condroitinasa AC escinde CS en enlaces 1 , 4 glicosídicos entre N-acetilgalactosamina y ácido glucurónico en el esqueleto polisacárido de CS. La escisión sucede a través de la eliminación beta en un patrón de acción endolitica aleatorio. La condroitinasa B escinde el enlace 1 , 4 galactosamina ácido idurónico en el esqueleto polisacárido de DS. La escisión tanto de CS como de DS sucede a través de procesos de eliminación beta que diferencia estos mecanismos enzimáticos de enzimas que degradan GAG de mamífero. La condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, son exo y endo Nasas que escinden tanto CS como DS. La retirada de CS y DS de la cicatriz glial permite la regeneración de extensión de neuritas en el área lesionada. Las mezclas de cualquiera de estas proteínas de fusión pueden usarse para proporcionar un tratamiento terapéutico para lesiones y trastornos del SNC que pueden incluir, aunque sin limitación, lesión por contusión, lesión cerebral traumática, apoplejía, esclerosis múltiple, lesión del plexo braquial, ambliopía, lesiones de la médula espinal. Las lesiones de médula espinal incluyen enfermedad y lesiones traumáticas, tales como el aplastamiento de neuronas provocado por un accidente de coche, caída, contusión, o herida de bala, así como otras lesiones. La práctica de los presentes métodos puede otorgar beneficios clínicos al mamífero tratado, proporcionando mejoras clínicamente relevantes en al menos una de las funciones de coordinación motora del sujeto y percepción sensorial. Las mejoras clínicamente relevantes pueden variar desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función alterada o perdida del SNC. La regeneración de las células nerviosas en el área del SNC afectada permite el regreso de la función motora y sensorial. La mejora químicamente relevante variará desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función nerviosa alterada o pérdida, variando con los pacientes y lesiones individuales. Una variante de una proteína o fragmentos de la misma se refieren a una molécula sustancialmente similar a la proteína completa o un fragmento, que tiene actividad biológica que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la proteína complementaria o fragmentos. Una molécula es sustancialmente similar a otra molécula si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas tienen una actividad biológica similar. Las variantes de proteína complementaria o fragmentos de la misma se producen por medio químico o recombinante. También pueden fabricarse variantes de los polinucleótidos construidos para expresar proteínas de fusión. Las variantes pueden incluir, por ejemplo, deleción de, o inserciones o sustituciones de, restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, o delecion, sustitución, o inserción de ácidos nucleicos de una secuencia codificante para una proteína o dominio polipeptídico de fusión particular en la proteína de fusión. Por ejemplo, en algunos casos la retirada de uno o más resto de aminoácidos de un polipéptido condroitinasa puede hacerse sin cambios significativo en su actividad de degradación de CSPG. Los cambios sustanciales en las propiedades funcionales como degradación de proteogl ¡canos o actividad de bloqueo frente a inhibidores del crecimiento de axones puede hacerse seleccionando sustituciones que son menos conservativas, es decir, que difieren más significativamente en su efecto de mantener la estructura, carga o hidrofobicidad del esqueleto peptídico en el área de la sustitución. La mayoría de las deleciones, inserciones, y sustituciones no se espera que produzca cambios radicales en las características de la molécula proteica; sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, delecion, o inserción antes de hacerlo, un especialista en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por ensayos de exploración de rutina. Por ejemplo, un cambio en el carácter de regeneración de axones de la molécula polipeptídica, a través de más o menos degradación de proteogl ¡canos puede medirse con ensayos de recuperación funcional así como por ensayos de HPLC para detectar los productos de digestión de disacáridos de CSPG. La presente invención se refiere al uso de una molécula que degrada proteoglicanos, una proteína tat de VIH, o un polipéptido derivado de tat, o una combinación de éstas como mezcla o proteína de fusión para suministrar una molécula de interés al SNC o un sitio en el SNC donde ha sucedido un daño del tejido neuronal por enfermedad o traumatismo. En particular, el sitio del daño en el SNC es donde ha sucedido una cicatrización como resultado de una lesión por contusión. La molécula de interés, opcionalmente se menciona como un agente o molécula de carga que puede ser una molécula terapéutica que promueve la plasticidad, crecimiento de axones, una molécula de diagnostico, o una molécula que degrada proteoglicanos. En el caso de una proteína de fusión que tiene un dominio polipeptídico de transducción de proteínas como la proteína tat de VIH, pueden suministrarse moléculas terapéuticas para la regeneración de axones a través de la barrera hemato-encefálica o puede suministrarse una molécula que degrada proteoglicanos en células para degradar almacenes celulares de proteoglicanos y promover la regeneración de axones. Los polipéptidos de transporte de esta invención pueden estar unidos ventajosamente a moléculas de carga por entrecruzamiento químico o por fusión genética. Un único resto de cisteína terminal es un medio preferido de entrecruzamiento químico. De acuerdo con algunas realizaciones preferidas de esta invención, el extremos carboxi terminal del resto de transporte está genéticamente fusionado al extremo amino terminal del resto de carga. Una realización de la presente invención consta de una metionina amino-terminal seguida por los restos 47-58, seguido por un polipéptido condroitinasa. Se apreciará que los 86 aminoácidos completos que componen la proteína tat pueden no ser necesarios para la actividad de captación de tat. Por ejemplo, puede usarse un fragmento proteico o un péptido que tiene menos de 86 aminoácidos, pero que muestra captación en células y/o puede atravesar la barrera hemato-encefálica (un fragmento o parte funcionalmente eficaz de tat).
Por ejemplo, la proteína tat que contiene los restos 1-72 puede ser suficiente para la actividad de captación y los restos 1-67 de tat pueden mediar la entrada de una proteína heteróloga en las células. Un péptido sintético que contiene los restos 1-58 de tat puede tener actividad de captación. El péptido tat puede ser una secuencia de aminoácidos única (es decir, continua) presente en la proteína tat o puede ser dos o más secuencias de aminoácidos que están presentes en la proteína tat, pero que en la proteína de origen natural están separadas por otras secuencias de aminoácidos. Como se usa en este documento, la proteína tat incluye una secuencia de aminoácidos de origen natural que es la misma que la de la proteína tat de origen natural, su equivalente funcional o fragmentos funcionalmente equivalentes de la misma (péptidos). Dichos equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente equivalentes pueden tener actividad de captación en la célula o a través de la barrera hemato-encefálica que es sustancialmente similar a la de la proteína tat de origen natural. La proteína tat puede obtenerse de fuentes de origen natural o puede producirse usando técnicas de ingeniería genética o síntesis química. La secuencia de aminoácidos de la proteína tat de VIH de origen natural pueden modificarse, por adicción, delección y/o sustitución de al menos un aminoácido presente en la proteína tat de origen natural, para producir una proteína tat modificada (también mencionada en este documento como proteína o polipéptido tat). La proteína tat modificada o análogos del péptido tat con estabilidad aumentada puede por tanto producirse usando técnicas conocidas. Por lo tanto, las proteínas o tat péptidos pueden tener secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares, aunque no idénticas, a las de la proteína tat de origen natural o partes de la misma. Además, pueden añadirse colesterol u otros derivados [¡píricos a la proteína tat para producir una tat modificada que tiene solubilidad en membrana aumentada. La proteína tat de VIH-1 de origen natural tiene una región (aminoácidos 22-37) donde 7 de los 16 aminoácidos son cisteína. Esos restos de cisteína son capaces de formar enlaces de sulfuro entre sí, con restos de cisteína en la región rica en cisteína de otras moléculas proteicas tat y con restos de cisteína en una proteína de carga o el resto de carga de un conjugado. Dicha formación de enlaces de disulfuro puede provocar la pérdida de la actividad biológica de la carga. Además, incluso si no es potencial para la unión por disulfuro al resto de carga (por ejemplo, cuando la proteína de carga no tiene restos de cisteína), la formación de enlaces disulfuro entre los polipéptidos de transporte puede conducir a agregación e insolubilidad del polipéptido de transporte, el conjugado polipéptido de transporte-carga o, ambos. La región rica en cisteína de tat puede seleccionarse para evitar la formación de enlaces disulfuro y evitar la agregación e insolubilidad del polipéptido de transporte, el conjugado polipéptido de transporte-carga, o ambos. La condroitinasa también es capaz de promover la plasticidad en regiones del SNC con PNN significativamente densa, incluyendo corteza, techo, hipocampo y médula espinal. Es razonable que alguna combinación de efectos, incluyendo regeneración, brote y plasticidad sean responsables de la mejora en la función después de SCI con tratamiento con condroitinasa o tratamiento con moléculas de fusión que incluyen condroitinasa u otra molécula que degrada proteoglicanos. NbR27-3n : Nogo es un componente de mielina de alto peso molecular que inhibe le extensión de neuritas. La región aminoterminal (Nogo66) es la parte de la molécula que está específicamente asociada con la inhibición de la extensión de neuritas. Los métodos de clonación de expresión revelaron que el receptor para Nogo66 (NgR) es una glicoproteina anclada por GPI expresada principalmente neuronas. NgR interacciona no sólo con Nogo, sino también con otros inhibidores asociados a mielina tales como MAG o MOG. Debido a este papel central en las propiedades inhibidoras de mielina en las neuronas, NgR ha sido la diana de enfoques para antagonizar sus interacciones con sus ligandos. El segmento soluble de NgR interacciona con Nogo66, MAG y MOG. La región abarca los restos 27-311 y este fragmento de NgR puede por lo tanto funcionar como receptor señuelo que impedirá la inhibición asociada a mielina de neuronas. Si NgR27-3n está unido a una molécula que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABCI para formar una proteína de fusión quimérica, el dominio polipeptídico NgR27-3n de la proteína de fusión se esperaría que limitara la inhibición asociada con mielina de extensión de neuritas y promoviera la regeneración axonal en regiones digeridas por condroitinasa de una lesión de médula espinal. Para ( gR27-3n) clonado, la región precisa de interés, o fragmentos pueden obtenerse del clon inicial. La actividad biológica de NgR27-3n , sus fragmentos, y polipéptidos de fusión que incluyen NgR27-3n puede confirmarse usando un ensayo ¡n vitro para el colapso de conos de crecimiento en neuronas. El ensayo de colapso del cono de crecimiento se ha establecido y la adición de MAG o Nogo66 provoca el colapso de los conos de crecimiento de un modo dependiente de dosis. Si NgR27-3ii, sus fragmentos, y polipéptidos de fusión que incluyen NgR27-3n que son activos, es biológicamente activo, entonces deben inhibir el colapso del cono de crecimiento mediado por MAG y Nogo66. Los datos del colapso del cono de crecimiento pueden recogerse por la inspección de fotomicrografías de neuronas DRG en respuesta a Nogo66 y MAG. El polipéptido L1 es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de adhesión celular que se expresan axones en crecimiento, células progenitoras gliales y células de Schwann durante toda la vida, pero tiene la expresión limitada al SNC. L1 interacciona consigo misma y con otras moléculas extracelulares, tales como el receptor de FGF para promover la fasciculación de neuritas y el crecimiento. La expresión de L1 está generalmente asociada con un medio permisivo para la regeneración axonal, la región precisa de interés, o fragmentos de L1 pueden obtenerse del clon inicial. Por ejemplo, las células de Schwann que expresan L1 mantienen la regeneración de nervios periféricos y se observa crecimiento axonal en los nervios ópticos de ratones transgénicos que expresan L1 en astrocitos pero no en nervios ópticos de tipo silvestre. Los fibroblastos diseñados para expresar L1 soportan el crecimiento axonal cuando se transplantan en médula espinal. Finalmente, una forma soluble de L1 unida a Fe promovió la recuperación funcional después de SCI aguda. Si L1 esta unido a una molécula que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABC I en una proteína de fusión es razonable esperar que la proteína de fusión promueva la regeneración axonal en regiones digeridas con condroitinasa de una lesión de médula espinal. Las neuregulinas y sus receptores comprenden un sistema factor de crecimiento y receptor tirosina quinasa diverso que ha demostrado ser esencial para la organogénesis en el SNC, epitelio muscular y otros tejidos. GGF2 es una isoforma soluble del gen de neuregulina 1. Se caracterizó inicialmente como un mitógeno 32 de células de Schwann, pero estudios posteriores han demostrado que dirige acciones en oligodendrocitos, neuronas y otros tipos celulares. GGF2 disminuye la desmielinización e inflamación y potencia la remielinización en un modelo de ratón para esclerosis múltiple. En base a estos resultados, es razonable esperar que una GGF2 humana recombinante sea un tratamiento potencial para la desmielinización asociada con SCI. Cuando GGF2 está unida a una molécula que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABC I es razonable esperar que promueva la remielinización de axones en regiones digeridas con condroitinasa de una SCI. Tabla 2. Ejemplos de fragmentos de GGF2 no limitantes para la expresión en E. coíi para su uso en composiciones y composiciones polipeptídicas de fusión.
La eficacia de una composición de una composición de la presente invención, tal como una molécula que degrada proteoglicanos y una molécula que bloquea la actividad de un inhibidor del crecimiento de axones como una mezcla o como una proteína de fusión puede evaluarse usando un modelo de SCI de rata validado a tres niveles diferentes de gravedad de SCI. Una molécula que degrada proteoglicanos como Condroitinasa ABCI está disponible en el mercado en pequeñas cantidades como una enzima obtenida de manera natural (Seikagaku Corporation) y puede fabricarse por un sistema de producción recombinante para que tenga esencialmente la misma actividad que la enzima purificada de Proteus vulgaris. El ADN genomico puede aislarse de Proteus vulgaris usando un kit DNeasy Tissue (Qiagen). Pueden sintetizarse cebadores de PCR con un sitio de restricción Ndel en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' que tienen las secuencias 5'-CAT ATG GCC ACC AGC MT CCT GCA TTT G-3'(F2) y 5'-GGA TCC TCA AGG GAG TGG CGA GAG-3'(R) respectivamente, para sintetizar la proteína madura. Los productos de PCR de 3,0 kb pueden ligarse en el vector pCR 2.1 (kit de clonación TOPO, Invitrogen) y transformarse en células competentes DH5a (Invitrogen). El ADN plasmídico puede aislarse de una diversidad de clones explorados por digestión con la enzima de restricción EcoRI. La integridad de un gen preparado de este modo puede confirmarse por secuenciación de ADN repetida. La secuencia de condroitinasa ABC I puede clonarse en un vector PET (Novogen) para la expresión en E. Coli. Después de la inducción de la expresión génica con IPTG, las bacterias pueden lisarse por sonicacion con la extracción concomitante de condroitinasa ABC I con Tritón X 114/PBS. Se descubrió que la mayoría de la condroitinasa ABC I recominante se encontraba en la fracción citosólica del lisado celular bacteriano que posibilitaba el desarrollo de un protocolo de purificación de condroitinasa ABC I que produce una enzima con alta actividad a altos rendimientos. El protocolo incluye cromatografía de intercambio catiónico como etapa de captura y filtración en gel como etapa de pulido. Después de estas etapas la condroitinasa ABC I alcanza una pureza de -95 %. La filtración en membrana de intercambio aniónico (Intercept Q, Millipore) puede usarse para la retirada de endotoxina y ADN hospedador. Esta etapa se espera que retire aproximadamente el 75% de endotoxina. Después de filtración, puede dializarse la condroitinasa ABC I en un tampón volátil, pH 8,0, y liofilizarse hasta sequedad. El producto final es estable a -70° C durante almacenamiento a largo plazo. La cABCI purificada es una proteína altamente básica con pl~9,5 como se determina por análisis IEF-PAGE de las muestras del lisado celular en bruto. Pueden usarse una diversidad de métodos analíticos para comparar la actividad enzimática de la versión recombinante de condroitinasa ABC I con la de una forma disponible en el mercado de la enzima (Seikagaku Corporation) purificada de Proteus vulgarís. Los métodos pueden adaptarse para evaluar la actividad de proteínas de fusión incluyendo polipéptidos que degradan proteoglicanos como condroitinasa. Las medidas de actividad específica se obtuvieron usando un ensayo espectrofotométrico aceptado que mide el cambio en la absorbancia debido a la producción de productos de reacción de la degradación de proteoglicanos. La forma recombinante de condroitinasa ABC I tiene aproximadamente un 25% de más actividad específica que la condroitinasa ABC I de Seikagaku. Puede usarse cromatografía por exclusión de tamaño para comparar las propiedades hidrodinámicas de las enzimas. Los perfiles de elucción para la enzima recombinante fueron idénticos a los de la enzima obtenida de manera natural. Puede usarse una forma de zimografía para caracterizar adicionalmente la enzima y puede adaptarse para la caracterización de las proteínas de fusión. Pueden polimerizarse geles de poliacrilamida en presencia de agrecano, un sustrato para condroitinasa ABC I. Pueden resolverse las muestras enzimáticas en los geles impregnados con agrecano por electroforesis en presencia de SDS. Después, los geles pueden someterse a una etapa de renaturalización en la que el SDS se extrajo y las enzimas se permitieron replegarse. La enzima se repliega y vuelve a ganar actividad, después digiere el agrecano en el gel y la pérdida resultante de carbohidrato en esa región del gel puede visualizarse por una tinción específica de carbohidratos. Una pérdida similar de carbohidratos en el gel se esperaría para formas activas de una proteína de fusión que incluye una parte polipeptídica que degrada proteoglicanos. En el caso de Condroitinasa ABC I recombinante, su actividad puede visualizarse como una mancha clara en zimograma. Los resultados del zimograma fueron consistentes con el análisis espectrofotométrico que demuestra que la forma recombinante de condroitinasa ABC I tiene la misma o más actividad específica que la forma de origen natural. Pueden usarse métodos de HPLC para detectar los disacáridos cuatro y seis sulfatados (A4DS y A6DS, respectivamente) liberados como resultado de la digestión con condroitinasa ABC I de CSPG. Los dos disacáridos pueden resolverse de manera eficaz por cromatografía de intercambio amónico. El ensayo de HPLC puede validarse mostrando que la cuantificación de A4DS y A6DS de cromatogramas produce una relación lineal de las cantidades inyectadas en el HPLC. La producción de A4DS y A6DS de la digestión de CSPG está directamente relacionada con la cantidad de actividad específica condroitinasa determinada por el ensayo espectrofotométrico descrito anteriormente. Este ensayo puede usarse como medio sensible y seguro para cuantificar independientemente A4DS y A6DS liberados por la digestión con condroitinasa de una diversidad de sustratos y también puede usarse para determinar la actividad de polipéptidos condroitinasa en una proteína de fusión. Otro ensayo funcional que puede realizarse para caracterizar la actividad del polipéptido proteoglicano es cuando se siembran en placas neuronas de ganglio de la raíz dorsal (DRG) en agrecano o agrecano tratado con un polipéptido que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABCI. Se espera que las neuronas sembradas en placas en agrecano no consigan adherirse a la placa y extender axones. En contraste, las neuronas sembradas en placas en agrecano tratado con un polipéptido que degrada proteoglicanos como condroitinasa ABCI en una composición o como parte de un polipéptido de fusión se esperaría que se adhirieran a la superficie y extendieran axones. El crecimiento de axones extenso, que se observa para condroitinasa ABCI se cree que se debe a la digestión de los carbohidratos en la proteína central de agrecano que crea un sustrato más permisivo para el crecimiento de axones. El modelo de SCI por contusión de rata es un modelo clínicamente relevante y puede usarse para evaluar la eficacia de proteínas de fusión y otras composiciones de la presente invención para promover la regeneración de axones. Con una SCI por contusión, las células se destruyen, sigue una hemorragia y comienza inflamación. Las células destruidas se retiran por macrófagos y comienza una gliosis reactiva. Se forma una cavidad quística y la gliosis madura en una cicatriz glial. La mielina en el área se destruye y muchas neuronas locales que no se destruyen se quedan en un estado desmielinizado. El modelo de SCI por compresión con fórceps es un modelo de contusión desarrollado y caracterizado. Este modelo se ha validado y provoca lesiones que son muy similares a los modelos de impacto más ampliamente usados. El modelo puede implicar compresión con fórceps a nivel de las vértebras T9/T10. Los fórceps comprimen la médula a un grosor de 0,9, 1 ,3 o 1 ,7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresión permiten una lesión grave, moderada o leve. Este modelo se ha validado usando el ensayo locomotor de campo abierto y el sistema de valoración de Basso, Bresnahan y Beattie (BBB). También se caracterizó histológicamente. El ensayo de comportamiento y valoración BBB demostraron que los fórceps producen una lesión altamente reproducible, con recuperación similar a la que se ve con modelos de impacto. Estos datos de ensayo y valoración demuestran que el modelo de compresión con fórceps es comparable a otros modelos de contusión y son suficientemente reproducibles para usarse como modelo de SCI experimental para la evaluación de composiciones de la presente invención. El tejido de animales lesionados por compresión con fórceps puede procesarse histológicamente para examinar la disponibilidad de materia blanca, cicatriz glial y formación de quiste. Como con otros modelos de SCI por contusión, se forma un quiste central después de la lesión, con un tamaño que aumenta con gravedad de la lesión aumentada (disminución del hueco de los fórceps). Alrededor del quiste se forma una cicatriz glial que se caracteriza por astrogliosis (GFPA), activación de macrófagos y pérdida de mielina. Se ilustrarán diversos aspectos de la presente invención con respecto a los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra cómo una molécula que degrada proteoglicanos puede administrarse, estudiarse, y demostrar que muestra una mejora funcional en animales que tienen lesión por contusión modelo. El modelo de compresión con fórceps de SCI es un modelo de contusión desarrollado y caracterizado. Este modelo se ha validado y los resultados son muy similares a los modelos de impacto más ampliamente usados. El modelo puede implicar una compresión con fórceps a nivel de las vértebras T9 T10. Los fórceps comprimen la médula a un grosor de 0,9, 1 ,3 ó 1 ,7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresión permiten una lesión grave, leve o moderada. Las ratas se lesionaron con el modelo de compresión con fórceps en las vértebras T9/T10. En el momento de la cirugía, se colocó un catéter intratecal para el suministro de condroitinasa. Los animales se trataron cada día durante una semana y después en días alternos durante una semana con 0,06 U/dosis de condroitinasa ABC I (Seikagaku), penicilinasa o fluido cerebromedular artificial (aCSF). Las dosis y controles se obtuvieron de Bradbury et al., 2002. El comportamiento se evaluó usando un ensayo de locomoción de campo abierto y el sistema de valoración BBB en el día 2, y después, semanalmente después de la lesión durante diez semanas. La Figura 5A muestra valores BBB medios para animales tratados con condroitinasa ABC I, penicilinasa y aCSF. Las ratas tratadas con aCSF o penicilinasa recuperaron un valor BBB medio de aproximadamente 4. Las ratas tratadas con condroitinasa recuperaron un valor BBB medio de aproximadamente 8. Múltiples animales recuperaron valores por encima de 10, lo que indica una aportación supra-medular. Los valores con condroitinasa fueron significativamente diferentes de ambos grupos de control por ANOVA y post hoc de Tukey.
El tejido de estos animales se procesó de manera inmunohistoquímica para la proteína ácida fibrilar glial (GFPA) para evaluar la arquitectura de la cicatriz general. El tejido también se tiñó con una tinción de Weil y una tinción de degeneración de plata para evaluar la degeneración de mielina y la neurona, respectivamente. Es interesante indicar que no se observaron diferencias obvias en estos parámetros entre tejidos experimentales y tratados con control. En la Figura 5B la gran lesión que comprende varios segmentos y el anclase en la médula ventral. La tinción de Weil reveló una desmielinización extensa tanto en animales tratados como no tratados. Las imágenes de GFAP (conjunto intermedio) demuestran la extensión de la cicatriz que se forma después de lesión con fórceps. La tinción por degeneración de plata amino cúprica demuestra la enorme degeneración neural que se extiende de manera tanto rostral como caudal después de la lesión. Otra vez, no se observaron diferencias obvias entre los tejidos tratados con condroitinasa y los de control. Los experimentos preliminares adicionales se han realizado a niveles de lesión moderada y se observó una mejora significativa en la actividad locomotora de campo abierto con tratamiento con condroitinasa. Los animales que recibieron condroitinasa ABCI recuperaron un valor BBB de 9,1 a las diez semanas después de la lesión, en comparación con 7,1 para los controles con penicilinasa. La consistencia de los datos (SEM de 0,6 y 0,3, respectivamente) y la región de valores en la escala BBB hace este cambio de 2 puntos estadísticamente significativo, sino también clínicamente significativo. Un valor de 9 indica colocación plantar con soporte de peso o frecuente para un soporte de peso uniforme con paso dorsal mientras que un valor de 7 indica movimiento de cada articulación en la extremidad trasera pero no soporta peso y arrastrado no uniforme de las extremidades. Un examen de los valores del animal individuales a las diez semanas muestra que 6 de los 12 animales en el grupo de condroitinasa recuperaron valores de 9 o superiores, mientras que sólo uno de los 12 animales en el grupo de penicilinasa recuperó un valor de 9. Un animal de cada grupo se retiró del análisis porque su valor no logró en ningún momento elevarse por encima de 2,5, lo que indica una gravedad de la lesión fuera de las normas del modelo. La Figura 5C y la Figura 5D incluyen una representación dispersa de los valores a las 10 semanas para cada animal en los grupos de tratamiento con penicilinasa y condroitinasa para la lesión moderada. Las medias de grupo se muestran a continuación. Los resultados muestran en este estudio bien controlado, que la condroitinasa mejora la función locomotora de campo abierto en ratas que se lesionaron con el modelo de compresión con fórceps en las vértebras T9/T10. Los animales recuperaron los valores BBB medios de 9,7 y 9,9 para los grupos de penicilinasa y condroitinasa, respectivamente. Este estudio demuestra un efecto significativo a niveles de lesión grave y moderada, pero no a niveles de lesión leve. No se observaron diferencias significativas entre ningún grupo en el estudio de lesión leve (fórceps a 1 ,3 mm). No está claro si la condroitinasa no es eficaz con lesión leve, si la condroitinasa provoca cambios no ensayados adecuadamente por el ensayo locomotor de campo abierto tal como longitud del paso, colocación de la pata, funciones sensorial o autonómica. Los análisis preliminares de histología para animales en este estudio confirmaron la colocación de los catéteres y lesiones en cada animal. Los experimentos en curso que sacrifican animales en tiempos puntuales después de lesión con y sin tratamiento con condroitinasa caracterizarán el contenido en CSPG de la cicatriz y los efectos de la digestión con condroitinasa sobre la expresión de antígeno de cola. Los experimentos futuros aumentarán la batería de ensayos de comportamiento y examinarán la médula para evidencias de regeneración localizando el tracto. Se realizaron dos estudios de toxicidad aguda en ratas. El primero fue un estudio intravenoso (IV) en el que se inyectó a las ratas 0, 0,2, 0,775 ó 7,775 mg/kg de condroitinasa ABCI. En el segundo estudio, se colocaron catéteres intratecales (IT) sobre las médulas espinales usando los mismos métodos empleados en estudios animales de SCI y se suministraron 0,06, 0,6 y 6,0 unidades de condroitinasa ABCI a través de los catéteres IT. Estas dosis fueron 1 , 10, y 100 veces mayores que las concentraciones locales estimadas de condroitinasa ABCI conseguidas con catéteres IT en los experimentos de SCI. Los animales se controlaron para el dolor y distrés y se consiguieron los pesos corporales diariamente. No se observaron reacciones manifiestas durante o inmediatamente después de la dosificación de condroitinasa ABCI. No se observó hinchazón, inflamación, magulladura o necrosis en el sitio de la inyección para el experimento IV. No se observaron cambios en la temperatura corporal en animales tratados mediante la vía IT. No se observaron alteraciones en la alimentación, acicalamiento o vocalizaciones. Los animales se evaluaron para el comportamiento motor en un espacio abierto. No se observaron anormalidades por el personal de cuidado animal o especialistas del comportamiento. Los animales no presentaron signos de debilidad o hinchazón de articulaciones. No hubo diferencias significativas en el cambio de peso entre los grupos de tratamiento. Los resultados demuestran que el tratamiento con condroitinasa ABCI no está asociado a toxicidad aguda usando dosis IV e IT sustancial mente superiores que las dosis IT eficaces. EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la preparación de agonista del receptor de Nogo, proteína de adhesión a células neurales L1, y dominios polipeptídicos de GGF2 que pueden usarse para composiciones y proteínas de fusión de la presente invención. Una parte soluble del receptor humano de Nogo que alberga los aminoácidos 27 a 311 (NgR27-3n ) se seleccionó porque ha mostrado inhibir la unión de Nogo66, MAG, y MOG a NgR unido a membrana. Se diseñaron cebadores que flanquean esta región, y se realizó RT-PCR usando ARN del hipocampo humano (BD Biosciences). Se amplificó y purificó de manera exitosa la región de 1 ,05 kb. L1 se preparó a través de una línea celular CHO del laboratorio del Dr. Melitta Schachner que secreta L1 humana como proteína de fusión con Fe humano (L1-Fc). Las células se hicieron crecer en frascos rotativos y después se purificó L1-Fc de los medios condicionados usando cromatografía en columna de afinidad a proteína A. La pureza de L1-Fc se evaluó por SDS-PAGE y se observó una única banda en el peso molecular apropiado. La actividad biológica de L1-Fc se confirmó usando un ensayo de extensión de neuritas. Las placas de cultivo tisular se recubrieron con poli L-lisina o L1-Fc y después se aislaron células granuladas del cerebelo de ratas de diez días después del nacimiento y se colocaron en cultivo sobre los sustratos. Se observó que las neuronas cultivadas en placa en el sustrato L1-Fc mostraron una cantidad sustancial de neuritas largas en comparación con los controles de sustrato de polilisina. Estos resultados demuestran que el L1-Fc producido es biológicamente activo en la promoción de extensión de neuritas. Este ensayo de extensión de neuritas se usará para evaluar la actividad biológica relacionada con la parte L1 de la proteína de fusión de condroitinasa ABCI. Se obtuvo una línea de células CHO que secreta una forma soluble de glicoproteína GGF2 de longitud completa de CeNes. La optimización extensiva de los medios y métodos de purificación se completó para obtener GGF2 esencialmente puro y biológicamente activo. Se desarrollaron varios métodos analíticos para caracterizar el GGF2 incluyendo SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, mapeo de péptidos y análisis de carbohidratos. Por ejemplo, un gel de SDS-PAGE de GGF2 reducido y no reducido; el aislado está esencialmente libre de proteínas contaminantes y muestra el peso molecular esperado y estructura monomérica. La actividad biológica de GGF2 se ensayó usando un método de proliferación de células de Schwann de rata primarias y se obtuvo de manera reproducible el efecto esperado con cuatro lotes independientes de GGF2. Se desarrolló otro ensayo funcional que mide la fosforilación de Akt quinasa, un componente de señalización cadena abajo de la vía del receptor erbB. Se observó que hay una fosforilación dependiente de dosis de Akt quinasa. EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la manipulación de condroitinasa ABCI para la construcción de quimeras.
La condroitinasa ABCI se clonó de P.vulgaris y se expresó en E.coli. Sorprendentemente no fueron exitosos intentos repetidos de crear proteínas de fusión N-terminales porque la parte de fusión N-terminal se escindió de condroitinasa ABCI durante la síntesis. Sin embargo, los mutantes de deleción catalíticamente activos con colas de fusión de His N-terminales denominados ABC ?-??20, ABC ?-??40 y ABCI-??ß? se prepararon delecionando 20, 40 y 60 aminoácidos respectivamente del extremo N-terminal de la proteína ABCI madura. A diferencia de la condroitinasa ABCI de longitud completa, los mutantes de deleción N-terminales son capaces de sintetizar colas 6xHis como una proteína de fusión N-terminal. También se observó que la deleción de 80 aminoácidos del extremo C-terminal formó un muíante con actividad de degradación de proteoglicanos de condroitinasa ABCI como se ensaya en el ensayo zimográfico.
Las proteínas de fusión con NgR27-3n o L1 con una molécula que degrada proteoglicanos tal como condroitinasa ABCI utilizará expresión de mamíferos y puede realizarse en células CHO. El ADNc de condroitinasa ABCI se ha clonado en un vector pSECTag (Invitrogen) en la pauta de lectura apropiada. Una línea de células CHO que tiene condroitinasa ABCI de secreción puede desarrollarse y puede ensayarse el medio condicionado para la actividad catalítica por ensayo zimográfico para confirmar que la condroitinasa ABCI expresada en células de mamífero es funcional. Una versión optimizada de codones de células de mamífero de condroitinasa ABCI puede sintetizarse por métodos conocidos en la técnica para su uso para la expresión en células CHO. GGF2 es una variante de corte y empalme del gen NRG1 en cerebro y médula espinal de seres humanos adultos. Es una proteína glicosilada de masa molecular entre 66-90 kDa. Se ha descubierto que GGF2 recombinante expresado en células CHO está altamente glicosilado y promueve la proliferación de células de Schwann ¡n vitro y también que un dominio tipo EGF de NRG1 expresado en E.coli es completamente funcional en la promoción de proliferación de miocitos y supervivencia.
Se han expresado fragmentos de GGF2 en E.coli como se describe en la sección de datos preliminares. El dominio GGF2 específico responsable de la proliferación de las células de Schwann y por lo tanto puede determinarse la remielinización. Si los dominios Ig y EGF juntos o separados muestran actividad biológica ¡n vitro, entonces pueden usarse para formar proteínas de fusión quiméricas. La clonación y expresión de NgR27-3n en células CHO. Un fragmento de NgR que corresponde a los restos 1-359 se aisló por RT-PCR del ARN poli K del hipocampo humano (BD Biosciences) y su estructura puede confirmarse por secuenciación de ADN. El fragmento génico que corresponde a los restos 27-311 puede clonarse del fragmento más grande y después subclonarse en el vector pSECTag (Invitrogen) en la pauta de lectura apropiada para expresar el fragmento como una proteína de secreción en células CHO. El ADN plasmídico que contiene el gen de NgR27-3n puede transfectarse en células CHO y la línea celular que produce NgR27-3n puede seleccionarse a presión de selección de higromicina B. Un plásmido de expresión quimera NgR27-3n-ABCI puede construirse para la expresión en un sistema de expresión de células CHO usando métodos conocidos en la técnica. EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra métodos que pueden usarse para purificar y aislar condroitinasa ABCI expresada, y dominios GGF2 expresados en E. coli. Estos métodos pueden aplicarse a purificación de proteínas de fusión quiméricas de la presente invención. Se ha desarrollado un sistema de expresión recombinante de E.coli eficaz y un proceso de purificación para condroitinasa ABCI que podrían aplicarse para la purificación de derivados quiméricos de condroitinasa ABCI. Por ejemplo, la expresión de diversos dominios de GGF2 en el hospedador de expresión de condroitinasa ABCI, E.Coli. se ha realizado y se han ensayado los siguientes péptidos: aa250-402, aa250-422 y aa350-402. Estos péptidos expresados se encontraron en la fracción soluble de lisados de E.coli. Es razonable esperar que los productos quiméricos finales de estos péptidos con condroitinasa ABCI en E.coli también sean solubles. Además, se espera que las características de carga de los productos quiméricos en comparación con la condroitinasa ABCI recombinantes sean similares. Por tanto, los valores de punto isoeléctrico (pl) para los péptidos de GGF2 son 9,3 para aa250-402, 9,18 para aa250-422 y 7,55 para aa350-402. Fusionando los dos primeros péptidos con condroitinasa ABCI se espera que se produzcan proteínas quiméricas con valores de pl aún por encima de 9. En este caso se espera que una cromatografía SP funcione bien como etapa de captura. El péptido de GGF2 más pequeño, aa 350-402, reducirá el pl de la quimera condroitinasa ABCI final hasta aproximadamente 8,4. Este cambio puede necesitar la optimización de las condiciones de la etapa de captura. Los productos quiméricos de condroitinasa ABCI con los péptidos NgR27-3n y L1 pueden expresarse en un sistema de células CHO. Antes de la purificación de las proteínas quiméricas expresadas, las condiciones de crecimiento para la línea celular que produce las proteínas quiméricas NgR27-3n o L1 se optimizarán en medio libre de suero. Un estudio de optimización de medios detallada puede realizarse para determinar las condiciones de producción más alta. Puede decidirse un volumen aumentado en escala en base a la velocidad de producción de proteínas quiméricas (pg/célula/día). Los medios condicionados de las diversas líneas celulares que producen quimeras pueden recogerse y someterse a filtración en flujo tangencial. Puede usarse cromatografía de intercambio iónico para capturar las proteínas secretadas de los medios condicionados, puede usarse cromatografía por filtración en gel como etapa de purificación por pulido y después puede usarse filtración en membrana de intercambio aniónico para retirada de endotoxinas y ADN. En cada etapa, la eficacia de la purificación se analizará por SDS-PAGE, y la cuantificación espectrofotométrica de la concentración de proteína. EJEMPLO 5 Este ejemplo profético describe la evaluación in vitro de actividad biológica quimera: Cada quimera se puede ensayar para la actividad enzimática condroitinasa y la actividad biológica de cada compañero de fusión. La primera etapa en el análisis puede emplear metodologías bioquímicas de proteínas convencionales para confirmar la fidelidad de la expresión de los genes. Estas incluyen SDS-PAGE, IEE, espectrometría de masas y cromatografía por exclusión de tamaño. La actividad específica condroitinasa quimera puede determinarse usando un ensayo espectrofotométrico convencional y uniformemente aceptado. La producción de productos de reacción a partir de la actividad catalítica de un polipéptido quimérico condroitinasa puede determinarse por una medida de la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reacción típica consta de 120 microlitros de mezcla de reacción (Tris 40 m , pH 8,0, NaAcetato 40 mM, caseína al 0,002%) combinada con sustrato (5 microlitros de 50 mM de condroitina C) y 1 ,5 microlitros de polipéptido de fusión quimérico condroitinasa ABCI o muestra de ensayo. El cambio en las unidades de absorbancia es la velocidad inicial que puede convertirse a una medida de actividad unitaria. Ensayo de HPLC de disacáridos: La actividad catalítica de polipéptido quimérico condroitinasa en un sustrato CSPG se espera que libere dos especies de disacáridos sulfatados incluyendo cc-cc AUA-[1? 3]-GalNAc-4S (? 4DS) y a-? AUA-[1? 3]-GalNAc-6S (? 6DS). Estas especies pueden resolverse por HPLC y la cuantificación de los cromatogramas resultantes es una medida sensible y segura de la actividad condroitinasa. Para "realizar el ensayo, se realizan muestras de reacción de digestión con condroitinasa con condroitinasa de tipo silvestre y pueden aclararse proteínas de fusión de condroitinasa por centrifugación y después someterse a un método de HPLC de intercambio aniónico validado del siguiente modo. Puede usarse una columna analítica Dionex CarboPac PA-10 (4 x 250 mm) ajustada con una columna auxiliar Dionex CarboPac PA-10 (4x 50 mm) con una fase móvil compuesta de un gradiente de agua a pH 3,5 (Tampón A) y NaCI 2 M, a pH 3,5 (Tampón B). La detección puede ajustarse a una longitud de onda de 232 nm. Un caudal de 1 ml/minuto y un gradiente continuo de 45 minutos de A al 100% a B al 100% B produce una resolución aceptable de A4DS y A6DS. Pueden generarse curvas patrón usando cantidades conocidas de A4DS y A6DS. Una zimografía permite la resolución de proteínas por peso molecular con una evaluación concomitante de actividad condroitinasa. Puede polimerizarse un gel de poliacrilamida al 10% en presencia de 85 pg/ml de agrecano. Las muestras se pueden hervir en un tampón de carga con SDS y después los analitos se pueden resolver por electroforesis. Después de la separación, el gel puede incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente en Triton X100 al 2,5%, después 16 horas a 37°C en Tritón X-100 al 2,5% reciente. Durante estas incubaciones, puede extraerse el SOS del gel y la condroitinasa se repliega y digiere el agrecano en su cercanía inmediato. Después del proceso de replegamiento, el gel puede teñirse para carbohidratos: El gel primero se puede incubar en Cetilpiridinio al 0,2% durante 90 minutos a temperatura ambiente y después transferirse en Azul de Toluidina al 0,2% en 49:50:1 H20, Etanol, y Ácido Acético durante 30 minutos. Después el gel puede desteñirse completamente. Después de desteñir el gel, se puede incubar durante una noche en una solución de 50 microgramos/ml de solución de Stains-AII (Sigma) en etanol al 50%. La actividad condroitinasa puede detectarse como una mancha clara en el gel que coincide con el peso molecular de la enzima. El tamaño del aclarado ha demostrado ser casi lineal con relación al la Unidad de actividad. La quimera NgR27-3ii-condroitinasa puede evaluarse para la actividad del receptor señuelo de Nogo. El ensayo puede usarse para medir el colapso de los conos de crecimiento: Se diseccionan los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de crías de rata Sprague Dawley un día después del nacimiento (P1 ) y se disocian en 200 U/ml colagenasa I (Worthington) y 2,5 U/ml dispasa (Boehringer/Roche) 2 veces durante 30 min a 37°C. Las enzimas se retiran y puede añadirse ADNasa (0,5mg/ml) a los ganglios. La trituración puede hacerse con una punta de pipeta unida a una Pipetman de 1000 µ?. La suspensión celular resultante puede filtrarse a través de un filtro celular de 40 micrómetros y centrifugarse a 70xg durante 5 min. Las células puede re-suspenderse en DMEM/FBS al 10% y pre-sembrarse durante 2 horas en una placa de cultivo tisular no recubierta (diámetro de 1 ,00 mm). Las neuronas no adherentes se retiran y se siembran a 10.000 células/pocilio en una placa de 24 pocilios recubierta con Poli-lisina/laminina en Neurobasal/B27 libre de suero con 50 ng/ml de NGF. Después de 20 a 24 horas, puede añadirse MAG o Nogo66 a concentraciones variadas durante 1 hora a 37°C para inducir el colapso de los conos de crecimiento. Puede añadirse la quimera NgR27-3ii-condroitinasa a diversas concentraciones para competir con MAG y Nogo66 y proteger de este modo a las neuronas de colapso de los conos de crecimiento. Los cultivos pueden fijarse añadiendo un volumen igual de paraformaldehído al 8%/sacarosa 0,6 M al medio durante 20 min mientras que las células se mantiene en una placa caliente a 37°C. Los conos de crecimiento pueden marcarse con faloidina AlexaS68 (Molecular Probes). Brevemente, las células pueden permeabil izarse con Triton-X 100 al 0,1 % durante 5 min a RT, bloquearse durante 20 min en BSA 1 % en PBS e incubarse en faloidina, diluida 1 :40 en BSA al 1 %, en PBS para 20 mm a RT. Las células pueden lavarse en PBS, montarse en Medio de Montaje Fluorescente (DAKO). El porcentaje de conos de crecimiento colapsados se determina analizando un mínimo de 100 conos de crecimiento por pocilio en un objetivo de 40x. La actividad biológica de proteínas de fusión L1 puede determinarse usando un ensayo de extensión de neuritas normalizado. Después de marcar un círculo en el centro de una placa de 35 mm tratada con cultivo tisular, se puede añadir 1 mi de 10 µg ml de poli-lisina a cada círculo marcado y se incuba a 37°C durante 60 minutos. La poli-lisina proporciona un control negativo para la extensión de neuritas. Los círculos marcados pueden lavarse 2 veces con solución salina equilibrada de Hank más calcio y magnesio (HBSS++) después del último lavado; se mancha con 1 ,2 µ? de L1-Fc (0,6 µ?, 0,3 µ?, 0,15 µ?, 0,075 µ?) sobre placa petri para servir como control positivo y pueden aplicarse diversas concentraciones de la proteína de fusión L1-condroitinasa a las placas como muestras de ensayo. Las placas pueden incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. Las manchas se aspiran ligeramente, para no retirarlas por secado, y se lavan inmediatamente 2 veces con 1 mi de HBSS++ y después se añade 1 mi de BSA al 1% en PBS a cada círculo marcado. Después de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, los círculos marcados pueden lavarse 2 veces con HBSS++, y una vez con medio de bioensayo (NeuralBasal(Gibco) + suplementos B27 (Gibco) + L-glutamina + ácido L-glutámico, penicilina y estreptomicina (100 U/ml) + suero fetal bovino al 1 % que permanecerá en las placas petri hasta el momento del ensayo. Para proporcionar neuronas que sembrar sobre los sustratos, se recogen células granulares del Cerebelo 9 ó 10 días después del nacimiento (PND). El cerebro se retira del cráneo de 1 cría, y se separa el cerebelo del resto del tejido. La meninges se retira, y el cerebelo se coloca en HBSS++ enfriado con hielo. El tejido se pica y se trata con tripsina usando tripsina al 0,25% durante 15 minutos a 37°C. La acción de la tripsina se inhibe añadiendo 0,5 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Gibco). El tejido se aclara con HBSS++ y se tritura usando una pipeta Pasteur reducida a la llama recubierta con EBS. Las células disociadas se sedimentan a 500xg durante 3 minutos, el sobrenadante se decanta, y las células se resuspenden en 2 mi de medio de crecimiento. Después de triturar ligeramente, la suspensión celular se coloca en capas cuidadosamente en la parte superior de un lecho de BSA al 3,5% (en PBS), y se hace girar a 500xg durante 3 minutos. El sobrenadante se aspira y el sedimento se resuspende en 2 mi de medio de crecimiento. Se realiza un recuento de las células y las células se diluyen a una concentración de trabajo final de 1 ,5x105 células/ml. Se añade una alícuota de 300 µ? de células diluidas al centro de cada placa, dando como resultado la distribución uniforme de 6x 04 células a través del área superficial completa del círculo marcado. Las células se dejan crecer durante 16 horas a 37°C en un medio humidificado suplementado con C02 al 5%. El siguiente día, las placas se retiran del incubador a 37°C, las células se fijan con paraformaldehído al 4% y se registra la extensión de neuritas por fotomicroscopía.
Los ensayos de actividad biológica para GGF2 pueden realizarse usando proliferación de células de Schwann. Los nervios ciáticos se diseccionan de crías de rata Sprague Dawley de tres días de edad y se disocian en medio L-15 (Invitrogen) que contiene tripsina al 0,25% y colagenasa tipo I al 0,03% (SIGMA) durante 15 minutos a 37°C. Los nervios se centrifugan a 400xg durante 5 minutos y el medio de disociación se remplaza por DMEM/FBS al 10%. Los nervios se trituran usando una jeringa de 21 gramos y posteriormente una jeringa de 23 g. La suspensión celular se filtra a través de una malla de 40 µ?t? colocada sobre la abertura de un tubo cónico de 50 mi. Las células pueden centrifugarse a 400xg durante 5min, sembrarse en un matraz T-75 recubierto con poli-D-lisina (PDL) a una densidad de aproximadamente 5 millones de células en 15 mi de DMEM/FBS al 10%/PenStrep e incubarse a un incubador a 37°C regulado con CO2 al 10%. Después de 24 horas de incubación, las células se lavan dos veces con DMEM/FBS al 10% y se re-alimentan con medio de inhibición de fibroblastos compuesto por DMEM/FBS al 10% y 10 µ?/ml de arabinósido de citosina 1 mM (Ara-C). Después de un tiempo de incubación de 2 a 3 días, el medio de inhibición de fibroblastos se remplaza por medio de crecimiento de células de Schwann (DMEM/FBS al 10%/150 ng/ml de GGF2/forscolina 5 µ?). Las células pueden expandirse y se congelan alícuotas de 2x106 células/ml en DMEM/DMSO al 10%, FBS al 54% en nitrógeno líquido. En el momento de su uso, las células de Schwann se descongelan y se siembran a una densidad de aproximadamente 16.000 células/pocilio en una placa de cultivo tisular de 96 pocilios recubierta con PDL en DMEM/FBS al 5%. Después de aproximadamente 24 horas, se añade GGF2 en dilución en serie que varía de 100 ng/ml a 0,78 ng/ml que contiene forscolina 5 µ? para establecer una curva patrón. Las muestras de proteínas de fusión de GGF2 también pueden añadirse en dilución en serie junto con forscolina 5 µ?. Se añade BrdU a10 µ?. Las células se incuban durante 48 horas en un incubador con CO2 al 10%. Puede usarse un kit de ELISA de BrdU de Roche Applied Science (N° Cat. 1 647 229) para detectar la proliferación de células de Schwann. El medio se vierte fuera de la placa y la placa se golpea sobre papel de tejido. Se añade una alícuota de 200 µ?/pocillo de Fix/Denat y se incuba durante 30 min a 15-25°C. Puede añadirse una alícuota de 100 µ?/pocillo de solución de trabajo anti-BrdU-POD (el anticuerpo liofilizado se disuelve en 1 ,1 mi de agua destilada dos veces y se diluye 1 :100 con solución de dilución de anticuerpo) e incubarse durante 90 min a temperatura ambiente. Los pocilios pueden lavarse 3 veces con 200-300 µ?/pocillos de solución de lavado. Se añade una alícuota de 100 µ? de solución de sustrato y se incuba durante 15 minutos o hasta que el desarrollo de color sea suficiente para la detección fotométrica. Las placas son rojas en un lector de placa SpectraMax a 450 nm antes de la adición de solución de parada a 370nm o después de la adición de 50 mi de ácido sulfúrico 1 N a cada pocilio. ELISA de Akt [pS473]: Se hacen crecer células de glioma C6, obtenidas de la ATCC, en DMEM/FBS al 10% en un matraz T-75 hasta confluencia. Después del tratamiento con tripsina, las células se siembran en una placa de 24 pocilios a una densidad de 500.000 células/pocilio en 0,5 mi de medio. Un día después de la siembra, las células se tratan con GGF2 (lote: Glu de Lonza Biologics) a diluciones en serie que varían de 0,78 a 100 ng/ml durante 30 minutos a 37°C para establecer una curva patrón. Como control negativo, se añade wortmanina, un inhibidor de PI3-quinasa, a las células a 10 nM durante 3 minutos antes de la adición de GGF2. Las muestras de proteínas de fusión de GGF2 también se añadirán en dilución en serie. Las células se lavan con PBS y después se extraen con 100 µ? de tampón de extracción celular (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1 mM, Na4P207 20 mM, Na3V04 2 mM, Tritón X-100 al 1%, glicerol al 10%, SDS al 0,1 %, desoxicolato al 0,5%, PMSF 1 mM, cóctel de inhibición de proteasas (Pierce)). Los extractos celulares se mantienen a -80°C hasta su uso posterior. Puede usarse un kit de ELISA de Biosource (N° Cat. KH001 II) para medir los niveles de Akt quinasa fosforilada. Brevemente, se cargan 100 µ? de una dilución 1 :50 de las muestras y una dilución en serie de patrones de Akt [pS473] en pocilios pre-recubiertos con anticuerpo anti-Akt durante 2 h a temperatura ambiente (TA) o durante una noche a 4°C. Los pocilios se lavan un se añade anticuerpo anti-Akt [pS473] y se incuba durante 1 hora. Después de lavado, se añade antisuero anti-conejo conjugado con HRP a los pocilios y se incuba durante 30 min. Después de lavado, se añade cromógeno TMB a los pocilios y se incuba durante 30 min a RT antes de detener la reacción con solución de parada. La placa se lee en un lector de placa SpectraMax a 450 nm. Las densidades ópticas se trazan frente a los patrones de Akt [pS473] y la concentración de pAkt en las muestra C6 se deducen de la curva patrón. EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra la construcción de una proteína de fusión de polipéptido condroitinasa y un péptido de transducción celular TAT. La secuencia génica que codifica una enzima condroitinasa puede unirse de manera operativa a un dominio de transducción de proteínas de VIH llamado el Péptido TAT. Los genes quiméricos resultantes de la construcción de ADN de fusión TAT-condroitinasa ABCI se muestran en la Figura 1. Se observó que durante la expresión bacteriana de esta construcción, el péptido TAT se retiraba de la enzima condroitinasa en algún punto del procesamiento durante el crecimiento bacteriano. La retirada de los péptidos unidos al extremo N-terminal también se observó durante la expresión de una enzima condroitinasa ABCI con una cola de histidina N-terminal. Los mutantes de deleción de la enzima condroitinasa ABCI se generaron cuando el muíante estaba perdiendo varios aminoácidos de la parte N-terminal del polipéptido pero mantenía su actividad de degradación de proteogllcanos. Se observó que estas deleciones N-terminales mantenían una cola de histidina que estaba unida al extremo N-terminal. Se espera que diversas construcciones de ADN de fusión TAT-mutante de deleción de condroitinasa ABCI puede expresarse sin la retirada del polipéptido TAT durante la expresión. Por ejemplo, el péptido TAT puede fusionarse al extremo N-terminal de mutantes de deleción como el muíante de deleción ABCI-NA20 o ABCI-??ß?. Sin desear estar unidos por la teoría, se cree que la enzima que degrada proteoglicanos nativa contiene una secuencia señal que está unida al extremo N-terminal. Esta secuencia señal se retira durante la producción natural en bacterias y en la producción de la enzima clonada en E. coli. Se cree que alguna señal en los aminoácidos N-terminales ordena a las bacterias a retirar cualquier cosa unida a este extremo. Puede hacerse una construcción de ADN con el péptido TAT unido al extremo N-terminal de uno de los mutantes de deleción de condroitinasa y una transferencia de Western y gel de la proteína que muestran esta proteína expresada y la actividad. EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra la difusión de moléculas en células y tejido usando una composición que degrada proteoglicanos. Se retiró un cerebro del cráneo de una rata Sprague Dawley adulta y se dividió en cuartos en las secciones frontal derecha, frontal izquierda, posterior derecha y posterior izquierda, que corresponden aproximadamente a los lóbulos frontal (anterior) y occisito-parietal (posterior). (A) El cuarto frontal derecho se coloca en fluido cerebromedular artificial (N° Catálogo 59-7316; Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contiene la enzima beta-galactosidasa (N° Catálogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) y condroitinasa ABC I a 0,5 U/ml (N° Catálogo C 3667; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto del cerebro se aclaró varias veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (N° Catálogo Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). La reacción sustrato-enzima (producto azul) se dejó desarrollar durante 1 hora, y después se aclaró el cerebro varias veces en PBS y los trozos del centro de cada bloque de cerebro se cortaron usando cuchillas rectas paralelas. (B) El cuarto frontal izquierdo se colocó en fluido cerebromedular artificial (N° Catálogo 59-7316; Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (N° Catálogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto del cerebro se aclaró varias veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (N° Catálogo Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). La reacción sustrato-enzima (producto azul) se dejó desarrollar durante 1 hora, y el cerebro se aclaró varias veces en PBS y los trozos del centro de cada bloque de cerebro se cortaron usando cuchillas rectas paralelas. (C) El cuarto frontal derecho se colocó en fluido cerebromedular artificial (N° Catálogo 59-7316; Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (N° Catálogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) y condroitinasa ABC I a 0,5 U/ml (N° Catálogo C 3667; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto del cerebro se aclaró varias veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (N° Catálogo Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). La reacción sustrato-enzima (producto azul) se dejó desarrollar durante 1 hora, y el cerebro se aclaró varias veces en PBS y los trozos del centro de cada bloque de cerebro se cortaron usando cuchillas rectas paralelas. (D) El cuarto posterior izquierdo se colocó en fluido cerebromedular artificial (N° Catálogo 59-7316; Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (N° Catálogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto del cerebro se aclaró varias veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (N° Catálogo Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). La reacción sustrato-enzima (producto azul) se dejó desarrollar durante 1 hora, y el cerebro se aclaró varias veces en PBS y los trozos del centro de cada bloque de cerebro se cortaron usando cuchillas rectas paralelas. Las imágenes de los cerebros se consiguieron en un escáner y se muestran en la Figura 2(I)(A-D). Se humedecieron los hemisferios del cerebro de una rata adulta en tampón solo o que contenía 33 U/ml de Condroitinasa ABCI (Acorda) durante 2 horas a 37 grados C. Los hemisferios se aclararon y se colocaron inmediatamente en Eosina Y (Sigma) o una solución saturada de Rojo Congo Red (Sigma) en etanol al 70%. Los trozos de tejido se cortaron y se consiguieron imágenes en un escáner. Véase la Figura 2(H) Eosina y Figura 2(lll) rojo Congo. La Figura 2(lll) solución saturada de Rojo Congo muestra mayor penetración a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Condroitinasa en comparación con un cerebro no tratado. El Rojo Congo es un colorante cargado negativamente de 697 kDa. La Figura 2(11) penetración de Eosina Y a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Condroitinasa parece ligeramente más difusa, pero la penetración no parece se más profunda en comparación con cerebro no tratado. Eosina Y es un compuesto zwitteriónico, que se usó teniendo una carga negativa global a pH bajo, y es de 692 kDa. La Figura 2(1) Lóbulos de rata adulta se incubaron en beta-galactosidasa sola (B&D), o con la adición de Condroitinasa ABCI (A, 0,5 U/ml o C, 0,005 U/ml).
Los resultados mostraron que el tejido tratado con condroitinasa afectaba a la penetración de beta-galactosidasa en tejido del SNC. La condroitinasa tiene efectos drásticos sobre la velocidad de penetración de colorante Rojo Congo pero aparentemente no de Eosina. EJEMPLO 8 Este ejemplo ilustra un Protocolo de Ensayo de Condroitinasa ABCI que puede modificarse para medir la actividad de proteínas de fusión de mutantes de deleción de Condroitinasa ABCI o la actividad de otras proteínas de fusión de polipéptidos que degradan proteoglicanos de la presente invención. La producción de productos de reacción a partir de la actividad catalítica de una molécula que degrada proteoglicanos o proteína de fusión se determina por una medida de la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reacción típica consta de 120 µ? de mezcla de reacción (Tris 40 mM, pH 8,0, NaAcetato 40 mM, caseína al 0,002%) en combinación con sustrato (5 µ? de condroitina C 50 mM) y 1 ,5 µ? de condroitinasa ABCI o una proteína de fusión de un muíante de deleción de condroitinasa ABCI-TAT. cABCI de Seikagaku de referencia: congelación a -20°C en alícuotas de 5 mi, uso de 1 mi por reacción, condroitina C 50 mM (PM 521) en agua: congelación a -20°C en alícuotas de 100 mi. Pueden prepararse alícuotas de mezcla de reacción de aproximadamente 120 µ? a 37°C durante 3 min o más. Se usa una longitud de onda de 232 nm con el espectrómetro. Conociendo en coeficiente de extinción para el producto de reacción, midiendo el cambio en la absorbancia del producto de reacción a 232 nm, leyendo en el tiempo después de la adición de una cantidad conocida de la Condroitinasa ABCI u otras proteínas de fusión de polipéptidos que degradan proteoglicanos a la mezcla de reacción de 120 µ? con caseína al 0,002% y sustrato de condroitina añadido, puede determinarse la actividad específica en µ????/min/mg de la proteína de fusión que degrada proteoglicanos. La Condroitinasa ABCI de Seikagaku tiene una actividad específica en estas condiciones de ensayo de aproximadamente 450 Aunque la presente invención se ha descrito en considerable detalle con respecto a ciertas realizaciones preferidas de la misma, son posibles otras versiones. Por lo tanto, el espíritu y alcance de la invención no deben limitarse a la descripción y las versiones preferidas contenidas en esta memoria descriptiva.

Claims (45)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende: un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica a polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido al menos dos: un dominio de transducción de proteínas, un dominio de degradación de proteoglicanos, o un dominio que promueve la regeneración neural.
2. La composición de la reivindicación 1 , en la que el ácido nucleico codifica el dominio de transducción de proteína domino TAT.
3. La composición de la reivindicación 1 , en la que cualquiera de los dos dominios de dicho polipéptido están unidos entre sí por un domino polipeptídico enlazador.
4. La composición de la reivindicación 1 , en la que el ácido nucleico codifica un dominio de degradación de proteoglicanos que es un mutante deleción de condroitinasa ABCI.
5. La composición de la reivindicación 1 , en la que el dominio que promueve la regeneración neural es L1 , una variante que es al menos un 80% L1 , o un mutante de deleción de L1.
6. La composición de la reivindicación 1 , en la que el dominio que promueve la regeneración neural es GGF2, una variante funcional que es al menos un 80% GGF2, o un mutante de deleción funcional de GGF2.
7. La composición de la reivindicación 1 , en la que el dominio que promueve la regeneración neural es NgR27-3i i , una variante funcional que es al menos un 80% homologa a NgR27~3n, o un mutante de deleción funcional de NgR27-3n-
8. La composición de la reivindicación 1 , expresada de células genéticamente modificadas.
9. La composición de la reivindicación 1 y células del sistema nervioso central.
10. Una composición que comprende: un polipéptido que comprende al menos dos de: un dominio de transducción de proteína, un dominio de degradación de proteoglicanos, o un dominio que promueve la regeneración neural.
1 1. La composición de la reivindicación 10, en la que el dominio de transducción de proteína es un dominio TAT.
12. La composición de la reivindicación 10, en la que dos dominios de dicho polipéptido están unidos entre sí por ¡n dominio pollpeptídico enlazador.
13. La composición de la reivindicación 10, en la que el dominio de degradación de proteoglicanos es un muíante de deleción de condroitinasa ABCI.
14. La composición de la reivindicación 10, en la que el dominio que promueve la regeneración neural es L1 , una variante que es al menos un 80% L1 , o un muíante de deleción de L1.
15. La composición de la reivindicación 10, en la que el dominio que promueve la regeneración neural es GGF2, una varianfe funcional que es al menos un 80% GGF2, o un muíante de deleción funcional de GGF2.
6. La composición de la reivindicación 10, en la que el dominio que promueve la regeneración neural es NgR27-3n , una varianfe funcional que es al menos un 80% homologa a NgR27-3n , o un muíante de deleción funcional de NgR27-3n.
17. La composición de la reivindicación 10, que tiene una condroitinasa.
18. La composición de la reivindicación 10, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
19. La composición de la reivindicación 10 y células del SNC.
20. Un método para promover la recuperación de función neurológica que comprende: identificar un paciente comprometida una función neurológica caracterizada por una lesión de SGI; y administrar una composición que comprende al menos dos de: un polipéptido de transducción de proteína, un polipéptido que degrada proteoglicanos, o un polipéptido que promueve la regeneración neural a un paciente en necesidad de dicho tratamiento.
21. El método de la reivindicación 20, en el que la composición se secreta por células genéticamente modificadas que está implantadas cerca del sitio de lesión del SNC.
22. La composición de la reivindicación 20, en la que la proteína que degrada proteoglicanos es Condroitinasa ABC I, Condroitinasa ABC II, Condroitinasa AC, Condroitinasa B, Hialuronidasa 1 , Hialuronidasa 2, Hialuronidasa 3, Hialuronidasa 4, PH20, o una combinación de estas.
23. La composición de la reivindicación 20, en la que los polipéptidos están unidos entre sí.
24. Un método para facilitar la difusión de un agente en un sistema nervioso central que comprende: administrar el agente al sistema nervioso central; y modificar una matriz extracelular en el sistema nervioso central para permitir la penetración del agente en la matriz extracelular.
25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende adicionalmente la etapa de utilizar al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos en la matriz extracelular.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que los proteoglicanos son proteoglicanos de condroitín sulfato.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la al menos una enzima se selecciona entre el grupo compuesto por condroitinasa ABC Tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, Hialuronidasa 1 , Hialuronidasa 2, Hialuronidasa 3, Hialuronidasa 4, catepsinas, ADAMT, PH20, y cualquier combinación de las mismas.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la al menos una enzima se administra con uno o más vehículos farmacéuticos.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el agente se selecciona entre el grupo compuesto por complejos biológicos, moléculas pequeñas, y células transplantadas.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la administración del agente se consigue por vía tópica, local o sistémica.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la administración del agente es por inyección en forma de bolo, suministro intravenoso, infusión continua, liberación sostenida de implantes, o agentes farmacéuticos de liberación sostenida.
32. Un método de penetración de un agente a través de una matriz extracelular, que comprende: administrar al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos de condroitín sulfato.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la al menos una enzima se selecciona entre el grupo compuesto por condroitinasa ABC Tipo 1, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, Hialuronidasa 1, Hialuronidasa 2, Hialuronidasa 3, Hialuronidasa 4, catepsinas, ADAMT, PH20, y combinaciones de las mismas.
34. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la al menos una enzima se administra en una cantidad eficaz.
35. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el agente se selecciona entre el grupo compuesto por complejos biológicos, moléculas pequeñas, y células transplantadas.
36. El método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende adicionalmente la etapa de administrar el agente por vía tópica, local o sistémica.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende adicionalmente la etapa de administrar el agente por inyección en forma de bolo, suministro intravenoso, infusión continua, liberación sostenida de implantes, o agentes farmacéuticos de liberación sostenida.
38. Un método para potencia la captación de un agente en un sistema nervioso central, que comprende: administrar el agente y al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos de condroitín sulfato.
39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la al menos una enzima se selecciona entre el grupo compuesto por condroitinasa ABC Tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, hialuronidasa 1 , hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, catepsinas, ADAMT, PH20, y cualquier combinación de las mismas.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la al menos una enzima se administra en una cantidad eficaz.
41. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la al menos una enzima se administra con uno o más vehículos farmacéuticos.
42. El método de la reivindicación 38, en el que el vehículo farmacéutico se selecciona entre el grupo compuesto por diluyentes, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes de desintegración, agentes tamponantes, agentes de isotonicidad, polioles, conservantes, y anestésicos.
43. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el agente se selecciona entre el grupo compuesto por complejos biológicos, moléculas pequeñas, y células transplantadas.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la administración del agente se consigue por vía tópica, local o sistémica.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la administración del agente es por inyección en forma de bolo, suministro intravenoso, infusión continua, liberación sostenida de implantes, o agentes farmacéuticos de liberación sostenida.
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