JP2013508401A - 軸索変性の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の方法において標的とされうるタンパク質の例には、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)、p38分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(p38 MAPK)、β-カテニン、転写第4因子(TCF4)、上皮性増殖因子レセプター(EGFR)、ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)、サイクリン依存性キナーゼ5(cdk5)、アデニリルシクラーゼ、c−Jun N末端キナーゼ(JNK)、BCL2結合Xタンパク質(Bax)、Ihチャネル、カルシウム/カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(CaMKK)、Gプロテイン、Gプロテインカップリングレセプター、転写第4因子(TCF4)、又はβ-カテニンが含まれるが、標的とされるプロセスの例は転写及びタンパク質合成である。
そのニューロンないし部分は、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、皮質ニューロン、交感神経性ニューロン及び海馬ニューロンからなる群から選択されるニューロンからなるか、又はそのニューロンないであってよい。
ニューロンないしその部分は、被検体、例えばヒト被検体に存在しうる。被検体は、例えば、(i) 神経系の疾患、(ii) 神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態、(iii) 物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷、(iv) 痛み、(v) 眼関連神経変性、(vi) 記憶喪失、及び(vii) 精神的疾患からなる群から選択される疾患又は症状を有するか、又はそれを発達させるリスクにあってよい。
疼痛の例には、慢性疼痛、線維症、脊髄痛、心皮トンネル症候群、癌の疼痛、関節炎、座骨神経痛、頭痛、手術の疼痛、筋けいれん、背痛、内臓痛、損傷の疼痛、歯の疼痛、神経痛、例えば神経性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は障害、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病が含まれる。
物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系の損傷の例には、中毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬剤、化学療法剤、ダプソン、HIV薬物、コレステロール低下薬、心臓又は血圧の薬物及びメトロニダゾールへの曝露によって生じる神経損傷が含まれる。他の例には、熱傷、傷、手術、事故、乏血、冷温への長期曝露、脳卒中、頭蓋内出血、脳溢血が含まれる。
眼関連神経変性の例には、緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(AMD)、湿性又は乾燥性のAMDと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎が含まれる。緑内障の例には、原発性緑内障、低眼圧緑内障、原発性閉寒隅角緑内障、急性閉寒隅角緑内障、慢性閉寒隅角緑内障、間欠性閉寒隅角緑内障、慢性開放隅角閉鎖緑内障、色素性緑内障、剥離緑内障、発生上の緑内障、二次的緑内障、水晶体性緑内障、眼内出血の二次的緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、薬物誘発性緑内障、中毒性緑内障、及び眼内腫瘍、網膜剥離、眼の重症化学的熱傷及び虹彩萎縮と関係する緑内障が含まれる。
他の例では、本発明の方法によって治療されるニューロンないしその部分は、エクスビボ又はインビトロである(例えば神経移植片又は神経移植)。
本発明の上記の方法において、DLKシグナル伝達インヒビターにより、JNKリン酸化の低減(例えばJNK2および/またはJNK3リン酸化の減少)、JNK活性(例えばJNK2および/またはJNK3活性の減少)、および/またはJNK発現の低減(例えばJNK2および/またはJNK3発現の減少)が生じる。これらの方法では、DLKシグナル伝達インヒビターは、本明細書中に記載の何れかのDLKシグナル伝達インヒビター(例えばJNKV又はJNKVIIなどの小分子、又はsiRNA)であってよい。
本発明の上記の方法において、薬剤はGプロテインインヒビターであってよい。
Gプロテインインヒビターは、本明細書中に記載の何れかのGプロテインインヒビター(例えば小分子)であってよい。
また、本発明は、ニューロンないしその部分の変性を阻害する際に使用する薬剤の同定方法を含む。これらの方法は、軸索又はニューロンの変性のアッセイにおいて候補薬剤(例えば抗神経成長因子(NGF)抗体、血清欠乏/KCl減少及び/又はロテノン治療)とニューロンないしその部分を接触させることを伴う。候補薬剤の存在下において、コントロールと比較してニューロンないしその部分の変性の低減が検出された場合、ニューロンないしその部分の変性を阻害する際に使用する薬剤が同定されたことが示される。候補薬剤は、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、核酸分子、小干渉RNA(siRNA)、ポリヌクレオチド、アプタマー、小分子及び多糖類からなる群から選択されてよい。
上記何れかの方法において、投与により、神経系の障害;神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態;物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系に対する損傷;疼痛;眼関連神経変性;記憶喪失;又は精神的障害の可能性が、前記薬剤を投与しない被検体のコントロール集団と比較して、少なくとも10%の減少(例えば少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はさらに100%の減少)が生じる。
ある例では、本発明は、中枢神経系(CNS)ニューロンないしその一部(例えばCNSニューロンの軸索又は細胞体部分)の変性を阻害するかまたは予防する方法を提供する。これらの方法は、二重ロイシンジッパーを持つキナーゼ(DLK)の活性(例えばシグナル伝達活性)又は発現を阻害する薬剤をCNSニューロンに投与することを含んでよい。ある例では、CNSニューロンないしその一部は、例えば、小脳顆粒ニューロン、皮質ニューロンおよび海馬ノイロンから選択されるCNSニューロンである。いくつかの例では、CNSニューロンはドーパミン作動性ニューロンでない。本発明の方法によると、投与によって、薬剤にて治療されていないニューロンの集団と比較して、ニューロンの集団の変性が少なくとも10%減少(例えば、少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はさらに100%減少)しうる。
本発明の方法は、生体外でのCNSニューロンへの薬剤の投与を伴ってよい。このような方法は、さらに、薬剤の投与の後にヒト患者にCNSニューロンを移植させるかまたは埋め込むことを含んでよい。本発明の方法の他の例において、CNSニューロンはヒト患者に存在する。このような方法において、薬剤は、薬学的に許容可能な担体で投与されてよい。さらに、薬剤の投与は、例えば、非経口、皮下、静脈内、腹膜内、脳内、病巣内、筋肉内、眼内、および動脈内の経路から選択される経路、または、間質性注入又は移植型送達装置の使用によって行われてよい。さらに、本発明の方法は、一又は複数の更なる製薬的薬剤を投与することを含んでよい。
本発明の方法による一又は複数の薬剤を投与することにより、(i) JNKリン酸化、JNK活性および/またはJNK発現の減少、(ii) cJunリン酸化、cJun活性および/またはcJun発現の減少、および/または(iii) p38リン酸化、p38活性および/またはp38発現の減少が生じうる。
また、本発明は、神経変性疾患又は状態、例えば上記ないしは本明細書全体に挙げた一又は複数の神経変性疾患又は状態の一又は複数の症状を低減ないし防止するかまたは進行を低減するための方法を提供する。これらの方法には、本明細書において記述されるように、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性又は発現を阻害する薬剤を投与することを含む。
さらに、本発明は、中枢神経系(CNS)ニューロンないしその一部の変性を阻害するかまたは防止する医薬の製造における、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性または発現を阻害する一又は複数の薬剤(例として上記および本明細書全体に挙げる薬剤を参照)の使用が含まれる。医薬は、例えば、神経変性疾患又は状態、例えば上記および本明細書全体に挙げた一又は複数の神経変性疾患又は状態の一又は複数の症状または発症の可能性を低減しうる。薬剤は、例えば、非経口、皮下、静脈内、腹膜内、脳内、病巣内、筋肉内、眼内、および動脈内の経路から選択される経路、または、間質性注入又は移植型送達装置の使用による投与のために製剤化されうる。さらに、医薬は一又は複数の更なる製薬的薬剤を含みうる。本発明の方法による一又は複数の薬剤の使用により、(i) JNKリン酸化、JNK活性および/またはJNK発現の減少、(ii) cJunリン酸化、cJun活性および/またはcJun発現の減少、および/または(iii) p38リン酸化、p38活性および/またはp38発現の減少が生じうる。
A.定義
「標的」なる用語は、活性に影響を与える薬剤によって調整されるときに、軸索変性を阻害するか又は減少させるタンパク質及び方法(プロセス)を指すために本明細書中で用いられる。活性を阻害する薬剤と接触させると、本明細書に記載の標的の多くは軸索変性を阻害するか又は減少させるが、本発明の標的には活性化されると軸索変性を阻害するか又は減少させるタンパク質及び方法も含まれる。本発明の例示的な標的は以下の通りである。二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)、p38分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(p38 MAPK)、上皮性増殖因子レセプター(EGFR)、ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)、サイクリン依存性キナーゼ5(cdk5)、アデニリルシクラーゼ、c−Jun N末端キナーゼ(JNK)、BCL2結合Xタンパク質(Bax)、Ihチャネル、カルシウム/カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(CaMKK)、Gプロテイン、Gプロテインカップリングレセプター、転写第4因子(TCF4)、β-カテニン、転写及びタンパク質合成。これらの標的のいくつかについての一般的な別名の選別を表1に挙げる。標的には、オルターナティブスプライシング変異体及び対立遺伝子変異体及びアイソフォームといったすべて天然に生じる変異体、並びにこれらの可溶型を含む、天然のヒト配列、及びサル、マウス、ラット及び他の非ヒト哺乳動物の配列のホモログが含まれる。また、例示的な非限定的配列参照も表1に示す。また、本発明に従って、様々な標的アイソフォーム、変異体、ホモログ及び断片の配列を含む他の配列が考慮されてよい。
「単離された」核酸分子は、同定され、対象の核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。単離される核酸分子の例は、天然の環境において近接している5'及び/又は3'隣接配列を欠くものである。
インヒビターの他の例は「Gプロテインインヒビター」である。Gプロテインインヒビターは、一又は複数のGプロテイン又はGプロテインカップリングレセプター(GPCR)の活性及び/又は発現(又は、Gプロテイン又はGPCRをコードする一又は複数の核酸の発現)を低減する、及び/又はGプロテイン又はGPCRの下流の一又は複数のタンパク質の活性及び/又は発現を低減することができる薬剤を指す。Gプロテインインヒビターの非限定的例には、Gプロテイン又はGPCRをコードする核酸の発現レベルを低減するsiRNA分子、Gプロテイン又はGPCRに結合する抗体又はペプチボディ、又はGプロテイン又はGPCRの活性を阻害する小分子又はペプチド(例えばSCH202676及び百日咳毒素)が含まれる。
インヒビターの他の例は「CAMKβインヒビター」である。CAMKβインヒビターは、CAMKβタンパク質(又はCAMKβをコードする核酸)の活性及び/又は発現を低減する、及び/又は細胞においてCAMKβの下流で機能する一又は複数のタンパク質の活性及び/又は発現を低減することができる薬剤を指す。CAMKβインヒビターの非限定的な例には、CAMKβに特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びCAMKβ又はCAMKβの下流で機能するタンパク質をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するsiRNA分子が含まれる。
インヒビターの他の例は「TCF4インヒビター」である。TCF4インヒビターは、TCF4タンパク質(又はTCF4をコードする核酸)の活性及び/又は発現を低減する、及び/又はTCF4タンパク質によって制御される遺伝子の活性及び/又は発現を低減することができる薬剤を指す。TCF4インヒビターの非限定的な例には、TCF4又はTCF4によって制御される遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びTCF4をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するか又はTCF4によって制御される遺伝子によってコードされるmRNAの発現を低減するsiRNA分子が含まれる。
インヒビターの他の例は「アデニルシクラーゼインヒビター」である。アデニルシクラーゼインヒビターは、アデニルシクラーゼタンパク質(又はアデニルシクラーゼをコードする核酸)の活性及び/又は発現を低減する、及び/又は細胞においてアデニルシクラーゼの下流で機能する一又は複数のタンパク質の活性及び/又は発現を低減することができる薬剤を指す。アデニルシクラーゼインヒビターの非限定的な例には、アデニルシクラーゼに特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びアデニルシクラーゼ又はアデニルシクラーゼの下流で機能するタンパク質をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するsiRNA分子が含まれる。アデニルシクラーゼインヒビターの他の例には、アデニルシクラーゼの活性を阻害する小分子(例えばホルスコリン及びNKH477)が含まれる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位又はエピトープに対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体と混ざらないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」なる修飾は、抗体が実質的に均一な集団から得たものである抗体の特徴を指すものであって、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256;495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、組み換えDNA法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第4816567号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab')2、及びFv断片;ダイアボディ(diabodies);直鎖状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(CL)及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。一つの例では、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び/又は他の変更)を有してもよい。「野生型」、「WT」、「wt」、及び「親」ないしは「親の」抗体なる用語は交換可能に用いられてよい。
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ala);アルギニン(Arg);アスパラギン(Asn);アスパラギン酸(Asp);システイン(Cys);グルタミン(Gln);グルタミン酸(Glu);グリシン(Gly);ヒスチジン(His);イソロイシン(Ile):ロイシン(Leu);リジン(Lys);メチオニン(Met);フェニルアラニン(Phe);プロリン(Pro);セリン(Ser);スレオニン(Thr);トリプトファン(Trp);チロシン(Tyr);及び、バリン(Val)からなる群から選択されうる。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、f1、fd、Pf1及びM13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「fd tet」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)(Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985);及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性及び特異性を有する、抗体などの化合物を保持するファージの同定及び単離に使用されるスクリーニング工程の複数のラウンド(回数)を指すために用いる。
「干渉RNA(RNAi)」なる用語は、特定のmRNAの触媒的分解をもたらす二本鎖RNAを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害/低減するために用いられうる。
本明細書中で用いる「治療する」、「治療」及び「療法」なる用語は、治癒的な療法、予防的な療法及び防止的な療法を指す。連続的な治療又は投与は、治療を中断することなく一又は複数の日による、少なくとも1日を基準とした治療を指す。間欠的な治療ないしは投与、又は間欠的な様式の治療ないしは投与は、連続的でなく、むしろ実際上周期的である治療を指す。本発明の方法による治療により、疾患又は状態からの完全な軽減又は治癒、ないしは疾患又は状態の一又は複数の症状の一部寛解が生じ得、一時的なものでも永続的なものでもよい。
本明細書中で用いる「ニューロン」なる用語は、中央の細胞質体又は細胞体を含む神経系細胞、及び2つのタイプの伸長又は突起、つまり、大多数の神経系シグナルを通常細胞体に運搬する樹状突起、及び、大多数の神経系シグナルを通常細胞体から標的ニューロン又は筋といったエフェクター細胞に運搬する軸索を意味する。ニューロンは、組織及び臓器から中枢神経系(求心性又は感覚ニューロン)へ情報を伝達し、中枢神経系からエフェクター細胞(遠心性又は運動ニューロン)へシグナルを伝えることができる。介在ニューロンと称する他のニューロンは、中枢神経系(脳及び脊柱)内でニューロンを連結する。本発明による治療に供されうるニューロンのタイプの特定の例には、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン及び皮質ニューロンが含まれる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
「アプタマー」は、本明細書中に記載の標的といった標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成及び治療的使用は当分野において十分に確立されている(例として米国特許第5475096号参照)。本発明で使用するアプタマーには、インビボでの分解から安定である修飾されたヌクレオチド(例えば核酸アナログ又は誘導体)が含まれうる。少なくとも、核酸分子は十分な時間をかけてインビボで十分に安定であるように設計され、分解及び/又は除去の前に治療的作用を起こす。非限定的な例として、このようなヌクレオチド類似体は、ホスホロチオネート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート及び2'-O-メチルアナログ及びそのアナログからなる群から選択されてよい。特定の例として、アナログは、2'−デオキシ−2'−フルオロ−RNA(2'-F-RNA)であってもよい。
本発明は、先のセクションAの表1に挙げた標的タンパク質及び活性の特定のモジュレーター(二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)、p38分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(p38 MAPK)、上皮性増殖因子レセプター(EGFR)、ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)、サイクリン依存性キナーゼ5(cdk5)、アデニリルシクラーゼ、c−Jun N末端キナーゼ(JNK)、BCL2結合Xタンパク質(Bax)、Ihチャネル、カルシウム/カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(CaMKK)、Gプロテイン、Gプロテインカップリングレセプター、転写第4因子(TCF4)、又はβ-カテニン、転写及びタンパク質合成)が、ニューロン(例えば軸索)変性の有効なインヒビターであるという発見にある程度基づく。活性化因子であるアデニリルシクラーゼの活性調節因子(モジュレーター)を除き、活性調節因子は標的タンパク質及び活性のインヒビターとして機能する。ニューロン又は軸索変性のインヒビターは、ニューロン又は軸索変性のインヒビターであるので、それぞれの標的に対する効果にかかわらず、本明細書中において「インヒビター」と称する。それらはまた、本明細書において、標的タンパク質の活性又はニューロン又は軸索の活性を調節し、ニューロン又は軸索変性の阻害を引き起こす「薬剤」と称する。
本発明で使われうるインヒビターには、ニューロン又は軸索変性を予防するために本明細書中に記載されるアッセイにおいて示された表2(以降のセクションC)に挙げるもの、並びに、本明細書中に記載の標的の他の公知のインヒビター(例として表3を参照)が含まれる。以降にまとめたように、本発明に用いられる他のインヒビターは各々の標的に特異的な標準的なスクリーニング法を使用して同定することができる。また、これらのアッセイを用いて、所望の活性を有することが明らかとなった化合物の誘導体の活性を確認することができ、標準的な医薬品化学手法に従って設計される。インヒビター(又はアデニリルシクラーゼの場合には活性化因子)が特定の標的について活性であることが確認されたあと、インヒビターを、本明細書に記載のように、ニューロン又は軸索変性のモデル、並びに適切な動物モデル系において試験されてよい。
本発明の方法に用いられうる、表1に挙げた標的のインヒビターを同定するため、並びにニューロン又は軸索変性の他のインヒビターを同定し特徴付けるための例示的なアッセイは、以下の通りに簡単にに記述される。
本明細書に記載の標的のインヒビターがニューロン又は軸索変性を阻害することを確認するため、並びにニューロン又は軸索変性の他のインヒビターを同定するためのアッセイは、以降の実施例に詳述しており、以下の通りに簡単に要約する。これらのアッセイには、(i)抗神経成長因子(抗NGF)抗体アッセイ、(ii)血清欠乏/塩化カリウム(KCl)減少アッセイ、(iii)ロテノン変性アッセイ、及び(iv)ビンクリスチン変性アッセイが含まれる。また、当分野で公知であるニューロン又は軸索変性を評価するための他のアッセイが本発明で使われてよい。
NGFは、標的ニューロンの分化及び生存に関与する小さい、分泌タンパク質である。NGFにて培養したニューロンを処理すると軸索が増殖するのに対して、抗NGF抗体にて該ニューロンを処理すると軸索変性が生じる。また、抗NGF抗体にてニューロンを処理すると、電子顕微鏡によって検出可能であるいくつかの異なる形態学的変化が生じ、これはモニターして候補インヒビターの効果を観察することができる。実施例1にさらに記載され例えば図1−4に図示されるこれらの変化には、静脈瘤形成、伸長したミトコンドリアの喪失、静脈瘤におけるミトコンドリアの蓄積、細胞骨格分解、及び軸索断片化が含まれる。抗NGF抗体によって誘導される何れかの形態学的変化を無効にすることがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは、本明細書に記載のもののような他の系において試験してもよい。
ニューロン又は軸索変性の他のモデルは、ビンクリスチンと培養したニューロンとの接触を含む。ビンクリスチンは、チューブリン二量体に結合して、微小管構造の集積を妨げるアルカロイドである。例えばニューロン特異的βIIIチューブリンに対する抗体にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出されうる、ビンクリスチンの存在下で培養したニューロンの変性をブロック又は低減することがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは本明細書に記載されるもののような他の系において試験されてよい。
候補インヒビターのプロテインキナーゼの活性への影響を測定するためのアッセイは当分野で公知であり、一般的に放射性標識されたリン酸塩により読み取られる直接リン酸化アッセイ、基質に対するリン酸化特異的抗体、及びキナーゼ活性、例えばリポーター遺伝子の活性化の下流の結果を測定する細胞ベースのアッセイが含まれる。蛍光偏光法に基づく代替アッセイに加えて、これらの主要な方策はいずれも、小規模又はハイスループットの形式で用い、インヒビターを同定、確認又は特徴付けてよい(例としてFavata et al., J. Biol. Chem. 273:18623-18632, 1998;Parker et al., J. Biomol. Screening 5:77-99, 2000;Singh et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 8:319-325, 2005;Garton et al., Meth. Enz. 439: 491-500, 2008;及びKupchko et al., Anal. Biochem. 317:210-217, 2003を参照)。
本明細書中に記載のアッセイを用いて、限定するものではないが、化学ライブラリ、天然の生成物ライブラリ(例えば、微生物、動物、植物などの集積)、及びランダムペプチド、オリゴヌクレオチドないしは小有機分子を含む組み合わせライブラリなどの化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。特定の実施態様では、本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、ナイーブヒト抗体、組み換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリをスクリーニングする。抗体ライブラリは、例えば、ウイルス粒子当たり平均1の単鎖抗体ないしは抗体断片をディスプレイする一価ライブラリ、及びウイルス粒子当たり平均2以上の抗体ないしは抗体断片をディスプレイする多価ライブラリを含むファージディスプレイライブラリであってもよい。しかしながら、本発明によってスクリーニングされる抗体ライブラリは、ファージディスプレイライブラリに限らない。他のディスプレイ技術には、例えば、リボソーム又はmRNAディスプレイ(Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994);Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997))、微生物細胞ディスプレイ(例えば細菌ディスプレイ(Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997))又は酵母菌ディスプレイ(Kieke et al., Protein Eng. 10: 1303-1310 (1997))、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ(Urban et al., Nucleic Acids Res. 33: e35 (2005)、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ(Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810 (2004);Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33: e10 (2005))、及びミクロビーズディスプレイ(Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002))が含まれる。
本発明に用いられるインビボアッセイには、様々な神経変性疾患の動物モデル、例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病及び多発性硬化症(例えばマウスの実験的自己免疫性脳炎(EAE))の動物モデルが含まれる。さらに、脊髄索及び外傷脳損傷モデルが用いられてもよい。本発明に用いられるインヒビターを特徴付ける際に使用されうるインビボアッセイの非限定的な例を、以下の通りに記述する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)の場合、スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)の変異形を発現するトランスジェニックマウスがALSの表現型及び病理学を反復する(Rosen et al., Nature 362(6415): 59-62, 1993)。SOD1マウスに加え、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のいくつかのマウスモデルが開発され、本発明で用いられうる。これらは、運動ニューロン変性(Mnd)、進行性運動神経障害(pmn)、ゆらぎ(Bird et al., Acta Neuropathologica 19(1): 39-50, 1971)、及び、TDP-43変異トランスジェニックマウス(Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2009年10月15日にe発行)を含む。さらに、イヌモデルが開発され、本発明に用いられうる(遺伝性イヌ脊髄筋萎縮(HCSMA))。
マウス、ラット、スナネズミ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ及びサルを含むいくつかの動物モデルが当分野で使用され、脳卒中を調べるために用いられる。局所性の脳虚血モデルのほとんどは、中大脳動脈のようなある主要な脳血管の閉塞を伴う(例としてGarcia, Stroke 15:5-14, 1984及びBose et al., Brain Res. 311: 385-391, 1984を参照)。本発明にこれらのいずれのモデルが使われてよい。
実施例において更に後述するように、以下の表2に挙げる化合物が、ニューロン又は軸索変性のインヒビターとして同定された。表2に挙げた標的及びプロセスを阻害する(又はアデニリルシクラーゼの場合には活性化する)これら化合物並びに他の薬剤(表3参照)は、本発明に従って、ニューロン又は軸索変性を阻害する方法に使用されうる。
本発明の結合及び活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えDNA技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
(i) 抗原調製
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。本発明の標的の例示的な配列を表1に示し、本発明で使用するための抗体の作製のための抗原の調製に使用することができる。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、典型的には、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物において産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、SOCl2、又はR及びR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100μg又は5μg(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。1ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。7ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。動物は、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び/又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫されうる。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えDNA法(例として米国特許第4816567号を参照)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含みうる適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定されうる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源となる。ひとたび分離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
また、DNAは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(CH及びCL)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第4816567号;Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993);及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991);Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、F(ab')2は、F(ab')2分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーGCN4を用いて形成される。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Fv断片(scFv)である。国際公開93/16185号を参照のこと。
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常2つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、BsAb)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインを有しうる。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)は、融合の少なくとも一つに存在しうる。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される3つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、3つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも2つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、2又は3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
国際公開第96/27011号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。界面は抗体の定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含んでよい。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に変換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再変換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている(Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。したがって、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的なVL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、よって2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている(Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと)。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる(Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
本発明に用いられる抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ADCC)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる(Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照)。
本発明のある実施態様では、例えば血管脳関門浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばDNA又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、Fcドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成しうる。他の例では、Fcドメインの1又は2のループ由来の3以上の残基が転移し、更に他の例では、エピトープはFc領域の(例えばIgGの)CH2ドメインから得られ、抗体のCH1、CH3、又はVH領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Fc領域のCH2ドメインから得られ、抗体断片のCL領域又はVL領域、又はその両方に転移する。
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はNないしC末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第5534615号に記載されており、これは出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の一例は、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第4640835号;第4496689号;第4301144号;第4670417号;第4791192号又は第4179337号に記載された方法で結合させることを含む。
更なる実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を実施してよい。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば国際公開第03/102157号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
例えばCDRH1、CDRH2及びCDRH3の溶媒接近可能な及び/又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。CDRL1、CDRL2及びCDRL3に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
一例では、ライブラリはヒト化抗体4D5配列、又はヒト化抗体4D5配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。ライブラリはDVKコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基95−100aを置換することによりつくられ、ここでDVKコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用されうる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(DVK)7を含む。ある実施態様では、ライブラリはDVKとNNKの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基95−100aを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(DVK)6(NNK)を含む。他の実施態様では、ライブラリはDVKとNNKの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基95−100aを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(DVK)5(NNK)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(NNK)6を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
多様性をCDRH1及びCDRH2においてまた生じさせることができる。CDR-H1及びH2多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。H1/H2領域における多様性の制限は約104から105倍縮重を減少させ、より多くのH3多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。CDRH3において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばDVK又はNVTを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
ある実施態様では、CDRH3領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約7から19アミノ酸の範囲のCDRH3領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
CDRH3での変異を持つライブラリを、例えばCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及び/又はCDRH2のような他のCDRの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、CDRH3ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置28、29、30、31、及び/又は32に変異アミノ酸を持つヒト化4D5抗体配列の形態において作りだしたCDRL3ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、CDRH3に対する変異のライブラリは変異CDRH1及び/又はCDRH2重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、CDRH1ライブラリは位置28、30、31、32及び33に変異アミノ酸を持つヒト化抗体4D5配列を用いてつくり出される。CDRH2ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置50、52、53、54、56及び58に変異アミノ酸を持つヒト化抗体4D5の配列を用いてつくり出すことができる。
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び/又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ10倍良好な、少なくともおよそ20倍良好な、少なくともおよそ50倍良好な、時には少なくともおよそ100倍又は200倍良好な生物学的活性を有しうる。例えば、抗標的抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ10倍強力な、少なくともおよそ20倍強力な、少なくともおよそ50倍強力な、時には少なくともおよそ100倍又は200倍強力な、標的に対する結合親和性を有してよい。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるala変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、表4において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro;及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の2又はそれ以上が置換され、例えば約2から約10の高頻度可変領域置換である。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び/又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第5534615号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンFc領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定されるか又は特徴付けられるインヒビター(例えば、上記の特定のインヒビター)などの本明細書中に記載の標的のインヒビターは、ニューロン又は軸索変性を阻害する方法において使用されうる。したがって、インヒビターは、例えば、(i) 神経系の疾患(例えば神経変性疾患)、(ii) 神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態、(iii) 物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷、(iv) 痛み、(v) 眼関連神経変性、(vi) 記憶喪失、及び(vii) 精神的疾患の治療に有用である。これらの疾患、状態及び障害のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
本発明に従って予防又は治療されうる神経変性疾患及び状態の例には、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、一次側索硬化症(PLS)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群(例えばヘルニア性、破裂性、脱出性椎間板症候群)、頸部脊椎症、叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症、軽度認知障害、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病(例えば他系統萎縮症、進行性核上性麻痺及び皮質基底核変性症)、レーヴィ小体を有する認知症、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患(例えばギラン-バー症候群及び多発性硬化症)、シャルコー・マリー・トゥース病(CMT;別名、遺伝性運動及び感覚神経障害(HMSN)、遺伝性感覚運動神経障害(HSMN)、及び腓骨筋萎縮症)、プリオン病(例えばクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、及び牛海綿様脳症(BSE、一般に狂牛病として知られる))、ピック病、癲癇、及びエイズ認知症複合(別名、HIV認知症、HIV脳症及びHIV関連認知症)が含まれる。
神経系以外に主な作用を有する特定の状態及び疾患により神経系への障害が引き起こされ得、これらは本発明の方法によって治療されうる。このような状態の例には、例えば、糖尿病、癌、エイズ、肝炎、腎臓機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、HIV感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス及びアミロイドーシスによって生じる末梢性神経障害及び神経痛が含まれる。
また、本発明の方法は、物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系の損傷を治療するために用いられうる。よって、この方法は、物理的な損傷(例えば熱傷、傷、手術及び事故と関連する)、乏血、低温への長期曝露(例えば凍傷)、並びに例えば脳卒中又は頭蓋内出血(例えば脳溢血)による中枢神経系への損傷によって生じる末梢神経損傷の治療に用いられうる。
また、本発明の方法は、例えば、統合失調症、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調症様、共有精神病性障害、精神異常、妄想性人格障害、統合失調型人格障害、境界線人格障害、反社会性人格障害、自己陶酔性人格障害、強迫神経障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、抑鬱、ストレス疾患、パニック障害、広場恐怖症、社会的恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害(例えば盗癖、ギャンブル依存症、放火癖及び抜毛癖)を含む精神医学的な疾患の治療に用いられうる。
本明細書中に記載のインヒビターの治療用製剤は、所望の純度を有するインヒビター(小分子又は抗体など)を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照)と混合することによって、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形で保存するために調製される。許容範囲内の担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに非中毒性であり、これらには、バッファ、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;アスコルビン酸を含む抗酸化剤、BHA及びBHT;低分子量(およそ10未満の残基)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン;単糖、二糖及び他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン;EDTAなどのキレート剤;糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばツイーン、プルロニック又はPEGが含まれる。
インヒビターは、場合によって、関連の疾患又は状態の治療において有用であることが公知な他の薬剤(一又は複数)と組み合わせるか又はこれと合わせて投与されうる。ゆえに、ALSの治療では、例えば、インヒビターは、リルゾール(Rilutek)、ミノサイクリン、インスリン様増殖因子1(IGF-1)及び/又はメチルコバラミンと組み合わせて投与されてよい。他の例では、パーキンソン病の治療では、インヒビターは、Lドーパ、ドーパミンアゴニスト(例えばブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、カベルゴリン、アポモルヒネ及びリスリド)、ドーパデカルボキシラーゼインヒビター(例えばレボドパ、ベンセラジド及びカルビドーパ)、及び/又はMAO−Bインヒビター(例えばセレギリン及びラサギリン)と共に投与されてよい。更なる実施例において、アルツハイマー病の治療では、インヒビターは、アセチルコリンエステラーゼインヒビター(例えばドネペジル、ガランタミン及びリバスチグミン)及び/又はNMDAレセプターアンタゴニスト(例えばメマンチン)と共に投与されてよい。併用療法は、当業者によって適切であると決定されるように、同じ又は異なる手段によって、同時的又は経時的な投与を伴ってよい。また、本発明には本明細書中に記載の組合せを含む薬学的組成物及びキットが含まれる。
脳内使用では、ボーラス注入が許容されるが、化合物はCNSの流体リザーバへの注入によって連続的に投与されてよい。インヒビターは、脳の室に投与されるか、そうでなければCNS又は髄液内に導入されうる。留置カテーテル及びポンプのような連続投与手段を用いて投与されてもよいし、徐放性媒介物の移植、例えば脳内移植によって投与されてもよい。より詳しくは、インヒビターは、慢性的に植設されたカニューレにより注入されてもよいし、浸透圧性ミニポンプを活用して慢性的に注入されてもよい。小さい管を介してタンパク質を脳室に供給する皮下ポンプは有用である。非常に高性能のポンプが皮膚により補充されてもよく、それらの運搬速度は外科的介入なしで設置されうる。全体的に移植されたドラッグデリバリーシステムを介する皮下ポンプ装置又は連続的な脳室内注入を伴う好適な投与プロトコール又はデリバリーシステムの例は、ドーパミン、ドーパミンアゴニスト及びコリン作動性アゴニストのアルツハイマー病患者及びパーキンソン病の動物モデルへの投与のために用いられるものである。これはHarbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987);及びDeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143 (1987)に記載されている。
別の実施態様では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている(例えば、米国特許第6703019号参照)。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができる、及び/又は組換えDNA技術によって製造することができる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。
結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横切る抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増大に関連しており、これにより抗体又は抗原結合断片を脳に容易に導入できる。血液脳関門が完全に保持されているとき、そこに分子を搬送するための複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体又は抗原結合断片を封入すること(例えば、米国特許出願公開第2002/0025313号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第2004/0204354号参照)、又はアポリポタンパク質E(例えば、米国特許出願公開第2004/0131692号参照)中の抗体又は抗原結合断片をコーティングすることが含まれる。
本発明に使用する抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、1回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の1〜99%で、或いは経験的/臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で用いられる。
また、本発明は、ニューロン又は軸索変性を活性化するか又は増やす方法を含む。これは、先の表2に挙げた一又は複数の標的の活性化因子又はアゴニストの使用によって達成されうる(アデニリルシクラーゼを除いては、インヒビターはニューロン又は軸索変性を活性化するために用いられうる)。ゆえに、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)、p38分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(p38 MAPK)、上皮性増殖因子レセプター(EGFR)、ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)、サイクリン依存性キナーゼ5(Cdk5)、c−Jun N末端キナーゼ(JNK)、BCL2結合Xタンパク質(Bax)、Ihチャネル、及びカルシウム/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ(CaMKK)のアゴニストが、軸索変性を活性化するか又は増やす方法で使われうる。本明細書において記述されるように、このようなアゴニストは、軸索変性のアッセイにおいて同定されるか又は特徴付けされうる。ゆえに、例えば、候補アゴニストは、神経成長因子の存在下でニューロンが培養される培地に存在し、変性に対するその作用を評価されうる。ニューロン又は軸索変性のアゴニストは、癲癇及び自閉症を含む疾患又は状態、並びに軸索剪定及び変性の天然のプロセスを欠いていることに特徴を有する任意の疾患又は状態の予防及び治療に使用されうる。アゴニストは、先のセクションEに記載のものなどの方法を用いて調製され、前記治療が必要な被検体に投与されてよい。
本発明の他の態様では、上記の疾患又は症状の治療又は予防に有用な物質を含む製造品(例えば薬学的組成物又はキット)が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療又は予防するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のインヒビターである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明のインヒビターを含有する組成物を中に収容する第一の容器;と(b)更なる治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを具備しうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に具備する。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
上記のように、ニューロン又は軸索変性は、多くの神経変性疾患の一般的な形質であって、神経系への損傷又は外傷の結果としても起こる。しかしながら、この活性なプロセスを制御するメカニズムは、理解され始めたばかりである。ニューロン又は軸索変性の異なるモデルを用いた研究に基づいて、疾患又は損傷の性質に応じて、異なるメカニズムがこの方法に関与するようである。ニューロン又は軸索変性を制御する現象の特徴を更に表すために、ニューロン又は軸索変性のモデルにおいて公知のシグナル伝達経路を標的とする小分子化合物のライブラリがスクリーニングされた。複数のシグナル伝達経路がニューロン又は軸索変性に必要であることが同定された。特に、多くのキナーゼがニューロン又は軸索変性のメディエーターとして確認され、さらにメカニズムの研究は軸索又は細胞質体区画に対する異なるキナーゼの機能に集中していた。また、これらの経路は、同種の結果を有する他の変性パラダイムで調べられ、ニューロン又は軸索の自滅が引き起こされる一般的な分子メカニズムが提唱された。これらの実験を以下の実施例に記載する。
ニューロン又は軸索変性のモデル
本明細書中に記載するように、ニューロン又は軸索変性のインヒビターを同定し特徴付けするために使用されうるアッセイの記載について先に説明したニューロン又は軸索変性のモデルを、抗NGF抗体、血清欠乏/KCl低減及びロテノン治療アッセイを含む、下記の実施例において使用した。
上述の通り、NGFにて培養した神経を処理すると軸索の増殖が生じるのに対して、抗NGF抗体による該神経の処理により軸索変性が生じる(図1)。抗NGF抗体によるニューロンの処理は、電子顕微鏡によって検出可能であるいくつかの異なる形態学的変化を引き起こす。例えば、静脈瘤は軸索断片化の前に抗NGF抗体と共に培養した神経において形成され、場合によって、破裂したようであった(図2)。他の例では、抗NGF抗体と共に培養した軸索はミトコンドリアの伸長を欠いており、静脈瘤でのミトコンドリアの蓄積を示したことから、軸索内輸送が遮断されることが示唆される。数時間の軸索断片化の間、有意な数のミトコンドリアが以前として活性であった(図3)。更なる実施例は細胞骨格分解に関する。軸索切断の後、微小管網状組織は、アクチン及び神経フィラメント網状組織の前に分解する。それに対して、NGF離脱モデルでは、微小管網状組織は、アクチン又は神経フィラメント網状組織の前に分解されなかった(図4)。
軸索変性の他のモデルはウォラー変性であり、この変性は細胞質体から切り離す軸索内の病変の発生によって誘導される(図5)(例としてRaff et al., Science 296(5569): 868-871, 2002を参照)。ウォラー変性遅延(WldS)変異体において、野生型コントロールと比較して軸索変性は有意に遅延した(図5;Araki et al., Science 305(5686): 1010-1013, 2004)。WldS変異体の効果は、軸索の自滅メカニズムの存在に裏付けられており、それはWldS変異体において減弱している。WldSは、NGF離脱の後で軸索を保護したが、アポトーシスを妨げなかった。
抗NGF抗体、血清欠乏/KCL低減及びロテノン処理アッセイに関する付加的情報は、実施例2−4(抗NGF抗体)、7(血清欠乏/KCl低減)、8及び9(ロテノン処理)に示す。
ニューロン又は軸索変性のインヒビターのスクリーニング
実施例1において上記した抗NGF抗体モデルを、ニューロン又は軸索変性のインヒビターのためのスクリーニングに用いた。400以上の小分子(Tocris Bioscience)のライブラリを試験し、ある場合には、抗NGF抗体の存在下で観察される変性をどれが調節しているかを調べた。
マウスE13.5胚を切開し、L15培地(Invitrogen)に播いた。脊髄は、接着したDRGをもつ胚から切り出した。接着したDRGを有する脊髄は、氷上のL15培地+5%ヤギ血清(Gibco)に置いた。DRGはタングステン針を使用して取り除き、残りの脊髄は処分した。8ウェルスライドにN3−F12溶液(23mlのハムF12、1mlのN3サプリメント及び1mlの1M グルコース)を満たし、25ng/mlのNGF(Roche)を添加した。(N3サプリメントはN3 100倍濃縮物の希釈により作製し、以下の順序で、以下の成分を混合することによって作製した:10.02 mlの全容量に対して、5.0 ml ハンクス緩衝生理食塩溶液(HBSS;Ca, Mgフリー;Invitrogen)、1.0ml ウシ血清アルブミン(HBSS中に10mg/ml=150μm)、2.0ml トランスフェリン(T1147−1G、ヒト、HBSS中に100mg/ml=1.1mM)、1.0 ml 亜セレン酸ナトリウム(S9133-1MG、HBSS中に0.01mg/ml=58μM)、0.4ml プトレシンジヒドロクロライド(P5780−5G、HBSS中に80mg/ml=500mM)、0.2ml プロゲステロン(P8783−5G、無水エタノール中0.125mg/ml=400μM)、0.02ml コルチコステロン(C2505−500MG、無水エタノール中2mg/ml=5.8 mM)、0.1ml トリヨードチロニン, ナトリウム塩(T6397−100MG、0.01N NaOH中0.2mg/ml=300 μM)、0.4ml インスリン(I6634−250MG、ウシ膵臓、241U/mg、20mM HCl中25mg/ml=4.4 mM)、(−20℃で保存可能)。N3サプリメント貯蔵液は、以下を組み合わせることによって作製した:40mlの全容量に対して、10ml Pen/Strep(100倍、Gibco)、10mlのグルタミン(200mM、Gibco)、10mlのMEMビタミン(100倍、Gibco)、10mlのN3濃縮物(100倍、上記参照)。混合物は0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌し、1〜2mlの一定量を−20℃に保存した)。
これらの実験において、コントロールニューロン(アクチン染色によって視覚化される)がNGF離脱により有意な変性を受けた。これに対して、特定の小分子がある場合には、軸索完全性はNGF離脱によっても維持された。図6−10は、プロテアソームインヒビター及びGSKインヒビター(図6)、p38 MAPKインヒビター及びアデニリルシクラーゼ活性化因子(図7)、転写インヒビター及びEGFRキナーゼインヒビター(図8)、JNKインヒビター及びBaxチャネルブロッカー(図9))、及びIhチャネルブロッカー及びCaMKKインヒビター(図10)についての実験の結果を示す。神経変性に対して保護することがわかっている特定の化合物と対応する標的の例を表5に示す。これは、いくつかの化合物について生じた所見についての注釈を含む欄を更に含むこと以外は、先の表2と類似している。
増殖因子離脱後の添加のタイミングに関するインヒビターの特徴づけ
NGF離脱後の様々な時点で添加したインヒビターの活性を評価するために調査を実施した。特に、候補キナーゼが阻害され軸索変性が止まる開始NGF欠乏の後の最新の時間-点を決定するために実験を行った。
この研究において使用する一次細胞は、Charles RiverのCD−1 E13の後根神経節(DRG)とした。細胞は、N3/F12(+25ng/mlのNGF)培地中で維持した(ハムF12(23ml)、N3サプリメント(1ml)、グルコース(1mlの1M グルコース貯蔵液)、25ng/mlの神経成長因子2.5S、マウス(Roche 11362348001)を含むハムF12(貯蔵液:50μg/ml、−80℃)使用前にフィルター滅菌する)。また、実験は、BD Biocoat PDL/ラミニンコートグラス8ウェルチャンバスライド(BD354688)と、24×60mmのナンバー1カバーグラス(VWR 48393 106)を使用した。
胚をL15培地に切開した(切開ツールは70%イソプロパノールに浸し、皿は氷上に置いた:脊髄に対して10cm皿(1皿につき4つの胚)及び1つの6cm皿)。E13.5脊髄をDMEM+10%FBSに抽出した。128より多いDRGを脊髄から分離し、タングステン針にて半分に分けた。8ウェルスライドに250μlのN3/F12(25ng/mlのNGF)を満たした。切断したDRG(1ウェルにつきおよそ4)を5μl体積にした。室温でおよそ10分間接着させ、次いでDRGを37℃で終夜インキュベートした。以下の条件を用いてインヒビターを試験した。25μg/mlの抗NGF抗体を22時間目に加えた。インヒビターは、抗NGF添加のT=0、1、3、6、9及び12時間後に加えた(1.25μlのインヒビター添加;−20℃にした質量混合物からの5μl一定分量;12μlのDMSO中18μl;24μlのDMSO中6μl;12μlのDMSO中18μl;21μlのDMSO中9μl;24μlのDMSO中6μl)。インヒビターの添加と軽い振盪によって混合した。コントロールは+/−抗NGF(+1.25μlのDMSO)とし、実験は重複して行った。
25時間後に、250μlの30%スクロース/8%PFAを250μlの培養培地に添加して、30分間置いた。スライドは1×PBSにて洗浄した(停止:4℃)。免疫蛍光法は以下の通りに実行した。初めに、5%BSA/0.2%トリトンに室温で30分間置いてブロックを行った。一次抗体(Tuj1(1:1000))は、4℃の2%BSA中で終夜、スライドと共にインキュベートした。スライドは、1×PBSにて洗浄し、二次抗体(ヤギ抗マウス488;1:200)を添加した。スライドは、二次抗体と共に暗所にて室温で1時間インキュベートした。スライドは、1:10000のHoeschtを含むPBS中で10分間洗浄し、ガラスコープランドのPBSで5分間洗浄し、タオルに押しつけてやや乾燥させ、200μlのフルオロマウントGにてカバーガラスをかけ、4℃に保存した。画像はすべて同じ環境(すなわち露出時間)とした。さらに、変性の速度は、細胞質体からの軸索の分離に基づいて評価した。
これらの試験は、NGF離脱の数時間(3、6、9及び12時間)後に加えた場合であってもインヒビターが保護に働くことを示す(図11)。軸索スコアは、1から10のスケールの軸索正常状態のスコアである(0=抗NGFコントロール様;10=NGFコントロール様;5=0時間に添加したキナーゼインヒビター様。これらの試験に使用したインヒビターを表6に挙げる。
局在した変性に関する化合物の特徴づけ
Campenotチャンバを用いて、実施例2に記載の軸索変性を阻害することが同定された化合物をさらに分析した。Campenotチャンバにより、細胞質体と軸索の環境を分離し、局在化した変性の誘導を促した(図12及び例としてZweifel et al., Nat. Rev. Neurosci. 6(8): 615-625, 2005を参照)。このようなチャンバでは、軸索変性は局所化し、アポトーシスなしで進行する(図13及び14)。
テフロンデバイダー(Tyler Research)は、水で洗浄し、残りの油脂分を拭き取ることによって清浄化した。次いでデバイダーをNochromix(Godax Laboratories)/硫酸に終夜浸し、蒸留して加圧滅菌処理した水(SQ水)で5回すすぎ、30分間沸騰させ、その後使用前に空気乾燥した。
マウスラミニン(5μg/mlを含む濾過滅菌水;Invitrogen)をPDLコート35mm皿(BD Biosciences)に添加し、37℃で1時間インキュベートした後に、SQ水で2回すすいだ。皿は、吸引乾燥し、次いでラミナーフローフードにおいて15分間空気乾燥した。その後調製した皿をピンレーキ(Tyler Research)にて切り目をつけた。NGFを含む50μlのNBM+MC溶液は結果として生じたスコアトラック全体に適用した(溶液は以下の通りに作製した:1750mgのメチルセルロースを480mlのNeurobasal(Invitrogen)と組合せ、4.5mlのペニシリン/ストレプトマイシン、7.5mlのL−グルタミン、10mlのB−27無血清サプリメント(Invitrogen)を加え、溶液を室温で1時間、4℃で終夜、更に室温で1時間混合した。その後溶液をフィルター滅菌し、使用前に50ng/mlのNGF(Roche)を加えた)。高い真空グリース(VWR)は、切開範囲下の各テフロンデバイダーに加えた。ラミニンコートPDL皿を逆さにし、テフロンデバイダーに落とし、トラックを含まない領域にようじを用いて圧力を加えた。皿を37℃で1時間インキュベートした。500μlのNBM+MC(50ng/mlのNGF)溶液を各々の横の区画に加え、油障壁を中心細胞溝の前に加えた。
28時間の抗NGF抗体処理の後、8%PFA/30%スクロース(上記参照)を1:1の希釈で培養培地に加え、30分間インキュベートした。添加して初めの15分経ったときにテフロンデバイダーを取り除いた。システムは、免疫染色の前に2.5mlのPBSにて1回洗浄した。ニューロンは、5%BSA/0.2%トリトンを含むPBSに30分間置いてブロックした。一次抗体Tuj1(Covance)を、2%BSAを含むPBSに最終希釈1:1000で加え、4℃で終夜インキュベートした。皿はPBSにて1回洗浄した。二次抗体(Alexa488ヤギ抗マウス抗体(Invitrogen))を、2%BSAを含むPBSに最終希釈1:200で加え、室温で1時間インキュベートした。皿はPBSにて二回洗浄し、22×22mmのカバーグラス(VWR)を350μlのフルオロマウントG(Electron Microscopy Sciences)と共に加えた。蛍光顕微鏡を用いてニューロンを可視化した。
上述の通り、E13.5 DRGを単離し、Campenotチャンバ中で5日間生育させた。50μg/mlの抗NGFを実験上の軸索区画に加え、インヒビターを、軸索区画(NGF抗体あり)又は細胞体区画に加え、軸索を28時間変性させた。他の軸索区画をコントロールとしてNGF中で維持した。図15及び16に示すように、細胞質体をSB415(GSKi)又はActD(転写インヒビター)に曝した場合、又は、軸索をAG555(EGFRi)又はSB239(p38i)に曝した場合に、NGFを奪った軸索は変性しなかった。それに対して、NGF欠乏軸索区画のSB415(GSKi)又はActD(転写インヒビター)、又は細胞体区画のAG555(EGFRi)又はSB239(p38i)処理は変性を妨げなかったことから、局所の軸索変性におけるシグナル伝達が失われている軸索部分に限定していないことが示唆される。細胞質体及び軸索に適用した場合、いくつかのインヒビターが最も有効である。これらの結果の定量化を図17に示す。表7は、Campenotチャンバーからの軸索変性データの概要を示す。
a−Cross et al., J. Neurochem. 77(1): 94-102, 2001;小脳顆粒ニューロンのインビトロペプチドアッセイによる総GSK-3活性。
b−Fry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(20): 12022-12027, 1998;MDA−MB−453細胞におけるヘレグリン誘導性チロシンリン酸化。
c−Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(26): 9773-9778, 2006;3T3−Her2細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化。
d−Barone et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(2): 312-321, 2001;ヒト単球におけるLPS誘導性TNFα産生。
e−Tokumitsu et al., J. Biol. Chem. 277(18): 15813-15818, 2002;形質移入したHeLa細胞におけるイオノマイシン刺激後のCaMKK活性。
ニューロン変性の特定の表現型に関する化合物の特徴づけ
細胞質体に適用した細胞質体インヒビターとして先に同定された化合物(SB415(GSKi)及びActD(転写インヒビター))、及び軸索に適用した軸索インヒビターとして同定された化合物(AG555(EGFRi)及びSB239(p38i))により、上記したCampenotチャンバアッセイを使用した静脈瘤の形成に関して局所的に欠乏した軸索が観察された。静脈瘤を有する多数の軸索、並びに断片化した軸索は、細胞質体インヒビターによって観察された(図23)。軸索インヒビターは僅かな静脈瘤を示し、軸索はそれらインヒビター(図23)による処理に応じて断片化へ進行したようであった。これらの所見は、EGFR及びp38が静脈瘤の形成の上流にありうることを示す。ミトコンドリア機能不全及び軸索内輸送の遮断を、GSK、EGFR及びp38インヒビターによって調べた。図24に示すように、機能的ミトコンドリアが観察されたが、いずれも伸長していなかった。
また、細胞質体によるシグナル伝達が起こらない軸索変性パラダイムにおいてGSKを阻害することも調べた。50μMのSB415が病変後の変性をわずかに遅延させたので、GSK3を阻害することは、主に軸索の微小管網状組織の安定化によって軸索への直接効果を有する。この効果により、全体的なNGF離脱の後に観察される軸索変性が遅延するようであるが、細胞質体におけるGSK3bの役割はより顕著であるようである(図25)。加えて、GSKインヒビターが軸索変性を遮断したが、細胞死を遮断しなかったので、全体的なNGF離脱の後の軸索保護は、ニューロンの死におけるGSKの役割とは無関係であるようである(図26)。
患者の末梢性神経障害の予防
Tarceva(登録商標)(エルロチニブ)はEGFRキナーゼインヒビターである。パクリタキセル及び他の化学療法剤による患者の治療は末梢性神経障害を引き起こすことが知られている(Wilkes, Semin. Oncol. Nurs. 23(3): 162-173, 2007に概説される)。Tarceva(登録商標)とパクリタキセルの組合せで治療した患者は、プラセボ+パクリタキセル群と比較して、有意に少ない末梢神経障害を示した(p=0.012;フィッシャー直接検定)(16.3%に対して患者26.4%;登録した初めの400人の患者;一般的な有害事象の分析)。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルにおけるEGFRキナーゼレベルの分析
筋萎縮性側索硬化症(「ALS」)は重度の障害であり、致死的な神経変性疾患である。このの病理学は運動ニューロンの喪失に特徴がある。スーパーオキシドジスムターゼ(「SOD」)遺伝子の変異(SOD(G93A))を含むALSのマウスモデルに類似の病理が生じる。EGFレセプターのリン酸化は軸索の変性と関係している。EGFRレベルはSOD(G93A)マウスにおいて変更しており、リン酸化したEGFRレベルがSOD(G93A)マウスにおいても変更しているか否かを決定するために実験を行った。
末端SOD(G93A)及び非トランスジェニック同腹仔からの脊髄をスライドへ低温切開し(20μm厚)、−80℃に保存した。スライドは室温に解凍し、1回のすすぎにつき5分かけてPBSに2回水和した。スライドは、過酸化水素(PBS中0.3%)中で5分間ブロックし、次いで1回のすすぎにつき5分かけてPBSにて2回すすいだ。スライドは、1回の洗浄につき10分かけ、PBS-T(0.1%トリトンX100を含むPBS)で2回洗浄した。スライドは、5%BSA及び0.3%トリトンX100を含むPBSに、室温でおよそ1時間かけてブロックした。ウサギモノクローナル抗リン酸化EGFR一次抗体(Novus Biologicals)は、1%BSA及び0.3%トリトンX100を含むPBSに1:500に希釈し、4℃で終夜スライドと共にインキュベートした。スライドは、1回の洗浄につき10分かけて、PBS−Tに4回洗浄した。ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体(Vector Labs)は、1%BSA及び0.3%トリトンX100を含むPBSに1:300に希釈し、30分〜1時間スライドと共にインキュベートした。スライドは、1回の洗浄につき5分かけて、PBS−Tに4回洗浄した。洗浄したスライドは、アビジン-ビオチン複合体溶液(Vector Laboratories)中で室温で30分間インキュベートした。スライドは、1回の洗浄につき5分かけて、PBS−Tに4回洗浄した。次いでスライドを、所望の強度になるまでペルオキシダーゼ基質(ジアミノベンジジン(DAB);Sigma)と共にインキュベートした。スライドを水ですすぎ、カバースライドをかけて観察した。
EGFR抗体で染色した脊髄索の切片を示す図27及び28に示すように、リン酸化EGFRレベルは、コントロールマウスと比較してSODマウスにおいて増加した。この所見は、EGFRキナーゼ阻害がインビボのALS治療において有益となりうることを示す。
図29は、SOD ALSモデルの軸索に残っているpEGFRを示す。図に示すように、軸索数は、SOD1-tg脊髄において減少しており、pEGFRは一部SOD1-tg動物の軸索と共局在している。ゆえに、軸索は、非トランスジェニックコントロールと比較して、SOD1トランスジェニックマウスにおいて失われており、残りの軸索の多くはpEGFRに免疫反応性がある。
血清欠乏/KCl減少が誘導した変性からの小脳顆粒ニューロンの保護
キナーゼインヒビター(GSK3、JNK、EGFR、p38及びCaMKKのインヒビター)は、血清欠乏/KCl低減後の培養した小脳顆粒ニューロン(CGN)を保護する能力について試験した。簡単に言うと、P7マウス脳から単離したCGNを、血清及びカリウムを含む培地(29mM KCl及び10%FBSを含む基礎培地イーグルス)にて、PDL−及びラミニンコート96ウェル組織培養皿上で37℃で培養した。24時間の培養の後に、細胞を、単独又は表8に示す様々な小分子インヒビターと組み合わせて、「欠乏」培地(5mM KClを含む基礎培地イーグルス)に交換した。更に24時間培養した後に、ニューロンを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、神経系マーカー(抗クラスIIIβ-チューブリン、Covance)で染色した。撮像は、ImageXpress自動化撮像システム(Molecular Devices)を使用して実行した。使用するプレート設定を表8にまとめる。
CAMKKインヒビター=STO-609
EGFRインヒビター=AG555
P38インヒビター=SB239063
GSK3インヒビター=SB415286
カラム1−6:細胞密度=5×104/ウェル
カラム7−12:細胞密度=2.5×104/ウェル
図30に示すように、キナーゼインヒビターは、変性からCGNを保護する際に有効であることが明らかとなり、これはDRGについての実施例2及び3に見られる所見と類似していた。
ロテノンが誘導した変性からの海馬ニューロンの保護
キナーゼインヒビター(GSK3、JNK、EGFR、p38及びCaMKKのインヒビター)を、ロテノンに依存する変性から海馬ニューロンを保護する能力について試験した。アッセイは以下の通りに実施した。まず、海馬ニューロンを切開した。簡単にいうと、麻酔した妊娠ラットからE18−E19胚を取り出し、冷温HBSS(上記参照)を含むペトリ皿に置き、新鮮な冷温HBSSで洗浄した。胚は嚢から取り出し、新鮮な冷温HBSSに置き、脳を単離して、標準的な技術を使用して新鮮な冷温HBSSに置いた。海馬及び皮質を各々の胚から単離し、脳は矢状に半分に切り、半球を分離した。残りの小脳/脳幹、嗅球、非皮質腹側性基底組織及び髄膜を取り出した。残りの組織から海馬を取り出し、氷上の1.5mlチューブへ移した。皮質組織は、氷上の異なる1.5mlチューブへ移した。できるだけ多くのHBSSを取り除き、1%トリプシン(Hyclone)/0.1%DNA分解酵素(Sigma)を含むHBSSを各チューブの残りの組織に加えた。組織は、先端熱加工したピペットを使用して各々分割した。組織は、2分毎にチューブをタッピングしながら37℃で10分間インキュベートした。溶液をできる限り組織から取り除き、組織はそれぞれ0.05%DNA分解酵素(Sigma)溶液にて洗浄した。試料は、(1)2/3孔の先端熱加工ピペットと(2)1/3孔の先端熱加工ピペットをそれぞれ用いて、0.05%DNA分解酵素(Sigma)におよそ20回粉末加工した。試料を5分静置し、その後上清を回収し(デブリは沈み、上清をピペットにて取り出した)、細胞を血球計数器にて計数した。
10μMのロテノン(DMSOに再懸濁;VWR)を、ベヒクル又は実験的化合物の有無の下でニューロンに加えた。ロテノン添加の17〜18時間後に、ニューロンは、4%パラホルムアルデヒド/15%スクロースの溶液に室温で40分間かけて固定した。ニューロンはPBSにて1回洗浄し、マウス抗Tuj1抗体(Covance)を1:1000(PBS、0.1%トリトンX−100、2%ヤギ血清中)の希釈で加え、4℃で終夜インキュベートした。ニューロンはPBSにて4回洗浄し、Alexa-568(Alexa)をコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を1:200(PBS、2%ヤギ血清中)の希釈で加え、30分置いた。ニューロンは、PBSにて更に4回洗浄し、Vectashieldマウント培地(Vector Labs)のスライド上にマウントした。すべてのニューロンはTuj1にて視覚化し、個々のニューロンはGFPにて視覚化した。
図31に示すように、キナーゼインヒビターは、ロテノン依存性の変性から海馬ニューロンを保護することが明らかとなった。皮質ニューロンを用いて類似の研究を行ったところ、キナーゼインヒビターによって皮質ニューロンもまたロテノン依存性の変性から保護されることが示された(図32)。
軸索上のErbBレセプターの視覚化
軸索上のErbBレセプター発現を視覚化するために、画面情報のためにDRGを上記のように培養した。24時間成育させた後、1:1の比率で培養培地に8%PFA/30%スクロースを加えて30分置いて細胞を固定し、PBSにて1回洗浄した。固定した細胞を、5%BSA及び0.2%トリトンX100を含むPBS中で30分間インキュベートし、次いで以下の抗体と共に2%BSAを含むPBS中で4℃で終夜インキュベートした:(1) 50μg/mlの抗EGFR(D1-5、Genentech)、(2) 1:500の抗ErbB2(Abcam)、(3) 24μg/mlの抗ErbB3(57.88、Genentech)、及び(4) 1:500のErbB4(Abcam)。細胞はPBSにて1回洗浄した後、蛍光標識がコンジュゲートした二次抗体(1:200、Invitrogen)と共に室温で30分間インキュベートし、ヘキスト33258(1μg/ml、Invitrogen)を含むPBSにて1回、その後最終的にPBSにて洗浄し、250μlのフルオロマウントG (Electron Microscopy Sciences)にてカバーガラスをかけた。図33に示すように、免疫細胞化学法によってErbBが軸索に検出される。
EGFRリガンドによる軸索上に発現したEGFRの特徴づけ
EGFを含むリガンドによってEGFRの活性化の効果を評価するために実験を行った。
材料及び方法
後根神経節(DRG)イムノブロットを以下の通りに調製した。実験に使用する主な細胞は、チャールズリバー社のCD−1 E13後根神経節(DRG)とした。細胞は、N3/F12(+25ng/mlのNGF)培地(ハムF12(23ml)、N3サプリメント(1ml)、グルコース(1mlの1M グルコース貯蔵液)、25ng/mlの神経成長因子2.5S, マウス(Roche11362348001)を含むハムF12(貯蔵液:50μg/ml−80℃)、これは使用前にフィルター滅菌した)に維持した。また、実験には、トリトン溶解バッファ(20mM トリスpH7.5、150mM NaCl、0.1%トリトン-X100、100×ホスファターゼインヒビター反応混液I(新鮮なものを添加)、100×ホスファターゼインヒビター反応混液II(新鮮なものを添加)、1錠/10mlのプロテアーゼインヒビター錠(新鮮なものを添加))を使用した。
0日目にDRG移植片を調製した。胚をL15培地に切開した(切開ツールは70%イソプロパノールに浸し、皿は氷上に置いた:脊髄に対して10cm皿(1皿につき4つの胚)及び1つの6cm皿)。E13.5脊髄をDMEM+10%FBSに抽出した。5×20のDRGを脊髄から分離した。8ウェルスライドに250μlのN3/F12(25ng/mlのNGF)+7μM シトシンアラビノシドを満たした。およそ20のDRGを各ウェルに置き(合計5)、室温でおよそ10分間接着させた。2日目に、培地をN3/F12+25μg/ml NGFに交換した。3日目に、ErbBリガンド(1000×;100μg/ml;SQ水に1:10に希釈)を加えて30分から1時間置き(SQ水(コントロール);EGF(ErbB1);ニューレグリン-1(ErbB3);β-セルリン(ErbB1/4);エピレグリン(ErbB1/4);抗NGF(25μg/ml))、スライドをわずかに振とうした。
これらの実験の目的は、EGFによるEGFRの活性化が変性を起こすために十分か否かを観察することである。図34に示すように、EGFRは軸索に発現される。図35は、NGFに維持されるニューロンに添加したNGFによって変性が生じないことを示す。これらのアッセイに用いた神経系培養物においてEGFがEGFR/ErbBを活性化することができることを確認するために、ERK活性化を評価した(ERKはEGFRの下流の標的である)。図35のグラフに示すように、ウエスタンブロットによって決定されたように、EGFの添加によりERK活性が増加した。これらのデータは、EGFRを活性化することが変性を起こさせるために十分でないことを示す。
EGFR外部ドメインを用いた軸索上に発現したEGFRの特徴付け
EGFRの活性化に対するEGFR外部ドメインの効果を評価するために実験を行った。
材料及び方法
これらの研究に使用する材料には、BD Biocoat PDL/ラミニンコートガラス8ウェルチャンバスライド(BD354688) ;L15培地(Invitrogen 11415114);ウシ血清のアルブミン(BSA)(Sigma A7906-500g);ウシ胎児血清(Sigma F2442-100ml);N3サプリメント(上記参照);フルオロマウントG(Electron Microscopy Sciences 17984-25);24×60mmナンバー1カバーグラス(VWR48393 106);モノクローナル抗神経系クラスIIIβ-チューブリン(Covance MMS-435P);神経成長因子2.5S, マウス(Roche 11362348001)を含むハムF12;及び、トリトンX-100(Sigma T8787-100ml)が含まれる。これらの実験に使用する溶液には、25mlのN3/F12培地(23mlのハムF12;1mlのN3サプリメント;1mlの1M グルコース;25ng/mlのNGF)及び30%スクロース/8%PFA(上記参照)が含まれる。
外部ドメイン(R&D Systems)は、フィルター滅菌した0.1%BSAに1mg/mlで再懸濁した。マウスE13.5胚を切り出し、L15培地に置いた。ピンセットを使用して、胚の腹側部を開き、臓器を取り出し、肋骨を切り離し、脊髄をDRGが接着したまま切り出した。接着したDRGを有する脊髄は、氷上のL15培地+5%ヤギ血清に置いた。DRGはタングステン針で取り出し、残りの脊髄を処分した。8ウェルスライドをN3-F12+25ng/mlのNGFで満たした。DRGを半分に切断した。切断したDRGは8-チャンバスライドの各ウェルの中心に置き、DRGは室温で5〜10分間接着させた。外部ドメインは、上列の終濃度50μg/mlで加えた。スライドは、37℃でのインキュベーターに終夜置いた。外部ドメインは、終濃度50μg/mlで、下列に加えた。抗NGF抗体は、25μg/mlの濃度でウェルに加えた。ポジティブコントロールとしてEGFRインヒビターAG555は10μMの濃度で加えた。
24時間の抗NGF抗体処置の後、8%PFA/30%スクロースを1:1の希釈で培養培地に直接加え、30分置いた。初めの15分後にテフロンデバイダーを取り外し、スライドをPBSにて1回洗浄した。
スライドは、5%BSA/0.2%トリトン中で30分かけてブロックし、2%BSA中で一次抗体(Tuj1(1:1,000))と共に終夜インキュベートした。スライドはPBSにて1回洗浄し、二次抗体(ヤギ抗マウス488;1:200)を加えた。スライドは、室温で1時間インキュベートし、PBSにて2回洗浄し、250μlのフルオロマウントGにてカバーガラスをかけ、4℃で保存した。
EGFに加え、EGFRを活性化しうる多くのリガンドがある。変性の間のEGFR活性化がリガンド依存性であるか否かを試験するために、R&D SystemsからのEGFR外部ドメインを50μg/mlの濃度で加えた。この濃度は、EGFRを活性化しうる任意の遊離リガンドを結合するために十分であると思われる。抗NGF添加の24時間前又は添加と同時に加えたEGFR外部ドメインは、変性をブロックしない。このことから、変性中のEGFR活性化はおそらくリガンド非依存性であることが示唆される。
背面の脊髄(DSC)移植片は神経変性の他のモデルである。DSCは一定の日数にわたって軸索を延ばすが、DSCが生存因子の添加によってレスキューされない場合、それらは最終的に変性する。図37に示すように、Tarceva(登録商標)(Erlotinib)はこの変性プログラムを遅延させうる。
A.二重ロイシンジッパー含有キナーゼの阻害
材料と方法
293細胞株中におけるDLKの形質移入
293細胞を6ウェルプレートの3つのウェル中に30%のコンフルエンスで播種した。細胞に、野生型DLKを発現するDNAコンストラクトであるコントロールプラスミドDNAか、あるいは一方が野生型DLKを発現し、他方がスレオニン277をアラニンに変異させた(T278A)DLKを発現する二つのプラスミドの何れかを形質移入し、活性を伴わないタンパク質の形態をつくり出した(Fugene 6, Roche)。形質移入から24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、各プレートを擦り落とし、エッペンドルフ管に移した。ついで、細胞を遠沈させ、過剰の培地を除去した。ペレット状細胞を、20mMのTris、150mMのNaCl、0.1%のトリトンX−100中に溶解させ、30分間、4℃に置いた。ついで、試料を遠心させて不溶性粒子を除去し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Promega)でタンパク質濃度を試験した。
マウスE13.5胎仔を解剖し、L15培地(Invitrogen)中に配した。脊髄を、DRGが付着した胎仔から解体した。DRGが付着した脊髄を氷上のL15培地+5%ヤギ血清(Gibco)中に配した。DRGをタングステン針を使用して除去し、残りの脊髄を処分した。8ウェルのスライドに、25ng/mlのNGF(Roche)を添加したN3−F12溶液(23mlのハムのF12、1mlのN3サプリメント、及び1mlの1Mグルコース)を満たした。N3サプリメントは、次の成分を次の順で混合することによって作製したN3の100X濃縮物の希釈により作製した:5.0mlのハンクの緩衝生理食塩水(HBSS;非含有Ca,Mg;Invitrogen)、1.0mlのウシ血清アルブミン(HBSS中10mg/ml=150μm)、2.0mlのトランスフェリン(T1147−1G,ヒト,HBSS中100mg/ml=1.1mM)、1.0mlの亜セレン酸ナトリウム(S9133−1MG,HBSS中0.01mg/ml=58μM)、0.4mlのプトレシン二塩酸塩(P5780−5G,HBSS中80mg/ml=500mM)、0.2mlのプロゲステロン(P8783−5G,無水エタノール中0.125mg/ml=400μM)、0.02mlのコルチコステロン(C2505−500MG,無水エタノール中2mg/ml=5.8mM)、0.1mlのトリヨードチオニン・ナトリウム塩(T6397−100MG,0.01NのNaOH中0.2mg/ml=300μM)、0.4mlのインスリン(I6634−250MG、ウシ膵臓、241U/mg、20mMのHCl中25mg/ml=4.4mM)で、10.02mlの全体積(−20℃で保存可能)。N3サプリメント原液は、次のものを組み合わせることによって作製した:10mlのPen/Strep(100X,Gibco)、10mlのグルタミン(200mM,Gibco)、10mlのMEMビタミン(100X,Gibco)、10mlのN3濃縮物(100X,上記を参照)で、40mlの全体積。混合物を、0.22μmのフィルターを使用して濾過殺菌し、1−2mlのアリコートを−20℃で保存した。
E13.5DRGを解体し、コントロールsiRNA又はDLKに対して産生されたsiRNAを用いて電気穿孔し、5日間、上述のようにして培養した。ついで、ニューロンからのRNAを、製造者のプロトコルに従って、Qiagen RNeasyミニキットによってPurify Total RNAを使用して単離した。コントロール及びDLK siRNAで処理した細胞からの10ngの全RNAをDLK及びGAPDH(コントロール)に特異的なDNAプライマー(CATCATCTGGGTGTGGGAAG(順方向プライマー)及びAGTTGCAGCATGAGGGCATTC(逆方向プライマー);配列番号:16及び17)を使用する定量的PCR実験(Qiagen Quantifect SYBR Green RT-PCR)において3通り実施した。増幅曲線を分析し、各試料の相対的RNA濃度をコントロールに対して計算した。
これらの実験の結果を図38に示す。野生型DLKをコードするプラスミドでの293細胞の一過性形質移入は、JNKのリン酸化と活性化を生じ、DLKがシグナル伝達カスケードにおけるJNKの上流のキナーゼであることを示している。キナーゼデッドDLKをコードするプラスミドの同時形質移入は、JNKリン酸化のレベルを低減させた。siRNAを介してのDLK発現のノックダウンは、下流のキナーゼJNKの阻害がするように、ニューロンの分解からの保護を生じせしめた。DLK(Dharmicon)に対して産生されたsiRNAを形質移入した培養ニューロンを使用する実験において、コントロールsiRNA(アクチン染色によって可視化)を形質移入したニューロンは、TuJI染色によって可視化されたNGF離脱時に有意な分解を受けた(図38及び39)。これに対して、DLKに対して標的化されたsiRNAを形質移入したニューロンでは、NGF離脱時に軸索一体性が維持された。これらの実験におけるDLK発現のノックダウンは、DLKに特異的なプライマーを用いた定量的PCRを使用して確認した。
DLK阻害の上で観察された保護作用が、毒素暴露のような他の侵襲によって引き起こされる軸索変性/ニューロンアポトーシスに対してより一般的に保護性であるかどうかを評価するために実験を実施した。単離されたニューロンを、DLKに特異的なsiRNAの存在下又は不存在下で有糸分裂阻害剤ビンクリスチンに暴露させた。
前記分析は、DLK阻害が皮質ニューロン及び後根神経節ニューロンにおける毒素誘発性又は増殖因子飢餓誘発性軸索変性/アポトーシスに対して保護性であることを証明している。更なる実験を、これらの誘発によって通常誘発される交感ニューロンを保護するDLK阻害の能力を評価するために実施した。
DLKのRNAサイレンシング及びキナーゼデッドDLKの導入が、培養ニューロンのNGF離脱トリガー又は毒素誘発性変性に対してそれぞれ保護性であったことを決定したので、ニューロン変性経路におけるDLKの役割を同定するために更なる実験を実施した。DLKは、複数系列キナーゼ(MLK)ファミリーにおけるMAPキナーゼキナーゼキナーゼである。MLKファミリーの他のメンバーと異なり、DLKの発現は神経系に限られている(Gallo等, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(9):663-672, 2002;Bisson等, Cell Cycle 7(7):909-916, 2008;Holzman等, J. Bio. Chem. 269(49):30808-30817, 1994)。DLKは、ある条件下でアポトーシス/炎症を生じるJNK1−3 及びcJunを活性化するシグナル伝達経路のメンバーである。増加したJNK/cJun活性は、患者試料の検査又は疾患の動物モデルでの実験を通して、パーキンソン病、緑内障、アルツハイマー病、ALS、卒中、及びハンチントン病を含む様々な神経性疾患に関連している(Oo等, J. Neurochem. 72(2):557-564, 1999;Ries等, J. Neurochem. 107(6):1578-1588, 2008;Vlug等, Eur. J. Neurosci. 22(8):1881-1894, 2005;Morfini等, Nat. Neurosci. 12(7):864-781, 2009;Perrin等, Exp. Neurol. 215(1):191-200, 2009;Levkovitch-Verbin等, Eye Res. 80(5):663-670, 2005;Tezel等, Brain Res. 996(2):202-212, 2004;Kuan等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(25):15184-15189, 2003;Yang等, Nature 389(6653):865-870, 1997;Hunot等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(2):665-670, 2004;Thakur等, J. Neurosci. Res. 85(8):1668-1673, 2007)。神経疾患とのDLKの潜在的な相関と一又は複数のJNK/cJun活性化経路の関与を調査した。
DLKはMAPキナーゼであり、他のMAPキナーゼのように、それはその活性化状態では活性化ループ内でリン酸化されている。活性化DLKと休止(非活性化)DLKを直ぐに区別することができるために、DLKのリン酸化型(「p−DLK」)に特異的である抗体を産生させた。これをなすために、活性部位の特定の残基を、リン酸化され得ないアラニンに変異させた。ついで、これらのコンストラクトを、実施例14のパートA(上記)に記載のものと同じプロトコルを使用して293細胞中に形質移入し、下流キナーゼJNKをリン酸化するその能力について試験した(図43C)。この分析は、スレオニン278(T278)及びセリン281(S281)が活性のために必要とされたことを確認した。ウサギにおいて標準的なインビボ免疫化技術を使用してこれらの残基を含むDLKタンパク質の活性化ループ中のペプチドに対して抗体を産生した。免疫化に使用されたペプチド配列は、抗体317及び318ではCKELSDKSpTKMpSFAG(配列番号:13)、抗体319及び320に対してはKMpSFAGTVAWMAKKC(配列番号:14)、抗体321及び322に対してはCGTSKELSDKSpTKM(配列番号:15)であった。手順は、選択性を生じさせるためにリン酸化及び未リン酸化ペプチドのカラムでの精製を含む「p−部位」プロトコルを使用してYenzymで実施した。6匹の免疫化ウサギからポリクローナル抗体を単離し、DLK及びp−DLKへの結合についてスクリーニングした。
上述のようにして産生された抗体をついで試験して、DLKのリン酸化及び活性が、ビンクリスチンでストレスを受けた皮質ニューロンにおいて増加したかどうかを評価した。これは、DLK活性のノックダウンが生存を促進したので、予想されていた。上述のようにして増殖され、ビンクリスチンで1時間処理された場合、リン酸化DLKのレベルは、抗体318、319、及び320を使用してウェスタンブロット(上述のものと同じプロトコル)によって分析したときコントロール培養物と比較して上昇していた(図43D)。これは、リン酸化DLKのレベルは活性と相関し、ニューロンストレスの条件下で増加することの更なる確証を提供した。
免疫組織化学アッセイを次のようにして実施した。SOD1トランスジェニック動物を4%のパラホルムアルデヒドを用いて灌流し、脊髄を脊柱から注意して除去し、4℃で一晩、後固定した。ついで、脊髄を30%スクロース/PBS中で平衡にした後、凍結切片化のためにOCTに包埋した。冠状切片(20μm厚)を切り取り、冷スライドに取り付け、−80℃に維持した。切片をPBS中で水和させ、H2O2(PBS中0.3%)を用いて10分間内因性ペルオキシダーゼ活性についてブロックし、ついで、PBST(0.1%のトリトンX−100)で2回すすいだ。切片をPBS中の5%のBSA、0.3%のトリトンX−100で1時間ブロックし、ついで、PBS中1%のBSA、0.3%のトリトンX−100のp−DLK中の一次抗体と共に4℃でインキュベートした。スライドをPBST中で3回洗浄し、ついで、1%のBSA、0.3%のトリトンX−100を含むPBS中のビオチン化二次抗体(1:300)で1時間、標識した。スライドをPBSTですすいだ後、アビジンDH含有ABS試薬(Vector labs)と共に30分インキュベートし、最後に10−15分間、暗所でペルオキシダーゼ基質(30%のH2O2を使用の直前に添加した10mMのTris、150mMのNaCl、pH7.6中に0.05%のジアミノベンジジン)においてインキュベートした。反応を、水ですすぐことによって停止させ、切片をガラススライドに取り付け、ガラスカバーをした。アルツハイマーの患者の組織はUS Biologicalから購入した。アルツハイマーの患者の海馬からの組織可溶化液及び及び年齢が一致したコントロールをこの分析に使用した。分析は、上述のものと同じプロトコルを使用してウェスタンブロットによって実施した。
1.DLKサイレンシングの分子効果
実施例14において上で証明したように、DLKサイレンシングは、毒素暴露又は増殖因子離脱に応答してニューロンを分解から保護し、DLKキナーゼ活性はJNKリン酸化に直接的又は間接的に関与している。NGF離脱ストレス及び毒素依存性ストレス条件下でのJNK及びcJunの発現及び活性を評価するために実験を実施した。DLKの発現を減少(siRNA)させるために、また免疫ブロットのために使用される実験プロトコールは、上述のものと同じであった。
過去の研究では、DLKのドミナントネガティブキナーゼデッド変異型(K152A)が黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおいて栄養作用を生じせしめる一方、ロイシンジッパードメインのみを含むDLKのドミナントネガティブ型はそのような作用を生じせしめないことが示唆されている(Chen等, J. Neurosci. 28(3):672-680, 2008)。しかしながら、特に、この研究における栄養は、感染ニューロンと非感染ニューロン間の何らかの機能的又は形態的差よりもむしろ特定のマーカーを発現するDLK(K152A)感染ニューロンの増加数によって定義された。従って、DLKサイレンシングの影響が皮質ニューロン及びDRGにおいて研究された。これらの研究に使用されたプロトコルは、上述のものと同じであった。
本明細書に記載するアッセイにより、ニューロンの変性を減少させるGプロテイン及びGプロテインカップリングレセプター(GPCR)のいくつかのインヒビターが同定された。Gプロテインの役割及び変性経路のGPCRを検査するために、DRGにおいて実験を行った。これらの実験に使用する実験上のプロトコールは、実施例14に記述のものと同様である。百日咳毒素及びSCH202676はTocris Bioscienceから購入した。
データは、Gプロテインカップリングレセプターに結合するアゴニスト及びアンタゴニストを阻害するスルフヒドリル−反応化合物であるSCH202676が、DRGにおけるNGF離脱誘導性の変性を減少させることを示す(図49及び50)。また、Gプロテインシグナル伝達の他のインヒビターである百日咳毒素も、NGF離脱後のニューロンにおける変性を減少させる(図51)。これらのデータは、Gプロテイン及びGプロテインカップリングレセプターがニューロン変性に役割があることを示す。
本明細書に記載するアッセイにおいて同定され、変性経路において役割を有する他の細胞標的は、β-カテニンシグナル伝達経路及びその下流の標的のメンバー(例えば転写第4因子、TCF4)である。ニューロン変性におけるβ-カテニン及びTCF4をの役割を確認するために、海馬ニューロンにおいて実験を行った。これらの実験に使用する実験上のプロトコールは、実施例14に記載したものと同様である。
データは、β-カテニンの欠失を生じうる構造的に活性なGSK3の発現がニューロン生存度の低減を仲介することを示す(図52;上右パネル)。また、TCF4の優性ネガティブ型の発現は、ニューロン生存度の減少を仲介する(図52、下右パネル)。これらのデータは、β-カテニンシグナル伝達経路がニューロン生存度の維持に重要であることを示す。β-カテニンシグナル伝達経路を標的とするインヒビターを用いて、ニューロン変性を促すことができる(例えば、β-カテニン発現のインヒビター及びTCF4活性のインヒビター)。逆に、活性化因子又はβ-カテニン及びTCF4シグナル伝達は、軸索変性及び神経細胞死を妨げうる。
神経系変性はDLKノックアウトニューロンにおいて低減される
DLKノックダウンが毒性誘導性細胞死から皮質ニューロンを保護したので、実施例14(B)に示すように、DLKを欠いたニューロンもまたN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)によって生じる軸索変性/神経系アポトーシスから保護されるか否かを判断するために実験を行った。異なるストレス応答経路は、利用される神経系サブタイプ又は毒性の傷害に応じて神経系変性を調整することができることが示されている。
NMDAは、急性の神経変性(例えば脳卒中)、並びに遅発型又は慢性の神経変性(例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病)のニューロンの死に関わっているNMDAレセプターのアゴニストである(Loopuijt et al., Amino Acids 14:17-23, 1998)。NMDAレセプターが媒介するグルタミン酸塩興奮毒性は、Aβ誘導性神経系死をもたらす主な因子であることが報告されている(Sonkusare et al., Pharma. Res. 51: 1-17, 2005)。グルタミン酸塩興奮毒性が誘導する神経細胞死は、また、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病を含むいくつかのCNS疾患と関連していた(同上)。
DLKを欠いているニューロンに対するNMDAの効果を試験するために、後述するようにノックアウトマウスを作製した。DLKノックアウトマウスは、ネオマイシン耐性カセットおよびDLKエキソン2−5を含有するゲノム領域に隣接するLoxP部位の挿入が生じる、胚性幹(ES)細胞における相同組み換えによって作製した。次いで、ネオマイシンカセットに加えてエキソン2−5は、ES細胞においてCre媒介性組換えにより取り除いた。次いで、結果として生じたES細胞は、マウス胚盤胞に注入してキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配してヘテロ接合動物を生成した。実験のために、2匹のDLKヘテロ接合体(dlk+/−動物を交配して、DLKノックアウト胚を生成した。DLKノックアウトマウスにおけるDLKタンパク質の欠失は、2つの抗DLKポリクローナル抗体による試験で確認した(Hirai et al., J. Neurosci. 46:11992-12002, 2006、およびGenentech)。
DLKの下流標的がNMDA曝露に応答してDLKノックアウトマウスにおいて影響を受けたか否かを決定するために、DLKの下流経路、例えばJNK/cJunおよびp38経路を調べた。WTおよびHET皮質ニューロンをコントロールとして用いた。マウス皮質ニューロンを培養物中で成熟させ、シナプスを形成させた。Div(日目インビトロ)18−19に、NBActive4培地を、ECS培地(以下を含有する無Mg2+細胞外溶液:25mM HEPES酸、140mM NaCl、33mM グルコース、5.4mM KCl、及び1.3mM CaCl2、pH7.35およびモル浸透圧濃度320−330mOsm)又は50M NMDA及び20M グリシンを含有するECS培地と置き換えて1時間置いた。細胞は、NMDAグリシン処理の1時間後にウエスタンブロット分析のために、冷温PBSにてすすぎ、その後溶解バッファ(20mM トリス、150mM NaCl、0.1%トリトン)に溶解した。
ウエスタンブロットのために、還元剤およびSDS添加バッファを20μgの細胞溶解物に加え、5分間沸騰させ、その後4−12%Bis-トリスゲル(Invitrogen)上で実行した。次いでゲルは、製造業者の仕様書に従ってiBlot装置(Invitrogen)を用いてトランスファーした。ブロットは、5%乳汁を有するTBST(トリス緩衝生理食塩水、1%のツイーン20)中で1時間かけて遮断した。遮断した後、ブロットは、ホスホJNK(9251L、Cell Signaling Technologies)、ホスホcJUN(9261L、Cell Signaling Technologies)、ホスホP38(4511、Cell Signaling Technologies)、モノクローナル-チューブリン(T5201、Sigma)およびDLK(Genentech)に対する一次抗体と共に終夜インキュベートした。すべての抗体は、5%BSAを有するTBST中で1:1000に希釈した。インキュベートの後、ブロットはTBST中で3回洗浄し、その後HRP-コンジュゲート抗ウサギ二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。ブロットは、もう一度3回洗浄し、その後ECL(Promega)と共に1分間インキュベートした。ブロットは、バイオラドVersaDocTMゲル画像システムを使用して分析した。
製造業者の指示に従って、各神経系集団から50μLの培地をLDHアッセイに用いた。LDH放出の量を定量化し、放出される最大LDH(製造者が提供する溶解バッファにて溶解したウェルからの読み取り値)および最小LDH放出(NMDA処置なしのウェルからの読み取り値)に対して規準化した。%細胞障害性=(NMDA処理済み−未処理)/(最大細胞溶解−未処理) ×100。
ウエスタンブロットおよびLDHアッセイの結果を図53に示す。DLK KOマウスからの皮質ニューロンは、WT又はHETのコントロールよりNMDA誘導性の変性から保護された。さらに、DLK KOマウスからのニューロンは、JNK/cJunおよびp38経路の活性化の低減を示した。リン酸化cJun、p38およびJNKのレベルは、様々な経路の活性化を示している未処理のニューロンと比較して、NMDAにて処理した野生型およびヘテロ接合のニューロンにおいて上昇した。しかしながら、NMDAにて処理したDLK KOニューロンにおけるリン酸化cJun、p38およびJNKのレベルは、ノックアウトマウスでこれらの経路の活性化の欠如を示す未処理のDLK KOニューロンと比較して不変のままであった。これらの結果は、さらに、皮質ニューロンにおけるJNK/cJunおよびp38ストレス応答経路の上流の主なキナーゼとしてのDLKの役割を裏付けるものであり、DLKがNMDA媒介性興奮毒性の下流の神経系死の重要な調節因子であることを示す。
また、DLKタンパク質レベルはNMDAによる処理の後に有意に増加することは注目すべき点である(データは示さない)。また、この観察は、DLKタンパク質レベルが神経系変性と相関するので、NMDA誘導性の神経系ストレスへの応答の重要な調節因子としてのDLKを示唆する。
DN-DLK注入脳はリン酸化cJunニューロンを欠く
さらに中枢神経系ニューロンの神経保護におけるDLKの役割を調査するために、Chen et al., J. Neurosci. 28:672-680, 2008に記載されるように、リン酸化cJun(p-cJun)の存在を、GFPを発現するアデノ関連ウイルス(AAV GFP)又はロイシンジッパードメインのみを含有するDLKのドミナントネガティブ型を発現するアデノ関連ウイルス(AAV DLK-LZ)を摂取したマウス脳において調べた。
具体的には、1−2μLの濃縮(1012又は1013のウイルスゲノム/ml) AAV GFP又はAAV DLK-LZを、皮質、海馬および/または線条体に定位的に注入した。5〜7日後に、マウスを屠殺し、PBSの後に4パーセントのパラホルムアルデヒドにて灌流した。脳を切除し、30%スクロース/PBSに低温保存し、薄片化した。リン酸化c-junについての免疫組織化学は、10%仔羊血清および0.5%PBS トリトンX-100中で切片を遮断することによって実行し、その後、切片を、1:200の抗リン酸化c-jun抗体(Cell Signaling Technologies)と共に4℃で終夜かけてインキュベートした。その翌日、切片は、PBSにて洗浄し、室温で2時間かけて蛍光二次抗体と共にインキュベートし、PBSにて再度洗浄し、カバーガラスをかけて、蛍光顕微鏡にて分析した。単一のホスホc-junポジティブ細胞および二重標識ホスホc-jun/GFPポジティブ細胞は、全ての脳切片全体にわたって定量化した。
図54は、AAV GFP又はAAV DLK-LZに感染したマウスの脳においてp-cJunポジティブであったニューロンの数を示す。AAV DLK-LZ感染マウスは、AAV GFP感染マウスと比較して、c-junポジティブニューロンをほとんど有していなかった。我々は、次に、GFP及びホスホc-junを共に発現したAAV DLK-LZにて二重標識した細胞を分析することによって、ドミナントネガティブDLK過剰発現の細胞自律性効果を調べた。p-cJunおよびGFPを共に含有するニューロンは、AAV DLK-LZ注射マウスにおいて検出されなかったことから、DLKのドミナントネガティブ型がリン酸化c-junの発現を抑制したことが示される。実際、p-cJunおよびGFPポジティブニューロンは、AAV GFPベクターに感染したマウスにのみ観察された。我々は、DLKのドミナントネガティブ型の発現が、少なくともある程度、神経系アポトーシスおよび変性において役割があることが知られている、c-junリン酸化および活性化の阻害によって保護的であると結論付ける。
ドミナントネガティブDLKは発作強度を低減する
神経系保護におけるDLKの役割をさらに調べるために、DLKの効果を発作モデルにおいて調べた。具体的には、前項に記載のように、c57BL6マウスに、2マイクロリットルのAAV GFP又はAAV DLK-LZを注射した。5〜7日後のマウスに、25mg/kgのカイニン酸を注射し、発作を誘導した(Yang et al., Nature 389:865-870, 1997)。発作強度は、3時間にわたって5分ごとにラシーヌ発作スコア指標で評価した。
これらの実験からの結果を図55に示す。コントロールAAV GFP感染マウスと比較して、AAV DLK-LZを注射したマウスは発作活性を低減した。我々の結果は、JNK3ノックアウトマウス(Yang et al., Nature 389:865-870, 1997)の以前の所見と一致するものであり、DLKがこのモデルでの発作活性の低減をもたらす主要な上流キナーゼであることを強く示す。
このデータは、DLKがインビボでの興奮毒性誘導性変性に重要な役割を果たすことを裏付けるものであり、脳卒中及びアルツハイマー病を含む多くの神経変性状態に関係していた。ゆえに、DLK阻害は、疾患関連ストレスを用いて生きている成体動物の脳においてニューロンを保護する。
Claims (34)
- 中枢神経系(CNS)ニューロンないしその一部の変性を阻害又は予防する方法であって、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性又は発現を阻害する薬剤をCNSニューロンに投与することを含む方法。
- 変性がCNSニューロンの軸索又は細胞質体部分において阻害又は予防される、請求項1に記載の方法。
- CNSニューロンが小脳顆粒ニューロン、皮質ニューロンおよび海馬ニューロンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- CNSニューロンがドーパミン作動性ニューロンではない、請求項1に記載の方法。
- 前記投与により、薬剤にて処理していないニューロン群と比較して、ニューロン群の変性が少なくとも10%低減する、請求項1に記載の方法。
- 薬剤がDLKシグナル伝達のインヒビターである、請求項1から5のいずれか一に記載の方法。
- 薬剤がDLK発現のインヒビターである、請求項1から5のいずれか一に記載の方法。
- 薬剤が、抗体、小干渉RNA(siRNA)、ポリペプチド、ペプチボディ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、小分子および多糖類からなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一に記載の方法。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fv断片、Fab断片、Fab'断片およびF(ab')2断片からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 薬剤が、DLKを標的とするsiRNA分子、JNK1を標的とするsiRNA分子、JNK2を標的とするsiRNA分子、JNK3を標的とするsiRNA分子、小分子、DLKのドミナントネガティブ型、DLKのキナーゼデッド型及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- CNSニューロンへの投与が生体外で実施される、請求項1から10のいずれか一に記載の方法。
- 方法がさらに、薬剤の投与後に、ヒト患者にCNSニューロンを移植するか又は埋め込むことを含む、請求項1から11のいずれか一に記載の方法。
- CNSニューロンがヒト患者に存在する、請求項1から10のいずれか一に記載の方法。
- CNSニューロンへの投与が、薬学的に許容可能な担体での薬剤の投与を含む、請求項13に記載の方法。
- CNSニューロンへの投与が、非経口、皮下、静脈内、腹膜内、脳内、病巣内、筋肉内、眼内、動脈内、間質性の注入および移植型送達装置からなる群から選択される投与経路によって実行される、請求項14に記載の方法。
- さらに、一又は複数の更なる製薬的薬剤を投与することを含む、請求項1から15のいずれか一に記載の方法。
- 薬剤の投与により、JNKリン酸化、JNK活性および/またはJNK発現の減少が生じる、請求項1から16のいずれか一に記載の方法。
- 薬剤の投与により、cJunリン酸化、cJun活性および/またはcJun発現の減少が生じる、請求項1から17のいずれか一に記載の方法。
- 薬剤の投与により、p38リン酸化、p38活性および/またはp38発現の減少が生じる、請求項1から18のいずれか一に記載の方法。
- 患者が、神経変性疾患又は状態を有しているかまたは発症するリスクにある、請求項12又は13に記載の方法。
- 神経変性疾患又は状態が、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、乏血、脳卒中、頭蓋内出血、脳内出血、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、原発性側索硬化症(PLS)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症(prophyria)、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、皮膚基底核変性症、レーヴィ小体を有する痴呆、前頭側頭骨痴呆、脱髄性疾患、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、プリオン疾患、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、牛海綿様脳症、ピック病、癲癇、エイズ認知症複合、中毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬剤又は化学療法剤への曝露によって生じる神経損傷;物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系への損傷;緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(AMD)、湿性又は乾燥性のAMDと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 神経変性疾患又は状態の一又は複数の症状を低減又は予防する方法であって、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性又は発現を阻害する薬剤を患者に投与することを含む方法。
- 神経変性疾患又は状態の進行を低減する方法であって、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性又は発現を阻害する薬剤を患者に投与することを含む方法。
- 中枢神経系(CNS)ニューロンないしその一部の変性を阻害又は予防する医薬の製造における、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(DLK)の活性又は発現を阻害する薬剤の使用。
- 医薬が、神経変性疾患又は状態の一又は複数の症状あるいは神経変性疾患又は状態の発症の可能性を低減する、請求項24に記載の使用。
- 神経変性疾患又は状態が、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、乏血、脳卒中、頭蓋内出血、脳内出血、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、原発性側索硬化症(PLS)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症(prophyria)、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、皮膚基底核変性症、レーヴィ小体を有する痴呆、前頭側頭骨痴呆、脱髄性疾患、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、プリオン疾患、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、牛海綿様脳症、ピック病、癲癇、エイズ認知症複合、中毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬剤又は化学療法剤への曝露によって生じる神経損傷;物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系への損傷;緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(AMD)、湿性又は乾燥性のAMDと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎からなる群から選択される、請求項25に記載の使用。
- 薬剤が、抗体、小干渉RNA(siRNA)、ポリペプチド、ペプチボディ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、小分子および多糖類からなる群から選択される、請求項24から26のいずれか一に記載の使用。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fv断片、Fab断片、Fab'断片およびF(ab')2断片からなる群から選択される、請求項27に記載の使用。
- 薬剤が、DLKを標的とするsiRNA分子、JNK1を標的とするsiRNA分子、JNK2を標的とするsiRNA分子、JNK3を標的とするsiRNA分子、小分子、DLKのドミナントネガティブ型、DLKのキナーゼデッド型、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項27に記載の使用。
- 医薬が、非経口、皮下、静脈内、腹膜内、脳内、病巣内、筋肉内、眼内、動脈内、間質性の注入および移植型送達装置からなる群から選択される経路による投与のために製剤化されている、請求項24から29のいずれか一に記載の使用。
- 医薬がさらに、一又は複数の更なる製薬的薬剤を含む、請求項24から30のいずれか一に記載の使用。
- 医薬が、JNKリン酸化、JNK活性および/またはJNK発現を低減する、請求項24から31のいずれか一に記載の使用。
- 医薬が、cJunリン酸化、cJun活性および/またはcJun発現を低減する、請求項24から32のいずれか一に記載の使用。
- 医薬が、p38リン酸化、p38活性および/またはp38発現を低減する、請求項24から33のいずれか一に記載の使用。
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