MX2010012299A - Anticuerpos anti-pirb. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere generalmente al desarrollo neural y trastornos neurológicos. La invención trata específicamente de nuevos moduladores del sistema inhibidor asociado con mielina y varios usos de los moduladores identificados de este modo.

Description

ANTICUERPOS ANTI-PIRB CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente al desarrollo neutral y trastornos neurológicos . La invención trata específicamente de nuevos moduladores del sistema inhibidor asociado con mielina y varios usos de los moduladores identificados de este modo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Proteínas de mielina y asociadas con mielina Se sabe que los axones de las neuronas del SNC de mamífero adulto tienen muy limitada capacidad para regenerarse después de la lesión, mientras que los axones del sistema nervioso periférico (PNS) se regeneran rápidamente. Se ha sabido que la limitada capacidad para regenerarse de las neuronas del SNC es en parte de una propiedad intrínseca de los axones del SNC, pero también debido a un ambiente inadmisible. La mielina del SNC, si bien no es la única fuente de señales inhibidoras para el crecimiento neurítico, contiene numerosas moléculas inhibidoras que bloquean activamente el crecimiento axonal y en consecuencia constituye una barrera significativa a la regeneración. Se han identificado tres de las proteínas asociadas con mielina (MAP) : Nogo (también conocido como NogoA) es un miembro de la Ref.:215346 familia Reticulon de proteínas que tienen dos dominios de transmembrana; glicoproteína asociada con la mielina (MAG) es una proteína de transmembrana de la superfamilia Ig; y OMgp es una proteína de la repetición rica en leucina (LRR) con un glicosilfosfatidilinositol (GPI) anchor. Chen et al., Nature 403:434-39 (2000); GrandPre et al., Nature 417:439-444 (2000); Prinjha et al., Nature 403:383-384 (2000); McKerracher et al, Neuron 13:805-11 (1994); ang et al, Nature 417:941-4 (20020: Kottis et al J . Neurochem 82:1566-9 (2002) . Se ha descrito una porción de NogoA, Nogo66, como un polipéptido extracelular de 66 aminoácidos que se halla en todas las tres isoformas de Nogo.

A pesar de sus diferencias estructurales, se ha demostrado que las tres proteínas inhibidoras (que incluyen Nogo66) se unen al mismo receptor anclado en GPI, llamado Nogo (NgR; también conocido como receptor de Nogo 1 o NgRl) , y se ha propuesto que se podría requerir NgR para mediar las acciones inhibidoras de Nogo, MAG y OMgp. Fournier et al., Nature 409:341-346 (2001). También se han identificado dos homólogos de NgRl (NgR2 y NgR3) . US 2005/0048520 Al (Strittmatter et al.), publicado el 3 de marzo de 2005. Dado que NgR es una proteína de superficie celular anclada en GPI, es poco probable que sea un transductor de señales directos (Zheng et al., Proc . Nati. Acad. Sei. USA 102:1205-1210 (2005) ) . Otros han sugerido que el receptor de neurotrofina p75 actúa como un correceptor para NgR y proporciona el residuo transductor de señales en un complejo receptor (Wang et al., Nature 420:74-78 (2002); Wong et al., Nat . Neurosci. 5 : 1302-1308 (2002) ) .

PirB y ortólogos humanos El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) clase I fue identificado originalmente como una región que codifica una familia de moléculas que son importantes para el sistema inmune. Evidencias reciente han indicado que las moléculas MHC de clase I tienen funciones adicionales en el desarrollo del SNC adulto. Boulanger y Shatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004); US 2003/0170690 (Shatz y Syken) , publicado el 11 de setiembre de 2003. Se halló que muchos de los miembros de MHC clase I y sus compañeros de unión se expresan en las neuronas del SNC. Estudios genéticos y moleculares recientes se han centrado en las funciones fisiológicas del MHC clase I del SNC, y los resultados iniciales sugirieron que las moléculas de MHC clase I podrían participar en la plasticidad sináptica dependiente de la actividad, un proceso durante el cual la fuerza de conexiones sinápticas existentes aumenta o disminuye en respuesta a la actividad neuronal, seguido por alteraciones estructurales a largo plazo en los circuitos. Además, la región codificadora de MHC clase I también se ha vinculado genéticamente con una amplia variedad de trastornos con síntomas neurológicos y se considera que las funciones anormales de las moléculas de MHC clase I contribuyen a la alteración del desarrollo y plasticidad cerebral normal.

Uno de los receptores conocidos de MHC clase I en el establecimiento de la respuesta inmune es PirB, un polipéptido murino que fue descrito primero por Kubagawa et al., Proc. Nat . Acad. Sei. USA 94:5261-6 (1997). El PirB de ratón tiene varios ortólogos humanos, que son miembros de un receptor tipo inmunoglobulina de leucocitos, de la subfamilia B (LILRB) , y también se denominan como "trascriptos tipo inmunoglobulina" - (ILT). Los ortólogos humanos muestran homología significativa con la secuencia murina, de mayor a menor en el siguiente orden: LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3, LILRB2/ILT4, y, también como PirB, son todos receptores inhibidores. LILRB3/ILT5 (NP_006855) y LILRB1/ILT2 (NP_006660) fueron descritos primero por Samaridis y Colonna, Eur . J . Immunol . 27 (3 ): 660-665 (1997) LILRB5/ILT3 (NP_006831) ha sido identificado por Borges et al., J. Immunol. 159 (11) : 5192-5196 (1997) . LILRB2/ILT4 (también conocido como MIR10) , fue identificado por Colonna et al., J . Exp . Med . 186:1809-18 (1997). PirB y sus ortólogos humanos muestran un alto grado de variabilidad estructural. Las secuencias de varias formas de empalme alternativas están disponibles en EMBL/GenBank, que incluyen, por ejemplo, los siguientes números de acceso para ADNc de ILT4: ILT4-cll AF009634; ILT4- cll7 AF11566; ILT4-C126 AF11565. Como se indicó anteriormente, los polipéptidos de PirB/LILRB son receptores inhibidores de MHC clase I (MHCI) y son conocidos por su papel para la regulación de la activación de las células inmunes (Kubagawa et al., supra; Hayami et al., J. Biol . Chem. 272:7320 (1997); Takai et al., Immunology 115:433 (2005); Takai et al., Immunol . Re . 181:215 (2001); Nakamura et al. Nat . Immunol . 5:623 (2004); Liang et al., Eur. J. Immunol . 32:2418 (2002)).

Un estudio reciente de Syken et al. (Science 313:1795-800 (2006)) informó que PirB se expresa en subconjuntos de neuronas de todo el cerebro. En ratones mutantes que carecen de PirB funcional, la plasticidad de la dominancia ocular cortical (OD) está significativamente mejorada en todas las edades, lo que sugiere la función de PirB en la restricción de la plasticidad dependiente de la actividad en la corteza visual.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que interferir en la actividad de PirB mediante anticuerpos anti-PirB que bloquean funciones ayuda a impedir la inhibición del crecimiento neurítico por Nogo66 y mielina, y que el bloqueo de las actividades de PirB y NgR en forma concurrente produce una liberación casi completa de la inhibición de mielina.

En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado que se une esencialmente al mismo epítopo del PirB (LILRB) humano como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en YW259.2, YW259.9 y Y 259.12.

En otro aspecto, la invención se refiere un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado que compite por la unión al PirB (LILRB) humano con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en YW259.2, Y 259.9 y YW259.12.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado que comprende al menos una, dos o tres secuencias de la región hipervariable de una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: cadena pesada de YW259.2 (SEQ ID NO: 4 u 11), cadena pesada de Y 259.9 (SEQ ID NO: 5 o 12), y cadena pesada de YW259.12 (SEQ ID NO: 6 o 13) .

En una modalidad, el anticuerpo comprende todas las secuencias de la región hipervariable de la cadena pesada del anticuerpo YW259.2 (SEQ ID NO: 4 u 11) .

En otra modalidad, el anticuerpo comprende todas las secuencias de la región hipervariable de cadena pesada del anticuerpo YW259.9 (SEQ ID NO: 5 o 12) .

En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende todas las secuencias de la región hipervariable de la cadena pesada del anticuerpo Y 259.12 (SEQ ID NO: 6 o 13).

En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una cadena liviana.

En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende una, dos o tres secuencias de la región hipervariable de una cadena liviana de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7 o 15.

En aún otra modalidad, el anticuerpo comprende todas las secuencias de la región hipervariable de una cadena liviana que comprende la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7.

En una modalidad específica, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena liviana, donde la cadena pesada comprende una, dos o tres secuencias de la región hipervariable de una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: cadena pesada de Y 259.2 (SEQ ID NO: 4), cadena pesada de YW259.9 (SEQ ID NO: 5) y cadena pesada de YW259.12 (SEQ ID NO: 6), y/o la cadena liviana comprende una, dos o tres secuencias de la región hipervariable de una cadena liviana de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7.

En una modalidad adicional, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos YW259.2, YW259.9 y Y 259.12.

En otro aspecto, la invención se refiere un anticuerpo anti-PirB aislado en donde la forma IgG de longitud completa del anticuerpo se une específicamente PirB humano con una afinidad de unión de 5 nM o mejor, o 1 nM o mej or .

En una modalidad, el anticuerpo promueve la regeneración axonal, tales como la regeneración de las neuronas del SNC.

En otra modalidad, el anticuerpo, al menos parcialmente, impide la inhibición del crecimiento por Nogo66 y mielina.

En todos los aspectos, el anticuerpo con preferencia es un anticuerpo monoclonal, que puede ser, por ejemplo, be a anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de afinidad madura, un anticuerpo humano, o un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo o un inmunoconjugado .

En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-PirB de la presente .

En otros aspectos, la invención se refiere a vectores y células hospedero que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo (que incluye secuencias codificadoras de una o más cadenas de anticuerpo) en la presente. Las células hospedero incluyen hospederoes procarióticos , eucarióticos y mamíferos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener un anticuerpo anti-PirB, que comprende (a) expresar un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en una célula hospedera adecuada y (b) recuperar el anticuerpo.

En aún otro aspecto, la invención se refiere una composición que comprende un anticuerpo anti-PirB/ LILRB de la presente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En forma opcional, la composición comprende un segundo medicamento, en donde el anticuerpo anti-PirB/ LILRB es un primer medicamento. El segundo medicamento, por ejemplo, puede ser un inhibidor de NgR, tal como un anticuerpo anti-NgR.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a un kit que comprende un anti-anti-anticue po PirB/LILRB en la presente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para promover la regeneración del axón que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-PirB/ LILRB en la presente. Con preferencia, el sujeto es un paciente humano.

En modalidades, el método de tratamiento en la presente aumenta la supervivencia o neuronas y/o induce el crecimiento de las neuronas.

En aún otro aspecto, la invención se refiere un método de tratar una enfermedad neurodegenerativa, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-PirB/LILRB de la presente. La enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, se puede caracterizar por daño físico del sistema nervioso central e incluye, sin limitación, daño cerebral asociado con accidente cerebrovascular .

En una modalidad particular, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea , parálisis de Bell, miastenia gravis, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , esclerosis múltiple (MS) , atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, daño de nervios periféricos causado por lesión física (por ejemplo, quemaduras, heridas) o estados de enfermedad tales como diabetes, disfunción renal o por los efectos tóxicos de los agentes quimioterapéuticos usados para tratar el cáncer y SIDA, síndromes de disco invertebral herniado, roto o con prolapso, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas tales como las causadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, Síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, y enfermedad de Parkinson.

La invención además se refiere a un anticuerpo anti - idiotipo que se une específicamente a un anticuerpo anti-PirB de la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB muestran la secuencia de PirB de ratón (SEQ ID NO: 1) y la secuencia LILRB2 humana (SEQ ID NO: 2) .

Figuras 2A y 2B. El bloqueo de PirB revierte la inhibición, del crecimiento de CGN en AP-Nogo66 o mielina. Se incubó CGN de P7 de ratón disociado en PDL/laminina (control) , AP-Nogo66 o mielina para probar la inhibición del ensayo por estos sustratos. (Figura 2B A) Fotomicrografías representativas, (Figura 2B) un gráfico que mide la longitud de neuritas promedio (±SE) de un experimento representativo. Las neuronas cultivadas en PDL/laminina, AP-Nogo66 o mielina se cultivaron en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores de función para PirB (aPBl; 50 ug/ml) . aPBl redujo significativamente la inhibición por cada sustrato. (*p<0.01; Barras de escala, 50 µt?) Figuras 3A-3D. El bloqueo de PirB revierte la inhibición del crecimiento de CGN en AP-Nogo66 o mielina. Se incubó CGN de P7 de ratón disociado en PDL/laminina (control), AP-Nogo66, o mielina para la inhibición del ensayo por estos sustratos. Las fotomicrografías representativas se muestran en las Figuras 3A y 3C y un gráfico que mide la longitud de neuritas promedio (±SE) de un experimento representativo se muestra en las Figuras 3B y 3D. Las neuronas que crecen en PDL/laminina, AP-Nogo66, o mielina se cultivaron en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores de función para PirB (aPBl; 50 µg/ml) . aPBl redujo significativamente la inhibición por cada sustrato. (*p<0.01; Barras de escala, 50 µp?) Figuras 4A y 4B. Se requieren PirB y NgR para mediar el colapso de los conos de crecimiento por los inhibidores de mielina. Los conos de crecimiento de los axones DRG posnatales se trataron con medio solo (control) , mielina (3 ug/ml) , o AP-Nogo66 (100 nM) durante 30 minutos para estimular el colapso y se tiñeron con rodamina-faloidina para visualizar conos de crecimiento. (Figura 4A) Fotomicrografías representativas, (Figura 4B) un gráfico que mide el por ciento de colapso de los conos de crecimiento (±SEM) de experimentos acumulativos. Cada pérdida genética de NgR o inhibición de PirB por el tratamiento anti-PirB fue suficiente solo para impedir la actividad de colapso de los conos de crecimiento de mielina o AP-Nogo66. La inhibición de ambas vías también bloquean completamente el colapso. (Barras de escala, 50 µp?) Figuras 5A-5D. El bloqueo de PirB desinhibe parcialmente el crecimiento de neuritas en las neuronas DRG y en el sustrato AG. Las fotomicrografías representativas se muestran en las Figuras 5A y 5C; los gráficos que muestran la longitud de las neuritas promedio (±SE) de un experimento representativo se muestran en las Figuras 5B y 5D. (Figura 5A) y (Figura 5B) Las neuronas de DRG PIO disociados se incubaron en PDL/laminina, AP-Nogo66 o mielina en presencia o ausencia de anti-PirB. Hubo una reducción significativa de la inhibición por AP-Nogo66 y mielina por aPBl. (Figura 5C) y (Figura 5D) Los cultivos de CGN P7 disociados se incubaron en PDL/laminina o MAG-Fc, con o sin aPBl . Los anticuerpos para PirB redujeron la inhibición del crecimiento neurítico por MAG-Fc. (* p<0.01; Barras de escala, 200 µp? A, B; 50 µp? C) .

Figura 6. Secuencia de ADN de cadena pesada de YW259.2 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 8).

Figura 7. Secuencia de ADN de cadena pesada de YW259.9 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 9).

Figura 8. Secuencia de ADN de cadena pesada de YW259.12 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 3).

Figura 9. Secuencia proteica de la cadena pesada de YW259.2 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 4).

Figura 10. Secuencia proteica de la cadena pesada de Y 259.9 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 5).

Figura 11. Secuencia proteica de la cadena pesada de YW259.12 del anticuerpo anti-PirB (SEQ ID NO: 6).

Figura 12. Secuencia proteica de la cadena liviana de todos los anticuerpos YW259 (SEQ ID NO : 7) .

Figura 13. Capacidad del anticuerpo anti-PirB Y 259.2(IgG) para inhibir la actividad de PirB de ratón marcado con His.

Figura 14. Capacidad del anticuerpo anti-PirB YW259.9 (IgG) para inhibir la actividad de PirB de ratón marcado con His.

Figura 15. Capacidad del anticuerpo anti-PirB YW259.12 (IgG) para inhibir la actividad de PirB de ratón marcado con His.

Figura 16. Unión relativa de AP-Nogo66 de un panel de los anticuerpos anti-PirB, que incluyen YW259.2, YW259.9 y YW259.12.

Figuras 17A-17C. Alineamiento de las secuencias de cadena pesada de los anticuerpos anti-PirB YW259.2 (SEQ ID NO: 11); y YW259.9 (SEQ ID NO: 12) y YW259.12 (SEQ ID NO 13).

Las secuencias de CDR Hl, CDR H2 y CDR H3 están recuadradas, junto con los dominios de CDR H de acuerdo con Kabat, Chothia y los dominios de CDR H de contacto. Hum III es revelado como SEQ ID NO: 10.

Figuras 18A-18C. Alineamiento de las secuencias de cadena liviana de los anticuerpos anti-PirB Y 259.2 (SEQ ID NO: 15); YW259.9 (SEQ ID NO: 15) y Y 259.12 (SEQ ID NO: 15) . Las secuencias de CDR Ll, CDR L2 y CDR L3 están recuadradas, junto con los dominios de CDR L de acuerdo con Kabat, Chothia y los dominios de CDR L de contacto. HuKI es revelado como SEQ ID NO: 10.

Figura 19. C1QTNF5 (CTRP5 ; NP_05646) inhibe el crecimiento neurítico de las neuronas del ganglio de raíz dorsal y esta inhibición se reduce cuando se bloquea PirB por el anticuerpo YW259 que bloquea la función de PirB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Definiciones Los términos "receptor B tipo nmunoglobulina apareada" y "PirB" se usan en la presente en forma intercambiable, y se refiere a una secuencia nativa de la proteína inhibidora de ratón de 841 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Figura 1) (NP_035225) , y sus homólogos de secuencia nativa en las ratas y otros mamíferos no humanos, que incluyen todas las variantes naturales, tales como alternativamente variantes e isoformas empalmadas y alélicas, así como sus formas solubles. Para mayores detalles ver, Kubagawa et al., Proc Nati Acad Sci USA 94, 5261 (1997) .

Los términos "LILRB , " "ILT" y "MIR, " se usan en la presente en forma intercambiable, y se refieren a todos los miembros de "subfamilia B del receptor tipo inmunoglobulina de leucocitos" humana, que incluyen todas las variantes naturales, tales como las alternativamente variantes é isoformas empalmadas y alélicas, así como sus formas solubles. Los miembros individuales de esta subfamilia tipo B de los receptores LILR se denominan con números que siguen al acrónimo, tales como, por ejemplo, LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3 y ILIRB2/ILT4, donde una referencia a cualquier miembro individual, a menos que se indique de otro modo, también incluye la referencia a todas variantes naturales, tales como alternativamente variantes e isoformas empalmadas y alélicas, así como sus formas solubles. En consecuencia, por ejemplo, "LILRB2 , " "LIR2," y "MIR10" se usan en la presente en forma intercambiable y se refieren al polipéptido de 598 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (Figura 1) (NP_005865) , y sus variantes naturales, tales como alternativamente variantes e isoformas empalmadas y alélicas, así como sus formas solubles. Para detalles adicionales, ver Martin et al., Trends Immunol . 23, 81 (2002).

El término "PirB/LILRB" se usa en la presente para referirse en conjunto a las correspondientes proteínas de ratón y humanas y homólogos de secuencias nativas en otros animales no humanos, que incluyen todas las variantes naturales, tales como alternativamente variantes e isoformas empalmadas y alélicas, así como sus formas solubles.

El término "proteína asociada con la mielina" se usa en el sentido más amplio e incluye todas las proteínas presentes en la mielina del SNC que inhibe la regeneración neuronal, que incluye Nogo, MAG y OMgp.

"Aislado" cuando se usa para describir las diversas proteínas descritas en la presente, significa que la proteína ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que normalmente podrían interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos para la proteína, y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, la proteína se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por el uso de. un secuenciador de copa rotatoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, azul de Coomassie o con preferencia tinción de plata, o (3) a homogeneidad por técnicas de espectroscopia de masa o mapeo de péptidos . La proteína asilada incluye la proteína in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural de la proteína no estará presente. Normalmente, sin embargo, se preparará la proteína aislada por al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está comúnmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico en cuestión. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente de la forma o escenario en que se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico en consecuencia se distinguen de las moléculas de ácido nucleico ya que existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que normalmente expresa el ácido nucleico, donde por ejemplo. la molécula de ácido nucleico está presente en una ubicación cromosómica que es diferente de su localización en las células naturales.

Como se usa en la presente, el término "antagonista de PirB/LILRB" se usa para referirse a un agente capaz de bloquear, neutralizar, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades de PirB/LILRB. En particular, el antagonista de PirB/LILRB interfiere en las actividades inhibidoras asociada con mielina, de este modo mejora el crecimiento neurítico, y/o promueve el crecimiento, reparación y/o regeneración neuronal . En una modalidad preferida, el antagonista PirB/LILRB inhibe la unión de PirB/LILRB a Nogo66 y/o MAG y/o OMgp por la unión a PirB/LILRB. Los antagonistas de PirB/LILRB incluyen, por ejemplo, anticuerpos para PirB/LILRB y sus fragmentos de unión al antígeno, fragmentos truncados o solubles de PirB/LILRB, Nogo 66, MAG o OMgp que son capaces de secuestrar la unión entre PirB/LILRB y Nogo 66, o entre PirB/LILRB y MAG, o entre PirB/LILRB y OMgp y los inhibidores de molécula pequeña de la vía inhibidora relacionada PirB/LILRB. Los antagonistas de PirB/LILRB también incluyen moléculas de ARN de interferencia corto (ARNsi) capaces de inhibir o reducir la expresión de ARNm de PirB/LILRB. Un antagonista PirB/LILRB preferido es un anticuerpo anti -PirB/LILRB .

El término "anticuerpo" de la presente se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos intactos, monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que ellos exhiban la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, se dirigen contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que ellos se pueden sintetizar sin contaminarse con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden obtener por una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se puede obtener usando métodos de ADN recombinantes (ver por ejemplo, patente U.S. N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpo de fagos usando las técnicas descritas en por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadena (s) es idéntica u homologa con las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de otra especie particular o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de los anticuerpos, siempre que estos muestren la actividad biológica deseada (patente U.S. N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci.

USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo mono del viejo mundo, simio etc) , y secuencias de la región constante humana .

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia su región de unión al antígeno o variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, los fragmentos Fab 1 , F(ab')2 Y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de unión al antígeno así como un dominio constante de cadena liviana CL y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de la secuencia nativa humana) o sus variantes de la secuencia de aminoácidos. Con preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan con residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se obtienen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente el total de menos uno y normalmente dos dominios variables (Fab, Fab 1 , F(ab' )2# Fabc, Fv) , en el que todo o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son de la secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fe) , normalmente de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2 :593-596 (1992) .

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . La región hipervariable generalmente comprende los residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo alrededor de aproximadamente los residuos 24-34, 50-56, y 89-97 del dominio variable de cadena liviana y 31-35, 50-65, y 95-102 del dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32, 50-52, y 91-96 del dominio variable de cadena liviana y 26-32, 53-55, y 96-101 del dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). En ambos casos, los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, como se describe con más detalle a continuación. Residuos "estructurales" o de "FR" son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de las regiones hipervariables definidas en la presente .

Un "anticuerpo original" o "tipo salvaje" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que carece de una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos en comparación con una variante de anticuerpo que se describe en la presente. En consecuencia, el anticuerpo original tiene al menos una región hipervariable que difiere en la secuencia de aminoácidos de la correspondiente región hipervariable de una variante de anticuerpo que se describe en la presente. El polipéptido original puede comprender una secuencia nativa (es decir, natural) del anticuerpo (que incluye una variante alélica natural) , o un anticuerpo con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como inserciones, supresiones y/u otras alteraciones) de una secuencia natural. A lo largo de esta descripción, "tipo salvaje" "WT" "wt" y "original" o "progenitor" se usan en forma indistinta.

Como se usa en la presente, "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo original. Con preferencia, la variante de anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada o un dominio variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos que no se halla en la naturaleza. Las variantes necesariamente tienen menos de 100% de identidad o semejanza de secuencia con el anticuerpo original. En una modalidades preferida, la variante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75% a menos de 100% de identidad o semejanza de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena liviana o pesada del anticuerpo original, con más preferencia de aproximadamente 80% a menos de 100%, con más preferencia de aproximadamente 85% a menos de 100%, con más preferencia de aproximadamente 90% a menos de 100%, y con máxima preferencia de aproximadamente 95% a menos de 100%. La variante de anticuerpo es generalmente una que comprende una o más alteraciones de aminoácidos en una o más de sus regiones hipervariables o adyacentes a ellas.

Una "alteración de aminoácido" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Los ejemplos de alteraciones incluyen inserciones, sustituciones y supresiones. Una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada; con otro residuo de aminoácido diferente .

Un "reemplazo" de residuo de aminoácido se refiere a un residuo de aminoácido que reemplaza o sustituye otro residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos. El reemplazo de residuo puede ser un residuo de aminoácido natural o no natural .

Una "inserción de aminoácido" se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos predeterminada. La inserción de aminoácidos puede comprender una "inserción de péptido" en tal casa un péptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos se introduce en la secuencia de aminoácidos predeterminada. Cuando la inserción de aminoácidos involucra la inserción de un péptido, el péptido insertado se puede generar por mutagénesis aleatoria de modo que esta tenga una secuencia de aminoácidos que no existe en la naturaleza. Una alteración de aminoácido "adyacente a una región hipervariable" se refiere a la introducción o substitución de uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de una región hipervariable, de modo que al menos uno de los residuos de aminoácidos insertados o reemplazados forma un enlace peptídico con el residuo de aminoácido N-terminal o C-terminal de la región hipervariable en cuestión.

Un "residuo de aminoácido natural" es uno codificado por el código genético, generalmente seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg) ,-asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteína (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (lie) : leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ,- treonina (Thr) ; triptofano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) .

Un "residuo de. aminoácido no natural" de la presente es un residuo de aminoácido diferente de los residuos de aminoácidos naturales enumerados anteriormente, que es capaz de unir en forma covalente t residuos de aminoácidos (s) adyacentes en una cadena del polipéptido. Los ejemplos de residuos de aminoácidos no naturales incluye norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácido tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Para generar los residuos de aminoácidos no naturales, se pueden usar los procedimientos de Noren et al. Science 244:182 (1989) y Ellman et al., supra . En breves palabras, estos procedimientos involucran activar químicamente un AR t supresor con un residuo de aminoácido no natural seguido pro la transcripción y traducción in vitro del ARN.

A lo largo de esta descripción, se hace referencia al sistema de numeración de Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991) . En estos compendios, Kabat enumera muchas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos de cada subclase, y enumera los aminoácidos más comunes para cada posición del residuo en esa subclase. Kabat usa un método para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia enumerada, y este método para asignar residuos se ha vuelto estándar en el campo. En esta descripción se sigue el esquema de numeración de Kabat. Para los fines de esta invención, para asignar números de residuos a una secuencia de aminoácidos candidata del anticuerpo que no está incluido en el compendio de Kabat, se siguen los pasos siguientes. Generalmente, la secuencia candidata se alinea con cualquier secuencia de inmunoglobulina o cualquier secuencia de consenso de Kabat. Se puede realizar el alineamiento a mano, o por computadora usando programas de computación comúnmente aceptados; un ejemplo del programa es el programa Align 2. El alineamiento se puede facilitar por el uso de algunos residuos de aminoácidos que son comunes a la mayoría de las secuencias de Fab. Por ejemplo, las cadenas liviana y pesada normalmente tienen dos cisternas que tienen los mismos números de residuo; en el dominio VL las dos cisteína tienen normalmente los números de residuos 23 y 88, y en el dominio VH los dos residuos de cisteína normalmente se numeran 22 y 92. Los residuos estructurales generalmente, pero no siempre, tienen aproximadamente el mismo número de residuos, sin embargo las CDR variarán en tamaño. Por ejemplo, en el caso de una CDR de una secuencia candidata que es más larga que la CDR de la secuencia de Kabat a la que está alineada, normalmente se agregan sufijos al residuo para indicar la inserción de residuos adicionales (ver, por ejemplo residuos lOOabc de la Figura IB) . Para las secuencias candidatas que, por ejemplo, se alienan con la secuencia de Kabat para los residuos 34 y 36 pero no tienen residuo entre ellos para alinear con el residuo 35, el número 3 simplemente no se asigna a un residuo .

Como se usa en la presente, un anticuerpo con una "alta afinidad" es un anticuerpo que tiene una a KD, o constante de disociación, en el intervalo nanomolar (nM) o mejor. Una KD en el "intervalo nanomolar o mejor" se puede indicar con X nM, donde X es un número de aproximadamente 10.

Un anticuerpo de "afinidad madura" es uno con una o más alteraciones en una o más de sus CDR que producen una mejora de la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee estas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madura preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso .picomolares para el antígeno blanco. Los anticuerpos de afinidad madura se producen usando ciertos procedimientos conocidos en el arte. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por la transposición del dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describe en:: Barbas et al. Proc Na . Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 ( 7 ): 3310- 9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992).

Un "sitio de unión con el antígeno funcional" de un anticuerpo es uno que es capaz de unir un antígeno blanco. La afinidad de unión del antígeno de sitio de unión del antígeno no es necesariamente tan fuerte la del anticuerpo original del cual deriva el sitio- de unión del antígeno, pero la capacidad de unir el antígeno puede ser medible usando una variedad de métodos conocidos en para evaluar la unión del anticuerpo a un antígeno.

Un anticuerpo que tiene una "característica biológica deseada" de un anticuerpo diseñado es uno que posee una o más características biológicas de este anticuerpo que lo distingue de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno .

A fin de detectar anticuerpos que se unan a un epítopo de un antígeno unido con un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) .

El término "fago filamentoso" se refiere a una partícula viral capaz de desplegar un polipéptido heterogéneo en su superficie y incluye, sin limitación, fl, fd, Pfl y M13. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable tal como tetraciclina (por ejemplo, "fd-tet"). Varios sistemas de despliegue en fagos filamentosos son bien conocidos por los expertos en el arte (ver, por ejemplo, Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980), Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985); y Parmley y Smith Gene 73: 305-318 (1988) ) .

El término "inmunopurificación" se usa para referirse a las múltiples rondas del proceso de detección para la identificación y aislamiento de compuestos que portan fagos, tales como anticuerpos, con alta afinidad y especificidad con un blanco.

El término "ARN interférente corto (AR si) " se refiere a los ARN bicatenarios pequeños que interfieren en la expresión génica. Los ARNsi son un intermediarios de la interferencia de ARN, el ARN bicatenario del proceso silencia los genes homólogos. Los ARNsi normalmente están compuestos de dos ARN monocatenarios de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud que forman un dúplex, que puede incluir proyecciones monocatenarias . El procesamiento del ARN bicatenario por un complejo enzimático, por ejemplo por polimerasas, origina la escisión del ARN bicatenario para producir los ARNsi. La cadena antisentido del ARNsi es usada por un complejo de silenciamiento de interferencia de ARN (ARNi) para guiar la escisión del ARNm, de este modo promueve la degradación de ARNm. Para silenciar un gen usando los ARNsi, por ejemplo en una célula de mamífero, se selecciona una región de apareamiento de bases que evita la oportunidad de complementariedad con un ARNm no relacionado. Los complejos de silenciamiento de ARNi han sido identificados en el arte, tal como, por ejemplo, en Fire et al., Nature 391:806-811 (1998) y McManus et al., Nat . Rev. Genet . 3 (10) : 737-47 (2002) .

El término "ARN de interferencia (ARNi)" se usa en la presente para referirse al ARN bicatenario que produce la degradación catalítica de los ARNm específicos y de este modo se pueden usar para inhibir/reducir la expresión de un gen particular.

El término "polimorfismo" se usa en la presente para referirse a más de una de las formas de un gen o una de sus porciones (por ejemplo, variantes alélicas) . Una porción de un gen del que existen al menos dos formas diferentes se denomina como una "región polimórfica" del gen. Una secuencia genética específica de una región polimórfica de un gen es un "alelo" . Una región polimórfica puede ser un solo nucleótido, que difiere en alelos diferentes o puede tener varios nucleótidos de largo.

Como se usa en la presente, el término "trastorno" en general se refiere a cualquier condición que debería beneficiarse por un tratamiento con antagonistas de PirB/LILRB2, tales como un anticuerpo anti-PirB, que incluye cualquier condición patológica que se beneficiaría con una terapia de regeneración del axón y/o una mejora de plasticidad sináptica del sistema nervioso. Lo ejemplos no limitantes de trastornos tratados en la presente incluyen, sin limitación, enfermedades y condiciones que se benefician con la mejora del crecimiento neurítico, promoción del crecimiento, reparación o regeneración neuronal, que incluyen trastornos neurológicos, tales como nervios lesionados físicamente y enfermedades neurodegenerativas. Los trastornos incluyen específicamente daño físico al sistema nervioso central (por ejemplo lesión de médula espinal y trauma cefálico) ; lesión cerebral asociada con accidente cerebrovascular; y trastornos neurológicos relacionados con la neurodegeneración, tales como, por ejemplo, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia gravis, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, esclerosis múltiple (MS) , síndromes de disco invertebral herniado, roto o con prolapso, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, daño de nervios periféricos causado por lesión física o estados de enfermedad tales como diabetes, neuropatías periféricas tales como las causadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, Síndrome de Guillain-Barre , enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, o enfermedad de Parkinson.

Los términos "tratamiento" , "tratar" y "terapia" como se usan en la presente se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. El tratamiento o la administración consecutiva se refiere al tratamiento en al menos una base diaria sin interrupción del tratamiento por uno o más días. El tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de modo intermitente, se refiere al tratamiento que no es consecutivo, sino más bien de naturaleza cíclica.

El término "prevenir neurodegeneracion" como se usa en presente incluye (1) la capacidad de inhibir evitar la neurodegeneracion en los pacientes recién diagnosticados como portadores de una enfermedad neurodegenerativa o con riesgo de desarrollar una nueva enfermedad neurodegenerativa y (2) la capacidad de inhibir o evitar neurodegeneracion adicional en pacientes que ya están padeciendo o tienen síntomas de una enfermedad neurodegenerativa.

El término "mamífero" como se usa en la presente se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, que incluye los seres humanos, primates no humanos superiores, roedores, domésticos y de granja tales como vacas, caballos, perros y gatos. En las modalidades preferidas de la invención, el mamífero es un ser humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener resultados terapéuticos beneficiosos o deseados (que incluyen la prevención) . Una cantidad efectiva se puede administrar en una o más administraciones.

Como se usa en la presente, las expresiones "célula" "línea celular" y "cultivo celular" se usan en forma indistinta y todas estas denominaciones incluyen la progenie. En consecuencia, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula y los cultivos sujetos primarios derivados de ella sin tener cuenta el número de transferencias. También se considera que toda la progenie no puede ser precisamente idéntico al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o involuntarias. El término "progenie" se refiere a cualquiera y toda la descendencia de cada generación posterior a una célula o línea celular transformada originalmente. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica analizada en la célula transformada. Cuando se deseen denominaciones distintas, será claro a partir del contexto.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir la brechas, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de varias maneras que están dentro de la experiencia del arte, pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen asignar algoritmos necesarios para obtener el alineamiento máximo respecto de la longitud completa de las secuencias comparadas. Para los fines de la presente, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2, que fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación del usuario en U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se registra bajo U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen para el programa ALIGN-2 y no varían.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación puede ser determinada con facilidad por los expertos en la técnica y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas superiores para el apareamiento apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para aparearse de nuevo cuando están presentes las cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. A mayor grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia de hibridable, mayor temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas inferiores lo harían menos. Para detalles adicionales y la explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .

"Condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente, se pueden identificar por las siguientes: (1) emplean fuerza iónica baja y alta temperatura para lavado, por ejemplo 0,015 M de cloruro de sodio/0,0015 M de citrato de sodio/0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50° C; ( 2 ) emplea durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina sérica bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de buffer de fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42° C; o (3) emplea 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml) , 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con un lavado de 10 minutos a 42° C en 0,2 x de SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C seguido por un lavado de rigurosidad alta de 10 minutos que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55° C.

Las "condiciones de rigurosidad moderada" se pueden identificarse en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la incubación a 37 °C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de de esperma e salmón fragmentado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 °C. Los profesionales expertos reconocerán cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar los factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "secuencias control" se refiere las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretora está unida operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificadora si esta afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si esta se ubica de modo de facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN unidas están contiguas, y, en el caso de un líder secretora, en forma contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no deben estar contiguos. La unión se obtiene por el ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si los sitios no existen, los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos se usan de acuerdo con la práctica convencional .

Una "pequeña molécula" se define en la presente tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1000 Dalton, con preferencia menor de aproximadamente 500.

B. Producción de anticuerpos anti-PirB/LILRB Los anticuerpos anti-PirB de la presente invención se pueden producir por métodos conocidos en el arte, que incluyen técnicas de tecnología de ADN recombinante . i ) Preparación de antígeno Los antígenos solubles o sus fragmentos, opcionalmente conjugados con otras moléculas se pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos. En las moléculas de transmembrana, tales como receptores, se pueden usar sus fragmentos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. En forma alternativa, las células que expresan las moléculas de transmembrana se pueden usar como inmunógeno . Las células pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo líneas de células cancerosas) o pueden ser células que han sido transformadas por técnicas recombinantes para expresar las moléculas de transmembrana. Otros antígenos y sus formas útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos del arte. ( ii ) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales con preferencia se originan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser de utilidad conjugar el antígeno relevante para una proteína que es inmunogénica en las especies inmunizadas, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, t iroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o RiN=C=NR, donde R y Ri son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados por la combinación, por ejemplo, de 100 ug o 5 ug de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante de Freund completo y la inyección de la solución en forma intradérmica en múltiples sitios. Un mes después a los animales se les aplica un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante de Freund completo por la inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 después se extrae sangre a los animales y se analiza el suero para determinar el título de anticuerpos. Se aplica refuerzo a los animales hasta que el título llega a la meseta. Con preferencia, se aplica el refuerzo al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se obtienen en un cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. Asimismo, se usan agentes de agregación tales como alumbre para aumentar la respuesta inmune, (iii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se puede preparar por métodos de ADN recombinante (Patente Estadounidense No. 4.816.567). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, se inmuniza como se describió anteriormente en la presente para estimular linfocitos que produce o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización.

Alternativamente los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

Luego los linfocitos se fusionan con las células de mieloma mediante un agente de fusión adecuada, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp.59- 103 (Academic Press, 1986)) .

Las células del hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que con preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplo si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina y timidita (medio HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de las células deficientes en Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan en forma eficiente, sostienen la producción de alto nivel de anticuerpos estable por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murinas, tal como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Mariland USA. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al, Anticuerpo monoclonal Production Techniques y Applications, pp . 51-63 ( arcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el cual crecen las células del hibridoma se ensaya para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Con preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vi ro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima (ELISA) .

Después de que se identifican las células del hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución límite y cultivar por métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células del hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal .

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ej . , por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y livianas del anticuerpo) . Las células del hibridoma sirven como una fuente preferida del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, que luego se transfectan en las células hospedero tales como células de E. coli, células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedero recombinantes . La producción de anticuerpos recombinantes se describirá con más detalle a continuación.

En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fagos generadas mediante las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks etal., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la prodücción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por transposición génica (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria e recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). En consecuencia, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas del hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicional para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo por sustitución de la secuencia codificadora por las cadenas pesada y/o livianas de los dominios constantes en lugar de las secuencias murinas homologas derivadas del clon del hibridoma (Patente estadounidense No. 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por la unión en forma covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina total o parte de la secuencia codificadora del polipéptido no inmunoglobulina.

Normalmente los polipéptidos no inmunoglobulina están sustituidos en los dominios constantes de un anticuerpo, o ellos están sustituidos en los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente . ( iv) Anticuerpos humanizados y humanos Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en este, provenientes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan como residuos de "importación", que normalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por la sustitución de las secuencias de la región hipervariable para las secuencias de las CDR de roedores o CDR correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente y anticuerpos humanos en los que se sustituyen algunos residuos de la CDR y posiblemente algunos residuos FR con residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto pesado como liviano, que se usan para obtener los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza frente a la biblioteca completa de las secuencias conocidas del dominio variable humano. La secuencia humana que está más próxima a la de roedor luego se acepta como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método usa una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo de las cadenas livianas o pesadas. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

Además es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en el arte. Se dispone de programas de computación que ilustran y despliegan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influye en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor e importar las secuencias de modo de obtener las características del anticuerpo deseado, tal como aumento de afinidad para los antígenos blanco. En general, los residuos de la CDR están directamente y más sustancialmente involucrados para influir en la unión al antígeno.

En forma alternativa, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J.sub.H) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal produce una inhibición completa de la producción de anticuerpos monoclonales . La transferencia de la matriz del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en los ratones mutantes de línea germinal originará la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992) . Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de las bibliotecas de despliegue en fago (Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al, J. MoL Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). La generación de anticuerpos humanos a partir de las bibliotecas de despliegue en fago del anticuerpo también se describen a continuación, (v) Fragmentos de anticuerpo Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaban por medio de la digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al ., Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24:107-117 (1992), y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo estos fragmentos en la actualidad se pueden producir directamente por células hospedantes recombinante . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpos descrita anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab' )2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)).). En otra modalidad que se describe en el siguiente ejemplo, el F(ab')2 se forma usando el cierre de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula de F(ab')2. De acuerdo con otro método, los fragmentos de F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células hospedero recombinantes . Otras técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional experto. En otras formas d realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple Fv (scFv) . Ver WO 93/16185. (vi) Anticuerpos multiespecífieos Los anticuerpos multiespecífieos tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, donde los epítopos son usualmente de antígenos diferentes. Si bien estas moléculas normalmente solo se unirán a dos epítopos diferentes (es decir, anticuerpos biespecífieos , BsAbs) , los anticuerpos con especificidades adicionales - tales como los anticuerpos triespecífieos están comprendidos en esta expresión usada en la presente. Los ejemplos de BsAbs incluyen los que tienen un brazo dirigido contra PirB/LILRB2 y otro brazo dirigido contra Nogo o MAG o OMgp . Un ejemplo adicional de BsABs incluye los que tienen un brazo dirigido contra PirB/LILRB2 y otro brazo dirigido contra NgR.

Los métodos para preparar anticuerpos biespecífieos son conocidos en el arte. La producción tradicional de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de las inmunoglobulinas tienen especificidades diferentes (Millstein et al, Nature, 305: 537 (1983)) . Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza usualmente por pasos de cromatografía de afinidad, es bastante laboriosa y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J.( 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un método diferente los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación del ant icuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es con preferencia con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones de bisagra, CH2 , y CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de cadena pesada (CH1) , con el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se deseara, de la cadena liviana de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo hospedero adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las modalidades en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas para la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar la secuencia codificadora para dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales produce altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significación particular.

En una modalidad preferida de este método, los anticuerpos biespecífieos están compuestos de una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama y un par de cadena pesada-cadena liviana de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de las combinaciones de la cadena de inmunoglobulina no deseada, ya que la presencia de una cadena liviana de la inmunoglobulina de la molécula en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un método fácil de separación. Este método se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecífieos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro método descrito en WO96/27011, la interfaz entre una par de moléculas de anticuerpo se puede manipular genéticamente para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinante . La interfaz preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ej . , tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadena (s) laterales grandes creadas en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo por el reemplazo de las cadenas laterales grandes de aminoácidos con unas más pequeñas (por ej . , alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero respecto de otros productos finales no deseados tales como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo uno de los anticuerpos del heteroconjugado se pueden acoplar a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo han sido propuestos para dirigir las células del sistema inmune a las células no deseadas (Patente Estadounidense No. 4.676.980), y para tratamiento de la infección con VIH (WO 91/00360, O 92/200373) . Los anticuerpos del heteroconjugado se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos de reticulación conveniente. Tales agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en el arte, y se describen en la Patente Estadounidense No. 4,676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecífieos a partir de los fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo los anticuerpos biespecífieos se pueden preparar mediante la unión química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab 1 generados luego se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB luego se reconvierte al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado del Fab '-TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecífieos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas Los fragmentos de Fab'-SH también se pueden recuperar directamente de de E. coli y se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecífieos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab' )2 del anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab1 se secretó en forma separada de la E. coli y sometió al acoplamiento químico in vitro para formar el anticuerpo biespecífico .

Se han descrito varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecífieos directamente del cultivo de células recombinantes . Por ejemplo los anticuerpos biespecíficos se han producido mediante cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos del cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también se puede usar para la producción de los homodímeros del anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecífieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) por un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de este modo se forman dos sitios de unión con el antígeno. Se ha informado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecífieos por el uso de los dímeros Fv (Fvs) de cadena simple. Ver Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994) .

Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Por ejemplo se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tuft et al. J . Immunol . 147: 60 (1991). (vii) Manipulación genética de la función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de modo de mejorar la efectividad del anticuerpo. Por ejemplo, los residuos de cisteína se pueden introducir en la región de Fe, de este modo se permite la formación de enlaces disulfuro intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener mejor capacidad de internalización y/o aumento de la destrucción celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral aumentada también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en olff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, se puede manipular genéticamente un anticuerpo que tiene regiones de Fe duales y de este modo puede presentar aumento de lisis de complemento y capacidades de ADCC. Ver Stevenson et al Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . (viii) Fusiones del epítopo de unión al receptor de reciclaje En ciertas modalidades de la invención, es deseable usar un fragmento de anticuerpo, más que un anticuerpo intacto, por ejemplo para aumentar la penetración en el tumor. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo a fin de aumentar su vida media sérica. Esto se puede obtener, por ejemplo, por la incorporación de un epítopo de unión al receptor de reciclaje en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo por la mutación de la región apropiada del fragmento del anticuerpo o por la incorporación del epítopo en una marca del péptido que luego se fusiona al fragmento del anticuerpo en cualquier extremo o en la mitad, por ejemplo, por síntesis de ADN o péptido) .

El epítopo de unión al receptor de reciclaje con preferencia constituye una región donde alguno o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles del dominio de Fe se transfieren a una posición análoga del fragmento del anticuerpo. Aun con más preferencia, tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio de Fe se transfieren. Aún con más preferencia, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fe (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o V.sub.H, o más de una de esta región del anticuerpo. En forma alternativa, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fe y se transfiere a la región CL o región VL o ambas, del fragmento del anticuerpo. ( ix) Otras modificaciones covalentes de anticuerpos Las modificaciones covalentes de los anticuerpos están incluidas en el alcance de esta invención. Pueden ser pos síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula por la reacción de residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminal . Ejemplos de modificaciones covalentes se describen en la patente estadounidense No. 5.534.615, que se incorpora específicamente en la presente como referencia. Un tipo preferido de modificación covalente del anticuerpo comprende una unión del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol o polioxialquilenos , de la manera que se expone en las patentes estadounidenses Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. (x) Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos del anticuerpo sintético En una modalidad preferida, la invención proporciona un método de generar y seleccionar nuevos anticuerpos mediante un método de despliegue en fagos único. El método incluye la generación de bibliotecas de fagos del anticuerpo sintético sobre la base un modelo estructural único, diseño de suficiente diversidad dentro de los dominios variables, despliegue de polipéptidos que tienen dominios variables diversificados, selección de anticuerpos candidatos con alta afinidad para dirigirse al antígeno y aislamientote los anticuerpos seleccionados.

Los detalles de los métodos de despliegue en fagos se pueden hallar, por ejemplo, en WO03/102157 publicada el 11 de diciembre de 2003, cuya descripción completa está expresamente incorporada en la presente como referencia.

En un aspecto, las bibliotecas de anticuerpos usadas en la invención se pueden generar por la mutación de al menos una CDR de un dominio variable del anticuerpo en posiciones accesible al solvente y/o altamente diversas. Algunas o todas las CDR se pueden mutar usando los métodos provistos en la presente. En algunas modalidades, puede ser preferible generar diversas bibliotecas de anticuerpos al mutar posiciones de CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 para formar una biblioteca única o al mutar posiciones de CDRL3 y CDRH3 para formar una biblioteca única o al mutar posiciones de de CDRL3 y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 para formar una biblioteca única.

Una biblioteca de dominios variables del anticuerpo se puede generar, por ejemplo, realizando mutaciones en posiciones accesibles al solvente y/o altamente diversas de CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Otra biblioteca se puede generar realizando mutaciones en CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Estas bibliotecas también se pueden usar en conjunto con otras para generar ligadores de afinidad deseada. Por ejemplo, después de una o más rondas de selección de bibliotecas de cadena pesada para unirse a un antígeno blanco, se puede reemplazar una biblioteca de cadena liviana en la población de ligadores de la cadena pesada en adicionales rondas de selección para aumentar la afinidad de los ligadores.

Con preferencia, se crea una biblioteca por la sustitución de aminoácidos originales con variantes de aminoácidos en la región CDRH3 de la región variable de la secuencia de la cadena pesada. La biblioteca resultante puede contener una pluralidad de secuencias del anticuerpo, en donde la diversidad de secuencia está principalmente en la región CDRH3 de la secuencia de la cadena pesada.

En un aspecto, la biblioteca se crea en el contexto de la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado o la secuencia de los aminoácidos estructurales de la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado. Con preferencia, la biblioteca se crea por la sustitución de al menos los residuos 95-100a de la cadena pesada con aminoácidos codificados por el conjunto del codón DVK, en donde el conjunto del codón DVK se usa para codificar un conjunto de variantes de aminoácidos para cada una de estas posiciones. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 7. En algunas modalidades, se crea una biblioteca por la sustitución de al menos los residuos 95 -100a de la cadena pesada con aminoácidos codificados por el conjunto de codones DVK y NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 6 (NNK) . En otra modalidad, se crea una biblioteca crea por la sustitución de al menos los residuos 95 -100a de la cadena pesada con aminoácidos codificados por los conjuntos de codones DVK y NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 5 (NNK) . Otro ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos que ' es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (NNK) 6. Otros ejemplos de secuencias de oligonucleótidos adecuadas puede ser determinados por los expertos en el arte de acuerdo con los criterios descritos en la presente.

En otra modalidad, se utilizan diseños de CDRH3 diferentes para aislar ligadores de alta afinidad y aislar ligadores para una variedad de epítopos. El intervalo de longitudes de CDRH3 generado en esta biblioteca es 11 a 13 aminoácidos, aunque también se pueden generar longitudes diferentes. La diversidad de H3 se puede expandir por el uso de los conjuntos de codones NNK, DVK y NVK, así como diversidad más limitada en N y/o C-terminal.

También se puede generar diversidad en CDRH1 y CDRH2. Los diseños de las diversidades de CDR-H1 y H2 siguen la estrategia de dirigirse a imitar el repertorio de anticuerpos naturales como se describió con la modificación que centra la diversidad más estrechamente apareada a la diversidad natural que en el diseño previo.

Para la diversidad de CDRH3 , se pueden construir bibliotecas múltiples en forma separada con diferentes longitudes de H3 y luego se combinan para seleccionar los ligadores para los antígenos blanco. Las múltiples bibliotecas se pueden mezclar y separar usando métodos de selección en soporte sólido y clasificación en solución como se describe previamente y a continuación en la presente. Se pueden emplear múltiples estrategias de separación. Por ejemplo, una variación involucra la separación del blanco unido a un sólido, seguido por una marca que puede estar presentes del polipéptido de fusión (por ejemplo, marca anti-gD) y seguido por otras separación del blanco unido al sólido. En forma alternativa, las bibliotecas se pueden separar primero en un blanco unido a una superficie sólida, los ligadores eluidos luego se separan usando la unión en fase de solución con concentraciones decrecientes del antígeno blanco. La utilización de combinaciones de diferentes métodos de separación proporciona la minimización de la selección de únicamente secuencias altamente expresadas y proporciona la selección de numerosos clones de afinidad diferente.

Los ligadores de alta afinidad para el antígeno blanco se pueden aislar de las bibliotecas. La limitación de la diversidad de la región H1/H2 disminuye la degeneración aproximadamente 104 a 105 veces y permite que la mayor diversidad de H3 proporcione ligadores de afinidad más alta. La utilización de bibliotecas con diferentes tipos de diversidad de CDRH3 (por ejemplo, mediante DVK o NVT) proporciona el aislamiento de los ligadores que pueden unir a epítopos diferentes de un antígeno blanco.

De los ligadores aislados de las bibliotecas combinadas como se describió anteriormente, se ha descubierto que también se puede aumentar la afinidad al proporcionar diversidad limitada en la cadena liviana. La diversidad de la cadena liviana se genera en esta modalidad de la siguiente manera en CDRL1 : la posición de aminoácido 28 está codificada por RDT; la posición de aminoácido 29 está codificada por RKT; la posición de aminoácido 30 está codificada por RVW; la posición de aminoácido 31 está codificada por AW; la posición de aminoácido 32 está codificada por THT; opcionalmente , la posición de aminoácido 33 está codificada por CTG ; en CDRL2 : la posición de aminoácido 50 está codificada por KBG; la posición de aminoácido 53 está codificada por AVC; y opcionalmente, la posición de aminoácido 55 está codificada por GMA ; en CDRL3 : la posición de aminoácido 91 está codificada por TMT o SRT o ambas; la posición de aminoácido 92 está codificada por DMC; la posición de aminoácido 93 está codificada por RVT; la posición de aminoácido 94 está codificada por NHT; y la posición de aminoácido 96 está codificada por TWT o YKG o amabas .

En otra modalidad, se genera una biblioteca o bibliotecas con diversidad en las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3. En esta modalidad, la diversidad de CDRH3 se genera mediante una variedad de longitudes de las regiones H3 y usando principalmente los conjuntos de codones XYZ y NNK o NNS. Las bibliotecas se pueden formar usando oligonucleótidos individuales y se mezclan o. los oligonucleótidos se pueden mezclar para formar un subconjunto de bibliotecas. Las bibliotecas de esta modalidad se pueden clasificar contra blanco unido al sólido. Los clones aislados de múltiples clases se pueden analizar en cuanto a especificidad y afinidad usando ensayos ELISA. Para la especificidad, los clones se pueden analizar contra los antígenos blanco deseados así como otros antígenos no blanco. Estos ligadores del antígeno blanco luego se pueden analizar para determinar la afinidad en ensayos de ELISA de competición de. unión en solución o ensayo de competición puntual. Los ligadores de alta afinidad se pueden aislar de la biblioteca que utiliza conjuntos de codones XYZ preparados como se describió anteriormente. Estos ligadores se producen fácilmente como anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno con alto rendimiento en cultivo celular.

En algunas modalidades, puede redeseable generar bibliotecas con una mayor diversidad de longitud de la región CDRH3. Por ejemplo, puede redeseable generar bibliotecas con regiones CDRH3 de aproximadamente 7 a 19 aminoácidos.

Los ligadores de alta afinidad aislados de las bibliotecas de estas modalidades se producen fácilmente en cultivos bacterianos y eucarióticos con alto rendimiento. Los vectores se pueden diseñar para eliminar fácilmente secuencias tales como marcas gD, secuencia de componentes de la proteína de envoltura viral y/o agregar secuencias de la región constante para proporcionar la producción de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión al antígeno con alto rendimiento.

Una biblioteca con mutaciones en CDRH3 se puede combinar con una biblioteca que contiene variantes de versiones de otras CDR, por ejemplo CDRL1, CDRL2 , CDRL3 , CDRH1 y/o CDRH2. En consecuencia, por ejemplo, en una modalidad, una biblioteca de CDRH3 se combina con una biblioteca de CDRL3 creada en el contexto de la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado con variantes de aminoácidos en las posiciones 28, 29, 30,31, y/o 32 usando conjuntos de codones predeterminados. En otra modalidad, una biblioteca con mutaciones en CDRH3 se puede combinar con una biblioteca que comprende variantes de los dominios variables de cadena pesada de CDRH1 y/o CDRH2. En una modalidad, la biblioteca de CDRH1 se crea con la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado con variantes de aminoácidos en las posiciones 28, 30, 31, 32 y 33. Una biblioteca de CDRH2 se puede crear con la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado con variantes de aminoácidos de las posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58 usando los conjuntos de conjuntos predeterminados. (xi) Mutantes de anticuerpo Los nuevos anticuerpos generados de las bibliotecas de fago también se pueden modificar para generar mutantes de anticuerpos con mejores propiedades físicas, químicas y/o biológicas respecto del anticuerpo original. Cuando se usa como ensayo un ensayo de actividad biológica, el anticuerpo mutante con preferencia tiene una actividad biológica en el ensayo de elección que es al menos aproximadamente 10 veces mejor, con preferencia al menos aproximadamente 20 veces mejor, con más preferencia al menos aproximadamente 50 veces mejor, y algunas veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mejor, que la actividad biológica del anticuerpo original en este ensayo. Por ejemplo, un anticuerpo mutante anti-PirB/LILRB con preferencia tiene una afinidad de unión por PirB/LILRB que es al menos aproximadamente 10 veces más fuerte, con preferencia al menos aproximadamente 20 veces más fuerte, con más preferencia al menos aproximadamente 50 veces más fuerte, y algunas veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces más fuerte, que la afinidad de unión del anticuerpo original.

Para generar el anticuerpo mutante, se introducen una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo sustituciones) en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo original. En forma alternativa, o adicional, se pueden introducir una o más alteraciones (por ejemplo sustituciones) de los residuos de la región estructural del anticuerpo original donde ellas originan una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo mutante para el antígeno de la segunda especie de mamífero. Los ejemplos de residuos de la región estructural por modificar incluyen los que unen directamente al antígeno en forma no covalente (Amit et al. (1986) Science 233:747-753); interactúan/efectúan la conformación de una CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917); y/o participan en la interfaz VL - VH (EP 239 400B1) . En ciertas modalidades, la modificación de uno o más de estos residuos de la región estructural producen un aumento de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Por ejemplo, se pueden alterar de aproximadamente una a aproximadamente cinco residuos estructurales en esta modalidad de la invención. Algunas veces, esto puede ser suficiente para producir un anticuerpo mutante adecuado para usar en ensayos preclínicos, aun cuando ninguno de los residuos de la región hipervariable se ha alterado. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo mutante comprenderá alteraciones adicionales de la región hipervariable.

Los residuos de la región hipervariable alterada se pueden cambiar en forma aleatoria, en especial donde la afinidad de unión inicial del anticuerpo original es tal que las mutantes producidas aleatoriamente se pueden analizar fácilmente.

Un procedimiento útil para la generar los anticuerpo mutantes se llama "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, uno o más residuos de la región hipervariable se reemplazan con residuos de alanina o polialanina para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la segunda especie de mamífero. Estos residuos de la región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional con las sustituciones luego se refinan por la introducción adicional o de otras variantes en o para los sitios de sustitución. De este modo, mientras el sitio de introducción de una variación de una secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Las mutantes ala producidas de esta manera se analizan en cuanto a su actividad biológica como se describe en la presente .

Normalmente se debería comenzar con una sustitución conservadora tal como las que se muestran a continuación bajo el título de "sustituciones preferidas". Si las sustituciones producen un cambio en la actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) , por lo tanto se introducen cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones" en la siguiente tabla, o como se describe a continuación en referencia a las clases de aminoácidos y se analizan los productos.

Sustituciones preferidas: Residuo Ejemplos de Sustitucio original sustituciones nes preferidas Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val; met; leu ala ; phe ; norleucina Leu (L) norleucina; ile; ile val; met; ala,- phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; leu ala; tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr ; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; leu phe; ala; norleucine Se pueden obtener modificaciones aún más sustanciales de las propiedades biológicas de un anticuerpo por la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupo basados en las propiedades comunes de sus cadenas laterales : (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr, asn, gln; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: his, lys, arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio un miembro de uno de estas clases por otra clase.

En otra modalidad, los sitios seleccionado para la modificación son de afinidad madura usando el despliegue en fago (ver anteriormente) .

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las mutantes de la secuencia de aminoácidos se preparan por una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen pero sin limitación, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada antes o una versión no mutante del anticuerpo original. El método preferido para preparar mutantes es mutagénesis dirigida al sitio (ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 82 : 488) .

En ciertas modalidades, el anticuerpo mutante solo tendrá sustituido un residuo de la región hipervariable . En otras modalidades, dos o más residuos de . la región hipervariable del anticuerpo original estarán sustituidos, por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente diez sustituciones de la región hipervariable.

Normalmente, el anticuerpo mutante con mejores propiedades biológicas tendrá una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 75% de identidad o semejanza de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada o liviana del anticuerpo original, con más preferencia al menos 80%, con más preferencia al menos 85%, con más preferencia al menos 90%, y con máxima preferencia al menos 95%. La identidad o semejanza con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticas (es decir, residuo igual) o similar (es decir, residuo de aminoácido del mismo grupo basado en las propiedades de la cadena lateral común, ver anteriormente) con los residuos del anticuerpo original, después de alinear las secuencias e introducir brechas, si corresponde, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones N-terminal, C-terminal o internas en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se interpretará como que afecta la identidad o semejanza de secuencia.

Después de la producción del anticuerpo mutante, se determina la actividad biológica de esta molécula con respecto al anticuerpo original. Como se indicó anteriormente, esto puede involucrar la determinación de la afinidad de unión y/u otras actividades biológicas del anticuerpo. En una modalidad preferida de la invención, se prepara un panel de anticuerpos mutantes y se analizar en cuanto a afinidad de unión para el antígeno o un fragmento de este. Uno o más de los anticuerpos mutantes seleccionados de esta prueba inicial se someten opcionalmente a uno o más ensayos adicionales de actividad biológica para confirmar que el anticuerpo mutante con afinidad de unión aumentada sea efectivamente útil, por ejemplo para ensayos preclínicos.

El anticuerpo mutante así seleccionado se puede someter a modificaciones adicionales, a menudo de acuerdo con el uso pretendido del anticuerpo. Las modificaciones pueden incluir la alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión de polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes tales como las elaboradas a continuación. Con respecto a las alteraciones de la secuencia de aminoácidos, se elaboraron los ejemplos de modificaciones anteriores. Por ejemplo, cualquier residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo mutante también puede estar sustituida, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. A la inversa, se pueden agregar enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv) . Otro tipo de mutante de aminoácidos tiene un patrón de glicosilación alterado. Esto se puede obtener por la supresión de uno o más residuos de carbohidrato hallados en el anticuerpo, y/o agregado de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos está normalmente N-ligada u 0- ligada. Los N- ligados se refieren a la unión del residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias del tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo la presencia de cualquiera de estas secuencias del tripéptido de un polipéptido origina un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación 0-ligada se refiere a la unión de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5 -hidroxiprolina o 5 -hidroxilisina . La adición de los sitios de glicosilación al anticuerpo se logra en forma conveniente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias del tripéptido descrito anteriormente (para los sitios de glicosilación N-ligados) . La alteración también se puede realizar por la adición, o sustitución de uno o más residuos serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original ( (para los sitios de glicosilación O-ligados) . (xii) Producción de anticuerpos recombinantes Para la producción recombinante de anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ej . , por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y livianas del anticuerpo) . Muchos vectores están disponibles. Los componentes del vector en general incluyen pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción (por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No. 5.534.615, incorporada específicamente en la presente como referencia) .

Las células hospedero adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente son las células procarióticas , levadura o células eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este fin incluye eubacteria, tales como organismos Gramnegativos o Grampositivos , por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un hospedero de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), si bien otra cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes .

Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o levaduras son hospedero de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más comúnmente usada entre los microorganismos hospedero eucarióticos inferiores. Sin embargo, numerosos géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son de utilidad en la presente, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospederoes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, hospederoes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedero adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados también derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales que corresponden a célula hospedera de insecto permisivas tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la f uta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles al público, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y los virus se pueden usar como el virus de la presente de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, papa, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como hospederoes .

Sin embargo, existe mayor interés en las células de vertebrados y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de las líneas celulares de células hospedero de mamíferos son la línea CV1 del riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) , línea de riñon embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)), células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/ -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) , células de riñon de mono verde africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587) , células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) , células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065), tumor mamario de ratón, células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)), células MRC 5, células FS4 y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2) .

Las células hospedero se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo y se cultivan en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedero usadas para producir el anticuerpo de esta invención se puede cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles en el mercado tal como Ham FIO (Sigma) , medio mínimo esencial ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para el cultivo de las células hospedero. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102 : 255 (1980), Patentes Estadounidenses Nos. 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, o 5.122.469, WO 90/03430, WO 87/00195, o Patente Estadounidense Re. 30.985 se puede usar como medio de cultivo para las células hospedero. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuando fuera necesario con hormonas y/ otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , buffer (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como fármaco GENTAMICINA™ , oligoelementos (definidos como compuestos orgánicos usualmente presentes en concentraciones finales de intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede incluir también en concentraciones apropiadas que deben ser conocidas para los expertos en el arte. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las que se usan previamente con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y será evidente para el profesional experto .

Cuando se usan técnicas recombinantes , el anticuerpo se puede producir en forma intracelular en el espacio periplásmico o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce en forma intracelular, como un primer paso, los desechos particulados, de las células hospedero o células lisadas se eliminan por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración . Cuando el anticuerpos se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero mediante un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de los pasos precedentes para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes accidentales La composición del anticuerpo preparada a partir de las células se pueden purificar mediante por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, la técnica de purificación preferida es la cromatografía de afinidad. La adecuación de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies e isotipos de cualquier dominio Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar los anticuerpos basados en las cadenas pesadas ?? , ?2 , o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para los isotipos de ratón y para ?3 humanos (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es con más frecuencia agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivilnil) benceno permiten los caudales de flujo mas rápidos y los tiempos de procesamiento más cortos que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ cromatografía en una resina de intercambio aniónica o catiónica (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque , SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

C. Usos de anticuerpos anti-PirB/LILRB Se considera que los anticuerpos anti-PirB/ LILRB de la presente invención con de utilidad como agentes para aumentar la supervivencia o inducir el crecimiento de las células nerviosas. Estos son, en consecuencia, útiles en la terapia de trastornos degenerativos del sistema nervioso ("enfermedades neurodegenerativas"), que incluyen, por ejemplo, daño físico al sistema nervioso central (médula espinal y cerebro) ; daño físico asociado con accidente cerebrovascular; y trastornos neurológicos relacionados con la neurodegeneración, tales como, por ejemplo, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia gravis, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , esclerosis múltiple (MS) , atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, daño de nervios periféricos causado por lesión física (por ejemplo, quemaduras, heridas) o estados de enfermedad tales como diabetes, disfunción renal o por los efectos tóxicos de los agentes quimioterapéuticos usados para tratar el cáncer y SIDA, síndromes de disco invertebral herniado, roto o con prolapso, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas tales como las causadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, Síndrome de Guillain-Barre , enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, o enfermedad de Parkinson .

Los anticuerpos anti-PirB/LILRB de la presente también son útiles como componentes del medio de cultivo para usar en el cultivo de células nerviosas in vitro.

Finalmente, las preparaciones que comprenden los anticuerpos anti-PirB/LILRB de la presente son útiles como estándares de los ensayos de unión competitiva cuando se marcan con yodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcas de espín y similares.

Las formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos anti-PirB/LILRB de la invención se prepara para conservación por la mezcla del compuesto identificado (tales como un anticuerpo) que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales aceptables para uso fisiológico (.Remington ; The Science y Practice of Pharmacy 20th edition (2000) ) , en forma torta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas y incluyen a los buffer tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas , polímeros tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, azúcares de alcohol tales como manitol o sorbitol, contraiones formadores de sal tales como sodio, y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, Pluronics o PEG.

Los anticuerpos anti-PirB/LILRB que se usan para administración in vivo deben ser estériles. Estos se logra fácilmente por la filtración a través de membranas de filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas se pueden colocar en un recipiente que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Los anticuerpos anti-PirB/LILRB de la presente invención opcionalmente se pueden combinar o administrar en combinación con factores neurotróficos que incluyen NGF, NT-3, y/o BDNF y usar con otras terapias convencionales para trastornos nerviosos degenerativos. Además, los anticuerpos anti-PirB de la presente invención se pueden administrar en forma ventajosa en combinación con los inhibidores de NgR, tales como anticuerpos, moléculas o péptidos pequeños, que bloquean la unión de Nogo-66, MAG y/o OMgp to NgR.

La vía de administración está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por las vías intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional , administración tópica o por sistemas de liberación sostenida como se indica a continuación.

Para uso intracerebral, los compuestos se pueden administra en forma continua por infusión en los reservorios líquidos del SNC, aunque la inyección en bolo es aceptable. Los compuestos con preferencia se administran en los ventrículos del cerebro o se introducen de otro modo en el SNC o líquido espinal. La administración se puede realizar por un catéter permanente usando un medio de administración continuo tal como una bomba o se puede administrar por implantación, por ejemplo, implantación intracerebral de un vehículo de liberación sostenida. Más específicamente, los compuestos se pueden inyectar a través de cánulas implantadas en forma crónica, o infundidas en forma crónica con la ayuda de minibombas osmóticas. Están disponibles las bombas subcutáneas que administran proteínas mediante una tubería pequeña a los ventrículos cerebrales. Las bombas altamente sofisticadas se pueden rellenar a través de la piel y su velocidad de administración se puede ajustar sin intervención quirúrgica. Los ejemplos de protocolos de administración adecuados y sistemas de administración que involucran un dispositivo de bomba subcutánea o infusión intracerebroventricular continua mediante un sistema de administración de fármaco totalmente implantado como los que se usan para la administración de dopamina, agonistas de dopamina y agonistas colinérgicos a los pacientes con Alzheimer modelos animales para la enfermedad de Parkinson descritos por Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl . , 24:271 (1987); y DeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143 (1987).

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeable en forma de artículos definidos, por ej . , películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (Patente Estadounidense No. 3.773.919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato (Sidman, et al., 1983, Biopolymers 22:547), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer, et al., 1981, J. Biomed.

Mater. Res. 15:167; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98), acetato de etilenvinilo (Langer, et al., Id.) o ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico (EP 133,988A) Las composiciones de liberación sostenida también incluyen compuestos capturados en liposomas, que se pueden preparar por métodos conocidos per se. (Epstein, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324A). Normalmente los liposomas son de tipo unilaminar (aproximadamente 200-800 Angstrom) en los que el contenido de lípidos es mayor de aproximadamente 30 mol. El % de colesterol y la proporción seleccionada se ajustan para la terapia óptima.

Una cantidad efectiva de un compuesto activo empleado en forma terapéutica dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la condición del paciente. Por consiguiente será necesario para el terapeuta titular la dosis y modificar la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 ug/kg hasta 100 mg/kg o más, de acuerdo con los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el clínico administrará un compuesto activo hasta alcanzar una dosis que repare, mantenga y en forma óptima, reestablezca la función neuronal . El progreso de esta terapia se controla fácilmente con ensayos convencionales.

Otros detalles de la invención se ilustran con los siguientes ejemplos no limitantes.

Ej emplol Clonación de expresión de LILRB2 Para identificar nuevos receptores para las proteínas inhibidoras de mielina, se realizó un método de clonación. Como cebo, se generaron constructos que se fusionaron a la fosfatasa alcalina (AP) a los extremos N-y/o C-terminal de los siguientes inhibidores de mielina caracterizados (se usa ADNc humano) : Nogo66, dos dominios inhibidores adicionales de NogoA (NiR<delta>D2 y NiG<delta>20) (Oertle T, J Neurosci . 2003, 23(13): 5393-406), MAG, y OMgp . Estos constructos se transíectaron en 293 células para producir el medio acondicionado (en DMEM/2% FBS) que contiene las proteína cebo. La biblioteca de ADNc usada en la prueba estaba compuesta de clones de ADN humano de longitud completa en vectores preparados para la expresión generados por Origene. Estos ADNc se compilaron, ordenaron y mezclaron. Las mezclas de aproximadamente 100 ADNc se transfectaron en forma transitoria en las células COS7.

En particular, en el Día 1, las células COS7 se sembraron a una densidad de 85.000 células por pocilio en placas de 12 pocilios. En el día 2, 1 mg de los ADNc mezclados se transfectaron por pocilio usando el reactivo de transfección basado en lípidos FuGENE 6 (Roche) . En el día 4, se realizó el análisis. En breves palabras, se eliminó el medio de cultivo de las células y se reemplazó con 0,5 mi del medio acondicionado 293 células que contiene proteínas cebo de fusión a AP (20-50 nM) . Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Luego las células se lavaron 3 veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , se fijaron durante 7 minutes con 4% de paraformaldehído, se lavaron 3 veces en HEPES-salina amortiguada (HBS) , e inactivaron con calor a 65 °C durante 90 minutos para destruir la actividad endógena de AP. Las células se lavaron una vez en buffer AP (100 mM de NaCl , 5 mM de MgCl2 100 mM de Tris pH 9,5), y se incubaron en sustrato cromogénico (Western Blue, Promega) , y se analizaron para determinar la presencia de producto de reacción una hora después de la incubación y otra vez después de la incubación toda la noche. Las células positivas se identificaron por la presencia de precipitado azul oscuro sobre la superficie de la membrana. Las mezclas positivas también se degradaron para identificar los clones positivos individuales por rondas posteriores de análisis.

A partir del análisis, se identificaron los siguientes impactos positivos: El cebo MAG-AP produjo 4 impactos positivos. Uno fue previamente caracterizado como el receptor Nogo (Fournier et al., Nature 409, 342-346 (2001). Dos de estos aciertos fueron énzimas de procesamiento glicolítico, y se estimaron de improbable relevancia. El cuarto se anotó como "ARNm de proteína hipotética de Homo sapiens del clon 643 (LOC57228)". El análisis más minucioso del ADNc reveló un ORF alternativo que era homólogo a la proteína SMAG previamente descrita.

El cebo AP-Nogo66 produjo 2 impactos positivos. Uno fue previamente caracterizado como el receptor Nogo. El otro era "ARNm, miembro 2 (LILRB2) , subfamilia B (con dominios TM y ITIM) , del receptor tipo inmunoglobulina de Homo sapiens" (SEQ ID NO: 2) . Este gen también se conoce con múltiples nomenclaturas alternativas, que incluyen MIG10, ILT4, y LIR2 (.Kubagawa et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 94:5261-6 (1997); Colonna et al., J. Ex . Med. 186:1809-18 (1997)).

Ejemplo 2 Preparación y análisis de anticuerpos bloqueantes de la función PirB Anticuerpos ¿logueantes de la función de PirB Los anticuerpos contra PirB se generaron por inmunopuri icación de una biblioteca de anticuerpos de fago sintético contra el dominio extracelular de PirB (W. C. Liang et al., J" Mol Biol 366, 815 (2007)). Luego los clones del anticuerpo (10 pg/ml) se analizaron in vitro para determinar su capacidad de bloquear la unión de AP-Nogo66 (50 nM) a las células COS7 que expresan PirB. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias de la cadena pesada y liviana de varios anticuerpos PirB (anti-mPirB) anti-ratón Y 259 se muestran en las Figuras 6-16, y 17 y 18. Las Figuras 17 y 18 también muestran las secuencias de la región hipervariable dentro de las cadenas pesada y liviana de Y 259.2, YW250.9 y YW259.12, respectivamente.

Ensayo de crecimiento neurítico Placas de 96 pocilios precubiertas con poli-D-lisina (Biocoat, BD) se cubrieron con mielina (0,75 toda la noche o con AP-Nogo66 o MAG-Fc (150-300 ng/mancha) durante dos horas y luego se trataron con laminita (10 ug/ml en F-12) durante 2 horas (cultivos de CGN) o 4 horas (cultivos de DRG) . Las neuronas cerebelares P7 de ratón se cultivaron como se describió previamente (B. Zheng et al., Proc Nati Acad Sci U S A 102, 1205 (2005)) y se sembraron a razón de -2X104 células por pocilio. Las neuronas DRG PIO de ratón se cultivaron como se describió previamente (Zheng et al., 2005, supra) y se sembraron a razón de -5X103 células por pocilio. Los cultivos se incubaron durante 22 horas a 37 °C con 5% de C02, y luego se fijaron con 4% de paraformaldehído/10% de sacarosa y se tiñeron con anti-ß???- tubulina (TuJl, Covance) . En cada experimento, todas las condiciones se llevaron a cabo en seis pocilios replicados, en los cuales se midieron longitudes de neurita máximas y se determinaron los promedios entre los seis pocilios. Se realizó cada experimento al menos tres veces con resultados similares. Los valores de p se determinaron usando la prueba de Student .

Ensayo de colapso de los conos de crecimiento Se aislaron los explantes de DRG por la disección de DRG de ratones de 3 semanas y se los cortó en tercios . Cada explante de DRG luego se cultivó en un PDL individual (100 g/ml) y pocilio recubierto con laminina (10 µg/ml) de una placa de 8 pocilios. A las 72 horas después de la siembra, los explantes se incubaron con AP-Nogo66 (100 nM) o mielina (3 µg/ml) durante 30 minutes para estimular el colapso. Los cultivos se fijaron con 4% de paraformaldehído/10% de sacarosa y luego se visualizaron los conos de crecimiento por la tinción con rodamina- faloidina (Molecular Probes) y se clasificaron para el colapso. Se determinó el colapso de los conos de crecimiento promedio al promediar al menos 3 pocilios replicados.

Resultados Para averiguar si PirB es un receptor funcional para Nogo66, nosotros nos centramos en las neuronas granulares de cerebelo (CGN) juveniles (P7) , en las cuales se inhibe el crecimiento neurítico cuando se cultiva en AP-Nogo66 (K.C. Wang et al., Nature 420,74 (2002)). Se ha demostrado que las CGN adultas expresan PirB (J. Syken et al., Science 313,1795 (2006)), y nosotros hallamos que también se produce en las CGN juveniles evaluados por RT-PCR, inmunohistoquímica e hibridación in situ (datos no mostrados) .

Primero, se analiza la capacidad de un ectodominio soluble de PirB (PirB-His) para interferir la inhibición de AP-Nogo66 in vitro. Como se muestra en la Figura 2A, AP-Nogo66 inhibe el crecimiento neurítico de CGN P7 a aproximadamente 66% de niveles de controles no tratados. La inclusión de PirB-His en este ensayo revirtió la inhibición de AP-Nogo66, con el crecimiento neurítico que retorna esencialmente a los niveles control . Estos resultados son similares a los informados usando el ectodominio de NgR para bloquear la inhibición con Nogo66 (B Zgeng et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005); A. E. Fournier, et al., J". Neurosci . 22, 8876 (200); Z. L. He et al., Neuron 38, 177 (2003)), e indican que PirB puede unir el dominio funcional inhibidor de Nogo66, pero no determinar si el PirB endógeno en CGN media la inhibición con AP-Nogo66.

En consecuencia, se generaron anticuerpos para PirB (anti-PirB) capaces de interferir en la interacción de PirB-Nogo66. Usando una plataforma de despliegue en fago (W.C.

Liang et al., J. Mol. Biol. 366, 815 (2007)) dirigida contra el dominio extracelular de PirB, se analizaron múltiples clones para determinar su capacidad de bloquear la unión de AP-Nogo66 al PirB. El clon Y 259.2 (de aquí en adelante denominado como aPBl) , que interfirió mejor en la unión de AP-Nogo66-PirB, presentó una Kd de 5 nM para PirB (ver, Figuraes 13-16) . aPBl no tuvo efecto sobre el crecimiento axonal basal de las CGN. Sin embargo, aPBl redujo significativamente la inhibición con AP-Nogo66 o mielina en CGN cultivadas (Fig. 2B) , lo que impide el crecimiento neurítico 59% desde 41% en AP-Nogo66, y 62% desde 47% en mielina. Se observaron resultados similares usando MAG como sustrato inhibidor, o usando un tipo celular diferente (neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRG) ) (Fig. 5). Estos resultados avalan que PirB es un receptor funcional que media la inhibición del crecimiento neurítico a largo plazo.

Para confirmar este resultado, se analizó su la eliminación genética de PirB de la superficie celular también revirtió la inhibición con AP-Nogo66 o mielina, al cultivar neuronas de ratón PirBTM, en las que se eliminaron cuatro exones que codifican el dominio de transmembrana y parte del dominio intracelular de PirB (J. Syken et al., Science 313,1795 (2006))). Se cultivaron las CGN provenientes de ratones PirBTM o compañeros de camada tipo salvaje (WT) sobre el sustrato control, AP-Nogo66 o mielina. Respecto del sustrato control (PDL/laminina) , las neuronas PirBTM se comportaron de modo similar las neuronas WT (Fig. 2C) . Sin embargo, el crecimiento neurítico de las neuronas PirBTM fue mucho menos inhibido que en las neuronas WT con AP-Nogo66 o mielina. En AP-Nogo66, en crecimiento dde las neuronas WT fue inhibido al 50% de los niveles control, mientras que las neuronas PirBTM fueron inhibidas solo 66%. De modo similar, respecto de la mielina, las neuronas WT fueron inhibidas al 52% de los nivele de control, mientras que las neuronas PirBTM fueron inhibidas solo 70%. Nuevamente, nosotros observamos una desinhibición parcial similar de las neuronas DRG de PirBTM tanto con mielina como AP-Nogo66 (Fig. 5) . Estos hallazgos indican que PirB es efectivamente un receptor funcional para la inhibición mediada por AP-Nogo66 y mielina del crecimiento neurítico. Sin embargo, la pérdida de actividad de PirB no impide completamente el crecimiento.

Debido a que NgR ha sido descrito previamente como un receptor para los inhibidores de mielina, es posible que PirB y NgR actúen juntos para mediar la inhibición del crecimiento neurítico. Para tratar este tema, las funciones de PirB y NgR se bloquearon juntas en las CGN por el cultivo de las neuronas de ratones sin NgRe en presencia de anti-PirB. Como se indicó previamente (B. Cheng et al., PNAS 2005, supra) , el crecimiento neurítico NgR-/- CGN se inhibió con AP-Nogo66 o mielina en la misma medida que en las neuronas WT (50% y 49%; Figura 3) . El tratamiento con anticuerpo aPBl de las neuronas NgR+/- revirtió parcialmente la inhibición por AP-Nogo66 o mielina, como se observó anteriormente para el tratamiento con aPBl de las neuronas WT. De modo similar, el tratamiento con aPBl de las neuronas NgR-/- revirtió parcialmente la inhibición con AP-Nogo66, pero no proporcionó ninguna inhibición adicional que la observada por el tratamiento con aPBl de las neuronas NgR+/- o neuronas WT. En contraste, el tratamiento con aPBl de las neuronas NgR+/-restauró el crecimiento neurítico en la mielina a casi los niveles de control. En consecuencia, parece que se requiere PirB, pero no NgR, para la inhibición del sustrato por APNogo66 en las CGN, pero solo en parte. Más aún PirB y NgR en conjunto contribuyen a la inhibición de sustrato impartida por la mielina.

Debido a que se sabe que se requiere NgR para el colapso de los conos de crecimiento en respuesta a los diversos inhibidores de mielina (J.E. Kim et al., Neuron 44, 439 (2004), O.Chivatakarn et al., J". Neurosci . 27, 7117 (2007) ) , es posible que PirB también esté involucrado en esta respuesta más aguda. Se usaron neuronas sensoras del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de ratones de 3 semanas, con expresión confirmada de PirB, para este experimento. Se ha hallado que los conos de crecimiento en este sistema de cultivo presentan un alto nivel basal de colapso (-30%) , que también aumenta por la incubación con APNogo66 o mielina (Fig. 4) . Este colapso fue anulado en gran parte en las neuronas NgR-/-. Además, el bloqueo de la función de PirB con aPBl también fue suficiente para revertir el colapso de los conos de crecimiento por estos inhibidores. La inhibición de las vías PirB y NgR juntas (usando el tratamiento con aPBl de las neuronas de ratones NgR-/-) también revirtió por completo el colapso de los conos de crecimiento, pero este resultado no fue informativo debido a que el tratamiento solo dio un rescate completo en este ensayo.

En otro experimento, C1QTNF5 inhibió el crecimiento neurítico de las neuronas granlares cerebrales (CGN) , y esta inhibición fue revertida por el anticuerpo YW259.2 que bloquea la función de PirB. Los resultados se muestran en la Figura 19.

En conjunto, estos resultados avalan un nuevo papel para PirB como un receptor necesario para la inhibición de las neuritas por los extractos de mielina y más específicamente por los inhibidores asociados a mielina Nogo66 y MAG . En efecto, PirB parece ser un mediador más significativo de la inhibición del sustrato que NgR, ya que la eliminación de la función de PirB sola (sea en forma genética o mediante anticuerpos) desinhibe parcialmente el crecimiento en los extractos de mielina y los inhibidores de mielina, mientras que la eliminación genética de NgR solo no desinhibe ninguno de estos sustratos. Sin embargo, NgR parece cumplir un papel complementario en la mediación de la inhibición con los extractos de mielina (pero no Nogo66) , ya que la eliminación genética de NgR puede aumentar la desinhibición causada por los anticuerpos anti-PirB en la mielina (pero no en Nogo66) . Nuestros hallazgos pueden ayudar a explicar la sorprendente falta regeneración aumentada de CST en ratones deficientes en NgR (J.E. Kim et al., supra, B. Zheng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005)), a pesar de la regeneración informada o el brote observado en roedores infundidos con el ectodominio de NgR. Li et al., J. Neurosci. 24, 10511 (2004)). En consecuencia, podría ser necesario eliminar tanto PirB como NgR para obtener regeneración significativa in vivo. Además, debido al sustrato Nogo66, la eliminación genética de NgR no aumenta adicionalmente desinhibitorio parcial de la eliminación de PirB, es probable que existan receptores de unión adicionales para Nogo66.

Si bien PirB parece ser un receptor más significativo para la inhibición del sustrato que NgR, la inactivación de PirB o NgR solo es suficiente para bloquear el colapso agudo de los conos de crecimiento causado por la adición de inhibidores de mielina. Esta observación sugiere que el colapso es un proceso más exigente, que requiere las actividades de PirB y NgR, qye actúan tanto en paralelo como en conjunto. En este contexto, es de interés que se haya demostrado recientemente que los receptores de PirB y NgR cumplen funciones similares para limitar la plasticidad de conexiones sinápticas en la corteza visual: en ratones que carecen de cualquier receptor, el cierre del ojo durante un período de desarrollo crítico causa un fortalecimiento excesivo de las conexiones por medio del ojo abierto (J. Syken et al., 2006, supra, A. . McGee et al., Science 309, 2222 (2005), supra) . Los mecanismos responsables del efecto de ambos receptores para mediar el colapso de los conos de crecimiento también podría explicar la similitud de su papel en la plasticidad de la dominancia ocular.

La incapacidad de los axones del adulto para regenerarse después de una lesión es el principal obstáculo para recuperar función después de las lesiones traumáticas del SNC. Se ha postulado que la regeneración potencial declina a medida que la capacidad de plasticidad sináptica se vuelve limitada con la edad, en un esfuerzo por restringir el desarrollo de las conexiones sintéticas excesivas o exuberantes. Esta hipótesis consigue respaldo a partir del hallazgo de que PirB, previamente implicado en la limitación de la plasticidad sináptica durante el desarrollo y en la adultez (J. Syken et al., 2006, supra), también es un mediador de la inhibición axonal por mielina, que proporciona un paralelo con el hallazgo de que NgR, implicado inicialmente en la inhibición axonal, de modo similar regula la plasticidad sináptica (S. Li et al., J. Neurosci. 24, 10511 (2004) ) .

Nuestros hallazgos también amplían el repertorio de potenciales ligandos de PirB más allá del alcance de las moléculas de MHC clase I que incluyen los inhibidores de la regeneración neuronal . A la inversa, debido a que la supresión genética del inhibidor de mielina conocido Nogo o MAG produce solo una modesta reducción de la inhibición por mielina - lo que implica que otras inhibiciones están presentes - nuestros hallazgos plantean la posibilidad de que las moléculas de MHCI, que se expresan normalmente en bajos niveles en los oligodendrocitos , pueden ser reguladas por aumento después de la lesión y contribuir a la inhibición del crecimiento en conjunto con Nogo y MAG en mielina central.

El mecanismo por el cual las señales de PirB para inhibir el crecimiento axonal en respuesta a los inhibidores de mielina no está claro. Sin embargo, se ha demostrado que PirB antagoniza la función de los receptores de integrina (S. Pereira et al., J. Immunol . 173:5757 (2004)), y recluta las fosfatasas SHP-1 y SHP-2) alguno o ambos de estos eventos podría atenuar el normal crecimiento neurítico. El bloqueo de la actividad de PirB, usando los anticuerpos anti-PirB de la presente o por otros medios, proporciona un nuevo objetivo importante para las intervenciones terapéuticas para estimular la regeneración axonal .

Todas las referencias mencionadas en toda la descripción están expresamente incorporadas en la presente en su totalidad como referencia.

Si bien presente invención se ha descrito con referencia a las que se consideran modalidades específicas, se considera que la invención no está limitada a las modalidades. A la inversa, se considera que la invención abarca varias modificaciones y equivalentes que se incluyen dentro del alcance y espíritu de las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado que se une a un mismo epítopo del PirB(LILRB) humano que un anticuerpo caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste en YW259.2, YW259.9 y YW259.12.

2. Un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado que compite por la unión al PirB(LILRB) humano con un anticuerpo caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste en YW259.2, YW259.9 y YW259.12.

3. Un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado aislado caracterizado porque comprende al menos una, dos o tres secuencias de la región hipervariable de una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: cadena pesada de YW259.2 (SEQ ID NO: 4 u 11) , cadena pesada de YW259.9 (SEQ ID NO: 5 o 12) y cadena pesada de YW259.12 (SEQ ID NO: 6 o 13).

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende todas las secuencias de la región hipervariable de cadena pesada del anticuerpo YW259.2 (SEQ ID NO: 4 u 11) .

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende todas las secuencias de la región hipervariable de cadena pesada del anticuerpo YW259.9 (SEQ ID NO: 5 o 12) .

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende todas las secuencias de la región hipervariable de la cadena pesada del anticuerpo Y 259.12 (SEQ ID NO: 6 o 13).

7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque además comprende una cadena liviana.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cadena liviana comprende una, dos o tres secuencias hipervariables de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 15.

9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cadena liviana comprende todas las secuencias de la región hipervariable de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7 o 15.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consisten en los anticuerpos YW259.2, Y 259.9 y Y 259.12.

11. Un anticuerpo anti -PirB/LILRB aislado caracterizado porque la forma IgG de longitud completa del anticuerpo se une específicamente al PirB(LILRB) humano con una afinidad de unión de 5 nM o mejor.

12. Un anticuerpo anti-PirB/LILRB aislado caracterizado porque la forma IgG de longitud completa del anticuerpo se une específicamente al PirB(LILRB) humano con una afinidad de unión de 1 nM o mejor.

13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque promueve la regeneración axonal .

1 . El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque promueve la regeneración de las neuronas del SNC.

15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque al menos parcialmente, impide la inhibición del crecimiento neurítico por Nogo66 y mielina.

16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .

17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de afinidad madura, un anticuerpo humano y un anticuerpo biespecífico .

18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.

19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque es un inmunoconjugado .

20. Un polinucleótido caracterizado porque codifica un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o una cadena pesada o liviana de este.

21. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20.

22. El vector de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es un vector de expresión.

23. Una célula hospedera caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 21.

24. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es procariótica.

25. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es eucariótica.

26. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque es de mamífero.

27. Un método para obtener un anticuerpo anti-PirB/ LILRB, caracterizado porque comprende (a) expresar un vector de conformidad con la reivindicación 22 en una célula hospedera adecuada, y (b) recuperar el anticuerpo.

28. El método dé conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la célula hospedera es procariótica .

29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la célula hospedera es eukariótica.

30. Una composición caracterizada porque comprende un anticuerpo anti-PirB/LILRB de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende un segundo medicamento, en donde el anticuerpo anti-PirB/LILRB es un primer medicamento.

32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el segundo medicamento es un inhibidor de NgR.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el inhibidor de NgR es un anticuerpo anti-NgR.

34. Un kit caracterizado porque comprende un ant-i-anticuerpo anti-PirB/ LILRB de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

35. Un método para promover la regeneración del axón, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-PirB/LILRB de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el sujeto es un paciente humano.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque aumenta la supervivencia de las neuronas.

38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque se induce el crecimiento de las neuronas.

39. Un método de tratar una enfermedad neurodegenerativa, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-PirB/LILRB de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad neurodegenerativa se caracteriza por daño físico en el sistema nervioso central.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la enfermedad neurodegenerativa es daño cerebral asociado con accidente cerebrovascular .

42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea , parálisis de Bell, miastenia gravis, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , esclerosis múltiple (MS) , atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, daño de nervios periféricos causado por lesión física (por ejemplo, quemaduras, heridas) o estados de enfermedad tales como diabetes, disfunción renal o por los efectos tóxicos de los agentes quimioterapéuticos usados para tratar el cáncer y SIDA, síndromes de disco invertebral herniado, roto o con prolapso, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas tales como las causadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, Síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.

43. Un anticuerpo anti-idiotipo caracterizado porque se une específicamente a un anticuerpo anti-PirB/LILRB de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.