EA043015B1 - Антитела против сортилина и способы их применения - Google Patents

Антитела против сортилина и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA043015B1
EA043015B1 EA201792221 EA043015B1 EA 043015 B1 EA043015 B1 EA 043015B1 EA 201792221 EA201792221 EA 201792221 EA 043015 B1 EA043015 B1 EA 043015B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sortilin
antibody
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201792221
Other languages
English (en)
Inventor
Арнон Розенталь
Тина Швабе
Майкл Карнеллас
Энтони Купер
Роберт Пейхал
Original Assignee
ЭЛЕКТОР ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ЭЛЕКТОР ЭлЭлСи filed Critical ЭЛЕКТОР ЭлЭлСи
Publication of EA043015B1 publication Critical patent/EA043015B1/ru

Links

Description

Настоящее изобретение относится к антителам против сортилина и терапевтическому применению таких антител.
Уровень техники
Сортилин представляет собой трансмембранный белок I типа, действующий как рецептор нескольких лигандов и участвующий в сортировке выбранного продукта переноса из сети транс-Гольджи (TGN) к поздним эндосомам и лизосомам для деградации. Сортилин содержит большой внеклеточный домен, который является частью семейства VPS10, гомологичной дрожжевому VPS10P, и содержит 10лопастную бета-пропеллерную структуру и богатый цистеином модуль 10CC (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270; и Zheng, Y et al., (2011) PLoS One 6: e21023). Небольшая фракция сортилина может сбрасываться в результате активности ADAM10 или гамма-секретазы (<5%) (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270; и Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85).
Сортилин связывает секретируемый белок програнулин (PGRN) и нацеливает его на лизосомную деградацию, таким образом, регулируя путем отрицательной связи уровни PGRN (Hu, F et al., (2010) Neuron 68, 654-667. Наряду с этим, дефицит сортилина значительно увеличивает уровни PGRN в плазме как в мышиных моделях in vivo, так и в клетках человека in vitro (Carrasquillo, M. M et al., (2010) Am J Hum Genet 87, 890-897; Lee, W. C et al., (2014) 23, 1467-1478). Более того, как показано, полиморфизм сортилина сильно связан с уровнями PGRN в сыворотке у людей (Carrasquillo MM et al., 2010), Am J Hum Genet. 10; 87(6): 890-7).
Програнулин (PGRN) представляет собой секретируемый, подобный фактору роста, трофический и противовоспалительный белок, который также играет роль в качестве адипокина, вовлеченного в алиментарное ожирение и резистентность к инсулину (Nguyen DA et al., (2013). Trends in Endocrinology and Metabolism, 24, 597-606). Дефицит програнулина отвечает за, примерно, 25% всех наследственных форм лобно-височной деменции (FTD), нейродегенеративного заболевания с ранним началом. Пациенты с гетерозиготными мутациями потери функционирования PGRN имеют на ~50% сниженные внеклеточные уровни белка и у них всегда будет развиваться FTD, что делает PGRN геном, обуславливающем данное заболевание (Baker, M et al., (2006) Nature 442, 916-919; Carecchio M et al., (2011) J Alzheimer's Dis 27, 781-790; Cruts, M et al., (2008) Trends Genet 24, 186-194; Galimberti, D et al., (2010) J Alzheimer's Dis 19, 171-177). В дополнение к этому, были идентифицированы мутантные аллели по PGRN у пациентов с заболеванием Альцгеймера (Seelaar, H et al., (2011). Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 82, 476-486). Важно отметить, что PGRN действует как защитный фактор в нескольких моделях заболеваний с увеличенными уровнями PGRN, ускоряя поведенческое восстановление от последействий ишемии (Tao, J et al., (2012) Brain Res 1436, 130-136; Egashira, Y. et al., (2013). J Neuroinflammation 10, 105), подавляя локомоторные недостатки на модели болезни Паркинсона (Van Kampen, J. M et al., (2014). PLoS One 9, e97032), ослабляя патологию на модели бокового амиотрофического склероза (Laird, A. S et al., (2010). PLoS One 5, e13368) и артрита (Tang, Wet al., (2011). Science 332, 478-484) и предотвращая нарушения памяти на модели Альцгеймера (Minami, S. S et al., 2014). Nat Med 20, 1157-1164).
Сортилин также непосредственно связывается с пронейротрофинами, такими как профактор роста нервов (pro-NGF), pro-BDNF, пронейротрофин-3, и т.д., которые содержат продомен и обычно являются про-апоптичными. Такие предшественники пронейротрофинов высвобождаются во время стресса, а сортилин вовлекается в регулирование их высвобождения, а также связывания на воспринимающей клетке и стимуляции апоптоза в сочетании с p75NTR (Willnow, TE et al., (2008) Nat Rev Neurosci 9: 899-909; Nykjaer, A et al., Trends Neurosci 35: 261-270; и Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427: 843-848; Hiroko Yano et al., (2009) J Neurosci.; 29: 14790-14802. Teng H. K., et al., J. Neurosci. 25: 5455-5463(2005)). Сортилин также непосредственно связывается с p75NTR (Skeldal S et al., (2012) J Biol Chem.; 287: 43798). Сортилин также связывается с нейротензином на участке, который частично перекрывается с участком связывания програнулина (Quistgaard, EM et al., (2009) Nat Struct Mol Biol 16: 96-98; и Zheng, Y et al., PLoS One 6: e21023). Сортилин также взаимодействует с Trk-рецепторами NTRK1, NTRK2 и NTRK3; и может управлять их антероградным аксональным транспортом и передачей сигнала (Vaegter, CB et al., (2011) Nat. Neurosci. 14: 54-61). Сортилин также взаимодействует и управляет процессингом и миграцией амилоидного белка-предшественника и приводит к продукции патологических бета-амилоидных пептидов (Gustafsen C et al., (2013). J Neurosci. 2; 33(1): 64-71.
Как показано, сортилин связывается с аполипопротеинами и липопротеиновой липазой и, таким образом, его дефицит ведет к пониженному высвобождению VLDL из печени и пониженному уровню холестерина (Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85; Kjolby, M et al., (2010) Cell Metab 12:
- 1 043015
213-223; Nilsson, SK et al., (2007) Biochemistry 46: 3896-3904.; Nilsson, SK et al., (2008) J Biol Chem 283: 25920-25927; и Klinger, SC et al., (2011) J Cell Sci 124: 1095-1105). Недавно установили, что сортилин непосредственно связывается с APP (Gustafsen, C et al., (2013) J. Neurosc. 33: 64-71), а также с процессирующим APP ферментом BACE1 (Gustafsen, C et al., (2013) J. Neurosc. 33: 64-71; и Finan, GM et al., J Biol Chem 286: 12602-12616). Сортилин также связывается с аполипопротеином E (APOE), с A-бета-пептидом (Carlo, AS et al., (2013) J, Neurosc, 33: 358-370) и с PCSK9 (Gustafsen et al, (2014) Cell Metab, 19: 310-318). Показано, что сортилин связывается и управляет внеклеточными уровнями PCSK9, который направляет рецептор липопротеинов низкой плотности на деградацию в лизосомы, приводя к повышенным уровням холестерина-ЛНП (Gustafsen C et al., (2014). Cell Metab. 2014 Feb 4; 19(2): 310-8).
Когда сортилин присутствует во внутриклеточных везикулах, таких как эндосомы, то его аминоконцевой внеклеточный домен направлен в сторону просвета, в котором присутствует продукт везикулы. Однако карбоксиконцевой внутриклеточный/цитоплазматический домен сортилина, связывается с рядом адаптерных белков, которые управляют миграцией из поверхности и в пределах внутриклеточных компартментов. Эти белки включают AP2 (клатриновый адаптер для модуляции эндоцитоза из клеточной поверхности) и ретромерный комплекс/AP1, который модулирует перемещение из ранних в аппарат Гольджи для рециклирования; и взаимодействует с семейством белков GGA (локализированный в аппарате Гольджи, содержащий гамма-ухо, ADP-рибозилированный фактор связывания) для перемещения из аппарата Гольджи непосредственно в ранние эндосомы, обычно для последующей деградации посредством лизосом. Таким образом, сортилин может связываться с лигандами в их люминальном домене, при этом задействуя цитоплазматические адаптеры, которые определяют их конечное назначение для определения внутриклеточных изменений, таких как деградация програнулина и других факторов.
Несмотря на различные взаимодействия с белками, такими как програнулин, показано, что сортилин и его многочисленные лиганды вовлечены в различные заболевания, нарушения и патологические состояния и условия, такие как лобно-височная деменция, боковой амиотрофический склероз, фенотипы бокового амиотрофического склероза-лобно-височной деменции, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, депрессии, нейропсихиатрические нарушения, сосудистую деменцию, эпилептические припадки, дистрофию сетчатки, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому, травматическое повреждение мозга, старение, эпилептические припадки, нарушение заживления ран, инсульт, артрити атеросклеротические заболевания сосудов.
Соответственно, существует потребность в терапевтических антителах, которые специфически связывают сортилиновые белки и блокируют связывание сортилина с его лигандами, такими как програнулин, или иным образом модулирующие эффективную концентрацию лигандов, для лечения одного или более заболеваний, нарушений и патологических состояний, связанных с активностью сортилина.
Все цитируемые в данном документе ссылки, включая заявки на патенты и публикации, тем самым включены в данный документ в полном объеме путем ссылки.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее описание в целом относится к антителам против сортилина и способов использования таких антител. Предложенные в данном документе способы находят применение для предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего лобно-височную деменцию, болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, эпилептические припадки, дистрофию сетчатки, травматическое повреждение мозга, повреждение спинного мозга, длительную депрессию, атеросклеротические заболевания сосудов, нежелательные симптомы естественного старения, деменцию, смешанную деменцию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, нормотензивную гидроцефалию, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, таупатию, инсульт, острую травму, хроническую травму, волчанку, острый и хронический колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, малярию, эссенциальный тремор, волчанку центральной нервной системы, болезнь Бехчета, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию, синдром Шая-Дрейджера, прогрессирующий супрануклеарный паралич, кортикальную базальную ганглионарную дегенерацию, острый рассеянный энцефаломиелит, связанные с гранулематозом нарушения, саркоидоз, болезни старения, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому, пигментный ретинит, дегенерацию сетчатки, инфекцию дыхательных путей, сепсис, глазную инфекцию, системную инфекцию, воспалительные нарушения, артрит, рассеянный склероз, нарушения метаболизма, ожирение, резистентность к инсулину, диабет 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранение, дегенерацию межпозвонковых дисков или один или более нежелательных симптомов естественного старения.
Некоторые аспекты по настоящему описанию основаны, по меньшей мере частично, на идентификации антител против сортилина, которые способны блокировать взаимодействие между сортилином и програнулином (см., например, пример 4), антитела против сортилина, которые способны к увеличению внеклеточных уровней програнулина, секретируемого клетками в культуре и из клеток головного мозга, мышиных моделей болезни Альцгеймера (см., например, пример 5), антитела против сортилина, которые способны уменьшать клеточные уровни сортилина в первичных моноцитах человека (см., например, пример 25), и антитела против сортилина, которые способны увеличивать клеточные уровни програнулина in vivo (см., например, пример 26). Неожиданно обнаружено, что один класс антител показал спо
- 2 043015 собность увеличивать внеклеточные уровни програнулина без способности блокировать взаимодействие между сортилином и програнулином (например, антитела S-2, S-15 и S-22), тогда как второй класс антител показал способность как блокировать взаимодействие между сортилином и програнулином, так и увеличивать внеклеточные уровни програнулина (например, антитела S-8, S-49 и S-60). Более того, антитела против сортилина, способные увеличивать внеклеточные уровни програнулина (например, антитела S-2, S-8, S-15, S-22, S-49 и S-60), неожиданно показали также снижение клеточных уровней сортилина, таких как уровни сортилина на клеточной поверхности (см., например, пример 5). Кроме того, показано, что клеточные уровни сортилина сильно и обратимо коррелировали с увеличениями клеточных уровней програнулина (см., например, фиг. 10B-10E и фиг. 23B и 23C). Антитела против сортилина, способные увеличивать внеклеточные уровни програнулина, также способны блокировать pro-NGF, связывающийся с сортилином (см., например, пример 6). Другие аспекты по настоящему описанию основаны, по меньшей мере частично, на идентификации антител против сортилина, которые блокируют взаимодействие между сортилином и програнулином и способны увеличивать внеклеточные уровни програнулина без снижения клеточных уровней сортилина (например, антитело S-30 и Пример 30). Другие аспекты по настоящему описанию основаны, по меньшей мере частично, на идентификации антител против сортилина, которые блокируют взаимодействие между сортилином и програнулином без увеличения внеклеточных уровней програнулина или снижения клеточных уровней сортилина (например, антитело S-5 и S-64 и Пример 5).
Соответственно, некоторые аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из: увеличения внеклеточных уровней програнулина, увеличения клеточных уровней програнулина, уменьшения клеточных уровней сортилина, ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином и любой их комбинации.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело уменьшает уровни сортилина на клеточной поверхности, уменьшает внутриклеточные уровни сортилина, уменьшает общие уровни сортилина или создает любую комбинацию из них. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина индуцирует деградацию сортилина, расщепление сортилина, интернализацию сортилина, снижение регуляции сортилина и любую их комбинацию. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и увеличивает клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и увеличивает клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает уровни програнулина in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает уровни програнулина in vivo без уменьшения клеточных уровней сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает уровни програнулина в головном мозге. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина в крови. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина в одном или более периферических органов. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает уровни програнулина в головном мозге, крови, одном или более периферических органов, или любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против
- 3 043015 сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина в головном мозге. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина в одном или более периферических органов. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина в головном мозге, одном или более периферических органов, или в любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и не уменьшает клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина и не уменьшает клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает внеклеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает внеклеточные уровни програнулина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает клеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает клеточные уровни програнулина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина, увеличивает клеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина, ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и не увеличивает клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает клеточные уровни програнулина, ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и не увеличивает внеклеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина, ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и не уменьшает клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина, не увеличивает клеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина, увеличивает клеточные уровни програнулина, увеличивает внеклеточные уровни програнулина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, клеточные уровни програнулина, внеклеточные уровни програнулина, клеточные уровни сортилина и их любую комбинацию измеряют с использованием анализа in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, клеточные уровни програнулина, внеклеточные уровни програнулина, клеточные уровни сортилина и их любую комбинацию измеряют с использованием анализа на основе клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, клеточные уровни програнулина, внеклеточные уровни програнулина, клеточные уровни сортилина и их любую комбинацию измеряют с использовани
- 4 043015 ем модели in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и профактором роста нервов (pro-NGF). В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и одним или более белков из группы, состоящей из пронейротрофина, нейротрофина, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), пронейротрофина-3, нейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, нейротензина, нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-про), амилоидного белка-предшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP). В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и одним или более белков путем: a) снижения эффективных уровней сортилина, доступного для взаимодействия с одним или более белков; b) индуцирования деградации сортилина; или обоих вариантов. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина ингибирует клеточную секрецию PCSK9, ингибирует продукцию A-бета-пептида или их обоих. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина специфически связывается с сортилином человека, сортилином мыши или их обоих. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело, моноклональное антитело, поливалентное антитело, конъюгированное антитело или химерное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина представляет собой биспецифическое антитело, распознающее первый антиген и второй антиген. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, первый антиген представляет собой сортилин, а второй антиген представляет собой антиген, облегчающий транспорт через гематоэнцефалический барьер. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, второй антиген выбирают из группы, состоящей из сортилина, рецептора трансферрина (TR), инсулинового рецептора (HIR), рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGFR), белков 1 и 2 подобных рецептору липопротеинов низкой плотности (LPR-1 и 2), рецептора дифтерийного токсина, CRM197, однодоменного антитела ламы, TMEM 30(A), белкового домена трансдукции, TAT, Syn-B, пенетратина, полиаргининового пептида, пептида ангиопеп, базигина, Glut1, CD98hc и ANG1005. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина представляет собой фрагмент антитела, который связывается с эпитопом, содержащим аминокислотные остатки на сортилине человека или белке сортилине млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, фрагмент представляет собой фрагмент Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv или scFv. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина дополнительно содержит одну или более активностей, выбранных из группы, состоящей из: (a) индукции одного или более активностей програнулина; (b) снижения эндосомной интернализации програнулина или его фрагментов; и (c) увеличения эффективной концентрации програнулина.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывает прерывистый сортилиновый эпитоп. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, прерывистый сортилиновый эпитоп содержит два или белее пептидов, три или более пептидов, четыре или более пептидов, пять или более пептидов, шесть или более пептидов, семь или более пептидов, восемь или более пептидов, девять или более пептидов, или 10 или более пептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, каждый из пептидов содержит пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более, 21 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более,
- 5 043015 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с конформационным эпитопом сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с одной или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: i) аминокислотных остатков 740-749 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 740-749 из SEQ ID NO: 1; ii) аминокислотных остатков 623632 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 623-632 из SEQ ID NO: 1; iii) аминокислотных остатков 429-443 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 429-443 из SEQ ID NO: 1; iv) аминокислотных остатков 367-391 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 367-391 из SEQ ID NO: 1; v) аминокислотных остатков 314-338 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 314-338 из SEQ ID NO: 1; vi) аминокислотных остатков 297-317 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 297317 из SEQ ID NO: 1; vii) аминокислотных остатков 237-2 60 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-2 60 из SEQ ID NO: 1; viii) аминокислотных остатков 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1; ix) аминокислотных остатков 237-247 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 из SEQ ID NO: 1; x) аминокислотных остатков 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1; xi) аминокислотных остатков 233-243 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 233-243 из SEQ ID NO: 1; xii) аминокислотных остатков 212-221 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 212-221 из SEQ ID NO: 1; xiii) аминокислотных остатков 207-227 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 из SEQ ID NO: 1; xiv) аминокислотных остатков 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1; xv) аминокислотных остатков 207-231 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-231 из SEQ ID NO: 1; xvi) аминокислотных остатков 175-181 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 175-181 из SEQ ID NO: 1; и xvii) аминокислотных остатков 131-138 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 131-138 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с одним или более аминокислотными остатками, выбранными из группы, состоящей из H131, V132, P133, L134, V135, I136, M137, T138, T210, T218, Y222, S223, S227, S242, K243, K248, K254, S305, R311, S316, R325, S379, R382, Y386 и S595 из SEQ ID NO: 1, или одним или более аминокислотными остатками на белке сортилине млекопитающего, соответствующими аминокислотным остаткам, выбранным из группы, состоящей из H131, V132, P133, L134, V135, I136, M137, T138, T210, T218, Y222, S223, S227, S242, K243, K248, K254, S305, R311, S316, R325, S379, R382, Y386 и S595 из SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-5, S6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 и 15; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 и 32; (c) HVRL3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 и 123; (d) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 и 148; (е) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 и 175; или (f) HVR-H3, содержащий аминокислотную последователь
- 6 043015 ность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 и 254. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 и 15, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 и 15; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 и 32, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 и 32; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 и 123, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SeQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 и 123; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 и 148, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 и 148; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 и 175, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170 173, и 175; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 и 254, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 и 254. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 324, 326, 330, 401, 409, 430, 436, 438, 439, 453 и 474; и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 325, 327, 331, 402, 410, 431, 437, 440, 454 и 475.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-2, S14, S-15, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-29, S-51, S57, S-61 и S-82. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-10, 13 и 14; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-31 и 33-35; (c) HVRL3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 и 122; (d) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 и 147; (e) HVRH2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150, 155-158, 162, 166, 169 и 173; или (f) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 и 253. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-10, 13 и 14, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-10, 13 и 14; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2631 и 33-35, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-31 и 33-35; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 и 122, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 и 122; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 и 147, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 и 147; (b) HVR-H2, содержа
- 7 043015 щий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150, 155158, 162, 166, 169 и 173, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150, 155158, 162, 166, 169 и 173; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 и 253, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 и 253. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 319, 341, 343, 348, 350, 352, 354, 356, 370, 413, 425, 430 и 472; и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 320, 342, 349, 351, 353, 355, 357, 369, 414, 426, 431 и 473.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-5, S30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 70 и 100; (d) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 136 и 142; (e) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 163 и 170; или (f) HVRH3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 204 и 233. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 70 и 100, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 70 и 100; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 136 и 142, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 136 и 142; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 163 и 170, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 163 и 170; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 204 и 233, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 204 и 233. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 324, 371 и 430; и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 325, 372 и 431.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103- 8 043015
107, 109, 111-116, 118 и 121-125, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4150, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121125; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177178; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-6, S-8, S-49, S-60, S-63, S-72, S-83, и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-45, S-64, S-65, и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-30, S-60, и любой их комбинации.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-12, S-14, S-15, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-24, S-25, S-26, S28, S-29, S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, S-42, S-43, S-44, S-45, S-48, S-49, S-50, S-51, S-55, S-57, S-58, S-59, S-60, S-61, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-69, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-78, S-81, S-82, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 616, 20-22 и 24-25; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125; (d) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144145 и 147-149; (e) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178; или (f) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243247, 249 и 252-256. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103107, 109, 111-116, 118 и 121-125; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149, или аминокислотную последовательность с по мень
- 9 043015 шей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160166, 169-175 и 177-178, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SeQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 317-334, 337-338, 341-345, 348-357, 360-365, 368-372, 375-376, 379380, 389-392, 395-402, 407-414, 421-422, 425-433, 436-444, 447-448, 451-461, 464-465 и 470-479.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-2, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-28, S-29, S-82, и любой их комбинацией. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-1, S-3, S-4, S-6, S-7, S-9, S-10, S-14, S-15, S-26, S-32, S48, S-51, S-55, S57, S-58, S-59, S-61, S-69, S-71, S-73, S-74, S-75, S-85, и любой их комбинацией. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-12, S-24, S-25, S-30, S-34, S39, S-40, S-42, S-43, S-44, S-45, S-60, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-72, S-76, S-78, S-81, S-83, S-84, и любой их комбинацией. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-8, S-49, S-50, и любой их комбинацией. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое по существу связывается с таким же эпитопом сортилина, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из: S-1, S2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-12, S-14, S-15, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-24, S-25, S-26, S-28, S-29, S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, S-42, S-43, S-44, S-45, S-48, S-49, S-50, S-51, S-55, S-57, S-58, S-59, S-60, S-61, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-69, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-78, S-81, S-82, S-83, S-84 и S-85.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103107, 109, 111-116, 118 и 121-125, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4150, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121125; или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169175 и 177-178; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219,
- 10 043015
222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219,
222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином, увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина, причем антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-8, S-49 и S-60. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 11; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 26; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 48; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 127; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 152; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 185. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 26; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 89; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 140; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 166; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 223. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 100; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 142; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 147; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 233. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином, увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-8, S-49, S-60, и любой их комбинации. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином, увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина, причем антитело против сортилина связывается с одним или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: i. аминокислотных остатков 429-443 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 429-443 из SEQ ID NO: 1; ii. аминокислотных остатков 232-243 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 232-243 из SEQ ID NO: 1; и iii. аминокислотных остатков 207-231 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-231 из SEQ ID NO: 1.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина без ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, причем антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-2, S-19 и S-22. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 27; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 42; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 126; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 150; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 180. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 35; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 59; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную по- 11 043015 следовательность из SEQ ID NO: 130; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 158; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 194. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 27; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 61; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 130; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 157; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 196. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина без ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-2, S-19, S-22, и любой их комбинации. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое увеличивает уровни програнулина и уменьшает клеточные уровни сортилина без ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, причем антитело против сортилина связывается с одним или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: i. аминокислотных остатков 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1; и ii. аминокислотных остатков 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином без увеличения уровней програнулина и без уменьшения клеточных уровней сортилина, причем антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-5 и S-64. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 45; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 126; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 151; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 182. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 15; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 27; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 104; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 142; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 169; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 236. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином без увеличения уровней програнулина и без уменьшения клеточных уровней сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-64, и любой их комбинации.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и увеличивает уровни програнулина без уменьшения клеточных уровней сортилина, причем антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела S-30. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10; (b) содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 70; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 136; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 163; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 204. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, которое ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и увеличивает уровни програнулина без уменьшения клеточных уровней сортилина, причем антитело против сортилина конкурирует за связывание с сор
- 12 043015 тилином с антителом S-30.
Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из AASSLQS (SEQ ID NO: 27); и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQSDVSPIT (SEQ ID NO: 42); и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из YTFX1X2YX3MX4 (SEQ ID NO: 480), где X1 представляет собой T, G, V, P, L, F, A или R, X2 представляет собой G, A или S, X3 представляет собой Y, M или L, a X4 представляет собой H или W; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1X2X3PX4X5GX6TX7YAQKFQG (SEQ ID NO: 481), где X1 представляет собой W, I или G, X2 представляет собой I, V или T, X3 представляет собой N, G или L, X4 представляет собой N, S, V или M, X5 представляет собой S, G, W или Q, X6 представляет собой G, F, A, Y, S, N или R, a X7 представляет собой N, R, S или M; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARGKRSSGWYEGYGMDV (SEQ ID NO: 180). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVRL2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S2-14 и S-2-15; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-25, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 последовательностей из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S2-14 и S-2-15. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит вариабельный участок легкой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-211, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14 и S-2-15. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSX1X2SNLA (SEQ ID NO: 508), где X1 представляет собой V или I, а X2 представляет собой S или G; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из GASTRAT (SEQ ID NO: 29); и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQARLGPWT (SEQ ID NO: 55); и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVRH1, содержащий аминокислотную последовательность из YTX1X2X3X4X5X6S (SEQ ID NO: 509), где X1 представляет собой F или L, X2 представляет собой T или A, X3 представляет собой S или K, X4 представляет собой Y, T, R, L, T, G, Q или H, X5 представляет собой Y, T или L, а X6 представляет собой M или I; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1INPX2GGX3X4SYAX5X6FX7G (SEQ ID NO: 510), где X1 представляет собой I или V, X2 представляет собой S, W, Y, V, F, L или I, X3 представляет собой S или T, X4 представляет собой T или A, X5 представляет собой Q или R, X6 представляет собой K или R, a X7 представляет собой Q или R; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из X1RDPX2GX3X4X5X6X7PX8X9RX10X11X12GX13DV (SEQ ID NO: 511), где X1 представляет собой A, V или T, X2 представляет собой S, F или G, X3 представляет собой I или A, X4 представляет собой A или G, X5 представляет собой A, L или V, X6 представляет собой A, L или P, X7 представляет собой G, F или Y, X8 представляет собой A, G или F, X9 представляет собой S, G или A, X10 представляет собой Y, G, P, H или S, X11 представляет собой Y или N, X12 представляет собой Y, L, Q или R, a X13 представляет собой M или L. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVRL1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-61, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15- 13 043015
6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-1510-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-1015, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-1514, S-15-15 и S-15-16; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-153, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-156-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-1510-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16; (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16; (iv) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S15-15 и S-15-16; (v) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-154, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-1013, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-1511, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16; и (vi) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-66, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-1010, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-1510-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит вариабельный участок легкой цепи любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-156-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-101, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-1510-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-156-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-159, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-109, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-1018, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 и S-15-16. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVRL1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSISSWLA (SEQ ID NO: 8); (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из KASSLES (SEQ ID NO: 28); и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQADGHIT (SEQ ID NO: 62); и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из X1TFX2X3YAX4X5 (SEQ ID NO: 565), где X1 представляет собой G или Y, X2 представляет собой S, R, G или T, X3 представляет собой S, G или N, X4 представляет собой I или M, а X5 представляет собой S или A; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность GIX1PX2X3GX4AX5YAQKFQG (SEQ ID NO: 566), где X1 представляет собой I или V, X2 представляет собой I, R, G, A, S, T или Q, X3 представляет собой F или G, X4 представляет собой T, R или W, а X5 представляет собой S, N, Q или W; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARQGRKTGYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 197). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет по меньшей
- 14 043015 мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-225, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 последовательностей из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-225, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит вариабельный участок легкой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8 и S-22-9; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-226, S-22-7, S-22-8 и S-22-9. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RSSQX1LLX2SNGYNYLD (SEQ ID NO: 580), где X1 представляет собой S или G и X2 представляет собой H или R; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из LGSNRXS (SEQ ID NO: 581), где X представляет собой A или V; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из MQQQETPLT (SEQ ID NO: 100); и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVRH1, содержащий аминокислотную последовательность из YSISSX1X2YWG (SEQ ID NO: 582), где X1 представляет собой G или V, a X2 представляет собой Y или R; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1IYX2SGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 583), где X1 представляет собой T, S или A, а X2 представляет собой H или P; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARQGSIKQGYYGMDV (SEQ ID NO: 233). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8 и S-60-9; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S60-3, S-60-4, S-60-5, S-60- 6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит вариабельный участок легкой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. Другие аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к выделенному (например, моноклональному) антителу против сортилина, причем антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 14); (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из GASSRAT (SEQ ID NO: 26); и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQSHVSPWT (SEQ ID NO: 122); и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из X1SIX2SX3X4YYWG (SEQ ID NO: 589), где X1 представляет собой G или Y, X2 представляет собой S, V, Y, K или P, X3 представляет собой S или R, a X4 представляет собой D или E; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1IYX2X3GSTX4YNPSLKS (SEQ ID nO: 590), где X1 представляет собой S, G, Q или L, X2 пред
- 15 043015 ставляет собой Y, W или R, X3 представляет собой S, R, K или A, а Х4 представляет собой Y или V; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARGVGSGYSYGYRYFDY (SEQ ID NO: 253). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (ii) HVR-L2 содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (iii) HVR-L3 содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (iv) HVR-H1 содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVRH1 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S82-7 и S-82-8; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит вариабельный участок легкой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любой одной из последовательностей антител из антитела, выбранного из группы, состоящей из S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина имеет изотип IgG1 человека или мыши и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; (b) антитело против сортилина имеет изотип IgG2 и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; или (c) антитело против сортилина имеет изотип IgG4 и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) Fc-участок дополнительно содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из A330L, L234F, L235E, P331S и любой их комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; (b) Fc-участок дополнительно содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из M252Y, S254T, T256E и любой их комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; или (c) Fc-участок дополнительно содержит аминокислотную замену S228P в соответствии с нумерацией EU или Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина уменьшает экспрессию одного или более провоспалительных медиаторов, выбранных из группы, состоящей из IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1e, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих, значение которой лежит в диапазоне от около 100 нМ до около 0,005 нМ, или менее 0,005 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, значение которой лежит в диапазоне от около 70,4 нМ до около 0,005 нМ, или менее 0,005 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина мыши, значение которой лежит в диапазоне от около 40,3 нМ до около 0,07 нМ, или менее 0,07 нМ.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к выделенной нуклеиновой кислоте, содержа
- 16 043015 щей нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к выделенной клетке-хозяину, содержащей вектор по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу продуцирования антитела против сортилина, включающего культивирование клетки-хозяина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, в результате которого продуцируется антитело против сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выделение антитела против сортилина, продуцируемого клеткой-хозяином. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к выделенному антителу против сортилина, полученному способом по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к фармацевтической композиции, содержащей антитело против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу увеличения уровней програнулина в головном мозге индивида, нуждающегося в этом, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина при применении для увеличения уровней програнулина в головном мозге индивида, нуждающегося в этом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина для производства лекарственного средства для увеличения уровней програнулина в головном мозге индивида, нуждающегося в этом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу увеличения уровней програнулина в организме индивида, нуждающегося в этом, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина при применении для увеличения уровней програнулина в организме индивида, нуждающегося в этом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина для производства лекарственного средства для увеличения уровней програнулина в организме индивида, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, уровни програнулина увеличиваются в головном мозге, крови и/или одном или более периферических органов индивида. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, уровни програнулина увеличиваются без уменьшения клеточных уровней сортилина.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу увеличения внеклеточных уровней програнулина из одной или более клеток, включающему приведение в контакт одной или более клеток с антителом против сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина при применении для увеличения внеклеточных уровней програнулина из одной или более клеток. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина для производства лекарственного средства для увеличения уровней програнулина из одной или более клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, уровни програнулина увеличиваются без уменьшения клеточных уровней сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу уменьшения клеточных уровней сортилина в организме индивида, нуждающегося в этом, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина при применении для уменьшения клеточных уровней сортилина в организме индивида, нуждающегося в этом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина для производства лекарственного средства для уменьшения клеточных уровней сортилина в организме индивида, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, уровни сортилина уменьшаются в головном мозге и/или одном или более периферических органов индивида. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу уменьшения клеточных уровней сортилина одной или более клеток, включающему приведение в контакт одной или более клеток с антителом против сортилина. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина при применении для уменьшения клеточных уровней сортилина одной или более клеток. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина для производства лекарственного средства для уменьшения клеточных уровней сортилина одной или более клеток.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу ингибирования одного или более взаимодействий между белком сортилином и одним или более белков, выбранных из группы, состоящей из програнулина, нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белкапредшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP), причем способ включает: приведение в контакт белка сортилина с антителом против сортилина, которое связывается с эпитопом, содержащим SEQ
- 17 043015
ID NO: 4. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина, которое связывается с эпитопом, содержащим SEQ ID NO: 4, при применении для ингибирования одного или более взаимодействий между белком сортилином и одним или более белков, выбранных из группы, состоящей из програнулина, нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белкапредшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP). Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина, которое связывается с эпитопом, содержащим SEQ ID NO: 4, при производстве лекарственного средства для ингибирования одного или более взаимодействий между белком сортилином и одним или более белков, выбранных из группы, состоящей из програнулина, нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белка-предшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP).
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из: увеличения внеклеточных уровней програнулина, увеличения клеточных уровней програнулина, уменьшения клеточных уровней сортилина, ингибирования взаимодействия между сортилина с и програнулином, и любой их комбинации; (b) антитело против сортилина уменьшает уровни сортилина на клеточной поверхности, уменьшает внутриклеточные уровни сортилина, уменьшает общие уровни сортилина или любую их комбинации; (c) антитело против сортилина индуцирует деградацию сортилина, расщепление сортилина, интернализацию сортилина, понижающую регуляцию сортилина или любую их комбинацию; (d) антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином; (e) антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином; (f) антитело против сортилина уменьшает клеточные уровни сортилина и увеличивает клеточные уровни програнулина; (g) антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина и не ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином; (h) антитело против сортилина ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и увеличивает клеточные уровни програнулина; (i) антитело против сортилина ингибирует взаимодействие между сортилином и програнулином и не уменьшает клеточные уровни сортилина; (j) антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина и не уменьшает клеточные уровни сортилина; (k) антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и профактором роста нервов (proNGF); (l) антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и одним или более белков, выбранных из группы, состоящей из пронейротрофина, нейротрофина, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), пронейтрофина-3, нейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, нейротензина, нейротензина, p75, сортилиновой пропептидазы (Sort-pro), амилоидного белкапредшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP); (m) антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и одним или более белков, выбранных из группы, состоящей из пронейротрофина, нейротрофина, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), пронейтрофина-3, нейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, нейротензина, нейротензина, p75, сортилиновой пропептидазы (Sort-pro), амилоидного предшественника-белка (APP), A-бета-петида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP) путем: a) снижения эффективных уровней сортилина, доступного для взаимодействия с одним или более белков; b) индуцирования деградации сортилина; или обоих вариантов; (n) антитело против сортилина ингибирует клеточную секрецию PCSK9, ингибирует продукцию A-бета-пептида или обоих вариантов; (o) антитело против сортилина индуцирует одну или более активностей програнулина; (p) антитело против сортилина уменьшает эндосомальную интернализацию програнулина или его фрагмента; и/или (q) антитело против сортилина увеличивает эффективную концентрацию програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина связывается исключительно с сортилином человека, сортилином мыши или обоими; (b) антитело против сортилина представляет собой антитело человека; (c) антитело против сортилина представляет собой гуманизированное антитело; (d) антитело против сортилина представляет собой биспецифическое антитело; (e) антитело против сортилина представляет собой биспецифическое антитело, распознающее первый антиген и второй антиген; (f) антитело против сортилина представляет собой биспецифическое антитело, распознающее первый антиген и второй антиген, причем первый антиген представляет собой белок сортилин, а второй антиген представляет собой антиген, облегчающий транспорт через гематоэнцефалический барьер и, необязательно, при этом второй антиген, выбран из группы, состоящей из сортилина, рецептора трансферрина (TR), рецептора инсулина (HIR), рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGFR), родственных белков 1 и 2 подобных рецептору липопротеинов низкой
- 18 043015 плотности (LPR-1 и 2), рецептора дифтерийного токсина, CRM197, однодоменного антитела ламы, TMEM 30(A), белкового домена трансдукции, TAT, Syn-B, пенетратина, полиаргининового пептида, пептида ангиопеп, базигина, Glut1, CD98hc и ANG1005; (g) антитело против сортилина представляет собой поливалентное антитело; (h) антитело против сортилина представляет собой конъюгированное антитело; (i) антитело против сортилина представляет собой химерное антитело; (j) антитело против сортилина представляет собой антитело; (k) антитело против сортилина представляет собой фрагмент антитела, который связывается с эпитопом, содержащим аминокислотные остатки сортилина человека, или белка сортилина млекопитающего; или (l) антитело против сортилина представляет собой фрагмент антитела, который связывается с эпитопом, содержащим аминокислотные остатки на сортилине человека или белке сортилине человека и, необязательно, при этом фрагмент представляет собой фрагмент Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv или scFv.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывает прерывистый сортилиновый эпитоп. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, прерывистый сортилиновый эпитоп содержит два или белее пептидов, три или более пептидов, четыре или более пептидов, пять или более пептидов, шесть или более пептидов, семь или более пептидов, восемь или более пептидов, девять или более пептидов, или 10 или более пептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, каждый из пептидов содержит пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более, 21 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более, 21 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с конформационным эпитопом сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с одной или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: i) аминокислотных остатков 740-749 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 740-749 из SEQ ID NO: 1; ii) аминокислотных остатков 623632 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 623-632 из SEQ ID NO: 1; iii) аминокислотных остатков 429-443 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 429-443 из SEQ ID NO: 1; iv) аминокислотных остатков 367-391 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 367-391 из SEQ ID NO: 1; v) аминокислотных остатков 314-338 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 314-338 из SEQ ID NO: 1; vi) аминокислотных остатков 297-317 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 297317 из SEQ ID NO: 1; vii) аминокислотных остатков 237-260 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 из SEQ ID NO: 1; viii) аминокислотных остатков 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1; ix) аминокислотных остатков 237-247 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 из SEQ ID NO: 1; x) аминокислотных остатков 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1; xi) аминокислотных остатков 233-243 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 233-243 из SEQ ID NO: 1; xii) аминокислотных остатков 212-221 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 212-221 из SEQ ID NO: 1; xiii) аминокислотных остатков 207-227 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 из SEQ ID NO: 1; xiv) аминокислотных остатков 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1; xv) аминокислотных остатков 207-231 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке
- 19 043015 сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-231 из SEQ ID NO: 1; xvi) аминокислотных остатков 175-181 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 175-181 из SEQ ID NO: 1; и xvii) аминокислотные остатки 131-138 из SEQ ID NO: 1 или аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 131-138 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина связывается с одним или более аминокислотными остатками, выбранными из группы, состоящей из H131, V132, P133, L134, V135, M136, M137, T138, T210, T218, Y222, S223, S227, S242, K243, K248, K254, S305, R311, S316, R325, S379, R382, Y386 и S595 из SEQ ID NO: 1, или одним или более аминокислотными остатками на белке сортилине млекопитающего, соответствующими аминокислотным остаткам H131, V132, P133, L134, V135, I136, M137, T138, T210, T218, Y222, S223, S227, S242, K243, K248, K254, S305, R311, S316, R325, S379, R382, Y386 и S595 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR антитела, выбранного из группы, состоящей из: S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-12, S-14, S-15, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-24, S-25, S-26, S-28, S-29, S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, S-42, S-43, S-44, S-45, S-48, S-49, S-50, S-51, S-55, S-57, S-58, S-59, S-60, S-61, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-69, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-78, S-81, S-82, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125; (d) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133140, 142, 144-145 и 147-149; (e) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178; или (f) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 22. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем вариабельный домен легкой цепи содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 2425, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22 и 24-25; (b) HVRL2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40; и (c) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 6870, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125; и при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145 и 147-149; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SeQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175 и 177-178; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249 и 252-256.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, причем: (a) вариабельный домен легкой цепи содержит HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSISSYLN (SEQ ID
- 20 043015
NO: 7); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASSLQS (SEQ ID NO: 27); и HVRL3, содержащий аминокислотную последовательность из QQSDVSPIT (SEQ ID NO: 42); и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из YTFX1X2YX3MX4 (SEQ ID NO: 480), где X1 представляет собой T, G, V, P, L, F, A или R, X2 представляет собой G, A или S, X3 представляет собой Y, M или L, a X4 представляет собой H или W; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1X2X3PX4X5GX6TX7YAQKFQG (SEQ ID NO: 481), где X1 представляет собой W, I или G, X2 представляет собой I, V или T, X3 представляет собой N, G или L, X4 представляет собой N, S, V или M, X5 представляет собой S, G, W или Q, X6 представляет собой G, F, A, Y, S, N или R, a X7 представляет собой N, R, S или M; и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARGKRSSGWYEGYGMDV (SEQ ID NO: 180); (b) вариабельный домен легкой цепи содержит HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSX1X2SNLA (SEQ ID NO: 508), где X1 представляет собой V или I, а X2 представляет собой S или G; HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из GASTRAT (SEQ ID NO: 29); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQARLGPWT (SEQ ID NO: 55); и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из YTX1X2X3X4X5X6S (SEQ ID NO: 509), где X1 представляет собой F или L, X2 представляет собой T или A, X3 представляет собой S или K, X4 представляет собой Y, T, R, L, T, G, Q или H, X5 представляет собой Y, T или L, а X6 представляет собой M или I; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1INPX2GGX3X4SYAX5X6FX7G (SEQ ID NO: 510), где X1 представляет собой I или V, X2 представляет собой S, W, Y, V, F, L или I, X3 представляет собой S или T, X4 представляет собой T или A, X5 представляет собой Q или R, X6 представляет собой K или R, a X7 представляет собой Q или R; и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из X1RDPX2GX3X4X5X6X7PX8X9RX10X11X12GX13DV (SEQ ID NO: 511), где X1 представляет собой A, V или T, X2 представляет собой S, F или G, X3 представляет собой I или A, X4 представляет собой A или G, X5 представляет собой A, L или V, X6 представляет собой A, L, или P, X7 представляет собой G, F или Y, X8 представляет собой A, G или F, X9 представляет собой S, G или A, X10 представляет собой Y, G, P, H или S, X11 представляет собой Y или N, X12 представляет собой Y, L, Q или R, a X13 представляет собой M или L; (c) вариабельный домен легкой цепи содержит HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSISSWLA (SEQ ID NO: 8); HVRL2, содержащий аминокислотную последовательность из KASSLES (SEQ ID NO: 28); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQADGHIT (SEQ ID NO: 62); и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из X1TFX2X3YAX4X5 (SEQ ID NO: 565), где X1 представляет собой G или Y, X2 представляет собой S, R, G, или T, X3 представляет собой S, G или N, X4 представляет собой I или M, а X5 представляет собой S или A; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из GIX1PX2X3GX4AX5YAQKFQG (SEQ ID NO: 566), где X1 представляет собой I или V, X2 представляет собой I, R, G, A, S, T, или Q, X3 представляет собой F или G, X4 представляет собой T, R, или W, а X5 представляет собой S, N, Q, или W; и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARQGRKTGYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 197); (d) вариабельный домен легкой цепи содержит HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RSSQX1LLX2SNGYNYLD (SEQ ID NO: 580), где X1 представляет собой S или G, а X2 представляет собой H или R; HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из LGSNRXS (SEQ ID NO: 581), где X представляет собой A или V; и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из MQQQETPLT (SEQ ID NO: 100); и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит HVRH1, содержащий аминокислотную последовательность из YSISSX1X2YWG (SEQ ID NO: 582), где X1 представляет собой G или V, а X2 представляет собой Y или R; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1IYX2SGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 583), где X1 представляет собой T, S или A, а X2 представляет собой H или P; и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARQGSIKQGYYGMDV (SEQ ID NO: 233); или (e) вариабельный домен легкой цепи содержит HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность из RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 14); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность из GASSRAT (SEQ ID NO: 26); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность из QQSHVSPWT (SEQ ID NO: 122); и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность из X1SIX2SX3X4YYWG (SEQ ID NO: 589), где X1 представляет собой G или Y, X2 представляет собой S, V, Y, K или P, X3 представляет собой S или R, a X4 представляет собой D или E; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность из X1IYX2X3GSTX4YNPSLKS (SEQ ID NO: 590), где X1 представляет собой S, G, Q или L, X2 представляет собой Y, W или R, X3 представляет собой S, R, K или A, а X4 представляет собой Y или V; и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность из ARGVGSGYSYGYRYFDY (SEQ ID NO: 253). В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-6, S-8, S-49, S-60, S-63, S-72, S-83, и их любой комбинации для связывания с сортилином; (b) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-45, S-64, S-65, и их любой комбинации за связывание с сортилином; (c) антитело против сортилина конкурирует с
- 21 043015 одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-30, S-60, и их любой комбинации за связывание с сортилином; (d) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-2, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-28, S-29, S-82, и их любой комбинации для связывания с сортилином; (e) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-1, S-3, S-4, S-6, S-7, S-9, S-10, S-14, S-15, S-26, S-32, S-48, S-51, S-55, S57, S-58, S-59, S-61, S-69, S-71, S-73, S-74, S-75, S-85, и их любой комбинации для связывания с сортилином; (f) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-5, S-12, S-24, S-25, S-30, S-34, S-39, S-40, S-42, S-43, S44, S-45, S-60, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-72, S-76, S-78, S-81, S-83, S-84, и их любой комбинации для связывания с сортилином; (g) антитело против сортилина конкурирует с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из S-8, S-49, S-50, и их любой комбинации для связывания с сортилином; или (h) антитело против сортилина, которое по существу связывает такой же сортилиновый эпитоп, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из: S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S12, S-14, S-15, S-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-24, S-25, S-26, S-28, S-29, S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, S-42, S-43, S-44, S-45, S-48, S-49, S-50, S-51, S-55, S-57, S-58, S-59, S-60, S-61, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-69, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-78, S-81, S-82, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина содержит вариабельный домен легкой цепи и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 317-334, 337-338, 341-345, 348-357, 360-365, 368-372, 375-376, 379-380, 389-392, 395-402, 407-414, 421-422, 425-433, 436-444, 447-448, 451-461, 464-465 и 470-479. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина представляет собой класс IgG, класс IgM или класс IgA; или (b) антитело против сортилина имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; (c) антитело против сортилина имеет изотип IgG1 человека или мыши и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; (d) антитело против сортилина имеет изотип IgG2 и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; или (e) антитело против сортилина имеет изотип IgG4 и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, и их любой комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, Fc-участок одной или более из (c), (d) и (e) дополнительно содержит: (a) одну или более дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из A330L, L234F, L235E, P331S и любой их комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; (b) Fc-участок дополнительно содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из M252Y, S254T, T256E и любой их комбинации, причем нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU или Kabat; или (c) аминокислотную замену S228P в соответствии с нумерацией EU или Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, (a) антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих, значение которой лежит в диапазоне от около 100 нМ до около 0,005 нМ, или менее 0,005 нМ; (b) антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих, значение которой лежит в диапазоне от около 70,4 нМ до около 0,005 нМ, или менее 0,005 нМ; или (c) антитело против сортилина обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих, значение которой лежит в диапазоне от около 40,3 нМ до около 0,07 нМ, или менее 0,07 пМ. В определенных вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина представляет собой антитело против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или повреждение, выбранное из группы, состоящей из лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной
- 22 043015 гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, воспалительных нарушений, артрита, рассеянного склероза, нарушения метаболизма, ожирения, резистентности к инсулину, диабета 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранения или одного или более нежелательных симптомов естественного старения, включающих введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения при применении для предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или повреждение, выбранное из группы, состоящей из лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, воспалительных нарушений, артрита, рассеянного склероза, нарушения метаболизма, ожирения, резистентности к инсулину, диабета 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранения или одного или более нежелательных симптомов естественного старения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения для производства лекарственного средства для предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или повреждение, выбранное из группы, состоящей из лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, воспалительных нарушений, артрита, рассеянного склероза, нарушения метаболизма, ожирения, резистентности к инсулину, диабета 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранения или одного или более нежелательных симптомов естественного старения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу предотвращения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или поражение, выбранные из группы, состоящей из лобно-височной деменции, прогрессирующего супрануклеарного паралича, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, деменции, инсульта, болезни Паркинсона, острого рассеянного энцефаломиелита, дегенерации сетчатки, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, рассеянного склероза, септического шока, бактериальной инфекции, артрита и остеоартрита, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения, применяемого для предотвращения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание,
- 23 043015 нарушение или поражение, выбранные из группы, состоящей из лобно-височной деменции, прогрессирующего супрануклеарного паралича, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, деменции, инсульта, болезни Паркинсона, острого рассеянного энцефаломиелита, дегенерации сетчатки, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, рассеянного склероза, септического шока, бактериальной инфекции, артрита и остеоартрита. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения в производстве лекарственного средства для предотвращения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или поражение, выбранные из группы, состоящей из лобно-височной деменции, прогрессирующего супрануклеарного паралича, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, деменции, инсульта, болезни Паркинсона, острого рассеянного энцефаломиелита, дегенерации сетчатки, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, рассеянного склероза, септического шока, бактериальной инфекции, артрита и остеоартрита.
Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу ингибирования одного или более из нейровоспаления, аксонопатии, характеризующейся коротким аксональным отростком и аномальным разветвлением, микроглиальной активации и воспалительного ответа, включающего введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения при применении для ингибирования одного или более из нейровоспаления, аксонопатии, характеризующейся коротким аксональным отростком и аномальным разветвлением, микроглиальной активации и воспалительного ответа. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения в производстве лекарственного средства для ингибирования одного или более из нейровоспаления, аксонопатии, характеризующейся коротким аксональным отростком и аномальным разветвлением, микроглиальной активации и воспалительного ответа. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу стимулирования одного или более из заживления ран, аутофагии и выведения агрегатов белков, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения при применении для стимулирования одного или более из заживления ран, аутофагии и выведения агрегатов белков. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения для производства лекарственного средства для стимулирования одного или более из заживления ран, аутофагии и выведения агрегатов белков. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу предотвращения, снижения риска или лечения индивида, болеющего артритом, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения при применении для предотвращения, снижения риска или лечения индивида, болеющего артритом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения в производстве лекарственного средства для предотвращения, снижения риска или лечения индивида, болеющего артритом. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к способу уменьшения экспрессии одного или более провоспалительных медиаторов, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к антителу против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения при применении для уменьшения экспрессии одного или более провоспалительных медиаторов. Другие аспекты по настоящему описанию относятся к применению антитела против сортилина по любому из предшествующих вариантов реализации изобретения для производства лекарственного средства для уменьшения экспрессии одного или более провоспалительных медиаторов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более провоспалительных медиаторов, выбирают из группы, состоящей из IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-Щ, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5.
В некоторых вариантах реализации изобретения, которые могут быть объединены с любым из предшествующих вариантов реализации изобретения, антитело против сортилина включает два или более антител против сортилина.
- 24 043015
Краткое описание чертежей
Файл патента или заявки содержит по меньшей мере одно графическое изображение, выполненное в цвете. Копии этого патента или публикации заявки на патент с цветным графическим изображением(ями) будут предоставлены патентным ведомством по запросу и после уплаты необходимой пошлины.
На фиг. 1 изображено несколько видов белка сортилина человека, показаны сайты связывания сортилина антител против сортилина S-1, S-65, S-49, S-78, S-44 и S-8. Скелет сортилина отображен в виде светло-серого представления. Линейные участки связывания, выделенные цветами, идентифицированы для антител S-1 (зеленый), S-65 (красный), S-49 (синий), S-78 (желтый), S-44 (розовый) и S-8 (фиолетовый). В пределах участков гибких петель сортилина обнаружены сайты связывания.
На фиг. 2A-2C показано определение параметров взаимодействия между сортилином и програнулином с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и ELISA. На фиг. 2A показаны данные кинетического анализа связывания програнулина (PGRN) с His-захваченным сортилином 1 (SORT1) с использованием анализа Biacore SPR. На фиг. 2B показано связывание биотинилированного PGRN человека с иммобилизированным SORT1 человека на планшете для ELISA. На фиг. 2C показано связывание биотинилированного PGRN мыши с иммобилизированным SORT1 мыши на планшете для ELISA.
На фиг. 3A показано авидное связывание антитела с сортилином человека (b-H Sort) на сенсорном чипе и конкуренция с антителами против сортилина (IgG). На фиг. 3B показано определение параметров взаимодействий между сортилином (SORT) и програнулином (PGRN) с использованием анализа Forte Bio и конкуренция с антителами против сортилина (IgG). Левый столбец: биотинилированный програнулиновый пептид иммобилизирован на сенсорном чипе и в раствор добавлен SORT, с последующим добавлением IgG. Центральный столбец: биотинилированный рекомбинантный SORT человека иммобилизирован на сенсорном чипе и в раствор добавлен рекомбинантный PGRN, с последующим добавлением IgG. Правый столбец: биотинилированный рекомбинантный PGRN иммобилизирован на сенсорном чипе и в раствор добавлен SORT человека, с последующим добавлением IgG. (SORT=сортилин, PGRN=програнулин, b=биотинилированный, H=человека, mono=мономерный).
На фиг. 4A показано примеры различных классов антител против сортилина, которые блокируют связывание програнулина в различных положениях ForteBio (описанных на фиг. 3B). На левом столбце изображено конкурентное связывание с использованием SORT человека, который связывает пептид PGRN, иммобилизированный на сенсорном чипе. На среднем столбце изображено конкурентное связывание с использованием нативного белка PGRN, который связывает SORT человека, иммобилизированный на сенсорном чипе. На правом столбце изображено конкурентное связывание с использованием нативного белка SORT, который связывает нативный белок PGRN, иммобилизированный на чипе SensorChip. На фиг. 4B показано связывание антител против сортилина с His-захваченным сортилином (SORT1) с использованием Biacore SPR при pH 6,4 и pH 7,4.
На фиг. 5A-5D показано определение параметров взаимодействия на клетках между сортилином и програнулином. На фиг. 5A показано график FACS, отображающий уровни связывания PGRN-Bio человека с клетками HEK293T, экспрессирующими SORT человека. На фиг. 5B показано график FACS, отображающий уровни связывания PGRN-Bio человека с контрольными клетками. На фиг. 5C показано среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), отложенную на графике по отношению к концентрации PGRN человека, связывающегося с клетками HEK293T, экспрессирующими SORT человека (круги) или контрольный антител (квадраты). На фиг. 5D показано значение MFI, отложенное на графике по отношению к концентрации PGRN мыши, связывающегося с клетками HEK293T, экспрессирующими SORT мыши (круги) или контрольными клетками (квадраты).
На фиг. 6A-6E показано дозозависимое ингибирование связывания антителами против сортилина биотинилированного програнулина с клетками, которые экспрессируют сортилин. На фиг. 6A и фиг. 6B изображено ингибирование связывания антителами програнулина человека, связывающегося с сортилином человека. На фиг. 6C и фиг. 6D изображено ингибирование антителами связывания програнулина мыши с сортилином мыши. На фиг. 6E изображено ингибирование связывания антителами против сортилина с концентрацией 67 нМ биотинилированного програнулина человека с клетками, которые экспрессируют сортилин человека.
На фиг. 7 изображено исследование синергических влияний комбинаций антитела на связывание биотинилированного програнулина с сортилином, экспрессирующимся на клетках HEK293T. S-49, S-64 (бин 4) и S-16 (бин 1) комбинировали либо с изотипным контрольным антителом, либо с друг с другом.
На фиг. 8A показано результаты анализа с визуализацией для времязависимого связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченного програнулина (PGRN) и его блокирование 10 мкМ сортилинового пропептида, который конкурирует с PGRN. Клетки, трансфицированные либо сортилином человека (hSort), либо lacZ, инкубировали с програнулином (PGRN) в течение 4, 15, 30 или 60 мин и после этого проводили визуализацию. Данный анализ предназначен для исследования способности антител против сортилина предотвращать связывание и эндоцитоз програнулина (PGRN) при участии сортилина (Sort). На фиг. 8B показано результаты для графика FACS, изображающие времязависимое связывание и эндоцитоз PGRNDyLight650 клетками, которые экспрессируют сортилин человека. Данный анализ предназначен для ис- 25 043015 следования способности антител против сортилина предотвращать связывание и эндоцитоз флуоресцентно меченого програнулина (PGRN) при участии сортилина человека. На фиг. 8C показано результаты для графика FACS, изображающие времязависимое связывание и эндоцитоз PGRN-DyLight650 клетками, которые экспрессируют сортилин мыши. Данный анализ предназначен для исследования способности антител против сортилина предотвращать связывание и эндоцитоз флуоресцентно меченого програнулина (PGRN) при участии сортилина мыши. PGRN-DyLight650 человека добавляли к Sort человека (фиг. 8B) или Sort мыши (фиг. 8C), или контрольным клеткам HEK293T, а количество связанного и поглощенного эндоцитозом PGRN определяли анализом FACS. На фиг. 8D показано результаты анализа FACS, демонстрирующие способность ингибирующего PGRN человека пропептида Sort предотвращать связывание и эндоцитоз флуоресцентно меченого PGRN при участии сортилина человека. На фиг. 8E показано результаты анализа FACS, демонстрирующие способность ингибирующего PGRN мыши пропептида Sort предотвращать связывание и эндоцитоз флуоресцентно меченого PGRN при участии сортилина мыши.
На фиг. 9A-9D показано результаты анализов, демонстрирующие способность антител против сортилина увеличивать эндогенные секретированные уровни програнулина в среде астроцитной линии клеток человека U-251, которые экспрессируют эндогенный сортилин человека. На фиг. 9A отображено результаты для клеток U-251, инкубированных с 50 нМ антител против сортилина в течение 72 ч. На фиг. 9B отражено результаты для клеток U-251, инкубированных с 5 нМ антител против сортилина в течение 72 ч. На фиг. 9C отображено результаты для клеток U-251, инкубированных с 50 нМ антител против сортилина в течение 72 ч. На фиг. 9D отражено результаты для клеток U-251, инкубированных с 5 нМ антител против сортилина в течение 72 ч. Уровни програнулина в среде количественно определяли анализом ELISA. Показаны средние значения двух независимых экспериментов. Статистические расчеты выполняли с использованием анализа ANOVA, а звездочками показаны антитела, которые статистически значимо повышали уровни програнулина.
На фиг. 10A-10F показано влияние антител против сортилина на уровни сортилина на клеточной поверхности на человеческих клетках U-251 или мышиных клетках N2A и соответствующую способность увеличивать секретируемые уровни эндогенного програнулина (PGRN) дозозависимым образом. Клетки инкубировали в течение 72 ч с 50 нМ блокирующего IgG, собирали и окрашивали их антителом против сортилина, которое связывает другой участок на сортилине, чем исследуемые антитела. На фиг. 10A показано экспрессию на клеточной поверхности сортилина на клетках U-251 в виде процента (%) от контрольных уровней, которые были предварительно обработаны исследуемыми антителами, перечисленными на оси X. Серые прямоугольники отмечают антитела, которые показали статистически значимое уменьшение для сортилина (ANOVA, p<0,05), тогда как белые прямоугольники отмечают антитела, которые не показали снижения для сортилина. Черные прямоугольники отмечают контрольный IgG. На фиг. 10B показано экспрессию на клеточной поверхности сортилина на клетках N2A в виде процента (%) от контрольных уровней, которые были предварительно обработаны исследуемыми антителами, перечисленными на оси X. Серые прямоугольники отмечают антитела, которые показали статистически значимое уменьшение для сортилина (ANOVA, p<0,05), тогда как белые прямоугольники отмечают антитела, которые не показали снижения для сортилина. Черные прямоугольники отмечают контрольный IgG. На фиг. 10C и фиг. 10D изображено уровни сортилина на клеточной поверхности в клетках U-251, которые инкубировали с другой концентрацией антител против сортилина в течение 72 ч. Антитела против сортилина индуцируют дозозависимое уменьшение в экспрессии сортилина на клеточной поверхности. Уменьшение уровней сортилина отображено уменьшенной интенсивностью флуоресценции (MFI) для антитела S-20, связывающегося с сортилином. На фиг. 10E изображено количественное определение на основе ELISA соответствующих уровней PGRN в среде клеток U-251 на фиг. 10B, которые инкубировали с перечисленными антителами против сортилина в течение 72 ч. Антитела против сортилина, которые уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности, также вызывают дозозависимое увеличение уровней внеклеточного PGRN. На фиг. 10F показано корреляцию между снижением уровней сортилина на клеточной поверхности, индуцированную антителами против сортилина, и увеличением внеклеточных уровней програнулина (PGRN).
На фиг. 11A-11F показано результаты, демонстрирующие, что вливание антитела против сортилина повышает эндогенные уровни програнулина головного мозга в несколько раз на модели болезни Альцгеймера на мышах Tg2576. На фиг. 11A изображено уровни програнулина в различных участках головного мозга, противоположных сайту ICV-влиявания. На фиг. 11B изображено уровни програнулина в различных участках головного мозга, расположенных на стороне сайта ICV-влиявания. Различные участки головного мозга представляют собой гиппокамп (Hip), лобную зону коры (F Ctx) и затылочную зону коры (R Ctx). Мышам Tg2576 возрастом 14 месяцев проводили ICV-вливания буферного раствора, IgG козла или поликлонального антитела козла против сортилина (п=3/группу). На фиг. 11C изображено уровни антитела против сортилина в трех различных участках головного мозга. На фиг. 11D изображено сильную положительную корреляцию между уровнями антитела против сортилина и уровнями эндогенного програнулина (PGRN) (r2=0,92). Более высокие уровни антитела против сортилина ведут к повышению PGRN головного мозга дозозависимым образом. На фиг. 11F изображено уровни пептида Abeta42 во
- 26 043015 фракции растворимых белков после ICV-вливания антитела против сортилина.
На фиг. 12A изображено данные анализа поверхностного плазмонного резонанса (ППР) biacore для отслеживания конкуренции между pro-NGF и антителами против сортилина за связывание с сортилином. Анализ показывает, что сортилин человека, захваченный с чипом Biacore, с последующим связыванием pro-NGF с сортилином, с последующим связыванием антитела против сортилина с сортилином. На фиг. 12B изображено неблокирующий контроль. Если pro-NGF и данное антитело против сортилина связывает такой же участок на сортилине, то связывание pro-NGF будет ингибировать последующее связывание антитела против сортилина. Таким образом, если данное антитело связывает сортилин в одинаковой степени в присутствие (штриховые линии) или отсутствие (сплошные линии) pro-NGF, как изображено на фиг. 12B, то такое антитело не блокирует связывание pro-NGF с сортилином. На фиг. 12C изображено связывание антител против сортилина с сортилином в присутствие (штриховые линии) или отсутствие (сплошные линии) pro-NGF. Показанные антитела являются частично блокированными присутствием связанного с сортилином pro-NGF. Антитела S-1 и S-65 сильно поддаются блокированию. Сплошные линии соответствуют связыванию антител с сортилином в отсутствие pro-NGF. Шриховые линии соответствуют связыванию антител с сортилином в присутствие pro-NGF. Серые линии соответствуют связыванию pro-NGF в присутствие pro-NGF (максимальная конкуренция).
На фиг. 13A-13G изображено уровни экспрессии сортилина на клеточной поверхности после 72 ч инкубации с антителами против сортилина при концентрациях 20 нМ, 5 нМ или 1, 25 нМ. На фиг. 13A, фиг. 13B, фиг. 13C и фиг. 13D изображено экспрессию сортилина на клеточной поверхности на клетках U-251 человека. На фиг. 13E, фиг. 13F и фиг. 13G изображено экспрессию сортилина на клеточной поверхности на клетках N2A мыши. Результаты указывают на то что аффинно зрелые антитела индуцируют увеличенное снижение уровней сортилина на клеточной поверхности, особенно когда применяется самая низкая концентрация 1,25 нМ.
На фиг. 14 изображено ингибирование связывания програнулина (в процентной величине блокирования PGRN) с клетками HEK293T, которые экспрессируют сортилин, 150 нМ аффинно зрелых антител против сортилина, полученных из антител S-15. Аффинно зрелое антитело S-15-6 показало улучшенное блокирование PGRN.
На фиг. 15A и фиг. 15B изображено профили масс-спектроскопии антитела S-2-11, связывающегося с сортилином в отсутствие (фиг. 15A) или присутствие (фиг. 15B) пептидов, полученных в результате расщепления сортилина. Пептиды не конкурируют со связыванием антител с сортилином. Сходное отсутствие конкуренции пептидов наблюдали с другими антителами против сортилина.
На фиг. 16A представляет собой схематическое изображение охвата пептидов после ферментативного протеолиза сортилина. Пептидами, полученными путем протеолиза, охватывалось 94, 78% внеклеточного домена (ECD) сортилина (SEQ ID NO: 714). На фиг. 16B показано пониженное связывание антитела S-30 с конкретными мутантами сортилина, в которых аминокислоты последовательности человека заменены аминокислотами последовательности мыши. Результаты указывают, что для связывания S-30 требуются аминокислоты HVPLVIMT131 или их поднабор. На фиг. 16C показано пониженное связывание антитела S-60 с конкретными мутантами сортилина, в которых аминокислоты последовательности человека заменены аминокислотами последовательности мыши. Результаты показали, что для связывания S-60 требуется аминокислота S595.
На фиг. 17A-17E изображено графики поверхностного плазмонного резонанса. На фиг. 17A показано уровни связывания програнулина (PGRN) с сортилином в присутствие или отсутствие нейротензина (NTS). На фиг. 17B показано уровни связывания антитела S-15 против сортилина с сортилином в присутствие или отсутствие NTS. На фиг. 17C показано уровни связывания антитела S-22 против сортилина с сортилином в присутствие или отсутствие NTS. На фиг. 17D показано уровни связывания антитела S-49 против сортилина с сортилином в присутствие или отсутствие NTS. На фиг. 17E показано уровни связывания антитела S-60 против сортилина с сортилином в присутствие или отсутствие NTS. NTS не влияет на связывание антител с сортилином, показывая, что антитела против сортилина не связываются с сайтом связывания NTS.
На фиг. 18A изображено снижение уровней белка сортилина в первичных макрофагах человека под действием как полноразмерных антител (IgG), так и антительных Fab антител против сортилина. На фиг. 18B изображено снижение уровней белка сортилина в первичных дендритных клетках человека под действием как полноразмерных антител (IgG). На гели наносили 15 мкг белка, проводили блоттинг и окрашивание антителами против сортилина и бета-актина.
На фиг. 19A и 19B изображено результаты измерений периода полувыведения антител против сортилина in vivo после внутрибрюшинной (ВБ) инъекции 40 мг/кг на день 0. На фиг. 19A изображено инъекцию человеческих N297A антител-IgG1 против сортилина, n=4-5 животных/группу. На фиг. 19B изображено инъекции мышиного N297A антитела-IgG1 против сортилина. Данные подбирали с использованием однофазной убывающей функции (Graph Pad Prism). Антитела против сортилина имели более короткий период полувыведения, чем контрольный IgG.
На фиг. 20A-20D изображено результаты измерений уровней програнулинового белка (PGRN) мыши в образцах плазмы мышей в различные моменты времени после инъекции 4 0 мг/кг антител против
- 27 043015 сортилина. На фиг. 20A и фиг. 20B изображено результаты с мышиными N297A антителами-IgGl против сортилина. На фиг. 20С и фиг. 20D изображено результаты с человеческим N297A антителом-IgG1 против сортилина. На фиг. 20B и фиг. 20D обобщен статистический анализ с использованием одностороннего анализа Anova с ретроспективным тестом Тьюки. Звездочки указывают уровень значимости по сравнению с ms или hu IgG1-изотипной контрольной группой: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Антитела против сортилина индуцируют в плазме увеличение уровней белка PGRN с длительностью эффекта, которая коррелирует с периодом полувыведения антител.
На фиг. 21A-21F изображено результаты измерений уровней белка сортилина с использованием анализа вестерн-блота лизатов лейкоцитов, взятых у мышей. В качестве контроля нагрузки и для нормализации использовали анти-бета-актин. На фиг. 21A и фиг. 21B показаны уровни белка на день 5. На фиг. 21C и фиг. 21D показаны уровни белка на день 12. Антитела против сортилина S-20, S-15-6 и S-2-11 индуцируют статистически значимое снижение уровней белка сортилина на день 5 (односторонний анализ Anova с ретроспективным тестом Тьюки. Звездочки указывают уровни значимости: **p<0,01, ***p<0,001). Антитело S-15-6 индуцировало сниженные уровни белка сортилина на день 12 у 2 из 3 мышей. На фиг. 21E и 21F показаны уровни белка в лейкоцитах после длительного шестинедельного курса еженедельных ВБ инъекций мышам с дозами антитела S15-6 против сортилина 20, 40 или 80 мг/кг. Все три дозы приводят к сильному и статистически значимому снижению регуляции сортилина в лейкоцитах (****p<0,0001 по сравнению с контрольным IgG, односторонний анализ ANOVA).
На фиг. 22A-22D изображено позитивную корреляцию между уровнями IgG антител против сортилина и уровнями програнулинового белка (PGRN) в образцах головного мозга дикого типа (WT) мышей после 2 недель ICV-вливания. Отсутствует значимая корреляция с изотипным контрольным антителом. На фиг. 22A изображено анализ с антителом S-15. На фиг. 22B изображено анализ с антителом S-20. На фиг. 22C изображено анализ с антителом S-30. На фиг. 22D изображено анализ с изотипным контрольным антителом.
На фиг. 23A изображено уровни IgG, измеренные после ВВ инъекции 40 мг/кг антитела против сортилина S-15-6 huIgG1 N297A. Периоды полувыведения IgG увеличиваются с уменьшением уровней сортилина, что демонстрирует тот факт, что относительно короткий период полувыведения S-15-6 в организме мышей дикого типа (WT) происходит скорее из-за деградации после захвата мишени, чем из-за иммуногенности или другой неспецифической деградации. На фиг. 23B изображено повышенную базовую уровней програнулинового (PGRN) белка у мышей с нокаутом (KO) сортилина по сравнению с гетерозиготными (Het) по сортилину однопометными мышами и мышами дикого типа (WT). Уровни PGRN измеряли в образцах плазмы с использованием анализа ELISA. На фиг. 23C изображено результаты, показывающие, что антитело S-15-6 индуцировало увеличение уровней програнулинового (PGRN) белка до восьми дней после инъекции мышам дикого типа (WT) и гетерозиготным (Het) по сортилину мышам, но не у мышей с нокаутом (KO) по сортилину. Черные стрелки указывают инъекцию антитела S-15-6 на сутки 7. ****p<0,0001, n. s. - не значимый по одностороннему анализу ANOVA, KO по сравнению cHet и по сравнению cWT.
На фиг. 24 изображено результаты исследования индуцированного коллагеном артрита у мышей. Выполненные два раза в неделю инъекции 40 мг/кг антитела S-15-6 против сортилина значимо снижали показатели клинического артрита по сравнению с контрольными группами (ФСБ и MOPC-21/ msIgG1).
На фиг. 25A изображено уровни в сыворотке програнулина через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 25B изображено количество перитонеальных нейтрофилов через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 25C изображено количество больших перитонеальных макрофагов через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 25D изображено количество малых перитонеальных макрофагов через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). Данные результаты отображают повышенные уровни програнулина; однако количество перитонеальных нейтрофилов, больших перитонеальных макрофагов и малых перитонеальных макрофагов не имели статистически значимой разницы. Незакрашенные круги представляют мышей дикого типа, а незакрашенные квадраты представляют мышей с нокаутом по сортилину. n=8-10 мышей/группу. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 и ****p<0,0001 по 1-стороннему ANOVA с тестом со множественными сравнениями Тьюки.
На фиг. 26A изображено уровни в сыворотке IL-6 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26B изображено уровни в сыворотке TNF-альфа через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26C изображено уровни в сыворотке IFN-гамма через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26D изображено уровни в сыворотке IL-10 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26E изображено уровни в сыворотке IL-12p70 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26F изображено уровни в сыворотке IL-12/IL-23p40 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26G изображено уровни в сыворотке IL-1-альфа через 1,5
- 28 043015 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 26H изображено уровни в сыворотке IL-1-бета через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). Незакрашенные круги представляют мышей дикого типа, а незакрашенные квадраты представляют мышей с нокаутом по сортилину. n=8-10 мышей/группу. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 и ****p<0,0001 по 1-стороннему ANOVA с тестом со множественными сравнениями Тьюки.
На фиг. 27A изображено уровни в сыворотке CXCL1 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 27B изображено уровни в сыворотке CCL2 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 27C изображено уровни в сыворотке CCL3 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 27D изображено уровни в сыворотке CCL4 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 27E изображено уровни в сыворотке CCL5 через 1,5 часа после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). Незакрашенные круги представляют мышей дикого типа, а незакрашенные квадраты представляют мышей с нокаутом по сортилину. n=8-10 мышей/группу. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 и ****p<0,0001 по 1-стороннему ANOVA с тестом со множественными сравнениями Тьюки.
На фиг. 28A изображено уровни в сыворотке IL-6 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28B изображено уровни в сыворотке TNF-альфа через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28C изображено уровни в сыворотке IFN-гамма через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28D изображено уровни в сыворотке IL-10 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28E изображено уровни в сыворотке IL-12p70 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28F изображено уровни в сыворотке IL-12/IL-23p40 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28G изображено уровни в сыворотке IL-1-альфа через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 28H изображено уровни в сыворотке IL-1-бета через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). Незакрашенные круги представляют мышей дикого типа, а незакрашенные квадраты представляют мышей с нокаутом по сортилину. n=8-10 мышей/группу. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 и ****p<0,0001 по 1-стороннему ANOVA с тестом со множественными сравнениями Тьюки.
На фиг. 29A изображено уровни в сыворотке CXCL1 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 29B изображено уровни в сыворотке CCL2 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 29C изображено уровни в сыворотке CCL3 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 29D изображено уровни в сыворотке CCL4 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). На фиг. 29Е изображено уровни в сыворотке CCL5 через 6 часов после введения LPS мышам дикого типа и мышам с нокаутом по сортилину (сортилин -/-). Незакрашенные круги представляют мышей дикого типа, а незакрашенные квадраты представляют мышей с нокаутом по сортилину. n=8-10 мышей/группу. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 и ****p<0,0001 по 1-стороннему ANOVA с тестом со множественными сравнениями Тьюки.
- 29 043015
Подробное описание сущности изобретения
Общие методы.
Методы и процедуры, описанные или упомянутые в данном документе, в общем случае хорошо известны и обычно применяются специалистами в данной области техники с использованием обычной методики, такой как, например, широко используемые методики, описанные в
Sambrooketal., MolecularCloning: ALaboratoryManual 3dedition (2001)
ColdSpringHarborLaboratoryPress, ColdSpringHarbor, Ν. Y.; CurrentProtocolsinMolecularBiology (F. M. Ausubel, etal. eds., (2003)); серии MethodsinEnzymology (AcademicPress, Inc. ): PCR 2: APracticalApproach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor, eds., (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Lntroduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Lmmunology (D. M. Weir and С. C. Blackwell, eds. ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and Μ. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Lmmunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Lmmunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993) .
Определения.
Как используется в данном документе, термин предотвращение включает обеспечение профилактики в отношении возникновения или рецидива конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния у индивида. Индивид может быть предрасположен, восприимчив к конкретному заболеванию, нарушению или патологическому состоянию или подвергаться риску развития такого заболевания, нарушения или патологического состояния, но еще не иметь установленного диагноза заболевания, нарушения или патологического состояния.
Как используется в данном документе, индивид, подвергающийся риску развития конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния может иметь или может не иметь обнаруживаемого заболевания или симптомов заболевания, и может иметь или может не иметь проявления обнаруживаемого заболевания или симптомов заболевания до начала использования способов лечения, описанных в данном документе. Подвергающийся риску означает, что индивид имеет один или более факторов риска, которые являются измеряемыми параметрами, которые коррелируют с развитием конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния, как это известно в данной области техники. Индивид, имеющий один или более из этих факторов риска, имеет более высокую вероятность развития конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния, чем индивид без одного или более из этих факторов риска.
Как используется в данном документе, термин лечение относится к клиническим вмешательствам, направленным на изменение естественного течения заболевания у индивидуума, подвергаемого лечению, в процессе клинической патологии. Требуемые эффекты лечения включают уменьшение скоро- 30 043015 сти прогрессирования, уменьшение интенсивности или временное ослабление патологического состояния и ремиссию, или улучшенный прогноз конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния. Индивид является успешно прошедшим лечение, например, если один или более симптомов, связанных с конкретным заболеванием, нарушением или патологическим состоянием смягчается или устраняется.
Эффективное количество относится к по меньшей мере количеству, эффективному при таких дозировках и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата. Эффективное количество может быть обеспечено за одно или более введений.
Терапевтически эффективное количество представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, необходимую для осуществления измеримого улучшения конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния. Терапевтически эффективное количество в данном документе может быть различным в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела пациента, и способности антитела против сортилина вызывать целевой ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при использовании которого терапевтические благоприятные эффекты превосходят любые токсические или отрицательные эффекты антитела против сортилина.
Как используется в данном документе, введение в сочетании с другим соединением или композицией включает в себя одновременное введение и/или введение в разное время. Введение в сочетании также включает в себя введение как совместной лекарственной формы, так и введение в форме отдельных композиций, включая различные частоты приема или интервалы, и использование одного способа введения или разных способов введения.
Индивид в целях лечения, предупреждения или снижения риска относится к любому животному, относящемуся к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также зоопарковых животных, животных для участия в спортивных мероприятиях или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, кролики, крупный рогатый скот, свиньи, хомяки, песчанки, мыши, хорьки, крысы, кошки и тому подобные. Предпочтительно, индивид представляет собой человека.
Термин иммуноглобулин (Ig) используется в данном документе взаимозаменяемо с термином антитело. В данном документе термин антитело используется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.
Основная единица 4-цепочечного антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Объединение в пару VH и VL приводит к формированию единичного антигенсвязывающего сайта. Структуру и свойства различных классов антител см., например, Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.
L-цепь любого вида позвоночных животных может быть отнесена к одному из двух четко различаемых типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ), исходя из аминокислотных последовательностей их консервативных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (CH), иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначенные соответственно альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ). Классы γ и α дополнительно подразделяются на подклассы (изотипы) на основании относительно незначительных различий в последовательности CH и функции, например у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурации различных классов иммуноглобулинов, которые в целом описаны, например, в публикации Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders Co., 2000).
Нативные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя количество дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепи также содержат регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. На одном конце каждой тяжелой цепи находится вариабельный домен (VH), а за ним - ряд константных доменов. На одном конце каждой легкой цепи находится вариабельный домен (VL), а на другом конце - константный домен; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют область взаимодействия между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи.
Выделенное антитело, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, представляет собой антитело, которое идентифицируется, выделяется и/или извлекается из компонента его окру- 31 043015 жающей среды при получении (например, природным или рекомбинантным путем). Предпочтительно выделенный полипептид не связан со всеми другими компонентами загрязняющих веществ из его окружающей среды при получении. Загрязняющие компоненты из его окружающей среды при получении, такие как те, которые получены из рекомбинантных трансфицированных клеток, представляют собой материалы, которые могут отрицательно влиять на исследовательское, диагностическое или терапевтические применения антитела, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворимые вещества. В предпочтительных вариантах реализации изобретений полипептид будет очищен: (1) более чем на 95% по массе антитела, как определено, например, по методу Лоури, а в некоторых вариантах реализации изобретения - более чем на 99% по массе; (2) до достаточной степени для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности посредством использования секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности, определяемой с помощью ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания с помощью Кумасси синего или, предпочтительно, окрашивания серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных T-клеток, поскольку по меньшей мере один компонент природной среды антитела будет отсутствовать. Обычно, как правило, выделенный полипептид или антитело будут получены посредством по меньшей мере одного этапа очистки.
Вариабельный участок или вариабельный домен антитела, такого как антитело против сортилина по настоящему описанию, относится к аминоконцевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи могут обозначаться как VH и VL, соответственно. Эти домены обычно являются наиболее вариабельными частями антитела (по сравнению с другими антителами того же класса) и содержат антигенсвязывающие сайты.
Термин вариабельный относится к тому факту, что среди антител некоторые сегменты вариабельных доменов сильно различаются по последовательностям, например антитела против сортилина по настоящему описанию. V-домен опосредует антигенное связывание и определяет специфичность конкретного антитела к своему конкретному антигену. В то же время, вариабельность не является равномерно распределенной по всему диапазону вариабельных доменов. Вместо этого она сосредоточена в трех сегментах вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, называемых гипервариабельными участками (HVR). Более консервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (FR). Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR-участка, преимущественно принимающих конфигурацию бета-листа и соединенных тремя HVR, образующими петли, соединяющие структуры бета-типа, а в некоторых случаях - являющиеся их частью. HVR в каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости от FR-участков и, вместе с HVR другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело зависимой клеточной токсичности.
Как используется в данном документе, термин моноклональные антитело относится к антителу, такому как антитело против сортилина по настоящему описанию, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. из популяции, отдельные антитела в которой являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирований), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного или более антигенных сайтов. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело по настоящему описанию может быть биспецифическим антителом. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на одном или более антигенных сайтов. Модификатор моноклональное указывает на то свойство, что антитело получено из практически однородной популяции антител; и его не следует интерпретировать как требование о продукции антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, которые предполагается применять в соответствии с настоящим описанием, могут быть получены различными методиками, включая, например, технологии фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 101(34): 12467472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), гибридомный метод (например, Kohler and Milstein., Nature, 256: 495-97 (1975); Hongoet al., Hybridoma, 14(3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)), методы рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567) и технологии продукции антител человека или аналогов антител человека в организмах животных, содержащих части или полные локусы или гены иммуноглобулинов человека, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33
- 32 043015 (1993); патенты США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016; Marks et al.,
Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Термины полноразмерное антитело, интактное антитело или полное антитело используются взаимозаменяемо для обозначения антитела, такого как антитело против сортилина по настоящему описанию в его, по существу, интактной форме, в отличие от фрагмента антитела. Конкретнее, полные антитела включают в себя антитела, обладающие тяжелой и легкой цепями, включая Fc-участок. Константные домены могут быть константными доменами нативной последовательности (например, человеческими константными доменами нативной последовательности) или их вариантами аминокислотной последовательности. В некоторых случаях интактное антитело может иметь одну или более эффекторных функций.
Фрагмент антитела содержит часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий и/или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (см. патент США 5641870, пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); молекулы антител с одной цепью и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.
При расщеплении папаином антител, таких как антитела против сортилина по настоящему описанию, образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемые фрагментами Fab, и остаточный фрагмент Fc, указывающий на хорошую способность к кристаллизации. Фрагмент Fab состоит из целой L-цепи вместе с доменом вариабельной области H-цепи (VH) и первым константным доменом одной из тяжелых цепей (CH1). Каждый фрагмент Fab является моновалентным по отношению к связыванию с антигеном, т.е. содержит единственный сайт связывания с антигеном. Обработка антитела пепсином позволяет выделить одиночный крупный фрагмент F(ab')2, который приблизительно соответствует двум фрагментам Fab с различной антигенсвязывающей активностью, соединенным дисульфидной связью, и сохраняет способность к перекрестному сшиванию антигена. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab тем, что несут несколько дополнительных остатков на карбоксиконце домена CH1, включая один или более остатков цистеина из шарнирного участка антитела. Fab'-SH - это обозначение, используемое в настоящем документе для Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов содержит(ат) свободную тиольную группу. Фрагменты антител F(ab')2 первоначально получали в виде пар фрагментов Fab', между которыми расположены шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие варианты химического соединения фрагментов антител.
Фрагмент Fc содержит карбоксиконцевые части обеих Н-цепей, соединенные друг с другом дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями Fc-участка, который также распознается рецепторами Fc (FcR), встречающимися на некоторых типах клеток.
Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный сайт распознавания и связывания антигена. Этот фрагмент состоит из димера доменов вариабельного участка одной тяжелой и одной легкой цепей, жестко связанных посредством нековалентных связей. При укладке этих двух доменов наружу выступают шесть гипервариабельных петель (по 3 петли каждой из H- и L-цепей), аминокислотные участки которых участвуют в связывании с антигеном и придают антителу специфичность по отношению к связыванию антигена. В то же время даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.
Одноцепочечные Fv, также сокращенно обозначаемые как sFv или scFv представляют собой фрагменты антител, включающие домены VH и VL антител, соединенные в составе одиночной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий sFv формировать структуру, требуемую для связывания с антигеном. Для обзора sFv, см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994).
Функциональные фрагменты антител, таких как антитела против сортилина по настоящему описанию, содержат часть интактного антитела, как правило, включающую антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или F-участок антитела, который сохраняет способность связывания FcR или обладает модифицированной способностью связывания FcR. Примеры фрагментов антитела включают линейное антитело, молекулы одноцепочечного антитела и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антитела.
Термин диатела относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем конструирования фрагментов sFv (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами VH и VL, благодаря чему достигается межцепочечное, а не внутрицепочечное сопряжение доменов V, приводящее к образованию бивалентного фрагмента, т.е. фрагмента, несущего два сайта связывания с антигеном. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры из двух пересекающихся фрагментов sFv, в которых домены VH и VL двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Диатела подробнее описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Nat'l
- 33 043015
Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993).
Как используется в данном документе, химерное антитело относится к антителу (иммуноглобулину), такому как антитело против сортилина по настоящему описанию, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81: 6851-55 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела в данном документе включают антитела PRIMATIZED®, причем антигенсвязывающий участок антитела образован антителом, полученным, например, путем иммунизации макак представляющим интерес антигеном. Как используется в данном документе, гуманизированное антитело применяют в качестве подтипа химерных антител.
Гуманизированные формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), таких как антитела против сортилина по настоящему описанию, представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, образованную иммуноглобулином нечеловеческого происхождения. В одном варианте реализации изобретения гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки из HVR реципиента заменены остатками HVR не относящегося к человеку вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, имеющим требуемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях FR-остатки иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации могут быть внесены для дополнительного улучшения характеристики антитела, такой как аффинность связывания. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все, по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют гипервариабельным петлям последовательности иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или по существу все из участков FR представляют собой участки FR последовательности иммуноглобулина человека, хотя участки FR могут включать замену одного или более отдельных остатков FR, которые улучшают характеристики антитела, такие как аффинность связывания, изомеризация, иммуногенность и т. п. Количество этих аминокислотных замен в FR, как правило, составляет не более 6 в H-цепи, и не более 3 в L-цепи. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящую из иммуноглобулина человека. Более подробные данные, см., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также, например, Vaswani and Hamilton, Akk. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и патенты США №6982321 и 7087409.
Антитело человека представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, продуцируемое организмом человека и/или полученное с использованием любого из методик получения антител человека, как описано в данном документе. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения. Антитела человека можно получать, используя различные методики, известные в данной области техники, в том числе библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Также для получения моноклональных антител человека доступны способы, описанные в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). См. также, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001). Антитела человека можно получать введением антигена трансгенному животному, которое модифицировано для продукции таких антител в ответ на иммунизацию антигеном, и эндогенные локусы которого заблокированы, например, иммунизированных ксеномышей (см., например, патент США №6075181 и 6150584, касательно технологии XENOMOUSE™). См. также, например, Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006) касательно антител человека, полученных посредством гибридомной технологии с B-клетками человека.
Как используют в данном документе, термин гипервариабельный участок, HVR или HV относится к участкам вариабельного домена антитела, такого как в антитела против сортилина по настоящему описанию, которые обладают гипервариабельными последовательностями и/или образуют структурно определенные петли. Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (LI, L2, L3). В природных антителах H3 и L3 характеризуются наибольшим разнообразием из шести HVR, и в частности, считается, что H3 играет уникальную роль в сообщении антителам высокой специфичности. См., например, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:
- 34 043015
1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). Фактически, антитела верблюдовых природного происхождения, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) and Sheriff et al., Nature
Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).
Существует ряд определений HVR, охватываемых настоящей заявкой. HVR, которые представляют собой определяющие комплементарность участки по EU или Kabat (CDR), основанные на вариабельности последовательностей и используемые наиболее широко (Kabat et al., выше). Chothia вместо этого указывает на расположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Участки HVR AbM представляют собой компромисс между CDR по EU или Kabat и структурными петлями Chothia, и они используются программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular's AbM. Определение контактных HVR основано на анализе доступных кристаллических структур комплексов. Остатки каждого из указанных HVR отмечены ниже.
Петля Kabat AbM Chothia Контакт
LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (нумерация Kabat)
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (нумерация Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101H 93-H101
HVR могут содержать расширенные HVR, следующего описания: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2), и 89-97 или 89-96 (L3) в VL, и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (предпочтительный вариант реализации изобретения) (H2), и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельных доменов пронумерованы согласно EU и Kabat et al., выше, для каждого из этих определений удлиненных HVR.
Остатки каркасного участка или FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков HVR, как определено в данном документе.
Фраза нумерация остатков вариабельных доменов по EU или Kabat или нумерация положений аминокислот по EU или Kabat и их вариации, относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи компиляции антител в EU или Kabat et al., выше. При использовании указанной системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорачиванию или инсерции в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 H2 и дополнительные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по EU или Kabat можно определять для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со стандартной пронумерованной по Kabat последовательностью.
Система нумерации по EU или Kabat, как правило, используется, когда речь идет об остатке в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Как правило, система нумерации по EU или Kabat или индекс EU используется, когда речь идет об остатке константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, описанный в Kabat et al., выше). Индекс EU, как по Kabat относится к нумерации остатков EU IgG1-антитела человека. Если в данном документе не указано иное, ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков по системе нумерации Kabat. Если в данном документе не указано иное, ссылки на номера остатков в константном домене антител означают нумерацию остатков по системе нумерации EU или Kabat (например, см. патентную публикацию США №2010280227).
Как используется в данном документе, акцепторный каркасный участок человека представляет собой каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка VL или VH, образованную из каркасного участка иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасного участка человека. Акцепторный каркасный участок человека, образованный из каркасного участка иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасного участка человека, может содержать такую же аминокислотную последовательность, как эти участки, или может содержать ранее существовавшие изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения число ранее существовавших аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. Если ранее существовавшие аминокислотные изменения имеются в VH, предпочтительно, эти изменения происходят только в трех, двух или в одном из положений 71H, 73H и 78H; например, аминокислотные замены в этих положениях могут быть 71A, 73T и/или 78A. В одном варианте
- 35 043015 реализации изобретения последовательность акцепторного каркасного участка VL человека идентична последовательности каркасного участка VL человека или консенсусной последовательности каркасного участка человека.
Консенсусный каркас человека является каркасом, представляющим наиболее распространенные аминокислотные остатки в выборке каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, отбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Примеры включают VL, подгруппа может быть подгруппой каппа I, каппа II, каппа I, каппа IV, как в Kabat et al., выше. Дополнителвно для VH, подгруппа может быть подгруппой I, подгруппой II или подгруппой III, как в Kabat et al., выше.
Модификация аминокислот в указанном положении, например антитела против сортилина по настоящему описанию, относится к замене или делеции указанного остатка, или вставке по меньшей мере одного аминокислотного остатка рядом с указанным остатком. Вставка рядом с указанным остатком означает вставку в пределах одного или двух остатков от него. Вставка может быть N-концевой или Cконцевой относительно указанного остатка. Предпочтительной модификацией аминокислот в данном документе является замена.
Антитело с созревшей аффинностью, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, представляет собой антитело с одним или более изменениями в одном или более его HVR, которые приводят к повышению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, которое не обладает этим изменением(ями). В одном варианте реализации изобретения антитело с созревшей аффинностью обладает наномолярной или даже пикомолярной аффинностью к антигену-мишени. Антитела с созревшей аффинностью получают способами, известными в данной области техники. Например, Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описывает созревание аффинности путем перетасовки VHи VL-доменов. Случайный мутагенез остатков HVR и/или каркасного участка описан, например: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
Как используется в данном документе термин специфически распознает или специфически связывает относится к измеряемым и воспроизводимым взаимодействиям, таким как притяжение или связывание между мишенью и антителом, например, между антителом против сортилина по настоящему описанию, что является решающим фактором присутствия мишени в присутствие гетерогенной популяции молекул, включая биологические молекулы. Например, антитело, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, которое специфически или предпочтительно связывает мишень или эпитоп, представляет собой антитело, которое связывает эту мишень или эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или более продолжительно, чем оно связывается с другими мишенями или другими эпитопами мишени. Из этого определения становится также понятно, например, и то, что антитело (или его фрагмент), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может или не может специфически или предпочтительно связываться со второй мишенью. Как таковое, специфическое связывание или предпочтителвное связывание необязательно требует (хотя оно может и включать в себя) исключительное связывание. Антитело, которое специфически связывается с мишенью, может иметь значение константы ассоциации по меньшей мере около 103 М-1 или 104 М-1, в отдельных случаях около 105 М-1 или 106 М-1, в других примерах около 106 М-1 или 107 М-1, около от 108 М-1 до 109 М-1или около 1010 М-1 до 1011 М-1 или выше. Для отбора антител, обладающих специфической иммунореактивностью в отношении конкретного белка, могут быть использованы разные иммуноанализы. Например, твердофазные иммунологические анализы ELISA, применение которых вошло в повседневную практику, используются для отбора моноклональных антител, обладающих специфической иммунореактивностью с белком. См., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, для описания форматов и условий иммунологических анализов, которые могут использоваться для определения специфической иммунореактивности.
Как используется в данном документе, взаимодействие между белком сортилином и вторым белком охватывает, без ограничения, белок-белковое взаимодействие, физическое взаимодействие, химическое взаимодействие, связывание, ковалентное связывание и ионное связывание. Как используется в данном документе, антитело ингибирует взаимодействие между двумя белками, в случае если антитело нарушает, снижает или полностью устраняет взаимодействие между двумя белками. Антитело или его фрагмент по настоящему описанию ингибирует взаимодействие между двумя белками, в случае если антитело или его фрагмент связывается с одним из этих двух белков.
Блокирующее антитело, антитело-антагонист, или ингибирующее антитело представляет собой антитело, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, которое ингибирует или снижает одну или более биологических активностей антигена, который оно связывает, таким образом как взаимодействия с одним или более белками. В некоторых вариантах реализации изобретения блокирующие антитела, антитела-антагонисты или ингибирующие антитела практически или полностью ингиби- 36 043015 руют одну или более биологических активностей или взаимодействий антигена.
Эффекторные функции антитела относятся к биологической активности, обусловленной Fcучастком (Fc-участком с нативной последовательности или варианта аминокислотной последовательности Fc-участка) антитела и варьируют в зависимости от изотипа антитела.
Термин Fc-участок применяется в данном документе для определения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-участки нативной последовательности и вариантов Fc-участков. Хотя границы Fc-участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут меняться, Fc-участок тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как протяженность от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбокси-конца. C-концевой остаток лизина (остаток 447 по системе нумерации EU или Kabat) Fc-участка может быть удален, например, в процессе продуцирования или очистки антитела, или посредством рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител, у которых удалены все остатки K447, популяции антител, у которых не удален ни один остаток K447, и популяции антител, содержащих смесь антител, имеющих остаток K447 и не имеющих его. Подходящие Fc-участки с нативной последовательностью для применения в антителах по настоящему описанию включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека.
Fc-участок нативной последовательности содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природного Fc-участка. Fc-участки нативной последовательности включают Fc- участок нативной последовательности человеческого IgG1 (аллотипы не-A и A); Fc-участок нативной последовательности человеческого IgG2; Fc-участок нативной последовательности человеческого IgG3 и Fc-участок нативной последовательности человеческого IgG4, а также их варианты природного происхождения.
Вариант Fc-участка содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности Fc-участка нативной последовательности за счет модификации по меньшей мере одной аминокислоты, предпочтительно путем одной или более аминокислотных замен. Предпочтительно вариант Fc-участка содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-участка или с Fc-участком исходного полипептида, например, содержит от около одной до около десяти аминокислотных замен и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-участка или в Fc-участка исходного полипептида. Вариантный Fc-участок в данном документе предпочтительно обладает по меньшей мере около 80% гомологии с Fc-участком нативной последовательности и/или Fc-участком исходного полипептида, а наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии, более предпочтительно по меньшей мере на около 95% гомологии с ним.
Fc-рецептор или FcR описывает рецептор, который связывается с Fc-участком антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы этих рецепторов, рецепторы FcyRII включают FcyRIIA (активирующий рецептор) и FcyRI IB (ингибирующий рецептор), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые различаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM). (см., например, M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Обзор по FcR содержится в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, включая те, что будут идентифицированы в будущем, в данном документе охватываются термином FcR. FcR также могут увеличивать период полувыведения антител из сыворотки.
Анализ связывания с FcRn in vivo и период полувыведения из сыворотки полипептидов с высокой аффинностью связывания с человеческим FcRn можно осуществлять, например, на трансгенных мышах или на трансфицированных линиях клеток человека, экспрессирующих человеческий FcRn, или на приматах, которым вводят полипептиды с вариантом Fc-участка. В WO 2004/42072 (Presta) описаны варианты антител с повышенным или пониженным связыванием с FcR. См. также, например, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
Как используется в данном документе, процент (%) идентичности аминокислотной последовательности и гомология относительно пептидной, полипептидной последовательности или последовательности антитела означает процентное содержание аминокислотных остатков в потенциальной последовательности, идентичной по аминокислотным остаткам в конкретной пептидной или полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание для целей опреде- 37 043015 ления процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными способами, известными специалистам в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или MEGALIGN ™ (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определять соответствующие параметры для измерения степени выравнивания, включая любые алгоритмы, известные в данной области техники, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, такое как антитело против сортилина по настоящему описанию, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в окружающей среде, в которой она была произведена. Предпочтительно, выделенная нуклеиновая кислота не связана со всеми компонентами, с которыми она связана в среде продуцирования. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды и антитела, описанные в данном документе, представлены в иной форме, чем форма или условия, в которых они находятся в природе. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды и антитела, описанные в данном документе, существующей естественным образом в клетках.
Как используется в данном документе термин вектор предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, которая относится к кольцевой двухцепочечной ДНК, с которой могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) можно интегрировать в геном клетки-хозяина при введении в клеткухозяина, и, таким образом, они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны контролировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В данном документе такие векторы называются рекомбинантными экспрессионными векторами или просто экспрессионными векторами. Как правило, экспрессионные векторы, применяемые в методах рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании термины плазмида и вектор могут употребляться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора.
Термины полинуклеотид или нуклеиновая кислота, используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который можно включить в полимер с помощью ДНКили РНК-полимеразы или реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например, метилированные нуклеотиды и их аналоги. В случае ее присутствия, модификацию нуклеотидной структуры можно осуществлять до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может содержать модификацию(и), осуществленную после синтеза, такую как конъюгация с меткой. Другие типы модификации включают, например, кэпы, замену одного или более нуклеотидов природного происхождения на аналог, межнуклеотидные модификации, например, такие как, например, модификации за счет не имеющих заряда связей (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.п.) и за счет имеющих заряд связей (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.п.), модификации, содержащие боковые фрагменты, например, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т. п.), модификации с интеркалирующими веществами (например, акридин, псорален и т. п.), модификации с хелатирующими веществами (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы-окислители и т. п.), модификации с алкилирующими агентами, такими как модифицирующие связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. п.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно имеющаяся в сахарах, может быть замещена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена обычными защитными группами или активирована с целью образования дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми или полутвердыми подложками. Концевые группы 5' и 3' OH могут быть фосфорилированными или могут быть заменены аминогруппами или органическими кэпирующими группами, содержащими от 1 до 20 углеродных атомов. Другие гидроксильные группы также могут быть дериватизированны обычными защитными группами. Полинуклеотиды могут также содержать аналоги сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые, как правило, известны в данной области техники, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил-, 2'-фтор- или 2'азидорибозу, карбоциклические аналоги Сахаров, а-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические ана
- 38 043015 логи и основные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одну или более фосфодиэфирных связей можно замещать альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты реализации изобретения, в которых фосфатная группа заменена на P(O)S (тиоат), P(S)S (дитиоат), (O)NR2 (амидат), P(O)R, P(O)OR', CO или CH2 (формацеталь), где каждый заместитель R или R' независимо обозначает H или замещенный, или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Описанное выше применимо ко всем полинуклеотидам, упомянутым в данном документе, включая РНК и ДНК.
Клетка-хозяин включает в себя отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или которая была реципиентом вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают в себя потомство одной клетки-хозяина, причем потомство необязательно должен быть полностью идентично (морфологически или на уровне комплементарной геномной ДНК) исходной родительской клетке, в силу природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает в себя клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) по настоящему описанию.
Носители, как используется в данном документе, включают фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, подвергаемых их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферные растворы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS™.
Как используется в данном документе термин апоптоз относится к управляемому генами процессу внутриклеточного разрушения клетки. Апоптоз отличается от некроза; он включает цитоскелетарное разрушение, сжатие и уплотнение цитоплазмы, экспрессию фосфатидилсерина на внешней поверхности клеточной мембраны и образование пузырьков, что приводит к образованию связанных с мембраной везикул или апоптозных телец. Данный процесс также называется программируемой гибелью клеток. Вовремя апоптоза возникают характерные такие проявления, как искривленные клеточные поверхности, уплотнение хроматина ядра, фрагментация хромосомной ДНК и наблюдается потеря функции митохондрий. Для выявления апоптоза можно применять различные известные методики, такие как окрашивание клеток аннексином V, пропидия йодидом, анализ фрагментации ДНК и YO-PRO-1 (Invitrogen). В некоторых вариантах реализации изобретения можно использовать окрашивание аннексином V и пропидия йодидом, и комбинированные процентные содержания популяций по окраске аннексином V+/PI+, аннексином V+/PI- и аннексином V-/PI+, считаются мертвыми клетками.
Термин около, как используется в данном документе, относится к обычному диапазону ошибок соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. В данном документе ссылка на около в отношении значения или параметра включает (и описывает) варианты реализаций изобретения, которые касаются значения или параметра, по сути.
Как используется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, упоминание антитела относится к одному антителу или множеству антител, например, в молярном количестве, и включает его эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и так далее.
Следует понимать, что аспект и варианты реализации изобретения по настоящему описанию, описанные в данном документе, включают аспекты и варианты реализации изобретения, определяемые терминами содержащие, состоящие из и состоящие по существу из.
Сортилиновые белки.
В одном аспекте изобретения в настоящем описании предложено выделенное (например, моноклональное) антитело, которое связывается с эпитопом в пределах белка сортилина по настоящему описанию. Сортилиновые белки по настоящего описанию включают, без ограничения, белок сортилин млекопитающего, белок сортилин мыши и белок сортилин крысы.
Сортилин называется по-разному как сортилин 1, sort1, NT-рецептор массой 100 кДа, гликопротеин 95 (GP95), програнулиновый рецептор (PGRN-R) и нейротензиновый рецептор 3 (NT-3 или NTR-3). Сортилин представляет собой белок из 831 аминокислоты, который кодирует мембранный рецептор I типа. Известны различные гомологи сортилина, включающие без ограничения, сортилин человека, сортилин крысы и сортилин мыши. Аминокислотная последовательность сортилина человека приведена ниже ка SEQ ID NO: 1 (с ключевыми аминокислотными остатками, которые предположительно принимают участие в связывании програнулина, изображенными жирным шрифтом, и предполагаемый участок связывания pro-NGF, отмеченный подчеркиванием):
- 39 043015
1020304050
MERPWGAADG LSRWPHGLGL LLLLQLLPPS TLSQDRLDAP PPPAAPLPRW
60708090100
SGPIGVSWGL RAAAAGGAFP RGGRWRRSAP GEDEECGRVR DFVAKLANNT
110120130140150
HQHVFDDLRG SVSLSWVGDS TGVILVLTTF HVPLVIMTFG QSKLYRSEDY 160170180190200
GKNFKDITDL INNTFIRTEF GMAIGPENSG KWLTAEVSG GSRGGRIFRS
210220230240250
SDFAKNFVQT DLPFHPLTQM MYSPQNSDYL LALSTENGLW VSKNFGGKWE
260270280290300
EIHKAVCLAK WGSDNTIFFT TYANGSCKAD LGALELWRTS DLGKSFKTIG
310320330340350
VKIYSFGLGG RFLFASVMAD KDTTRRIHVS TDQGDTWSMA QLPSVGQEQF 360370380390400
YSILAANDDM VFMHVDEPGD TGFGTIFTSD DRGIVYSKSL DRHLYTTTGG
410420430440450
ETDFTNVTSL RGVYITSVLS EDNSIQTMIT FDQGGRWTHL RKPENSECDA
460470480490500
TAKNKNECSL HIHASYSISQ KLNVPMAPLS EPNAVGIVIA HGSVGDAISV
510520530540550
MVPDVYISDD GGYSWTKMLE GPHYYTILDS GGIIVAIEHS SRPINVIKFS
560570580590600
TDEGQCWQTY TFTRDPIYFT GLASEPGARS MNISIWGFTE SFLTSQWVSY
610620630640650
TIDFKDILER NCEEKDYTIW LAHSTDPEDY EDGCILGYKE QFLRLRKSSV
660670680690700
CQNGRDYWT KQPSICLCSL EDFLCDFGYY RPENDSKCVE QPELKGHDLE 710720730740750
FCLYGREEHL TTNGYRKIPG DKCQGGVNPV REVKDLKKKC TSNFLSPEKQ
760770780790800
NSKSNSVPII LAIVGLMLVT WAGVLIVKK YVCGGRFLVH RYSVLQQHAE
810820830
ANGVDGVDAL DTASHTNKSG YHDDSDEDLL E
В дополнение к этому, аминокислотная последовательность сортилина мыши представлена на SEQ ID NO: 2:
MERPRGAADG LLRWPLGLLL LLQLLPPAAV GQDRLDAPPP PAPPLLRWAG
PVGVSWGLRA AAPGGPVPRA GRWRRGAPAE DQDCGRLPDF IAKLTNNTHQ
HVFDDLSGSV SLSWVGDSTG VILVLTTFQV PLVIVSFGQS KLYRSEDYGK
NFKDITNLIN NTFIRTEFGM AIGPENSGKV ILTAEVSGGS RGGRVFRSSD
FAKNFVQTDL PFHPLTQMMY SPQNSDYLLA LSTENGLWVS KNFGEKWEEI
HKAVCLAKWG PNNIIFFTTH VNGSCKADLG ALELWRTSDL GKTFKTIGVK
IYSFGLGGRF LFASVMADKD TTRRIHVSTD QGDTWSMAQL PSVGQEQFYS
ILAANEDMVF MHVDEPGDTG FGTIFTSDDR GIVYSKSLDR HLYTTTGGET
DFTNVTSLRG VYITSTLSED NSIQSMITFD QGGRWEHLRK PENSKCDATA
KNKNECSLHI HASYSISQKL nvpmaplsep NAVGIVIAHG SVGDAISVMV
PDVYISDDGG YSWAKMLEGP HYYTILDSGG IIVAIEHSNR PINVIKFSTD
EGQCWQSYVF TQEPIYFTGL ASEPGARSMN ISIWGFTESF ITRQWVSYTV
DFKDILERNC EEDDYTTWLA HSTDPGDYKD GCILGYKEQF LRLRKSSVCQ
NGRDYWAKQ PSVCPCSLED FLCDFGYFRP ENASECVEQP ELKGHELEFC
LYGKEEHLTT NGYRKIPGDK CQGGMNPARE VKDLKKKCTS NFLNPTKQNS
KSNSVPIILA IVGLMLVTW AGVLIVKKYV CGGRFLVHRY SVLQQHAEAD
GVEALDSTSH AKSGYHDDSD EDLLE
В дополнение к этому, аминокислотная последовательность сортилина крысы представлена на SEQ ID NO: 3.
- 40 043015
MERPRGAADG LLRWPLGLLL LLQLLPPAAV GQDRLDAPPP PAPPLLRWAG
PVGVSWGLRA AAPGGPVPRA GRWRRGAPAE DQDCGRLPDF IAKLTNNTHQ
HVFDDLSGSV SLSWVGDSTG VILVLTTFQV PLVIVSFGQS KLYRSEDYGK
NFKDITNLIN NTFIRTEFGM AIGPENSGKV ILTAEVSGGS RGGRVFRSSD
FAKNFVQTDL PFHPLTQMMY SPQNSDYLLA LSTENGLWVS KNFGEKWEEI
HKAVCLAKWG PNNIIFFTTH VNGSCKADLG ALELWRTSDL GKTFKTIGVK
IYSFGLGGRF LFASVMADKD TTRRIHVSTD QGDTWSMAQL PSVGQEQFYS
ILAANDDMVF MHVDEPGDTG FGTIFTSDDR GIVYSKSLDR HLYTTTGGET
DFTNVTSLRG VYITSTLSED NSIQSMITFD QGGRWEHLQK PENSKCDATA
KNKNECSLHI HASYSISQKL NVPMAPLSEP NAVGIVIAHG SVGDAISVMV
PDVYISDDGG YSWAKMLEGP HYYTILDSGG IIVAIEHSNR PINVIKFSTD
EGQCWQSYVF SQEPVYFTGL ASEPGARSMN ISIWGFTESF LTRQWVSYTI
DFKDILERNC EENDYTTWLA HSTDPGDYKD GCILGYKEQF LRLRKSSVCQ
NGRDYWAKQ PSICPCSLED FLCDFGYFRP ENASECVEQP ELKGHELEFC
LYGKEEHLTT NGYRKIPGDR CQGGMNPARE VKDLKKKCTS NFLNPKKQNS
KSSSVPIILA IVGLMLVTW AGVLIVKKYV CGGRFLVHRY SVLQQHAEAD
GVEALDTASH AKSGYHDDSD EDLLE
В некоторых вариантах реализации изобретения сортилин представляет собой белокпредшественник, который включает сигнальный пептид. В некоторых вариантах реализации изобретения сортилин представляет собой зрелый белок. В некоторых вариантах изобретения зрелый белок сортилин не включает сигнальную последовательность. В некоторых вариантах изобретения зрелый белок сортилин экспрессируется на клетке.
Сортилиновые белки по настоящему описанию включают несколько доменов, включающих без ограничения, сигнальную последовательность, пропептид, домен полости, домен Vps10p, домен 10 CC, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. В дополнение к этому, белки по настоящему описанию экспрессируются на высоких уровнях в ряде тканей, включая без ограничения, головной мозг, спинной мозг, сердечные и скелетные мышцы, щитовидную железу, плаценту и яички.
Сортилин представляет собой представителя семейства Vps10p рецепторов сортировки, которое также включает, без ограничения, родственный белку сортировки рецептор с повтором A-типа (SorLA), родственный сортилину рецептор 1, экспрессирующий CNS (SorCS1), родственный сортилину рецептор 2, экспрессирующий CNS (SorCS2), и родственный сортилину рецептор 3, экспрессирующий CNS (SorCS3). Участок полости сортилина выравнивается с каждым из двух доменов полости в дрожжевом Vps10p (домены Vps10p). Отличительным признаком домена Vps10p является аминоконцевой пропептид и карбоксиконцевой сегмент, который содержит 10 консервативных остатков (10CC). Другие рецепторы семейства Vps10p содержат домен Vps10p, который размещен на аминоконце, и содержит дополнительные эктодомены.
Семейство Vps10p рецепторов сортировки имеет разнообразные функции в пределах нервной системе и в других системах. Показано, что эти рецепторы являясь многофункциональными, связывают несколько различных лигандов, включая без ограничения, програнулин (PGRN), профактор роста нервов (Pro-NGF), фактор роста нервов (NGF), PCSK9, пронейротрофины, нейротрофины, пронейротрофин-3 (pro-NT3), пронейротрофин-4/5, нейротрофический профактор головного мозга (Pro-BDNF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротрофин-3 (NT3), нейротрофин-4/5, нейротензин, p75NTR, сортилиновый пропептид (Sort-pro), амилоидный белок-предшественник (APP), липопротеиновую липазу (LpL), аполипопротеины, аполипопротеин AV (APOA5), аполипопротеин E (APOE 2, 3, 4), связанный с рецептором белок (RAP) и элементы системы активатора плазминогена; и задействованы во внутриклеточную сортировку, эндоцитоз и передачу сигналов. Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию опосредуют быстрый эндоцитоз липопротеиновой липазы, нейротензина и проформы фактора роста нервов; и нацеливают белки для прохождения транспортировки из аппарата Гольджи в поздние эндосомы. Дополнительно показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию образуют комплекс с p75 на клеточной мембране и являются необходимыми для индуцируемой профактором роста нервов (NGF) нейрональной смерти. Недавно также было показано, что представители семейства рецепторов Vps10p взаимодействуют с представителями семейства нейротрофина, которые включают NGF, нейротрофический фактор головного мозга, нейротрофин-3 и нейротрофин-4/5 или продоменную форму нейротрофина (пронейротрофин). Показано также, что сортилиновые белки по настоящему описанию связывают и управляют внеклеточными уровнями PCSK9, который обрекает рецептор липопротеинов низкой плотности на деградацию в лизосомах, приводя к повышенным уровням холестерина-ЛНП.
Соответственно, как используется в данном документе сортилиновый белок по настоящему опи- 41 043015 санию включает, без ограничения, белок сортилин млекопитающего, белок сортилин человека, белок сортилин приматов, белок сортилин мыши и белок сортилин крысы. В дополнение к этому, антитела против сортилина по настоящему описанию могут связывать эпитоп в пределах одного или более из белка сортилина млекопитающего, белка сортилина человека, сортилина примата, белка сортилина мыши и сортилиновго белка крысы.
Домены белка сортилина.
Сортилиновые белки по настоящему описанию содержат несколько доменов, таких как домен Vps10p, который содержит мотив Asp-бокс, десятилопастную бета-пропеллерную структуру и гидрофобную петлю, и домен 10 CC.
Как описано в данном документе, взаимодействия между сортилиновыми белками по настоящему описанию и пронейротрофинами или нейротрофинами опосредованы доменом Vps10p, который содержит десятилопастную бета-пропеллерную структуру и мотив Asp-бокс. В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновые белки по настоящему описанию содержат домен Vps10p, который включает десятилопастную бета-пропеллерную структуру и расположен в пределах аминокислотных остатков 78-611 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 78-611 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотные остатки 190-220 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотные остатки сортилина млекопитающего, соответствующие аминокислотным остаткам 190-220 из SEQ ID NO: 1 расположены в пределах домена Vps10p.
Домены Vps10p по настоящему описанию могут включать мотив Asp-бокс. Как используется в данном документе, мотивы Asp-бокс имеют следующую последовательность: (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X(W/F/Y) (SEQ ID NO: 4), или X-X-(S/T)-X-(D/N)-X-G-X-(T/S)-(W/F/Y)-X (SEQ ID NO: 5), где X представляет любую аминокислоту. В сортилине человека мотив Asp-бокс расположен на аминокислотных остатках 200-207 (SSDFAKNF (SEQ ID NO: 694)). Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения, мотив Asp-бокс расположен на аминокислотных остатках 200-207 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотных остатках сортилина млекопитающего, который соответствует аминокислотным остаткам 200-207 из SEQ ID NO: 1.
Как описано в данном документе, взаимодействия между сортилиновыми белками по настоящему описанию и p75 опосредованы доменом 10CC гидрофобной петли домена Vps10p.
В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновые белки по настоящему описанию содержат домен 10CC, который расположен в пределах аминокислотных остатков 610-757 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 610-757 из SEQ ID NO: 1. В предпочтительных вариантах реализации изобретения аминокислотные остатки 592-593, 610-660 и/или 667-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотные остатки сортилина млекопитающего, соответствующие аминокислотным остаткам 592593, 610-660 и/или 667-749 из SEQ ID NO: 1 расположены в пределах домена 10CC сортилина.
В других вариантах реализации изобретения сортилиновые белки по настоящему описанию содержат гидрофобную петлю внутри домена Vps10p, который расположен в пределах аминокислотных остатков 130-141 сортилина человека (SEQ ID NO: 1) или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 130-141 из SEQ ID NO: 1.
Как будет понятно специалисту в данной области техники, начальные и конечные остатки доменов по настоящему описанию могут изменяться в зависимости от используемой программы компьютерного моделирования или используемого метода для определения домена.
Партнеры связывания сортилина.
Сортилиновые белки по настоящему описанию могут взаимодействовать с (например, связываться с) одним или более белков, включая, без ограничения, програнулиновый белок; нейротрофины, такие как пронейротрофины, пронейротрофин-3, нейротрофин-3, пронейротрофин-4/5, нейротрофин-4/5, профактор роста нервов (Pro-NGF), фактор роста нервов (NGF), нейротрофический профактор головного мозга (Pro-BDNF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF); нейротензин, p75, липопротеиновую липазу (LpL), аполипопротеин AV (APOA5), аполипопротеин E (APOE), амилоидный белокпредшественник, A-бета-пептид, PCSK9, p75NTR и связанный с рецептором белок (RAP).
Програнулин.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) непосредственно с програнулином и опосредуют деградацию програнулина (например, Zheng, Y et al., (2011) PLoS ONE 6(6): e21023).
Програнулин разнообразно называется, как PGRN, проэпителин, гранулин-эпителиновый предшественник, клеточный фактор роста PC (рака простаты) (PCDGF) и акрогранин. Програнулин представляет собой белок из 593 аминокислоты, который кодирует секретируемый гликопротеин массой 68,5 кДа, который содержит 7,5 повторов меньших мотивов гранулина (эпителина), в диапазоне 6-25 кДа, которые можно протеолитически отщеплять от предшественника PGRN. Примеры продуктов расщепления програнулина включают, без ограничения, гранулин A/ эпителины 1, гранулин B эпителины 2, гранулин C, гранулины D, гранулин E, гранулин F, гранулин G и любые другие известные пептидные продукты, по- 42 043015 лученные из програнулина.
Програнулин экспрессируется в широких пределах и в ненейрональных клетках связаны с разнообразными событиями, такими как регулирование клеточного цикла и подвижности клеток, заживление ран, воспаление, индукция факторов роста, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и онкогенез. Програнулин также широко экспрессируется при раннем развитии нервной системы, но ограниченно экспрессируется при позднем развитии определенных нейрональных популяций, таких как кортикальные нейроны, пирамидальные нейроны гиппокампа и клетки Пуркинье. Тем не менее, роль програнулина для клеток нервной системы была непонятной, до того момента, когда у страдающих лобно-височной деменцией (FTD) были обнаружены мутации в гене програнулина на хромосоме 17. Впоследствии было показано, что програнулин способствует выживанию клеток нервной системы и увеличивает аксоновый отросток у кортикальных и моторных нейронах. Таким образом, хотя програнулин не является нейротрофином или представителем семейства нейротрофинов, его называют нейротрофическим фактором, благодаря его способности облегчать выживание клеток нервной системы.
Дополнительно было показано, что гаплонедостаточность програнулина (которая включает более 70 различных мутаций, таких как мутации с потерей функционирования), связаны с лобно-височной деменцией (FTD) с патологией TDP-43. Кроме того, уровни програнулина в плазме снижаются у пациентов с FTD-мутациями. Мутации програнулина отвечают за 25% наследственной FTD. В дополнение к этому, низкие уровни програнулина обнаружены у некоторых пациентов с FTD без мутаций програнулиновых мутаций, и уровни програнулина изменены при болезни Альцгеймера и ALS. Таким образом, предполагают, что програнулин в целом может быть вовлечен в развитие дегенеративных заболеваний.
Было показано, что полная потеря програнулина приводит к фенотипу нейронального липоидного фусциноза (NPL). Соответственно, предполагают, что индивиды с различными нарушениями хранения в лизосомах могут отвечать на увеличенные уровни програнулина. Програнулин экспрессируется в широких пределах, а в центральной нервной системе продуцируется нейронами и микроглиями. Полагают также, что програнулин играет противовоспалительную роль в макрофагах и микроглиях, и способствующую выживанию роль в нейронах.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию, которые увеличивают уровни програнулина, уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности и/или блокируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином, будут полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии програнулина и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, эпилептическими припадками, дистрофией сетчатки, травматическим повреждением мозга, повреждением спинного мозга, длительной депрессией, атеросклеротическими заболеваниями сосудов, нежелательными симптомами естественного старения, деменцией, смешанной деменцией, болезнью КрейтцфельдаЯкоба, нормотензивной гидроцефалией, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Хантингтона, таупатией, инсультом, острой травмой, хронической травмой, волчанкой, острым и хроническим колитом, болезнью Крона, воспалительным заболеванием кишечника, неспецифическим язвенным колитом, малярией, эссенциальным тремором, волчанкой центральной нервной системы, болезнью Бехчета, болезнью Паркинсона, деменцией с тельцами Леви, множественной системной атрофией, дегенерацией межпозвонковых дисков, синдромом Шая-Дрейджера, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикальной базальной ганглионарной дегенерацией, острым рассеянным энцефаломиелитом, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезнями старения, возрастной макулярной дегенерацией, глаукомой, пигментным ретинитом, дегенерацией сетчатки, инфекцией дыхательных путей, сепсисом, глазной инфекцией, системной инфекцией, воспалительными нарушениями, артритом, рассеянным склерозом, нарушениями метаболизма, ожирением, резистентностью к инсулину, диабетом 2 типа, повреждениями тканей или сосудов, ранением или одним или более нежелательных симптомов естественного старения. В дополнение к этому, антитела против сортилина по настоящему описанию, которые увеличивают уровни програнулина, уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности и/или блокируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином, могут ингибировать взаимодействие между сортилином и програнулином, могутиндуцировать одну или более активностей програнулина, могут снижать эндосомальную интернализацию програнулина или его фрагмента, и/или могут увеличивать эффективную концентрацию програнулина.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые увеличивают уровни програнулина, уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности и/или блокируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином, связываются с одной или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или
- 43 043015
740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые увеличивают уровни програнулина, уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности и/или блокируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином, могут связывать одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Нейротрофины.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) непосредственно с пронейротрофинами (например, pro-NGF), которые содержат продомен и обычно являются проапоптозными (например, Andersen, OS et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285, 12210-12222). Такие предшественники pro-NGF высвобождаются во время стресса, и как обнаружено, сортилин вовлекается в регулирование их высвобождения, а также связывания на воспринимающей клетке. Связывание может быть опосредовано через линейный эпитоп на сортилине, который соответствует аминокислотным остаткам 163-174 из SEQ ID NO: 1.
Нейротрофины представляют собой семейство димерных пептидных белков-гормонов, которые индуцируют выживание, развитие и функционирование клеток нервной системы. Нейротрофины принадлежат к классу факторов роста, которые являются секретируемыми белками, способными к передаче сигнала конкретным клеткам для выживания, дифференцировки или роста. Факторы роста, такие как нейротрофины, которые способствуют выживанию нейронов, известны как нейротрофические факторы. Нейротрофические факторы секретируются целевыми тканями и действуют путем предотвращения инициации программируемой гибели клеток связанного нейрона. Нейротрофины также могут индуцировать дифференцировку клеток-предшественников для образования нейронов. Нейротрофин по настоящему описанию синтезируются внутри клеток как белки-предшественники массой 30-35 кДа, содержащие сигнальный пептид и сайт гликозилирования. Во время процессинга белки-предшественники также расщепляются по двухосновному сайту расщепления кальций-зависимой сериновой протеазой furin и другими представителями семейства конвертаз прогормонов внутри аппарата Гольджи. N-концевая часть этого расщепления представляет собой зрелый нейротрофин из 118-120 аминокислот и биологически активный C-концевой продукт массой 12-14 кДа (Seidah et al, Biochem. J. (1996) 314: 951-960). Как используется в данном документе, нейротрофин и нейротрофический фактор могут применяться взаимозаменяемо. Нейротрофин по настоящему описанию включает, без ограничения, родственный по структуре фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин-4 (NT-4). Как используется в данном документе пронейротрофин может относиться к любому пропептиду семейства нейротрофина, включая без ограничения, pro-NGF, pro-BDNF, pro-neurotrophin-3 и proneurotrophin-4/5.
Было показано, что пронейротрофины играют роль развития патологии при старении, эпилептических припадках, дистрофии сетчатки, травматическом повреждении мозга, повреждении спинного мозга и длительной депрессии (например, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 -57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870 -9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; и Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
Фактор роста нервов (NGF) представляет собой небольшой секретируемый белок, который гомодимеризуется и включается в комплекс большего размера. NGF обладает стимулирующей рост нервной ткани активностью, а комплекс вовлекается в рост, поддержание, выживание и дифференцировку симпатических и определенных сенсорных нейронов. Мутации в NGF связаны с наследственной сенсорной и автономной нейропатией, 5 типа (HSAN5) и дисрегуляцией экспрессии NGF, связанной с аллергическим ринитом. Безотносительно к какой-либо теории можно считать, что pro-NGF может индуцировать апоптоз и длительную депрессию.
Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) представляет собой секретируемый белок, индуцируемый кортикальными нейронами и необходимый для выживания стриарных нейронов в головном мозге. Экспрессия BDNF понижена у пациентов с болезнью Альцгеймера, и с болезнью Хатингтона. BDNF может играть роль в регулировании ответной реакции на стресс и биологию расстройств настроения. Для этого гена были определены множество вариантов транскриптов, кодирующих различные изо- 44 043015 формы. Безотносительно к какой-либо теории можно считать, что pro-BDNF может индуцировать апоптоз и длительную депрессию.
Нейротрофин-3 представляет собой секретируемый белок, необходимый для выживания и функционирования множества периферический нейронов и нейроны центральной нервной системы. Вариант гена нейротрофина-3 связывают с тяжелыми формами шизофрении, апронейротрофин-3 (pro-NT3) индуцирует гибель симпатических нейронов.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофин). Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии нейротрофина и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, эпилептическими припадками, дистрофией сетчатки, травматическим повреждением мозга, повреждением спинного мозга, длительной депрессией, атеросклеротическими заболеваниями сосудов, нежелательными симптомами естественного старения, деменцией, смешанной деменцией, болезнью Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалией, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Хантингтона, таупатией, инсультом, острой травмой, хронической травмой, волчанкой, острым и хроническим колитом, болезнью Крона, воспалительным заболеванием кишечника, неспецифическим язвенным колитом, малярией, эссенциальным тремором, волчанкой центральной нервной системы, болезнью Бехчета, болезнью Паркинсона, деменцией с тельцами Леви, множественной системной атрофией, дегенерацией межпозвонковых дисков, синдромом Шая-Дрейджера, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикальной базальной ганглионарной дегенерацией, острым рассеянным энцефаломиелитом, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезнями старения, возрастной макулярной дегенерацией, глаукомой, пигментным ретинитом, дегенерацией сетчатки, инфекцией дыхательных путей, сепсисом, глазной инфекцией, системной инфекцией, воспалительными нарушениями, артритом, рассеянным склерозом, нарушениями метаболизма, ожирением, резистентностью к инсулину, диабетом 2 типа, повреждениями тканей или сосудов, ранением или одним или более нежелательных симптомов естественного старения. Антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и нейротрофином по настоящему описанию (например, пронейротрофины), также могут предотвращать гибель клеток (например, апоптоз), индуцированную пронейротрофином.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и нейротрофином по настоящему описанию, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и нейротрофином по настоящему описанию, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Нейротензин.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с нейротензином в пределах бета-пропеллерной структуры сортилина, и показан важный контакт по серину 283 сортилина человека (например, Quistgaard, EM, et al. (2009) Nature Structural and Molecular Biology, 16 p96-98). Было также показано, что этот участок является важным для связывания програнулина. Сайт связывания нейротензина находится внутри расположенного в центре тоннеля бетапропеллерной структуры сортилина, тогда как домен пронейротрофина находится на поверхности бетапропеллерной структуры. Связывание пронейротрофина с сортилином частично ингибируется нейротензином, так как участки связывания находятся не очень далеко.
Нейротензин представляет собой нейропептид из 13 аминокислот, который считается принимает участие в регулировании лютеинизирующего гормона и высвобождения пролактина. Показано, что ней- 45 043015 ротензин проявляет существенное взаимодействие с дофаминергической системой. Нейротензин синтезируется как часть белка-предшественника из 169-170 аминокислот, которые также содержат родственный нейропептид - нейромедин. Кодирующие пептид домены расположены в тандеме около карбоксильного терминального конца предшественника и связаны, и отделены сопряженными сайтами процессинга основных аминокислот (лизин-аргинин). Нейротензин имеет существенное сходство в своих 6 Cконцевых аминокислотных остатках с некоторыми другими нейропептидами, включая нейромедин N. Cконцевой участок отвечает за полную биологическую активность, тогда как N-концевой участок играет модуляторную роль. В центральной нервной системе, нейротензин обладает двойной функцией нейромодулятора передачи дофамина и гормона секреции передней доли гипофиза. Показаны также сильные гипотермические и анальтезирующие влияния на головной мозг. Предполагается участие нейротензина в патофизиологии шизофрении, болезни Хантингтона и Паркинсона. Обнаружено также, что нейротензин обеспечивает нейропротекцию в экспериментальных моделях церебральной ишемии.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и нейротензином. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии нейротензина и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, эпилептическими припадками, дистрофией сетчатки, травматическим повреждением мозга, повреждением спинного мозга, длительной депрессией, атеросклеротическими заболеваниями сосудов или одним или более нежелательных симптомов естественного старения.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и нейротензином, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и нейротензином, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Рецептор фактора роста нервов с низкой аффинноствю (p75).
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с низкой аффинностью с рецептором (p75) фактора роста нервов (NGF) в пределах домена 10CC сортилина или гидрофобной петли домена Vps10p сортилина. Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию могут функционировать как корецептор с p75 для пронейротрофинов, которые индуцируют передачу сигнала апоптоза.
Рецептор NGF с низкой аффинностью по-разному называется p75, p75 нейротрофиновым рецептором, рецептором NGF p75, p75NTR, LNGFR, NGFR, CD271, Gp80-LNGFR и TNFRSF16, и p75NTR. P75 представляет собой один из двух типов рецепторов для нейротрофина по настоящему описанию. Показано, что P75 связывает и служит в качестве приемника нейротрофинов. Однако было также показано, что в отсутствие коэкспрессированного TrkA (другой тип рецептора нейротрофинов), p75 может индуцировать в клетках клеточную гибель (например, апоптоз). По существу и без привязки к какой-либо теории считают, что блокирование взаимодействия между сортилином и p75 снижает продукцию сигнала p75 клеточной гибели, зависимого от гибели иммуногенных клеток.
Таким образом, ингибирующее взаимодействие (например, связывание) сортилина с p75 будет уменьшать эффективную концентрацию пронейротрофинов и, таким образом, возникающую гибель клеток нервной системы.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и p75. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии p75 и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменци
- 46 043015 ей, эпилептическими припадками, дистрофией сетчатки, травматическим повреждением мозга, повреждением спинного мозга, длительной депрессией, атеросклеротическими заболеваниями сосудов или одним или более нежелательных симптомов естественного старения. Антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и p75 также могут уменьшать эффективные концентрации пронейротрофинов, требуемые для передачи апоптозного сигнала p75, снижать интернализацию p75 или его фрагментов, обеспечивать поступление в эндосомы, снижать продукцию в клетках сигнала клеточной гибели p75, зависимого от гибели иммуногенных клеток и предотвращать клеточную гибель (например, апоптоз), индуцированную p75.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и p75, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и p75, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Амилоидный белок-предшественник (APP).
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с амилоидным белком-предшественником. Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию могут функционировать в отношении изменения субклеточной локализации APP и увеличения его процессинга в A-бета-пептиды и внутриклеточные фрагменты, которые связаны с болезнью Альцгеймера.
Амилоидный белок-предшественник (APP) представляет собой интегральный мембранный белок, который экспрессируется во многих тканях и концентрируется в синапсах нейронов. Его основная функция не известна, тем не мене предполагают его участие в качестве регулятора образования синапсов, пластичности нервной ткани и экспортирования железа. APP лучше всего известен как молекулапредшественник, протеолиз которой образует бета-амилоид (Ae), пептид из от 37 до 49 аминокислот, амилоидная фибриллярная форма которого является основным компонентом амилоидных бляшек в головном мозге у пациентов с болезнью Альцгеймера.
Таким образом, ингибирующие взаимодействия (например, связывание) сортилина с APP будет увеличивать эффективную концентрацию пронейротрофинов. Более того, блокирование взаимодействия между сортилином и APP может приводить к уменьшенной эндосомной интернализации APP и его процессинга в A-бета-пептид.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и APP. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с аномальными уровнями процессинга экспрессии APP и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, эпилептическими припадками, дистрофией сетчатки, травматическим повреждением мозга, повреждением спинного мозга, длительной депрессией, атеросклеротическими заболеваниями сосудов или одним или более нежелательных симптомов естественного старения.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и APP, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему
- 47 043015 описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и APP, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Липопротеиновая липаза.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с липопротеиновой липазой (LpL). Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию связывают и модифицируют деградацию LpL.
Липопротеиновая липаза представляет собой секретируемый фермент, который обладает активностью EC 3. 1. 1. 34. Липопротеиновая липаза представляет собой представителя семейства генов липаз, которое включает панкреатическую липазу, липазу печени и липазу эндотелия. Она является водорастворимым ферментом, который гидролизирует триглицериды в таких липопротеинах, как обнаруженные в хиломикронах, и липопротеинах очень низкой плотности (VLDL) в две свободные жирные кислоты и одну моноацилглицеридную молекулу. Липопротеиновая липаза также вовлечена в стимулирование клеточного поглощения остатков хиломикронов, богатых холестерином липопротеинов, и свободных жирных кислот. Липопротеиновая липаза присоединяется к поверхности просвета эндотелиальных клеток в капиллярах и наиболее распространена в адипозной, сердечной ткани и ткани скелетных мышц. Липопротеиновая липаза секретируется из паренхимальных клеток в виде гликозилированного гомодимера, а затем транслоцируется во внеклеточный матрикс и через эндотелиальные клетки в просвет капилляров.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и липопротеиновой липазой. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии липопротеиновой липазы и/или ее активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией и/или атеросклеротическими заболеваниями сосудов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и липопротеиновой липазой, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и липопротеиновой липазой, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Аполипопротеин AV.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с аполипопротеином AV (APOA5). Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию связывают и модифицируют деградацию APOA5.
Аполипопротеин AV называется по-разному как аполипопротеин A-V, APOA5, APOAV и RAP3. Аполипопротеин AV является важным регулятором уровней триглицеридов в плазме, что представляет собой главный фактор риска для атеросклеротический заболеваний сосудов, таких как ишемическая болезнь сердца. Он является компонентом нескольких фракций липопротеинов, включающих VLDL, HDL и хиломикроны. Аполипопротеин AV может оказывать влияние на метаболизм липопротеинов путем взаимодействия с рецепторами семейства генов LDL-R.
- 48 043015
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином AV. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с аномальными уровнями экспрессии аполипопротеина AV и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией и/или атеросклеротическими заболеваниями сосудов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином AV, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином AV, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Аполипопротеин E.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с аполипопротеином E (APOE2, APOE3, APOE4). Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию связывают и модифицируют деградацию и транспорт APOE, а также агентов, которые переносит APOE, таких как A-бета-пептид.
Аполипопротеин E (APOE) представляет собой класс аполипопротеинов, обнаруженных в хиломикроне и липопротеине промежуточной плотности (IDL), которые является необходимыми для нормального катаболизма липопротеиновый заместителей, богатых триглицеридами. В периферических тканях APOE главным образом продуцируется печенью и макрофагами, и опосредует метаболизм холестерина, зависимым от типа изоформы образом. В центральной нервной системе APOE в основном продуцируется астороцитами, и транспортирует холестерин в нейроны посредством рецепторов АроЕ, которые являются представителями семейства генов рецепторов липопротеинов низкой плотности. Варианты APOE связывают с повышенным риском развития болезни Альцгеймера и сердечнососудистых нарушений, а также повреждения гематоэнцефалического барьера. Показано, что APOE транспортирует A-бетапептид в нейроны посредством сортилинового рецептора.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином E. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с аномальными уровнями экспрессии аполипопротеина E и/или его активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией и/или атеросклеротическими заболеваниями сосудов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином E, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и аполипопротеином Е, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сорти- 49 043015 лина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131,
Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207,
Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307,
Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382,
Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Связанный с рецептором белок.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с белком, связанным с рецептором (RAP).
Связанный с рецептором белок называется по-разному как RAP, белок 1, ассоциированный с белком, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности, LRPAP1, A2MRAP, A2RAP, HBP44 и MRAP. Связанный с рецептором белок представляет собой белок-шаперон, вовлеченный в перенос определенных представителей семейства рецепторов LDL, включая без ограничения, LRP1 и LRP2. Связанный с рецептором белок представляет собой гликопротеин, который связывается с рецептором альфа-2макроглобулина, а также с другим представителем семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности. Он действует путем ингибирования связывания всех известных лигандов для таких рецепторов, и может предотвращать агрегацию и деградацию рецепторов в эндоплазматическом ретикулуме, тем самым действуя как молекулярный шаперон. Связанный с рецептором белок может также находиться под отрицательным контролем кальмодулина.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и RAP. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с уменьшенными уровнями экспрессии RAP и/или ее активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией и/или атеросклеротическими заболеваниями сосудов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и RAP, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и RAP, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
PCSK9.
Показано, что сортилиновые белки по настоящему описанию взаимодействуют (например, связываются) с пропротеиновой конвертазой субтилизин/кексин 9 (PCSK9), и секретируют ее в кровоток.
PCSK9 представляет собой представителя подсемейства протеазы К секреторных протеаз. PCSK9 играет основную роль в гомеостазе холестерина. Она связывается с липопротеиновым рецептором низкой плотности (LDLR), индуцируя деградацию LDLR и снижение способности LDLR удалять холестерин, что ведет к гиперхолестенемии.
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут также ингибировать (например, блокировать) взаимодействие между сортилином и PCSK9, и секрецию PCSK9. Такие антитела могут быть полезны для предупреждения, снижения риска или лечения патологических состояний и/или заболеваний, связанных с увеличенными уровнями экспрессии PCSK9 и/или ее активностью, гибелью клеток (например, гибелью клеток нервной системы), лобно-височной деменцией, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией и/или атеросклеротическими заболеваниями сосудов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и PCSK9, связывают одну или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 131-138, 175-181, 190-220, 199220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в
- 50 043015 пределах аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют аминокислотным остаткам 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 и/или 740-749 из SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют (например, блокируют) взаимодействие между сортилином и PCSK9, связывают одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или аминокислотных остатков сортилина млекопитающего, которые соответствуют одному или более аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1.
Антитела против сортилина.
Антитела против сортилина по настоящему описанию могут ингибировать одну или более активностей белка сортилина, включающие, но ограничивающиеся ими, увеличение уровней програнулина (например, внеклеточные уровни програнулина и/или клеточные уровни програнулина), уменьшение клеточных уровней сортилина (например, уровней сортилина на поверхности клеток, внутриклеточных уровней сортилина и/или общих уровней сортилина), ингибирование взаимодействия (например, связывания) с програнулином и/или ингибирование взаимодействия (например, связывания) с одним или более из пронейротрофинов по настоящему описанию (пронейротрофин-3, пронейротрофин-4/5, pro-NGF, proBDNF и т.д.), нейротрофинов по настоящему описанию (нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, NGF, BDNF, т.д.), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белкомпредшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и связанным с рецептором белком (RAP), уменьшение секретирования PCSK9, уменьшение продукции бета-амилоидного пептида.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию увеличивают внеклеточные уровни програнулина и/или клеточные уровни програнулина in vitro или in vivo (например, в головном мозге, крови и/или периферических органах индивида). Как используется в данном документе, антитело против сортилина увеличивает внеклеточные уровни програнулина, если оно индуцирует увеличение на 20% или более внеклеточных уровней програнулина при измерении любым анализом in vitro на основе клеток или анализом на основе тканей (такого как на основе ткани головного мозга), описанного в данном документе или известного в данной области техники. Как используется в данном документе, антитело против сортилина увеличивает клеточные уровни програнулина, если оно индуцирует увеличение на 20% или более клеточных уровней програнулина при измерении любым анализом in vitro на основе клеток или анализа на основе тканей (такого как на основе ткани головного мозга), описанного в данном документе или известного в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию уменьшают клеточные уровни сортилина in vitro или in vivo (например, в головном мозге и/или периферических органах индивида). В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшение клеточных уровней сортилина включает уменьшение уровней сортилина на клеточной поверхности. Как используется в данном документе, антитело против сортилина уменьшает уровни сортилина на клеточной поверхности, если оно индуцирует уменьшение на 20% или более уровней сортилина на клеточной поверхности при измерении любым анализом in vitro на основе клеток или подходящей моделью in vivo, описанными в данном документе или известными в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшение клеточных уровней сортилина включает уменьшение внутриклеточных уровней сортилина. Как используется в данном документе, антитело против сортилина уменьшает внутриклеточные уровни сортилина, если оно индуцирует уменьшение на 20% или более внутриклеточных уровней сортилина при измерении любым анализом in vitro на основе клеток или подходящей моделью in vivo, описанными в данном документе или известными в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшение клеточных уровней сортилина включает уменьшение общих уровней сортилина. Как используется в данном документе, антитело против сортилина уменьшает общие уровни сортилина, если оно индуцирует уменьшение на 20% или более общих уровней сортилина при измерении любым анализом in vitro на основе клеток или подходящей моделью in vivo, описанными в данном документе или известными в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию увеличивают уровни програнулина и/или уменьшение клеточных уровней сортилина без ингибирования взаимодействия (например, связывания) между сортилином и програнулином. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию не ингибируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином. Как исполь- 51 043015 зуется в данном документе, антитело против сортилина не ингибирует взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином, если оно уменьшает связывание програнулина с сортилином на 20% или менее при насыщающих концентрациях антитела (например, 67 нМ) в любом анализе in vitro или анализе в культуре на основе клеток, описанных или известных в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию могут уменьшать клеточные уровни сортилина (например, уровни сортилина на клеточной поверхности, внутриклеточные уровни сортилина и/или общие уровни сортилина) путем индукции деградации сортилина. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию индуцируют деградацию сортилина.
Как используется в данном документе, уровни програнулина могут относиться к уровням экспрессии кодирующего програнулин гена; уровням экспрессии одного или более транскриптов, кодирующих програнулин; уровням экспрессии програнулинового белка и/или количеству програнулинового белка, секретируемого из клеток и/или присутствующего в пределах клетки. Как используется в данном документе, уровни сортилина могут относиться к уровням экспрессии кодирующего сортилин гена; уровням экспрессии одного или более транскриптов, кодирующих сортилин; уровням экспрессии белка сортилина и/или количеству белка сортилина, присутствующего в пределах клеточной поверхности. Для определения уровней програнулина и сортилина можно использовать любые методы, известные в данной области техники для измерения уровней генной экспрессии, транскрипции, трансляции и/или избытка или локализации белков.
Дополнительно, антитела против сортилина по настоящему описанию могут использоваться для предупреждения, снижения риска или лечения гибели клеток (например, гибели клеток нервной системы), лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, воспалительных нарушений, артрита, рассеянного склероза, нарушения метаболизма, ожирения, резистентности к инсулину, диабета 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранения и/или одного или более нежелательных симптомов естественного старения. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию представляют собой моноклональные антитела.
В определенных аспектах изобретения по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связывают прерывистый сортилиновый эпитоп. В некоторых вариантах реализации изобретения прерывистый сортилиновый эпитоп содержит два или белее пептидов, три или более пептидов, четыре или более пептидов, пять или более пептидов, шесть или более пептидов, семь или более пептидов, восемь или более пептидов, девять или более пептидов, или 10 или более пептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый из пептидов содержит пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более, 21 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более 14 или более, 15 или более, 16 или более, 17 или более, 18 или более, 19 или более, 20 или более, 21 или более, 22 или более, 23 или более, 24 или более, 25 или более, 26 или более, 27 или более, 28 или более, 29 или более, или 30 или более аминокислотных остатков на белке сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В других аспектах изобретения по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связываются с прерывистым эпитопом сортилина.
В определенных аспектах изобретения по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связываются с одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 131-138 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 131-138 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 175-181 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 175-181 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислот- 52 043015 ных остатков 207-231 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-231 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 207-227 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 207-227 и 237-260 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 212221 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 212-221 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 233-243 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 233-243 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 237-247 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 237-247 и 314-338 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 237-260 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 237260 и 297-317 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 297-317 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 297-317 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 314-338 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 314-338 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 367-391 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 367-391 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 429-443 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 429443 из SEQ ID NO: 1; одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 623-632 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 623-632 из SEQ ID NO: 1; и/или одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 740-749 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 740-749 из SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с одной или более аминокислот в пределах аминокислотных остатков 190-220 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 190-220 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207 и/или 203-207 сортилина человека; или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующего аминокислотным остаткам 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207 и/или 203-207 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с одной или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или из аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1. В других аспектах по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связываются с эпитопом, содержащим аминокислотные остатки (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X-(W/F/Y), где X представляет любую аминокислоту (SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию увеличивают внеклеточный уровень програнулина, увеличивают клеточные уровни програнулина
- 53 043015 и/или уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина и ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина и увеличивают клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают клеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином и увеличивают клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают уровни програнулина in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают уровни програнулина in vivo без уменьшения клеточных уровней сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают уровни програнулина в головном мозге. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают клеточные уровни програнулина в крови. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают клеточные уровни програнулина в одном или более периферических органов. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина в головном мозге. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина в одном или более периферических органов. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином и не уменьшают клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают клеточные уровни програнулина и не уменьшают клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают внеклеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают внеклеточные уровни програнулина и ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина и ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают клеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают клеточные уровни програнулина и ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина, увеличивают клеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина, ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином и не увеличивают клеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают клеточные уровни програнулина, ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином и не увеличивают внеклеточные уровни програнулина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают клеточные уровни програнулина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина, ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином и не уменьшают клеточные уровни сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина, не увеличивают клеточные уровни програнулина и не ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина уменьшают клеточные уровни сортилина, увеличивают клеточные уровни програнулина, увеличивают внеклеточные уровни програнулина и ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином. Внеклеточные уровни програнулина, клеточные уровни програнулина, уровни сортилина на клеточной поверхности или все эти параметры можно измерять путем анализа на основе клеток, известного в данной области техники и/или описанного в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения внеклеточные уровни програнулина, уровни сортилина на клеточной поверхности или оба этих параметра можно измерять путем использования клеточного анализа in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина также ингибируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина также ингибируют транспорт и секретирование PCSK9. В некоторых вариантах реализации изобретения анти
- 54 043015 тела против сортилина также ингибируют продукцию бета-амилоидного пептида. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина также ингибируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и профактором роста нервов (pro-NGF). В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина также ингибируют взаимодействие (например, связывание) между сортилином и одним или более белков из группы, выбранной из пронейротрофина, нейротрофина, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), пронейротрофина-3, нейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, нейротензина, нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-про), амилоидного белка-предшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP).
В определенных аспектах изобретения по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связываются с одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 130-141 или 592-757 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам 130-141 или 592-757 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 610-666, 592-593 и/или 667-749 сортилина человека; или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующего аминокислотным остаткам 610-666, 592-593 и/или 667-749 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с одной или более аминокислотами в пределах аминокислотных остатков 130-141 сортилина человека; или в пределах аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующего аминокислотным остаткам 130-141 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с одной или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или из аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и одним или более белков, выбранных из програнулина, пронейротрофина, нейротрофина, пронейротрофина-3, нейротрофина3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, профактора роста нервов (pro-NGF), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белкапредшественника (APP), А-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP) и/или вариантами природного происхождения. Предпочтительно антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и p75.
В других аспектах изобретения по настоящему описанию предложены антитела против сортилина, которые связываются с эпитопом, имеющим одну или более аминокислот из аминокислотных остатков His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 сортилина человека (SEQ ID NO: 1); или из аминокислотных остатков на сортилине млекопитающего, соответствующих аминокислотным остаткам His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350, Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 и/или Glu700 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и одним или более белков, выбранных из програнулина, пронейротрофина, нейротрофина, пронейротрофина-3, нейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, нейротрофина-4/5, профактора роста нервов (pro-NGF), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического профактора головного мозга (pro-BDNF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белка-предшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP). Предпочтительно антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и програнулином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина индуцируют одну или более активностей програнулина.
- 55 043015
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина снижают эндосомальную интернализацию програнулина или его фрагментов. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина увеличивают эффективную концентрацию програнулина.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и нейротрофином по настоящему описанию, таким как пронейротрофин, пронейротрофин-3, пронейротрофин-4/5, proNGF, pro-BDNF, нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, NGF и BDNF. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и нейротензином. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и p75. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и Sort-pro. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и APP. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют продукцию A-бетапептида. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют транспорт и секретирование PCSK9. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и LpL. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и APOA5. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и APOE. В других вариантах реализации изобретения антитела против сортилина ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином по настоящему описанию и RAP.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с белком сортилином по настоящему описанию и/или вариантами природного происхождению. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина связываются с сортилином человека.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с белком сортилином по настоящему описанию, экспрессируются на поверхности клеток, а голые антитела ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином и програнулином, пронейротрофином, нейротрофином, пронейротрофином-3, нейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, нейротрофином-4/5, профактором роста нервов (pro-NGF), фактором роста нервов (NGF), нейротрофическим профактором головного мозга (pro-BDNF), нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белкомпредшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE), PCSK9 и связанным с рецептором белком (RAP).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые связываются с белком сортилином по настоящему описанию, ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином и програнулином, пронейротрофином, нейротрофином, пронейротрофином-3, нейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, нейротрофином-4/5, профактором роста нервов (pro-NGF), фактором роста нервов (NGF), нейротрофическим профактором головного мозга (pro-BDNF), нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE), PCSK9 и связанным с рецептором белком (RAP) путем снижения эффективных уровней сортилина, который доступен для взаимодействия с этими белками либо на клеточной поверхности, либо внутри клетки.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые связываются с белком сортилином по настоящему описанию, ингибируют взаимодействие (например, связывание) между белком сортилином и програнулином, пронейротрофином, нейротрофином, пронейротрофином-3, нейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, нейротрофином-4/5, профактором роста нервов (pro-NGF), фактором роста нервов (NGF), нейротрофическим профактором головного мозга (pro-BDNF), нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE), PCSK9 и связанным с рецептором белком (RAP) путем индукции деградации сортилина.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурентно ингибируют связывание по меньшей мере одного антитела, выбранного из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурентно ингибируют связывание по меньшей мере одного антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S- 56 043015
15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-156-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-101, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-1510-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина по настоящему описанию конкурирует с одним или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-61, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-156-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-1510-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-1015, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-1514, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации, за связывание с сортилином, когда антитело против сортилина снижает связывание одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-211, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-1510-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации с сортилином по количеству в диапазонах от около 50% до 100% по сравнению со связыванием с сортилином в отсутствие антитела против сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина по настоящему описанию конкурирует с одним или более антителами, выбранными из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-156-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-1516, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации за связывание с сортилином, когда антитело против сортилина снижает связывание одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-154, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-1013, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-1511, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32,
- 57 043015
S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации с сортилином на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100%, по сравнению со связыванием с сортилином в отсутствие антитела против сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина по настоящему описанию, которое снижает связывание одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-66, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-1010, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-1510-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-825, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации с сортилином на 100% указывает, что антитело против сортилина по существу полностью блокирует связывание одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-153, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-156-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-1510-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации с сортилином. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина и одно или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-25, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-157, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-1510-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-1510-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-229, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации, присутствуют в количестве, которое соответствует соотношению 10:1, соотношению 9:1, соотношению 8:1, соотношению 7:1, соотношению 6:1, соотношению 5:1, соотношению 4:1, соотношению 3:1, соотношению 2:1, соотношению 1:1, соотношению 0,75:1, соотношению 0,5:1, соотношению 0,25:1, соотношению 0,1:1, соотношению 0,075:1, соотношению 0,050:1, соотношению 0,025:1, соотношению 0,01:1, соотношению 0,0075:1, соотношению 0,0050:1, соотношению 0,0025:1, соотношению 0,001:1, соотношению 0,00075:1, соотношению 0,00050:1, соотношению 0,00025:1, соотношению 0,0001:1, соотношению 1:10, соотношению 1:9, соотношению 1:8, соотношению 1:7, соотношению 1:6, соотношению 1:5, соотношению 1:4, соотношению 1:3, соотношению 1:2, соотношению 1:0,75, соотношению 1:0,5, соотношению 1:0,25, соотношению 1:0,1, соотношению 1:0,075, соотношению 1:0,050, соотношению 1:0,025, соотношению 1:0,01, соотношению 1:0,0075, соотношению 1:0,0050, соотношению 1:0,0025, соотношению 1:0,001, соотношению 1:0,00075, соотношению 1:0,00050, соотношению 1:0,00025 или соотношению 1:0,0001 антитела против сортилина с одним или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S- 58 043015
10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-157, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-1510-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-1510-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-229, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представлено в избытке на количество, которое находится в диапазоне от около 1, 5-кратного до 100-кратного или более 100-кратного по сравнению с количеством одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-157, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-1510-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-1510-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-229, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85, и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представлено в количестве, которое составляет около 2-кратного, 3-кратного, 4-кратного, 5-кратного, 6-кратного, 7-кратного, 8-кратного, 9кратного, 10-кратного, 15-кратного, 20-кратного, 25-кратного, 30-кратного, 35-кратного, 40-кратного, 45кратного, 50-кратного, 55-кратного, 60-кратного, 65-кратного, 70-кратного, 75-кратного, 80-кратного, 85кратного, 90-кратного, 95-кратного или 10 0-кратного избытка по сравнению с количеством одного или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-151, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-1510-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, и S-85, и любой их комбинации.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с эпитопом сортилина человека, который является таким же как или перекрывается с сортилиновым эпитопом, связываемым по меньшей мере одним антителом, выбранным из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с эпитопом сортилина человека, который является таким же как или перекрывается с сортилиновым эпитопом, связываемым по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-211, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-1510-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6,
- 59 043015
S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связывают по существу такой же сортилиновый эпитоп, связываемый по меньшей мере одним антителом, выбранным из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15. В некоторых вариантах реализации изобретения, антитела против сортилина по настоящему описанию связывают по существу такой же сортилиновый эпитоп, связываемый по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-153, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-156-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-1510-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85. Подробные типовые способы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в Morris (1996) Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилиномс одним или более антителами, выбранными из S-6, S-8, S49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-72, S-83 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из S-5, S-45, S-64, S-65 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилиномс одним или более антителами, выбранными из S-5, S-30, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилиномс одним или более антителами, выбранными из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-226, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-28, S-29, S-53, S-56, S-82 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилином одним или более антителами, выбранными из S-1, S-3, S-4, S-6, S-7, S-9, S-10, S-11, S13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-65, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-23, S-26, S-27, S-31, S-32, S-38, S-46, S-48, S-51, S-52, S-54, S-55, S57, S-58, S-59, S-61, S-62, S-68, S-69, S-70, S-71, S-73, S-74, S-75, S-77, S-79, S-80, S-85 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилиномс одним или более антителами, выбранными из S-5, S-12, S-24, S-25, S-30, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-47, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-72, S-76, S-78, S-81, S-83, S-84 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурируют за связывание с сортилиномс одним или более антителами, выбранными из S-8, S-49, S-50 и любой их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина понастоящему описанию конкурируют за связывание с сортилином с одним или более антителами, выбранными из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-610, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-1510-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85 и
- 60 043015 любой их комбинацией.
Для определения того, конкурирует ли антитело против сортилина с одним или более антител, выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-213, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-69, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-103, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, S-85 и любой их комбинации, можно использовать любой подходящий конкурентный анализ или анализ связывания сортилина, известный в данной области техники, такой как анализ BIAcore, анализ ELISA или проточной цитометрии. В типовом конкурентном анализе иммобилизованный сортилин или клетки, экспрессирующие сортилин на поверхности клетки, инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, связывающееся с сортилином (например, человека или не являющегося человеком примата), и второе немеченое антитело, исследуемое на предмет способности конкурировать с первым антителом за связывание с сортилином. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный сортилин или экспрессирующие сортилин клетки инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, благоприятных для связывания первого антитела с сортилином, удаляют избыток несвязанного антитела и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным сортилином или экспрессирующими сортилин клетками. Если количество метки, связанной с иммобилизованным сортилином или экспрессирующими сортилин клетками, существенно снижается в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с сортилином. См., Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых вариантах реализации изобретения конкурентный анализ, который используется с одним или более конкурентных анализов, описан в примерах 1, 3 или 4.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат (a) вариабельный участок легкой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3 из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 1115, или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-152, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-68, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-102, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-1510-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S82-8, S-83, S-84 и S-85; и/или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения HVR- 61 043015
L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 содержат последовательности CDR по EU или Kabat, CDR по Chothia или контактных CDR, как показано в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-155, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-1510-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-1512, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-224, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат по меньшей мере одни, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-26, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-156-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-108, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-1017, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-L2, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-1510-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-155, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-1510-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-1512, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-224, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVRH1, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2- 6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6- 62 043015
13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-1510-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-1016, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-228, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-66, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-1010, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-1510-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-825, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или из антитела, выбранного из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-153, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-156-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-1510-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит один или более из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 и 585, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 и 585; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40 и 586, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-40 и 586; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 и 121-125; и/или в которой вариабельный домен тяжелой цепи содержит один или более из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145, 147-149, 482-492, 513-524, 567-570, 587, и 591-596, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145, 147-149, 482492, 513-524, 567-570, 587 и 591-596; (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588 и 597-603, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588 и 597-603; и (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 179- 63 043015
186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239,
241, 243-247, 249, 252-256 и 540-564, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около
95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID
NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234,
236-239, 241, 243-247, 249, 252-256 и 540-564.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный участок легкой цепи из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 1115, или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-152, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-68, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-102, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-1510-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S82-8, S-83, S-84 и S-85; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любого из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-66, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-1010, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-1510-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-825, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный участок легкой цепи и/или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 317-334, 337-338, 341-345, 348-357, 360-365, 368-372, 375-376, 379-380, 389-392, 395-402, 407-414, 421-422, 425-433, 436-444, 447448, 451-461, 464-465, 470-479, 604-692.
Любые из антител по настоящему описанию могут быть получены с помощью клеточной линии. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная линия может быть клеточной линией дрожжей. В других вариантах реализации изобретения клеточная линия может быть клеточной линией млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточная линия может быть гибридомной клеточной линией. Любая клеточная линия, известная в данной области техники, пригодная для продуцирования антител, может быть использована для получения антитела по настоящему описанию. Типовые клеточные линии для продуцирования антител описаны в настоящем описании.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представляет собой моноклональное антитело против сортилина, выбранное из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-26, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-156-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-108, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-1017, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представляет собой антитело-антагонист.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описа- 64 043015 нию конкурентно ингибируют связывание по меньшей мере одного антитела, выбранного из S-5, S-6, S8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с эпитопом сортилина человека, который является таким же как или перекрывается с сортилиновым эпитопом, связываемым по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связывают по существу такой же сортилиновый эпитоп, связываемый по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат (a) вариабельный участок легкой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, выбранных из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83; и/или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, выбранных из S-5, S-6, S-8, S45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 содержат последовательности CDR по EU или Kabat, CDR по Chothia или контактных CDR из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-607, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, и S-83; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, и S-83; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 из антитела, выбранного из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный участок легкой цепи из любого из антител, выбранных из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из любого из антител, выбранных из S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 и S-83. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представляет собой моноклональное антитело против сортилина, выбранное из S-5, S-6, S8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S72 и S-835.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит один или более из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 и 15, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 и 15; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 и 32, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 и 32; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 и 123, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 и 123; и/или при этом вариабельный домен тяжелой цепи содержит один или более из: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 и 148, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 и 14 8; (b) HVR-H2, содержащий ами
- 65 043015 нокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 и 175, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170 173, и 175; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 и 254, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 и 254.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурентно ингибируют связывание по меньшей мере одного антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с эпитопом сортилина человека, который является таким же как или перекрывается с сортилиновым эпитопом, связываемым по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-2, S-2-1, S2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-1510-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связывают по существу такой же сортилиновый эпитоп, связываемый по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-63, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-1516, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат (a) вариабельный участок легкой цепи, включающий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, выбранных из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-26, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-154, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-1013, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-1511, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S82-6, S-82-7 и S-82-8; и/или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, выбранных из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-24, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-1510-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 содержат последовательности CDR по EU или Kabat, CDR по Chothia или контактных CDR из антител, выбранных из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-212, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S
- 66 043015
15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-613, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-1510-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-1016, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-157, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-1510-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-1510-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (ii) HVR-L, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-214, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-215, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-65, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из S-2, S-21, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-66, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-1010, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-1510-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-821, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-22, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-156-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-101, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-1510-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность из любой из последовательностей HVR-H3 из антитела, выбранного из S-2, S-2-1, S-2-2, S-23, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-1510-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
- 67 043015
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный участок легкой цепи из одного из антител, выбранных из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-156-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-101, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-1510-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8; и/или вариабельный участок тяжелой цепи из одного из антител, выбранных из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-212, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-613, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-1510-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-1016, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представляет собой моноклональное антитело против сортилина, выбранное из S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-610, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-1510-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-225, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 и S-82-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит один или более из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-10, 13 и 14, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-10, 13 и 14; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-31 и 33-35, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-31 и 33-35; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 и 122, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 и 122; и/или причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит один или более из: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 и 147, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 и 147; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150, 155-158, 162, 166, 169 и 173, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150, 155-158, 162, 166, 169 и 173; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 180, 19θ, 193-197, 203, 225, 231, 234 и 253, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 и 253.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию конкурентно ингибируют связывание по меньшей мере одного антитела, выбранного из S-5, S-30, S60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связываются с эпитопом сортилина человека, который является таким же как или перекрывается с сортилиновым эпитопом, связываемым по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию связывают по существу такой же сортилиновый эпитоп, связываемый по меньшей мере одним антителом, выбранным из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настояще
- 68 043015 му описанию содержат (а) вариабельный участок легкой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3, выбранных из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, и S-60-9; и/или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере один, два или три HVR, выбранных из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 выбранных из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 содержат последовательности CDR по EU или Kabat, CDR по Chothia или контактных CDR из антитела, выбранного из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-L1 из антитела, выбранного из S-5, S-30, S-601, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-L2 из антитела, выбранного из S-5, S-30, S60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и 5-60-9; (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-L3 из антитела, выбранного из S-5, S30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; (iv) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-H1 из антитела, выбранного из S5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, и S-60-9; (v) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-H2 из антитела, выбранного из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9; и (vi) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность любой из последовательностей HVR-H3 из антитела, выбранного из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный участок легкой цепи любого из антител, выбранных из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-604, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и 5-60-9; и/или вариабельный участок тяжелой цепи любого из антител, выбранных из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина представляет собой моноклональное антитело против сортилина, выбранное из S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 и S-60-9.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию содержат вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит один или более из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 30; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 70 и 100, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, 70 и 100; и/или причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит один или более из: (a) HVRH1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 136 и 142, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 126, 136 и 142; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 163 и 170, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 163 и 170; и (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 204 и 233, или аминокислотную последовательность с по меньшей мере около 95% гомологии с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 182, 204 и 233.
Константы диссоциации (KD) антитела против сортилина для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих могут составлять менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 60 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 30 нМ, менее 20 нМ, менее 10 нМ, менее 9 нМ, менее 8 нМ, менее 7 нМ, менее 6 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ, менее 2 нМ, менее 1 нМ, менее 0,5 нМ, менее 0,1 нМ, менее 0,09 нМ, менее 0,08 нМ, менее 0,07 нМ, менее 0,06 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,04 нМ, менее 0,03 нМ, менее 0,02 нМ, менее 0,01 нМ, менее 0,009 нМ, менее 0,008 нМ, менее 0,007 нМ, менее 0,006 нМ, менее 0,005 нМ, менее 0,004 нМ, менее 0,003 нМ, менее 0,002 нМ, менее 0,001 нМ или менее 0,001 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело обладает константой диссоциации (KD) для сортилина человека, сортилина мыши или их обоих, значение которой лежит в диапазоне от около 100 нМ до около 0,005 нМ, или менее 0,005 нМ. Предпочтительно константа диссоциации составляет менее 50 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константу диссоциации (KD) измеряют при 4°C или при комнатной температуре, используя, например, анализ связывания клеток, анализ ForteBio
- 69 043015 или анализ MSD-SET, как описано в данном документе (см., например, примеры 1 и 23).
Константы диссоциации (KD) антител против сортилина для сортилина человека и сортилина мыши могут составлять менее 71 нМ, менее 70,9 нМ, менее 70,8 нМ, менее 70,7 нМ, менее 70,6 нМ, менее 70,5 нМ, менее 70,4 нМ, менее 70,3 нМ, менее 70,2 нМ, менее 70,1 нМ, менее 70 нМ, менее 60 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 30,5 нМ, менее 30 нМ, менее 29,9 нМ, менее 29,8 нМ, менее 29,7 нМ, менее 29,6 нМ, менее 29,5 нМ, менее 29,4 нМ, менее 29,3 нМ, менее 29,2 нМ, менее 29,1 нМ, менее 29 нМ, менее 28,5 нМ, менее 28 нМ, менее 27,5 нМ, менее 27 нМ, менее 26,5 нМ, менее 26 нМ, менее 25,5 нМ, менее 25 нМ, менее 24,5 нМ, менее 24 нМ, менее 23,5 нМ, менее 23 нМ, менее 22,5 нМ, менее 22 нМ, менее 21,5 нМ, менее 21 нМ, менее 20,5 нМ, менее 20 нМ, менее 19,5 нМ, менее 19 нМ, менее 18, 9 нМ, менее 18,8 нМ, менее 18,7 нМ, менее 18,6 нМ, менее 18,5 нМ, менее 18,4 нМ, менее 18,3 нМ, менее 18,2 нМ, менее 18,1 нМ, менее 18 нМ, менее 17,5 нМ, менее 17 нМ, менее 16,5 нМ, менее 16 нМ, менее 15,5 нМ, менее 15 нМ, менее 14,5 нМ, менее 14 нМ, менее 13,5 нМ, менее 13 нМ, менее 12,5 нМ, менее 12 нМ, менее 11,5 нМ, менее 11 нМ, менее 10,5 нМ, менее 10 нМ, менее 9,5 нМ, менее 9 нМ, менее 8,5 нМ, менее 8 нМ, менее 7,5 нМ, менее 7 нМ, менее 6,9 нМ, менее 6,8 нМ, менее 6,7 нМ, менее 6,6 нМ, менее 6,5 нМ, менее 6,4 нМ, менее 6,3 нМ, менее 6,2 нМ, менее 6,1 нМ, менее 6 нМ, менее 5,5 нМ, менее 5 нМ, менее 4,5 нМ, менее 4 нМ, менее 3,5 нМ, менее 3 нМ, менее 2,5 нМ, менее 2 нМ, менее 1,5 нМ, менее 1 нМ, менее 0,95 нМ, менее 0,9 нМ, менее 0,89 нМ, менее 0,88 нМ, менее 0,87 нМ, менее 0,86 нМ, менее 0,85 нМ, менее 0,84 нМ, менее 0,83 нМ, менее 0,82 нМ, менее 0,81 нМ, менее 0,8 нМ, менее 0,75 нМ, менее 0,7 нМ, менее 0,65 нМ, менее 0,64 нМ, менее 0,63 нМ, менее 0,62 нМ, менее 0,61 нМ, менее 0,6 нМ, менее 0,55 нМ, менее 0,5 нМ, менее 0,45 нМ, менее 0,4 нМ, менее 0,35 нМ, менее 0,3 нМ, менее 0,29 нМ, менее 0,28 нМ, менее 0,27 нМ, менее 0,26 нМ, менее 0,25 нМ, менее 0,24 нМ, менее 0,23 нМ, менее 0,22 нМ, менее 0,21 нМ, менее 0,2 нМ, менее 0,15 нМ, менее 0,1 нМ, меньше чем 0,09 нМ, менее 0,08 нМ, менее 0,07 нМ, менее 005 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,04 нМ, менее 0,03 нМ, менее 0,02 нМ, менее 0,01 нМ, меньше чем 0,009 нМ, менее 0,008 нМ, менее 0,007 нМ, менее 0,006 нМ, менее 0,005 нМ, менее 0,004 нМ, менее 0,003 нМ, менее 0,002 нМ или менее 0,001 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константы диссоциацииантител против сортилина для сортилиновых белков человека находятся в диапазоне от менее около 70,4 нМ до менее около 0,29 нМ или от менее около 18,7 нМ до менее около 0,89 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константы диссоциацииантител против сортилина для сортилиновых белков человека находятся в диапазоне от около 70,4 нМ до около 0,005 нМ или менее 0,005 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константы диссоциацииантител против сортилина для сортилиновых белков мыши находятся в диапазоне от менее около 40,3 нМ до менее около 0,61 нМ или от менее около 29,6 нМ до менее около 0,61 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константы диссоциацииантител против сортилина для сортилиновых белков мыши находятся в диапазоне от около 40,3 нМ до около 0,07 нМ или менее 0,07 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения константы диссоциацииантител против сортилина для сортилиновых белков человека и мыши находятся в диапазоне от менее около 70,4 нМ до менее около 0,29 нМ или от менее около 29,6 нМ до менее около 0,61 нМ. Константы диссоциации могут быть определены с помощью любого аналитического метода, включая любой биохимический или биофизический метод, такой как ELISA, поверхностный плазмонный резонанс (ППР), интерферометрия в биослое (см., например, Octet System от ForteBio), обнаружение в среднем масштабе (см., например, Octet System от ForteBio), изотермическая титрационная калориметрия (ИТК), дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), круговой дихроизм (КД), анализ методом остановленной струи и колориметрический и флуоресцентный анализы плавления белка; или анализ связывания клеток. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения константу диссоциации (KD) измеряют при 4°C или при комнатной температуре, используя, например, анализ связывания клеток, анализ ForteBio или анализ MSD-SET, как описано в данном документе (см., например, примеры 1 и 23).
Дополнительные антитела против сортилина, например антитела, которые специфически связываются с белком сортилином по настоящему описанию, можно идентифицировать, подвергать скринингу или охарактеризовать относительно их физических/химических свойств и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области техники.
Уменьшенная экспрессия провоспалительных медиаторов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию могут уменьшать экспрессию провоспалительных медиаторов после связывания с экспрессированным в клетке белком сортилином.
Как используется в данном документе, провоспалительные медиаторы представляют собой белки, участвующие напрямую или косвенно (например, с помощью провоспалительных сигнальных путей) в механизме, который индуцирует, активирует, способствует или иным образом увеличивает воспалительную реакцию. Может быть использован любой способ, известный в данной области техники, для идентификации и определения характеристик провоспалительных медиаторов.
Примеры провоспалительных медиаторов включают, без ограничения, цитокины, такие как интерфероны I и II типа, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1e, TNF-α, IL-8, CRP, представители семейства IL-20, IL33, LIF, OSM, CNTF, GM-CsF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18 и CRP. Дополнительные примеры провоспали- 70 043015 тельных медиаторов включают, без ограничения, хемокины, такие как CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и
CCL5.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию могут уменьшать функциональную экспрессию и/или секретирование провоспалительных медиаторов, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-Щ, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшенная экспрессия провоспалительных медиаторов происходит в макрофагах, дендритных клетках, моноцитах, остеокластах, клетках Лангерганса кожи, клетках Купфера, Тклетках и/или микроглиальных клетках. Уменьшенная экспрессия может включать, без ограничения, уменьшение экспрессии генов, уменьшение транскрипционной экспрессии или уменьшение экспрессии белков. Может быть использован любой способ, известный в данной области техники, для определения экспрессии гена, транскрипта (например, мРНК) и/или экспрессии белков. Например, может быть использован анализ нозерн-блоттинга для определения уровней экспрессии генов провоспалительных медиаторов, может быть использована ОТ-ПЦР для определения уровня транскрипции провоспалительных медиаторов, и может быть использован анализ вестерн-блоттинга для определения уровней белков провоспалительных медиаторов.
Как используется в данном документе, провоспалительный медиатор может иметь уменьшенную экспрессию, если его экспрессия в одной или более клетках субъекта, получающего лечение антителом к сортилину, таким как антитело-агонист против сортилина по настоящему описанию, является большей, чем экспрессия такого же провоспалительного медиатора, экспрессируемого в одной или более клетках соответствующего субъекта, не получающего лечение антителом-агонистом против сортилина. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина по настоящему описанию может уменьшать экспрессию провоспалительного медиатора в одной или более клетках субъекта по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 110%, по меньшей мере на 115%, по меньшей мере на 120%, по меньшей мере на 125%, по меньшей мере на 130%, по меньшей мере на 135%, по меньшей мере на 140%, по меньшей мере на 145%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 160%, по меньшей мере на 170%, по меньшей мере на 180%, по меньшей мере на 190% или по меньшей мере на 200%, например, по сравнению с экспрессией провоспалительного медиатора в одной или более клетках соответствующего субъекта, который не получал лечение антителом против сортилина. В других вариантах реализации изобретения антитело против сортилина может уменьшать экспрессию провоспалительного медиатора в одной или более клетках субъекта по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 1,6 раз, по меньшей мере в 1,7 раз, по меньшей мере в 1,8 раз, по меньшей мере в 1,9 раз, по меньшей мере в 2,0 раза, по меньшей мере в 2,1 раза, по меньшей мере в 2,15 раз, по меньшей мере в 2,2 раза, по меньшей мере в 2,25 раз, по меньшей мере в 2,3 раза, по меньшей мере в 2,35 раз, по меньшей мере в 2,4 раза, по меньшей мере в 2,45 раз, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 2,55 раз, по меньшей мере в 3,0 раза, по меньшей мере в 3,5 раз, по меньшей мере в 4,0 раза, по меньшей мере в 4,5 раз, по меньшей мере в 5,0 раз, по меньшей мере в 5,5 раз, по меньшей мере в 6,0 раз, по меньшей мере в 6,5 раз, по меньшей мере в 7,0 раз, по меньшей мере в 7,5 раза, по меньшей мере в 8,0 раз, по меньшей мере в 8,5 раза, по меньшей мере в 9,0 раз, по меньшей мере в 9,5 раз или по меньшей мере в 10 раз, например, по сравнению с экспрессией провоспалительного медиатора в одной или более клетках соответствующего субъекта, который не получал лечение антителом против сортилина.
Fc-изотипы антитела против сортилина.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела по настоящему описанию включают антитела-антагонисты. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, которые связывают белок сортилин могут включать антитела-антагонисты, которые связывают сортилин и ингибируют одну или более активностей сортилина, либо путем предотвращения взаимодействия между сортилином и одним или более из его лигандов (например, програнулином, пронейротрофином, нейротрофином, нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом, APP, A-бета-пептидом, LpL, APOA5, APOE и RAP). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело-антагонист по настоящему описанию может содержать Fcдомен, который не способен связывать рецепторы Fcg.
Типовые блокирующие и/или антагонистические Fc-изотипы антител и модификации приведены ниже в табл. A. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина по настоящему описанию содержит Fc-изотип, отмеченный ниже в табл. A.
- 71 043015
Таблица A
Типовые Fc-изотипы антител против сортилина
Fc-изотип Мутация (схема нумерации no EU или Kabat)
IgGl N297A или N297Q
IgGl D265A и N297A
IgGl L234A и L235A
IgG2 V234A и G237A
IgG4 F235A и G237A и Е318А Е233Р и/или F234V N297A или N297Q
IgG4 S228P и L236ES241PS241P и L248E S228P и F234A и L235A
IgG2 H268Q и V309L и A330S и P331S
IgGl C220S и C226S и C229S и P238S
IgGl C226S и C229S и Е233Р и L234V, и L235A
IgGl Е233Р и L234V и L235A и 6236-удален Р238А D265A N297A A327Q или A327G Р329А
IgGl К322А и L234A и L235A
IgGl L234F и L235E и P331S
IgGl или IgG4 T394D
IgG2 С2323или C233S N297A или N297Q
IgG2 V234A и G237A и P238S и Н268А и V309L и A330S и P331S
IgGl, IgG2 или IgG4 Модификации дельта а, Ь, с, ab, ас, g
IgGl Любые из вышеперечисленных мутаций вместе с мутациями A330L или L234F и/или L235E и/или P331S
IgGl, IgG2 или IgG4 Любые из вышеперечисленных мутаций вместе с мутациями M252Y и/или S254T и/или Т256Е
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет изотип IgG1. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит константный участок IgG1 мыши. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит константный участок IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения константный участок IgG1 человека включает Fc-участок. В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок содержит одну или более модификаций. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения Fcучасток содержит одну или более аминокислотных замен (например, по сравнению с Fc-участком дикого типа того же изотипа). В некоторых вариантах реализации изобретения одну или более аминокислотных замен выбирают из N297A, N297Q (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23: 403-411), D265A, L234A, L235A (McEarchern et al., (2007) Blood, 109: 1185-1192), C226S, C229S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109: 1185-1192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34: 2204-2210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109: 1185-1192), P238A, A327Q, A327G, P329A (Shields RL. et al., (2001) J Biol Chem. 276(9): 6591-604), K322A, L234F, L235E (Hezareh, et al., (2001) J Virol 75, 12161-12168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica64, 700-704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica64, 700704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406-417), A330L, M252Y, S254T и/или T256E, где положения аминокислот соответствуют правилам нумерации EU или Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок дополнительно включает делецию аминокислоты в положении, соответствующем глицину 236 согласно правилу нумерации EU или Kabat.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело имеет изотип IgG1 с константным доменом тяжелой цепи, который содержит аминокислотную замену C220S в соответствии с правилом нумерации EU или Kabat.
В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок дополнительно содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен, выбранных из A330L, L234F; L235E и/или P331S, в соответствии с правилом нумерации EU или Kabat.
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет изотип IgG2. В
- 72 043015 некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит константный участок IgG2 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения константный участок IgG2 человека включает Fc-участок. В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок содержит одну или более модификаций. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок содержит одну или более аминокислотных замен (например, по сравнению с Fc-участком дикого типа того же изотипа). В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен выбраны из P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, V309L, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T и/или T256E, где положение аминокислот соответствует правилу нумерации EU или Kabat (Vafa O. et al., (2014) Methods 65: 114-126).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина имеет изотип IgG4. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело против сортилина содержит константный участок IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения константный участок IgG4 человека включает Fc-участок. В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок содержит одну или более модификаций. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок содержит одну или более аминокислотных замен (например, по сравнению с Fc-участком дикого типа того же изотипа). В некоторых вариантах реализации изобретения одну или более аминокислотных замен выбирают из E233P, F234V, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92: 11980-11984), S228P, L234A/F234A, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol, 164: 1925-1933; Angal et al., (1993) Mol Immunol. 30(1): 105-8; US 8614299 B2; Vafa O. et al., (2014) Methods 65: 114-126), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, и/или N297Q, где положение аминокислот соответствует правилу нумерации EU или Kabat.
В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-участок дополнительно содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен, выбранных из M252Y, S254T и/или T256E, где положение аминокислот соответствует правилу нумерации EU или Kabat.
Дополнительные мутации IgG.
В некоторых вариантах реализации изобретения один или более вариантов IgG1, описанных в данном документе, могут быть объединены с мутацией A330L (Lazar et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103: 4005-4010), и одной или более из мутаций L234F, L235E и/или P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105: 20167-20172), где положение аминокислот соответствует правилу нумерации EU или Kabat, для устранения активации комплемента. В некоторых вариантах реализации изобретения варианты IgG, описанные в данном документе, могут быть объединены с одной или более мутациями, чтобы увеличить период полувыведения антитела против сортилина из сыворотки крови человека (например, мутации M252Y, S254T, T256E в соответствии с правилом нумерации EU или Kabat) (Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem, 281: 23514-23524; и Strohl et al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20: 685-691).
В некоторых вариантах реализации изобретения вариант IgG4 по настоящему описанию может быть объединен с мутацией S228P в соответствии с правилом нумерации EU или Kabat (Angal et al., (1993) Mol Immunol, 30: 105-108) и/или с одной или более мутациями, описанными в Peters et al., (2012) J Biol Chem. 13; 287(29): 24525-33) для улучшения стабилизации антитела.
Биспецифические антитела.
Определенные аспекты изобретения по настоящему описанию относятся к биспецифическим антителам, которые связываются с одним или более доменами на белке сортилине по настоящему описанию и вторым антигеном. Способы получения биспецифических антител хорошо известны в данной области техники и описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифические антитела по настоящему описанию связываются с одним или более аминокислотными остатками из белка сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифические антитела по настоящему описанию распознают первый антиген и второй антиген. В некоторых вариантах реализации изобретения первый антиген представляет собой белок сортилин или его вариант природного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения второй антиген также представляет собой белок сортилин или его вариант природного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения второй антиген представляет собой антиген, облегчающий транспорт через гематоэнцефалический барьер (см., например, Gabathuler R., Neurobiol. Dis. 37 (2010) 48-57). Такие вторые антиген включают, без ограничения, рецептор трансферрина (TR), инсулиновый рецептор (HIR), рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR), белки 1 и 2 рецептора липопротеинов низкой плотности (LPR-1 и 2), рецептор дифтерийного токсина, CRM197, однодоменное антитело ламы, TMEM 30 (A), белковый домен трансдукции, TAT, Syn-B, пенетратин, полиаргининовый пептид, пептиды ангиопеп, такие как ANG1005 [см., например, Gabathuler, 2010), базигин, Glut1, CD98hc и другие белки клеточной поверхности, которые обогащают эндотелиальные клетки гематоэнцефалического барьера [см., например, Daneman et al., PLoS One. 2010 Oct 29; 5(10): e13741).
Комбинации антител.
Некоторые аспекты по настоящему описанию относятся к применению двух или более антител против сортилина, которые при использовании вместе показывают аддитивные или синергические эффекты, по сравнению с применением соответствующего антитела против сортилина.
- 73 043015
Фрагменты антител.
Определенные аспекты по настоящему описанию относятся к фрагментам антител, которые связываются с белком сортилином по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv или scFv. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент антитела используют в комбинации со вторым антителом к сортилину и/или одним или более антителами, которые специфически связывают вызывающий заболевание белок, выбранный из: бета-амилоида или его фрагментов, тау-белка, IAPP, альфа-синуклеина, TDP-43, белка FUS, прионного белка, PrPsc, хантингтина, кальцитонина, супероксиддисмутазы, атаксина, телец Леви, атриального натрий-уретического фактора, островкового амилоидного полипептида, инсулина, аполипопротеина AI, сывороточного амилоида A, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2-микроглобулина, гельзолина, кератоэпителина, цистатина, легкой цепи иммуноглобулина AL, белка S-IBM, продуктов трансляции, ассоциированных с повторами не ATG (RAN), пептидов дипептидного повтора (ДПП), пептидов повтора глицин-аланин (GA), пептидов повтора глицин-пролин (GP), пептидов повтора глицин-аргинин (GR), пептидов повтора пролин-аланин (PA) и пептидов повтора пролинаргинин (PR), и любой их комбинации.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты антител по настоящему описанию могут быть функциональными фрагментами, которые связывают такой же эпитоп, что и любое из антител против сортилина по настоящему описанию. IB некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты антител представляют собой уменьшенные варианты антител против сортилина или фрагментов антител по настоящему описанию, которые содержат такой же эпитоп соответствующего полноразмерного антитела, но имеющие намного меньшую массу молекулы. Такие уменьшенные фрагменты антител против сортилина могут обладать лучшей способностью к проникновению в головной мозг и меньшим периодом полувыведения, что является преимуществом для применения при визуализации и диагностике (см., например, Lutje S et al., Bioconjug Chem. 2014 Feb 19; 25(2): 335-41; Tavare R et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jan 21; 111(3): 1108-13; и Wiehr S et al., Prostate. 2014 May; 74(7): 743-55). Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты антител против сортилина по настоящему описанию обладают лучшим проникновением в головной мозг по сравнению с соответствующими полноразмерными антителами и/или имеют меньшие периоды полувыведения по сравнению с соответствующими им полноразмерными антителами.
Каркасы антител.
Любые из антител, описанные в данном документе, дополнительно включают каркас. В некоторых вариантах реализации изобретения каркас представляет собой каркас иммуноглобулина человека. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антитело (например, антитело против сортилина) содержит HVR, как в любом из вышеприведенных вариантов реализации изобретения и дополнительно содержит акцепторный каркас человека, например, иммуноглобулиновый каркас человека или консенсусный каркас человека. Каркасы иммуноглобулина человека могут быть частью антитела человека, или антитело, не являющееся человеческим, может быть гуманизировано путем замены одного или более эндогенных каркасов на каркасный(ые) участок(ки) человека. Каркасные участки человека, которые можно использовать для гуманизации, включают, но не ограничиваются ими: каркасные участки, выбранные с использованием способа наилучшего соответствия (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); каркасные участки, происходящие от консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных участков легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); зрелые (содержащие соматические мутации) каркасные участки человека или эмбриональные каркасные участки человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные участки, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий HVR-L1, HVR-L2 HVR-L3 по настоящему описанию и один, два, три или четыре каркасных участка легкой цепи, как показано в табл. 2 и SEQ ID NO: 630, 667 и 641-684. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий HVR-H1, HVR-H2 HVR-H3 по настоящему описанию и один, два, три или четыре каркасных участка тяжелой цепи, как показано в табл. 3 и SEQ ID NO: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 и 685-692. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий HVR-L1, HVR-L2 HVR-L3 по настоящему описанию и один, два, три или четыре каркасных участка легкой цепи, как показано в табл. 2 и SEQ ID NO: 630, 667 и 641-684, и дополнительно содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий HVR-H1, HVR-H2 HVR-H3 по настоящему описанию и один, два, три или четыре каркасных участка тяжелой цепи, как показано в табл. 3 и SEQ ID NO: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 и 685-692.
Получение антител.
Антитела против сортилина по настоящему описанию могут включать в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела, гуманизированные и химерные антитела, человеческие антитела, фраг
- 74 043015 менты антител (например, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv и F(ab')2), биспецифические и полиспецифические антитела, поливалентные антитела, гетероконъюгаты антител, полученные из библиотек антитела, антитела, имеющие модифицированные эффекторные функции, слитые белки, содержащие часть антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена, такой как эпитоп, имеющий аминокислотные остатки белка сортилина по настоящему описанию, включая гликозилированные варианты антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела против сортилина могут иметь происхождение от человека, мыши, крысы или какое-либо другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела).
(1) Поликлональные антитела.
Поликлональные антитела, такие как поликлональные антитела против сортилина, как правило, вырабатываются у животных путем множественных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгирование соответствующего антигена (например, очищенный или рекомбинантный белок сортилин по настоящему описанию) с белком, который является иммуногенным для иммунизируемых видов, например, с гемоцианином моллюска фиссуреллии (KLH), сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, например сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгирование через остатки цистеина), Nгидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl2 или 1N=C=NR, где R и R1 представляют собой независимо низшие алкильные группы. Примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают полный адъювант Фрейнда и адъювант MPL-TDM (монофосфориллипид A, синтетический дикориномиколат трегалозы). Протокол иммунизации может быть выбран специалистом в данной области техники без лишних экспериментов.
Животных иммунизируют против желаемого антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем объединения, например, 100 мкг (для кроликов) или 5 мкг (для мышей) белка или конъюгата с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъецированием этого раствора внутрикожно во множество участков. Спустя месяц животных повторно иммунизируют (бустер-имунизацией) от 1/5 до 1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожной инъекцией во множество участков. Через 7-14 дней у животных берут кровь и анализируют сыворотку в отношении титра антител. Животных стимулируют до достижения постоянного уровня титра. Конъюгаты могут быть также получены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Также для усиления иммунного ответа являются пригодными агрегирующие агенты, такие как квасцы.
(2) Моноклональные антитела.
Моноклональные антитела, такие как моноклональные антитела против сортилина, получают из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными за исключением возможных мутаций природного происхождения и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризаций, амидирований), которые могут присутствовать в минорных количествах. Таким образом, определение моноклональное указывает на то, что антитело не является смесью отдельных антител.
Например, моноклональные антитела против сортилина могут быть получены с использованием гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).
В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк, иммунизируют, как описано выше, для индукции лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, использованным для иммунизации (например, очищенный или рекомбинантный белок сортилин по настоящему описанию). В альтернативном варианте лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Как правило, иммунизирующий агент будет включать антигенный белок (например, очищенный или рекомбинантный белок сортилин по настоящему описанию) или его слитый вариант. В целом, если желательным источником является млекопитающее, не являющееся человеком, используют клетки селезенки или клетки лимфатического узла либо, если желательными являются клетки человеческого происхождения, используют лимфоциты периферической крови (PBL). Чтобы получить гибридомную клетку, лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией, используя подходящий агент слияния, такой как полиэтиленгликоль. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), p. 59-103.
Как правило, иммортализованные клеточные линии представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности клетки миеломы грызуна, быка или человека. Обычно используют клеточные линии миеломы крысы или мыши. Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых исходных клеток миеломы. Например,
- 75 043015 если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом обычно должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), и такие вещества предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.
Предпочтительными иммортализированными миеломными клетками являются такие клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают на стабильно высоком уровне продукцию антитела отобранными продуцирующими антитело клетками и чувствительны к такой среде, как среда HAT. Среди них предпочтительными являются линии миеломы мыши, такие как линии, полученные из опухолей мыши MOPC-21 и MPC-11 (доступные из Salk Institute Cell Distribution Center, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США), а также клетки SP-2 и их производные (например, X63-Ag8-653) (доступные из Американской коллекция типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния, США). Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также были описаны для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют в отношении продукции моноклональных антител, направленных против антигена (например, белка сортилина по настоящему описанию). Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, предпочтительно определяют с помощью иммунопреципитации или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Культуральная среда, в которой выращивают клетки гибридомы, может быть проанализирована на наличие моноклональных антител, направленных против требуемого антигена (например, белка сортилина по настоящему описанию). Аффинность связывания и специфичность моноклональных антител предпочтительно может быть определена с помощью иммунопреципитации или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Такие методы известны в данной области техники. Например, аффинность связывания может быть определена с помощью анализа Скэтчарда по Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы способами лимитирующего разведения и выращены стандартными способами (Goding, выше). Подходящие культуральные среды для указанной цели включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo в виде опухолей в организме животного.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки традиционными способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на протеине A-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ, аффинная хроматография и другие методы, описанные выше.
Моноклональные антитела против сортилина также могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, такими как способы, описанные в патенте США № 4816567 и описанные выше. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют, используя обычные процедуры (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы синтезировать моноклональные антитела в таких рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии бактериальной ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5: 256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Rev. 130: 151-188 (1992).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина могут быть выделены из фаговых библиотек антител, созданных с использованием методик, описанных в McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581597 (1991), описывающих выделение из фаговых библиотек мышиных и человеческих антител, соответственно. В последующих публикациях описано получение высокоаффинных (наномолярный (нМ) диапазон) антител человека с помощью перетасовки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), также комбинаторной инфекции in vivo и рекомбинации в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, такие методики являются приемлемыми альтернативами традиционным способам на основе продуцирующих моноклональные антитела гибридом для выделения моноклональных антител требуемой специфичности (например, которые связывают белок сортилин по настоящему описанию).
ДНК, кодирующая антитела или их фрагменты, может быть также модифицирована, например, путем замены последовательности, кодирующей константные домены тяжелой и легкой цепи, вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), или ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид. Обыч- 76 043015 но такими неиммуноглобулиновыми полипептидами заменяют константные домены антитела или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела, чтобы создать химерное бивалентное антитело, содержащее один антигенсвязывающий участок, имеющий специфичность по отношению к антигену, и другой антигенсвязывающий участок, имеющий специфичность по отношению к другому антигену.
Моноклональные антитела, описанные в данном документе, (например, антитела против сортилина по настоящему описанию или их фрагменты) могут быть моновалентными, получение которых хорошо известно в данной области техники. Например, один метод включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи иммуноглобулина. Тяжелую цепь, как правило, укорачивают в любой точке Fc-участка для предотвращения перекрестного сшивания тяжелой цепи. В альтернативном варианте релевантные остатки цистеина могут быть заменены другим аминокислотным остатком или удалены для предотвращения перекрестного сшивания. Способы in vitro также пригодны для получения моноклональных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности фрагментов Fab, можно осуществить с использованием обычных методик, известных в данной области техники.
Химерные или гибридные антитела против сортилина также можно получать in vitro с использованием известных способов в химии синтетических белков, включая способы с использованием перекрестно сшивающих агентов. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с помощью реакции дисульфидного обмена или путем формирования простой тиоэфирной связи. Примеры приемлемых для этой цели реагентов включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.
(3) Гуманизированные антитела.
Антитела против сортилина по настоящему описанию или фрагменты данных антител могут дополнительно включать гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизированные формы не являющихся человеческими антител (например, мышиных) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из не являющегося человеческим иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (CDR) реципиента заменены остатками CDR отличных от человека видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не присутствуют ни в антителе реципиента, ни в импортированной CDR или последовательностях каркасных участков. В целом, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все участки CDR соответствуют таковым в нечеловеческом иммуноглобулине, а все или практически все участки FR представляют собой участки консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Оптимально, чтобы гуманизированное антитело содержало также по меньшей мере участок константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593596 (1992).
В данной области техники хорошо известны способы гуманизации нечеловеческих антител против сортилина. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, введенных из источника, не являющегося человеком. Эти не совпадающие с человеческими аминокислотными остатками часто называют импортируемыми остатками, которые обычно получают из импортируемого вариабельного домена. По существу гуманизацию можно осуществлять, согласно способу Winter и сотрудников, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988), или посредством замены CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности антитела человека. Таким образом, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), в которых по существу по меньшей мере интактный вариабельный домен человека, был заменен соответствующей последовательностью из вида, не относящегося к человеку. На практике гуманизированные антитела являются обычно антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов.
Выбор вариабельных доменов, как легкой, так и тяжелой цепи человека, для использования в получении гуманизированных антител является очень важным для уменьшения антигенности. Согласно так называемому способу оптимальной подгонки последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу по сравнению с полной библиотекой известных последовательностей вариабельных доменов человека. Человеческую последовательность, которая наиболее близка последовательности грызуна, затем берут в качестве человеческого каркасного участка (FR) для гуманизированного антитела. Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987). В другом способе используют особый каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител че- 77 043015 ловека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких разных гуманизированных антител. Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992);
Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993).
Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности по отношению к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения указанной цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела получают, проводя анализ исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают возможные трехмерные конформационные структуры отобранных для исследования последовательностей иммуноглобулина. Исследование таких изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании отобранной для исследования последовательности иммуноглобулина, т.е. анализировать остатки, которые влияют на способность отобранного для исследования иммуноглобулина связывать соответствующий ему антиген. Таким образом могут быть отобраны и объединены остатки FR из реципиентных и импортируемых последовательностей так, чтобы добиться требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)-мишени(ям) (например, сортилиновым белкам по настоящему описанию). В общем, остатки CDR непосредственно и в наибольшей степени влияют на связывание антигена.
Рассматриваются различные формы гуманизированного антитела против сортилина. Например, гуманизированное антитело против сортилина может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab, который для образования конъюгата необязательно конъюгирован с одним или более цитотоксическими агентами. В альтернативном варианте антитело против сортилина может быть интактным антителом, таким как интактное антитело к IgG1.
(4) Антитела человека.
В альтернативном варианте могут быть получены антитела человека против сортилина. К примеру, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей) которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Гомозиготная делеция гена соединяющего участка тяжелой цепи (JH) антитела у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в такие мутантные по зародышевой линии мыши должен приводить к продукции антител человека при антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993); патенты США №5591669 и WO 97/17852.
В альтернативном варианте для продукции антител человека против сортилина и фрагментов антител in vitro можно использовать технологию фагового дисплея с использованием репертуаров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров. McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991). Согласно указанной методике гены V-доменов антител клонируют в рамке считывания с геном либо основного, либо минорного белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как M13 или fd, и выводят в виде функциональных фрагментов антител на поверхность фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию фагового генома в виде одноцепочечной ДНК, отбор на основе функциональных свойств антитела также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен во многих форматах, обзор которых приведен в, например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3: 564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) выделили широкий спектр антител к оксазолону из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V-генов неиммунизированных людей-доноров и можно выделить антитела к широкому спектру антигенов (включая аутоантигены), по существу следуя методу, описанному Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). См. также, например, патенты №5565332 и 5573905. В дополнение к этому, для продукции антител против сортилина и фрагментов антител можно использовать технологию дрожжевого дисплея in vitro (например, WO 2009/036379; WO 2010/105256; WO 2012/009568; US 2009/0181855; US 2010/0056386 и Feldhaus and Siegel (2004) J. Immunological Methods 290: 69-80). В других вариантах реализации изобретения для продукции антител против сортилина и фрагментов антител можно использовать технологию рибосомального дисплея in vitro (например, Roberts and Szostak (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 12297-12302; Schaffitzel et al. (1999) J. Immunolical Methods 231: 119-135; Lipovsek and Pluckthun (2004) J. Immunological Methods 290: 51-67).
Методики Cole et al. и Boerner et al., также доступны для получения моноклональных антител против сортилина (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991). Аналогично антитела человека против сортилина можно получать
- 78 043015 путем введения локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например, мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При стимуляции наблюдается продукция антител человека, которые сильно, во всех отношениях, похожи на антитела, выявляемые у людей, включая перестройку генов, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США №5545807; 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016 и следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Наконец антитела человека против сортилина также могут быть получены in vitro путем активации B-клеток (см. патенты США № 5567610 и 5229275).
(5) Фрагменты антител.
В некоторых вариантах реализации изобретения существуют преимущества для использования фрагментов антител против сортилина, а не целых антител против сортилина. Меньшие размеры фрагментов обеспечивают быстрый клиренс и лучшее проникновения в головной мозг.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методики. Традиционно такие фрагменты получали в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Однако в настоящее время такие фрагменты могут непосредственно продуцироваться рекомбинантными клетками-хозяевами или, например, с использованием нуклеиновых кислот, кодирующих антитела против сортилина по настоящему описанию. Все фрагменты антител Fab, Fv и scFv можно экспрессировать и выделять из E. coli, тем самым обеспечивая прямое получение больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител против сортилина также можно выделять из фаговых библиотек антител, обсуждавшихся выше. В альтернативном варианте фрагменты Fab'-SH могут быть непосредственно извлечены из клеток E. coli и химически соединены с образованием фрагментами F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Согласно другому подходу фрагменты F(ab')2 можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Продукция фрагментов антител Fab и F(ab')2 с увеличенными периодами полувыведения in vivo описана в патенте США №5869046. В других вариантах реализации изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (ScFv). См. WO 93/16185; патенты США №5571894 и патент США №5587458. Фрагмент антитела также может представлять собой линейное антитело, например, описанное в патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
(6) Биспецифические или полиспецифические антитела.
Биспецифические антитела (BsAb) являются антителами, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов, в том числе эпитопов на одном и том же или на другом белке (например, один или более сортилиновых белков по настоящему описанию). В альтернативном варианте одно плечо BsAb может быть сконструировано для связывания с целевым сортилиновым антигеном, а другое плечо может быть объединено с плечом, которое связывается со вторым белком. Такие антитела могут быть получены из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2 биспецифических антител).
В данной области техники известны способы получения биспецифических антител. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых цепей/легких цепей иммуноглобулина, где эти две пары цепей обладают различной специфичностью. Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983). Из-за случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистка правильной молекулы, которую обычно выполняют на этапе аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, и выход продукта низок. Сходные процедуры описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
В соответствии с другим подходом, вариабельные домены антитела с желательной специфичностью связывания (сайтами связывания антитело-антиген) объединяют в последовательности константных доменов иммуноглобулинов. Гибридизация предпочтительно происходит в константном домене тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащем по меньшей мере часть шарнирных участков CH2 и CH3. Предпочтительно иметь первую константную область тяжелой цепи (CH1), содержащую сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий в по меньшей мере одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулинов и, при желании, легкие цепи иммуноглобулинов, внедряют в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируют в организм подходящего хозяина. Это обеспечивает большую гибкость при коррекции взаимного соотношения трех полипептидных фрагментов в вариантах реализации изобретения, когда неравное соотношение трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивает оптимальный выход. В то же время можно вставлять кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высокому выходу или если их соотношение не имеет особого значения.
- 79 043015
В предпочтительном варианте реализации этого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и гибридной пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине этих биспецифических молекул обеспечивает легкий путь отделения. Этот подход описан в WO 94/04690. В отношении дополнительных подробностей образования биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
В соответствии с другим подходом, описанным в WO 96/27011 или патенте США №5731168, область контакта между парой молекул антител может быть сконструирована таким образом, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта содержит по меньшей мере часть участка CH3 константного домена антитела. В этом способе одна или более малых боковых цепей аминокислот из области контакта молекулы первого антитела заменены большими боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные полости идентичного или сходного размера относительно больших боковых цепей создаются на области контакта второй молекулы антитела путем замены больших аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, например, гомодимерами.
В литературе были описаны способы получения биспецифических антител из фрагментов антител. Например, можно получать биспецифические антитела за счет химического связывания. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела протеолитически расщепляют с созданием фрагментов F(ab')2. Эти фрагменты восстанавливают в присутствие арсенита натрия, образующего комплексы с дитиолами, для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные фрагменты Fab' превращают в тионитробензоатные (TNB) производные. Затем одно из производных Fab'-TNB повторно превращают в производное Fab'-TNB с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела можно использовать в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.
Фрагменты Fab' могут быть непосредственно извлечены из E. coli и химически связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) описывают образование полностью гуманизированных молекул F(ab')2 биспецифического антитела. Каждый фрагмент Fab' отдельно секретировался из E. coli и подвергался направленному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Образованное таким образом биспецифическое антитело было способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и нормальными T-клетками человека, а также запускать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против мишеней опухоли молочной железы человека.
Были также описаны разнообразные методики получения и выделения бивалентных фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, были получены бивалентные гетеродимеры с использованием лейциновых молний. Kostelnyet al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии из белков Fos и Jun связывали с частями Fab' двух разных антител слиянием генов. Гомодимеры антител восстанавливали по шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окисляли с образованием гетеродимеров антител. В технологии диател, описанной Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), предложен альтернативный механизм для получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) посредством линкера, который является слишком коротким, чтобы сделать возможным спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента с образованием посредством этого двух антигенсвязывающих сайтов. Сообщалась также другая стратегия для получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител с использованием одноцепочечных димеров Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
Также рассматриваются антитела, имеющие более двух валентностей. Например, можно получать триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
Типовые биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами на данной молекуле (например, белок сортилин по настоящему описанию). В альтернативном варианте плечо, нацеливающее на сортилиновый компонент передачи сигнала, можно объединять с плечом, связывающимся с триггерной молекулой на лейкоците, например, T-клеточным рецептором (например, CD2, CD3, CD28 или B7) или рецептором Fc для IgG (FcyR), таким как FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16), с целью сосредоточить клеточные защитные механизмы на экспрессирующей конкретный белок клетке. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов в клетках, экспрессирующих конкретный белок. Такие антитела обладают связывающим белок плечом и плечом, связывающим цитотоксический агент или хелатор радионуклида, такой как EOTUBE, DPTA,
- 80 043015
DOTA или TETA. Другое интересующее биспецифическое антитело связывает интересующий белок и дополнительно связывает тканевый фактор (TF).
(7) Поливалентные антитела.
Поливалентное антитело может интернализоваться (и/или катаболизироваться) быстрее, чем бивалентное антитело, клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела. Антитела против сортилина по настоящему описанию или их фрагменты антител могут представлять собой поливалентные антитела (которые могут относиться к классу, отличному от класса IgM) с тремя или более антигенсвязывающими сайтами (например, четырехвалентные антитела), которые можно легко получать посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих сайтов. Предпочтительный домен димеризации содержит Fc-участок или шарнирный участок. В этом случае, антитело будет содержать Fc-участок и три или более антигенсвязывающих сайтов со стороны аминоконца Fc-участка. Предпочтительное поливалентное антитело, представленное в данном документе, содержит от трех до около восьми, но предпочтительно четыре, антигенсвязывающих сайта. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (и предпочтительно две полипептидные цепи), причем полипептидная цепь, или цепи, содержит два или более вариабельных доменов. Например, полипептидная цепь, или цепи, может содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, причем VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-участка, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, а n равно 0 или 1. Аналогично, полипептидная цепь, или цепи, может содержать цепь VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-участок или цепь VH-CH1-VH-CH1-Fc-участок. Поливалентное антитело, представленное в данном документе, предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере два (и предпочтительно четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Поливалентное антитело, представленное в данном документе, например, может содержать от приблизительно двух до около восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Полипептиды вариабельного домена легкой цепи, рассматриваемые в данном документе, содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержат домен CL. Поливалентные могут распознавать сортилиновый антиген, а также, без ограничения, дополнительные антигены: антиген A-бета-пептида или антиген белка альфа-синуклеина, или антиген тау-белка, или антиген белка TDP-43, или антиген прионного белка, или антиген белка хантингтина, или RAN, антиген продуктов трансляции, включая дипептидные повторы (пептиды DPR), состоящие из глицин-аланина (GA), глицин-пролина (GP), глицин-аргинина (GR), пролин-аланина (PA) или пролин-аргинина (PR), инсулиновому рецептору, рецептору инсулиноподобного фактора роста или любому другому антигену, который облегчает перенос антитела через гематоэнцефалический барьер.
(8) Антитела-гетероконъюгаты.
Антитела-гетероконъюгаты также попадают объем настоящего описания. Антителагетероконъюгаты состоят из двух ковалентно связанных антител (например, антител против сортилина по настоящему описанию или фрагментов таких антител). Например, одно из антител в составе гетероконъюгата можно связать с авидином, а другое - с биотином. Такие антитела, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980, и их использовали для лечения ВИЧ-инфекции. Международные публикации № WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 0308936. Предполагается, что антитела можно получать in vitro с использованием известных способов в химии синтетических белков, включая способы с использованием перекрестно сшивающих агентов. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с помощью реакции дисульфидного обмена или путем формирования простой тиоэфирной связи. Примеры приемлемых для этой цели реагентов включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США № 4676980. Антитела-гетероконъюгаты можно получать с использованием любых удобных способов перекрестного связывания. Подходящие перекрестно связывающие агенты хорошо известны в данной области техники и описаны в патенте США № 4676980, наряду с рядом методик перекрестного связывания.
(9) Конструирование эффекторной функции.
Кроме того, может быть желательной модификация антитела против сортилина по настоящему описанию для изменения эффекторной функции и/или для увеличения периода полувыведения антитела из сыворотки. Например, сайт связывания с рецептором Fc на константном участке может быть модифицирован или мутирован с целью устранения или снижения аффинности связывания с определенными рецепторами Fc, такими как FcyRI, FcyRII и/или FcyRIII. В некоторых вариантах реализации изобретения эффекторная функция нарушается путем устранения N-гликозилирования Fc-участка (например, в домене CH2 IgG) антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения эффекторная функция нарушается путем модификации участков, таких как 233-236, 297 и/или 327-331 IgG человека, как описано в PCT WO 99/58572 и Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164: 1925-1933 (2000).
Для увеличения периода полувыведения антитела из сыворотки можно встраивать эпитоп связывания рецептора реутилизации в антитело (особенно во фрагмент антитела), как описано, например, в па- 81 043015 тенте США 5739277. Как используется в данном документе, термин эпитоп связывания рецептора реутилизации относится к эпитопу Fc-участка молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение периода полувыведения молекулы IgG из сыворотки in vivo.
(10) Другие модификации аминокислотной последовательности.
Рассматриваются также модификации аминокислотной последовательности антител против сортилина по настоящему описанию или фрагментов таких антител. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антител или фрагментов антител. Варианты аминокислотной последовательности антител или фрагментов антител получают путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела или фрагменты антител, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены осуществляется для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками (т.е. способностью связываться или физически взаимодействовать с белком сортилином по настоящему описанию). Аминокислотные замены также могут изменять посттрансляционный процессинг антитела, например, изменять число или положение сайтов гликозилирования.
Пригодный способ идентификации некоторых остатков или участков антитела против сортилина, которые являются предпочтительными положениями для мутагенеза, называется мутагенезом с аланиновым сканированием, как описано Cunningham и Wells в Science, 244: 1081-1085 (1989). Согласно данному методу идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют их нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для оказания влияния на взаимодействие аминокислот с антигеном-мишенью. Такие положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, далее модифицируют введением дополнительных или других вариантов в или на сайты замен. Таким образом, в то время как сайт введения вариантов аминокислотной последовательности заранее установлен, природа мутации per se не обязательно может быть заранее установленной. Например, для анализа характеристики мутации в данном сайте проводят аланинсканирующий или случайный мутагенез в кодоне-мишени и участке-мишени и экспрессированные варианты антитела подвергают скринингу на требуемую активность.
Вставки аминокислотных последовательностей включают амино-(N) и карбокси-(C) концевые слитые участки, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более аминокислотных остатков, а также находящиеся внутри последовательностей вставки из одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие вставочные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или C-концом антитела фермента или полипептида, что увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.
Другой тип варианта представляет собой вариант, основанный на замене аминокислотных остатков. В этих вариантах по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела заменен на другой остаток. Сайты, представляющие наибольший интерес для осуществления замещающего мутагенеза, включают гипервариабельные области, но рассматриваются также перестройки FR. Консервативные замены приведены в табл. B под заголовком предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то они являются более значимыми изменениями и приведены в табл. B под заголовком типовые замены, или могут быть введены и продукты подвергнуты скринингу, как дополнительно описано ниже по отношению к классам аминокислот.
- 82 043015
Таблица B
Аминокислотные замены
Исходный остаток Типовые Замены Предпочтительные Замены
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gin; asn lys
Asn (N) gin; his; asp. lys; arg gin
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gin (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gin asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn; gin; lys; arg arg
lie (I) leu; val; met; ala; phe; норлейцин leu
Leu (L) норлейцин ile val met ala; phe ile
Lys (K) arg; gin; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) Ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; норлейцин leu
Существенные модификации биологических свойств антител сопровождаются избирательными заменами, которые значительно различаются по способности поддерживать (a) структуру полипептидного остова в области замены, например, складчатую или спиральную конформацию, (b) заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени и (c) размеры боковой цепи. Остатки природного происхождения подразделяются на группы в зависимости от общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;
(3) кислотные: asp, glu;
(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly, pro; and (6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены включают замену представителя одного из этих классов на другой класс.
Цистеиновые остатки, которые не вовлечены в поддержание надлежащей конформации антитела, также могут быть замещены в основном серином, для усиления устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аномального перекрестного сшивания. Напротив, в молекулу антитела можно вводить цистеиновую связь(и) для улучшения ее стабильности (особенно в тех случаях, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv).
Особенно предпочтительный тип варианта, полученного путем замены, включает замену одного или более остатков гипервариабельных участков исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела против сортилина человека). Как правило, полученный вариант(ы), отобранные для дальнейшей модификации, будут иметь улучшенные биологические свойства по отношению к исходному антителу, из которого они получены. Подходящий способ получения таких вариантов, полученных путем замены, включает аффинное созревание с использованием фагового дисплея. Коротко говоря, несколько сайтов гипервариабельных участков (например, 6-7 сайтов) подвергают мутагенезу с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела отображают в моновалентной форме на поверхности частиц нитчатого бактериофага в виде их слияний с продуктом гена III бактериофага M13, упакованного в каждой частице. Фаговодисплейные варианты затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в данном документе. Для того чтобы идентифицировать возможные сайты модификации гипервариабельных участков, можно осуществлять аланин-сканирующий мутагенез, позволяющий идентифицировать остатки гипервариабельных участков, которые в значительной степени обеспечивают связывание антигена. В альтернативном варианте или дополнительно может оказаться полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для того, чтобы идентифицировать точки контакта между антигеном и антителом (например, белок сортилин по настоящему описанию). Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются потенциальными мишенями для замены, согласно методикам, представленным в данном документе. После создания таких вариантов их набор подвергают скринингу, как описано в данном документе, и антитела с улучшенными свойствами, как это устанавливается в одном или более соответствующих исследованиях, можно отбирать для дальнейшей модификации.
Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет первоначальный профиль гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается удаление одного или более углеводных фрагментов,
- 83 043015 обнаруженных в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют у антитела.
Гликозилирование антител обычно является N-связанным или O-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X - любая аминокислота, кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Oсвязанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также могут использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных участков гликозилирования). Изменение также может быть сделано добавлением, заменой одного или более остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (сайты O-связанного гликозилирования).
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела против IgE, получают с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, выделение из природных источников (в случае вариантов аминокислотных последовательностей природного происхождения) или получение с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайт-специфического) мутагенеза, мутагенеза с помощью ПЦР и с помощью кассетного мутагенеза ранее полученных вариантных или невариантных вариантов антител (например, антител против сортилина по настоящему описанию) или фрагментов антител.
(11) Другие модификации антител.
Антитела против сортилина по настоящему описанию, или их фрагменты, можно дополнительно модифицировать, внедряя в них дополнительные небелковые фрагменты, легкодоступные и известные в данной области техники. Предпочтительно фрагменты, пригодные для получения производных антитела, представляют собой водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры) и декстран- или поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропионовый альдегид полиэтиленгликоля может обладать преимуществами при производстве из-за его стабильности в воде. Указанный полимер может обладать любой молекулярной массой и быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться и, в случае присоединения более одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для получения производных, можно определять с учетом факторов, включающих конкретные свойства или функции антитела, подлежащего улучшению, возможность применения производных антитела в терапии при определенных условиях и т.д., но не ограничивающихся этим. Такие методики и другие подходящие композиции раскрыты в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
Анализы связывания и другие анализы.
Антитела против сортилина по настоящему описанию можно исследовать на антигенсвязывающую активность, например, с помощью таких известных способов, как ELISA, поверхностный плазмонный резонанс (ППР), вестерн-блоттинг, и т.д.
В некоторых вариантах реализации изобретения можно применять конкурентный анализ для идентификации антитела, конкурирующего с любым из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15, или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-213, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-69, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-103, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83,
- 84 043015
S-84 и S-85. В некоторых вариантах реализации изобретения такое конкурирующее антитело связывается с таким же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается любым из антител, перечисленных в табл. 1-3 и 11-15 или выбранных из S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-156-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-1516, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-822, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 и S-85. Подробные типовые способы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в Morris (1996) Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В типовом конкурентном анализе иммобилизованный сортилин или клетки, экспрессирующие сортилин на поверхности клетки, инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, связывающееся с сортилином (например, человека или не являющегося человеком примата), и второе немеченое антитело, исследуемое на предмет способности конкурировать с первым антителом за связывание с сортилином. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный сортилин или экспрессирующие сортилин клетки инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, благоприятных для связывания первого антитела с сортилином, удаляют избыток несвязанного антитела и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным сортилином или экспрессирующими сортилин клетками. Если количество метки, связанной с иммобилизованным сортилином или экспрессирующими сортилин клетками, существенно снижается в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с сортилином. См., Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Анализы связывания лигандов.
Дополнительно в данном документе предложены способы скрининга антител против сортилина, связывающих Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352 и/или Ile353 сортилина человека и блокирующих взаимодействия между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE). В некоторых вариантах реализации изобретения можно синтезировать библиотеку пептидов, в которой белок сортилин разрезан на последовательные пептиды в виде 15-мера и 25-мера, разделенные одним аминокислотным остатком и впоследствии нанесенные на фильтры. Затем можно исследовать связывание сортилинового лиганда на способность взаимодействовать с рецепторным пептидом или пептидами, которые, например, мутировали по Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352 и/или Ile353 из библиотек сортилина человека в присутствие или отсутствие антител против сортилина анализом связывания SPOT (например, Frank, R and Overwin, H (1996) Methods. Mol. Biol. 66, 149-169; Reineke, U et al., (2002) J. Immunol. Methods 267, 13-26; и Andersen, OS et al., (2010) J, BIOLOGICAL CHEMISTRY 285, 12210-12222). В некоторых вариантах реализации изобретения библиотеки пептидов для представителей семейства генов рецепторного VPS10p-домена или специфических вариаций пептидов относительно анализов замены или длины идентифицированных пептидов, связывающих лиганды, можно конструировать на целлюлозной мембране. В некоторых вариантах реализации изобретения для репрезентации семейства сортилиновых генов можно использовать всего 2181 пептидов, включая 273 пептидов для сортилина (№ доступа CAA66904), с 13-аминокислотами, перекрывающимися между пептидами в виде 16-мера (Frank, R (1992) Tetrahedron 48, 9217-9232). В некоторых вариантах реализации изобретения целлюлозную подложку можно готовить в виде мембраны с N-модифицированной аминогидроксипропиловым простым эфиром целлюлозы, и все циклы синтеза начинаются с определения точки роста с участием 9-флуоренил-метоксикарбонилаланин-пентафторфенилового сложного эфира, который создает аланиновый линкер между пептидом и мембраной. Например, для растущей пептидной цепи можно проводить автоматизированный линейный синтез из пошагового добавления различных аминокислот, защищенный по их N-концу 9-флуоренил-метоксикарбонилом и соответствующей защитой боковой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения профиль снятия защиты, активации и связывания продолжают до получения пептидов виде 16-меров, обеспечивая в результате равномерно распределенный набор массив ковалентно закрепленных с целлюлозной подложкой пептидов по их C-терминальным концам со свободными N-терминальными концами (Scharn, D et al., (2000) J. Comb. Chem. 2, 361-369). В некоторых вариантах реализации изобретения удаление боковой защитной группы можно осуществлять в два этапа.
- 85 043015
Во-первых, мембрану можно обрабатывать 90% трифторуксусной кислотой (в дихлорметане, содержащем 3% триизобутилсилана и 2% H2O); а во-вторых, например, 60% трифторуксусной кислотой (в дихлорметане, содержащем 3% триизобутилсилана и 2% H2O. Для удаления солей трифторуксусной кислоты мембрану можно промывать несколько раз H2O, этанолом, Tris-забуференным солевым раствором и этанолом, а затем высушивать. Наконец, мембрану блокируют в блокирующем буфере, разбавленном Tris-забуференным солевым раствором (pH 8, 0) с добавкой 5% сахарозы в течение 2 часов перед готовностью заданной библиотеки пептидов для анализа связывания лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения для исследований связывания пептиды, связанные с целлюлозой, результаты сканирования библиотеки, связанные с мембраной, инкубируют с объединенными лигандами, маркированными S-пептидом и полигистидином, в присутствие или отсутствие антител против сортилина, например, в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C, с последующей второй инкубацией с 1 мг/мл конъюгированного с HRP S-протеина также в блокирующем буфере, но в течение 3 ч при комнатной температуре. Впоследствии мембрану можно промывать, например, три раза в течение 10 мин Tris-забуференным солевым раствором перед проведением количественного определения параметровдля связанного лиганда с использованием хемилюминесцентного субстрата UptiLight и прибора LumiImager, получая интенсивности сигнала пятна в световых единицах Берингера. В альтернативном варианте выявление связанного лиганда можно выполнять иммунохимическим анализом с антителом против гистидиновой метки и вторичного конъюгированного с HRP антимышиного антитела. Инкубации можно выполнять с использованием стандартных процедур вестерн-блоттинга и выявления пятен.
Дополнительно в данном документе предложены способы скрининга антител против сортилина, блокирующих взаимодействия (например, связывание) между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE).
В некоторых вариантах реализации изобретения для каждого белка, позволяющего добавление Nконцевого S-пептида и полигистидиновых меток, можно готовить конструкции в виде меченых формы сортилиновых лигандов для выявления. Матричную кДНК для NGF и BDNF человека, включающую клоны ATCC, использовали для создания фрагментов с перекрывающимися остатками Glu1-Arg102 из NGF и Ala1-Arg110 из BDNF с использованием пары праймеров 5'GGTATTGAGGGTCGCGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCC-3' (SEQ ID NO: 695) и 3'GGGGGAAGTTGTCCTGAGTGTCCTCGTTCGCCACTCCGAG ATTGAGAGGAGA-5' (SEQ ID NO: 696); и пары праймеров 5'-GGTATTGAGGGTCGCGC CCCCATGAAAGAAGCAAACAT CCGAGG-3 ' (SEQ ID NO: 697) и 3'-CACGTTTGTAC AGGTACTCCCAGGCCGCGACTCCGAGATTGA GAGGAGA-5' (SEQ ID NO: 698). Данная кДНК может включать совместимые липкие концы для независимого от лигирования клонирования в векторе pET-30 Xa/LIC и амплификации с использованием ДНК-полимеразы Phusion, следуя протоколу, предоставленному производителем. Белки можно экспрессировать в штамме BL21/DE3 Escherichia coli, эффективно экстрагируемые из бактериальных телец включения с использованием реагента Bugbuster с добавленной бензоназой, и очищать стандартной аффинной хроматографией с никель-нитрилуксусной кислотой, например, в 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазоле и 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0. Элюцию белков выполняют в буферном растворе с добавкой 20 мМ ЭДТК. Верификацию интактных меченых вариантов HisS-NGFpro и HisS-BDNFpro можно осуществлять анализом с ДСН-ПААГэлектрофорезом с последующим окрашиванием Кумасси или анализом вестерн-блоттинга с использованием либо антитела против гистидиновой метки от Sigma (H-1029) и вторичным связанным с HRP антимышиным антителом или, в альтернативном варианте, прямым связыванием конъюгированного с HRP Sбелка от Novagen (№ по каталогу 69047-3) (например, Andersen, OS et al., P (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222). Сходные способы также можно применять для получения GST-маркированных сортилиновых лигандов (например, Quistgaard, EM et al., (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 96-98).
В некоторых вариантах реализации изобретения взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) можно охарактеризовать с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса (например, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287: 43798; и Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222). Определение непосредственного связывания сортилинового лиганда иммобилизированным сортилином в присутствие или отсутствие блокирующих антител против сортилина можно выполнять, например, на приборе Biacore2000 (Biacore, Швеция) с использованием CaHBS в качестве стандартного подвижного буфера (10 мМ HEPES, pH 7, 4, 140 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ EGTA и 0,005% Tween 20). В некоторых вариантах реализации изобретения можно активировать биосенсорный чип из Biacore (CM5) с использованием способа NHS/EDC с последующим покрытием сортилином до плотности белка 79 фмоль/мм2 и применять измерение аффинности рекомбинантных продоменов NGF, BDNF и NT3. После процедуры уравновешивания будет следовать подготовка поверхности биосенсора с помощью просортилина. Регенерацию проточной ячейки после каждого цикла эксперимента определения связывания лигандов можно осуществлять двумя импульсными введениями по 10 мкл регенерирующего буфера (10 мМ глицин-HCl, pH 4, 0, 500 мМ NaCl, 20 мМ
- 86 043015
ЭДТК и 0,005% Tween 20) и одним введением 0,001% ДСН. Подбор сенсограмм для оценки аффинности можно выполнять, например, используя BIAevaluation, версия 3. 1. После сходных протоколов можно также проводить иммобилизацию HisS-NGFpro или HisS-BDNFpro на биосенсорном чипе CM5 с использованием набора для связывания NHS/EDC, давая сходные плотности иммобилизированного белка на поверхности (~300 фмоль/мм2). Биосенсорный чип с иммобилизированным NGFpro или BDNFpro также можно использовать для проверки связывания сортилина в отсутствие или присутствие конкурирующих антител к сортилину. Также можно применять непроцессированные варианты pro-NGF и pro-BDNF, а также другой сортилиновый лиганд (например, связанный с рецептором белок (RAP), нейротензин, програнулин, p75, LpL, APOA5, APOE или APP) для иммобилизированного сортилина и можно измерять связывание в отсутствие или присутствие конкурирующих антител.
В некоторых вариантах реализации изобретения взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) можно охарактеризовать с использованием анализа pulldown (например, Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222). Например, экспрессированные внеклеточные домены сортилина можно инкубировать с мечеными сортилиновыми лигандами в отсутствие или присутствие блокирующих сортилин антител и осаждать с использованием 100 мкл сефарозных гранул с глутатионом (GSH) (Amersham Biosciences, № по каталогу17-0756-01). Количество используемых рецепторных доменов можно определять путем осаждения с использованием в качестве контроля гранул Talon. Связанные белки можно отделять анализом ДСН-ПААГ-электрофореза и визуализировать с использованием антитела против гистидина стандартным анализом Вестернблоттинга.
В некоторых вариантах реализации изобретения взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) можно охарактеризовать с использованием связанных с целлюлозой белков (например, Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222). Например, мембраносвязанные белки можно инкубировать с S-пептидом и полигистидиновым маркеров pro-NGF, pro-BDNF, програнулином или другим сортилиновым лигандом, таким как програнулин, пронейротрофин, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5 или APOE; в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C, с последующей второй инкубацией с 1 мкг/мл конъюгированного с HRP S-белка также в блокирующем буфере, но в течение 3 ч при комнатной температуре. Впоследствии мембрану можно промывать три раза в течение 10 мин Tris-забуференным солевым раствором перед проведением количественного определения параметров связанного лиганда с использованием хемилюминесцентного субстрата UptiLight и прибора LumiImager, получая интенсивности сигнала пятна в световых единицах Берингера. В альтернативном варианте выявление связанного лиганда можно выполнять иммунохимическим анализом с антителом против гистидиновой метки и вторичного конъюгированного с HRP антимышиного антитела. После инкубации могут следовать стандартный анализ вестерн-блоттинга и выявления пятен.
В некоторых вариантах реализации изобретения взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) можно охарактеризовать с использованием анализа определения близости лигирования (например, Gustafsen, C et al., (2013) The Journal of Neuroscience, 33: 64-71). Например, анализ определения близости лигирования (PLA) (DuolinkII) на клетках, экспрессирующих или подвергающихся действию сортилина и его партнера связывания, можно выполнять с первичными антителами антисортилин/FH, анти-SorLA/20C11 и антителами против партнера связывания, такими как антиAPP/AF1168 антитела, после инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с олигонуклеотидами, которые впоследствии гибридизируются с образующими кольца олигонуклеотидами и инициируют амплификацию по типу катящегося кольца, когда антигены расположены в пределах близости 40 нм. Амплифицированную ДНК можно визуализировать добавлением комплементарных флуоресцентно меченых олигонуклеотидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом (например, програнулином, пронейротрофином, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) можно охарактеризовать с использованием меченых щелочной фосфатазой лигандов в анализе со связыванием клеток (например, Hu, F et al., (2005) J. Neurosci. 25, 5298-5304; Fournier, AE et al., (2001) Nature 409, 341-346; Lauren, J et al., (2009) Nature 457, 1128-1132; and Hu, F et al., (2010) Neuron 68, 654-667). Например, меченые щелочной фосфатазой (AP) лиганды можно получать для оценки сортилина на трансфицированных клетках или первичных нейронах. Для выявления связывания меченых AP лигандов с клетками, экспрессирующими сортилин, культуры промывают, например, сбалансированным раствором Хэнкса, содержащим 20 мМ HEPES-натрия, pH 7,05 и 1 мг мл-1 бычьего сывороточного альбумина (BSA) (HBH). Затем планшеты можно инкубировать с мечеными AP лигандами в присутствие или отсутствие блокирующих сортилин антител, например, в HBH в течение 2 ч при 23°C. Связанный с AP лиганд можно выявлять и количественно определять в соответствии со способом, хорошо известным в данной области техники.
Анализы на основе клеток.
- 87 043015
Дополнительно в данном документе предложены методы скрининга на наличие антагониста связывания сортилина, такого как антитела против сортилина, которые включают приведение в контакт агента (например, антитела против сортилина) с клеткой, экспрессирующей белок сортилин на своей клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения агент и клетка дополнительно приведены в контакт с сортилиновым лигандом по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка сама по себе экспрессирует сортилиновый лиганд по настоящему описанию. Методы на основе клеток, в частности, подходят для скрининга и валидации антагонистов связывания сортилина (например, антител против сортилина) путем оценки влияния взаимодействия между сортилином и сортилиновым лигандом в контексте клетки.
Соответственно, определенные аспекты по настоящему описанию относятся к экспрессии клеткой белка сортилина по настоящему описанию на своей клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка эндогенно экспрессирует белок сортилин по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка рекомбинантно сконструирована для экспрессии белка сортилина по настоящему описанию. В любом из этих вариантов реализации изобретения белок сортилин по настоящему описанию (либо эндогенный, либо рекомбинантный), кодируемый полинуклеотидом, предпочтительно будет включать по меньшей мере белковые домены, требующиеся для посттрансляционного процессинга, мембранной транслокации и нацеливания на клеточную поверхность, включая, без ограничения, сигнальный пептид и трансмембранный домен. В некоторых вариантах реализации изобретения сигнальный пептид и/или трансмембранный домен могут относится к эндогенному сортилиновому сигнальному пептиду и/или трансмембранному домену. В других вариантах реализации изобретения сигнальный пептид и/или трансмембранный домен могут относится к экзогенному сигнальному пептиду и/или трансмембранному домену, которые, как известно, способствуют экспрессии на клеточной поверхности в требуемой клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах реализации изобретения белок сортилин будет также содержать домен, необходимый для связывания сортилинового лиганда по настоящему описанию.
Стандартные методики молекулярной биологии хорошо известны в данной области техники, такие как описанные и упоминаемые в настоящем описании, можно применять со сконструированными рекомбинантными методами клетками (например, клетки-хозяева по настоящему описанию) для экспрессии белка сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения методы включают культивирование клетки-хозяина по настоящему описанию, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок сортилин по настоящему описанию, в условиях, пригодных для экспрессии данного антитела.
Для рекомбинантной продукции белка сортилина по настоящему описанию выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок сортилин, и вставляют ее в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими белок сортилин).
Подходящие векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую сортилиновые белки по настоящему описанию или их фрагменты, экспрессируемые на клеточной поверхности, описанные в данном документе, включают, без ограничения, клонирующие векторы и экспрессионные векторы. Подходящие клонирующие векторы можно сконструировать в соответствии со стандартными методиками или могут быть выбраны из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области техники. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьировать в зависимости от клетки-хозяина, предназначенной для использования, подходящие клонирующие векторы обычно обладают способностью к саморепликации, могут иметь одну мишень для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены для маркера, который может быть использован при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и их производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны у коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Stratagene и Invitrogen.
Экспрессионные векторы, как правило, представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему описанию. Экспрессионный вектор может реплицироваться в клетках-хозяевах в виде эписомы или в качестве неотъемлемой части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессионные векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессионный(ые) вектор(ы), раскрытые в публикации PCT №WO 87/04462. Векторные компоненты, в целом, могут включать, но не ограничиваются ими, одно или более из следующих: сигнальную последовательность; точку начала репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) обычно также необходимы один или более регуляторных элементов трансляции, такие как сайты связывания рибосом, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.
Векторы, содержащие интересующие нуклеиновые кислоты можно вводить в клетку-хозяина лю
- 88 043015 бым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию и инфекцию (например, когда вектор является инфекционным агентом, таким как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто зависит от особенностей клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую одну или более аминокислотных последовательностей, кодирующих белок сортилин по настоящему описанию.
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические клетки. В предпочтительных вариантах реализации изобретения клеткахозяин по настоящему описанию представляет собой клетку млекопитающего, включая без ограничения, линию клеток CV1 почки обезьяны, трансформированную SV40 (COS-7); линию человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, описанные, например, в Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK); мышиные клетки Сертоли (клетки TM4, описанные, например, в Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, описанные, например, в Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), в том числе клетки DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)) и миеломные клеточные линии, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. В некоторых вариантах реализации клеткахозяин представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой клетку HEK293T.
В дополнение к клеткам млекопитающих, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи, в том числе штаммы грибов и дрожжей с гуманизированными путями гликозилирования, что приводит к продукции белка с профилем гликозилирования, частично или полностью характерным для человека (например, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006)). Подходящие для экспрессии гликозилированного белка клетки-хозяева также могут происходить из организма многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых (например, клетки Sf9 или S2). Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно применять в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В некоторых вариантах реализации изобретения способы по настоящему описанию включают приведение в контакт клетки, экспрессирующей белок сортилин на своей клеточной поверхности с агентом (например, антителом против сортилина) и сортилиновым лигандом в условиях, в которых белок сортилин способен связываться с сортилиновым лигандом. Как используется в данном документе, условия, в которых белок сортилин способен связываться с сортилиновым лигандом, могут относится к параметру или аспекту окружающей среды, в которой существует белок сортилин и сортилиновый лиганд (например, температура, pH, раствор и т.д.), и условия могут относится к окружающей среде, в которой существует белок сортилин и сортилиновый лиганд (например, общая сумма из множества отдельных условий). Эти условия позволят происходить взаимодействию сортилин-сортилиновый лиганд, описанному выше. В предпочтительных вариантах реализации изобретения эти способы также являются допустимыми для поддержания жизнеспособности клеток во временных рамках анализа.
В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновый лиганд присоединяют к флуорофору. Можно использовать флуорофор, известный в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофор может быть флуоресцентным белком или пептидом, включая без ограничения GFP, RFP, YFP, CFP, их производные и тому подобные белки. В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофор может быть небелковым органическим флуорофором, включая без ограничения, производное ксантина (например, родамин, флуоресцин, техасский красный и т. п.), производным сквараина, производное нафталина, производное цианина (например, цианин, индокарбоцианин, оксакарбоцианин и т. п.), производное кумарина, производное пирена, производное антрацена, производное оксадиазола, производное акридина, производное тетрапиррола, производное арилметина или производное оксазина. В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофором может быть квантовая точка. Перечни подходящих флуорофоров и их свойства (например, спектры абсорбции и эмиссии, коэффициенты молярной экстинкции, свойства фотообесцвечивания, яркости, фотостабильности и т.д.) в большинстве случаев получают у производителей, например, The Molecular Probes® Handbook, 11th ed. (Life Technologies, г. Калсбад, штат Калифорния). В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновый лиганд присоединяют к нефлуоресцентному фрагменту для выявления, такому как люминесцентный или биолюминисцентный фрагмент (например, люцифераза, такая как люцифераза Renilla или ее производное), и дополнительно включают биолюминогенный субстрат (например, люциферин, такой как ко
- 89 043015 элентеразин или производное коэлентеразин, включая без ограничения DeepBlueC™).
В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофор, присоединенный к сортилиновому лиганду, является ассоциированным с клеткой при связывании сортилинового лиганда с белком сортилином. Флуорофор, присоединенный к сортилиновому лиганду, может быть ассоциирован с клеткой, например, если он может быть выявлен на поверхности клетки и/или выявлен внутри клетки (например, в эндоцитном, эндосомном или лизосомном компартменте). Таким способом выявление излученной флуоресценции, связанной с клеткой (например, флуоресценции на поверхности клетки или внутри клетки) позволяет выявлять взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом в контексте клетки, экспрессирующей сортилин. Предпочтительно, флуорофор сам по себе и флуорофор, присоединный к сортилиновому лиганду, не нарушает связывание между сортилиновым лигандом и белком сортилином, экспрессируемым клеткой.
В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофор, связанный с клеткой, облучают светом с длиной волны, достаточной чтобы вызывать эмиссию флуоресценции флуорофором. В некоторых вариантах реализации изобретения выявляют флуоресценцию, излучаемую флуорофором, связанным с клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения длина волны, достаточная чтобы вызывать эмиссию флуоресценции, находится внутри спектра поглощения флуорофора. В некоторых вариантах реализации изобретения длина волны, которой облучают клетку, является длиной максимума поглощения или максимума возбуждения. В некоторых вариантах реализации изобретения выявляемая длина волны находится внутри спектра излучения флуорофора. В некоторых вариантах реализации изобретения выявляемая длина волны представляет собой максимум излучения. Как неограничивающий пример, DyLight-650, присоединенный к програнулиновому белку по настоящему описанию, можно возбуждать при 652 нм, а излучаемую флуоресценцию можно выявлять при 672 нм. Информация о длинах волн света, достаточных чтобы вызывать излучение флуоресценции флуорофора по настоящему описанию, и длины волн света, излучаемых флуорофором легко доступны в данной области техники и обычно предоставляется производителем (например, Life Technologies, Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, abcam и т.д.).
Можно применять любой подходящий метод выявления излученной флуоресценции при подходящей длине волны (например, длине волны, описанной выше). Методики выявления флуоресценции могут задействовать считывающее устройство для планшетов (например, считывающее устройство для планшетов PHERAstar от BMG LABTECH, г. Ортенберг, Германия), флуоресцентный микроскоп, проточный цитометр или любое другое оборудование, известное в данной области техники для флуоресцентного выявления.
В некоторых вариантах реализации изобретения флуорофор непосредственно связан с сортилиновым лигандом. В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновый лиганд связан с биотином, а флуорофор связан со стрептавидином, который присоедин к сортилиновому лиганду путем связывания с биотином. В данной области техники известны сходные методики присоединий донора/акцептора флуоресценции, флуорофор можно присоединять к сортилиновуму лиганду путем прямого связывания или их можно опосредованно соединять через интермедиат (например, связывание антитела, связывание биотин: стрептавидин, маркер аффинности и т. п). Например и без ограничения, если флуорофор представляет собой флуоресцентный белок, то сортилиновый лиганд можно транслировать с кодирующей последовательностью флуоресцентного белка, присоединенного (например, пептидным линкером), в рамке считывания с кодирующей последовательностью сортилинового лиганда, так что продуцируется гибридный белок. Например и без ограничения, если флуорофор представляет собой небелковый органический флуорофор, то флуорофор можно химически присоединять (например, посредством ковалентной связи) к сортилиновому лиганду. Наборы маркеров для присоединения флуорофора с интересующим белком (например, сортилиновым лигандом по настоящему описанию) коммерчески доступны и обычно используют химическую реакцию между первичным амином белка и аминореакционноспособным флуорофором или перекрестным линкером. Можно присоединять представителя пары донора/акцептора флуоресценции по N-концу, C-концу или любому подходящему положению вдоль аминокислотной последовательности сортилинового лиганда. Как правило, флуоресцентный белок можно присоединять к N- или Cконцу сортилинового лиганда.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетку, экспрессирующую белок сортилин на своей клеточной поверхности, приводят в контакт с агентом (например, антителом против сортилина) и сортилиновым лигандом в условиях, в которых белок сортилин способен связываться с сортилиновым лигандом, причем сортилиновый лиганд присоединен к флуорофору, а флуорофор оказывается ассоциирован с клеткой при связывании сортилинового лиганда с белком сортилином. Флуорофор, ассоциированный с клеткой, облучают светом с длиной волны, достаточной чтобы вызывать излучения флуорофором флуоресценции; и выявляют уменьшение флуоресценции, излучаемой ассоциированным с клеткой флуорофором, по сравнению с флуоресценцией, излучаемой флуорофором, ассоциированным с клеткой в отсутствии агента. Уменьшение излученной флуоресценции указывает, что агент является связывающим сортилин антагонистом. Не привязываясь к какой-либо теории, считается, что взаимодействие между белком сортилином по настоящему описанию, экспрессируемому на поверхности клетки и сортилино- 90 043015 вым лигандом по настоящему описанию, меченому флуорофором по настоящему описанию будет приводить к выявляемой флуоресценции, ассоциированной с клеткой (например, на поверхности клетки и/или во внутреннем пространстве клетки, если сортилиновый лиганд интернализирован клеткой). Считается, что антагонист связывания сортилина уменьшает сигнал флуоресценции, излучаемый флуорофором, ассоциированным с клеткой, путем снижения этого взаимодействия.
В некоторых вариантах реализации изобретения используется анализ на основе клетки, который осуществляется без излучаемой флуоресценции. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения клетку, экспрессирующую белок сортилин на своей клеточной поверхности, приводят в контакт с агентом (например, антителом против сортилина) и сортилиновым лигандом в условиях, в которых белок сортилин способен связываться с сортилиновым лигандом; и выявляется отсутствие уменьшения уровня сортилинового лиганда по сравнению с уменьшением уровня сортилинового лиганда в отсутствие данного агента. Отсутствие уменьшения уровня сортилинового лиганда указывает, что агент является связывающим сортилин антагонистом. Не привязываясь к какой-либо теории, считается, что приведение в контакт экспрессирующей сортилин клетки с сортилиновым лигандом по настоящему описанию приводит к уменьшению внеклеточного сортилинового лиганда посредством связывания сортилина, эндоцитоза и лизосомной деградации. Считается, что инкубирование экспрессирующей сортилин клетки с определенным уровнем сортилинового лиганда будет приводить к уменьшению сортилинового лиганда с течением времени, и что антагонист связывания сортилина по настоящему описанию (например, антитело против сортилина) способен снижать это уменьшение (например, неспособность уменьшать). Таким образом, по сравнению с контрольной обработкой, обработка антагонистом связывания сортилина по настоящему описанию приводит к отсутствию уменьшения сортилинового лиганда.
В этих вариантах реализации изобретения может применяться любая клетка, экспрессирующая белок сортилин по настоящему описанию на своей клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка эндогенно экспрессирует на своей клеточной поверхности белок сортилин по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка рекомбинантно сконструирована для экспрессии на своей клеточной поверхности белка сортилина по настоящему описанию. Можно использовать любой подходящий сортилиновый лиганд по настоящему описанию, такой чтобы сохранялась способность связываться с белком сортилином, экспрессируемым на клеточной поверхности. Сортилиновый лиганд не требует наличия флуоресцентной метки. Уровни сортилинового лиганда можно выявлять любым анализом, известным в данной области техники, включая без ограничения, ELISA, ППР, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрию, иммунопреципитацию, пептидный микрочип и т.д.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетку, которая экспрессирует на своей клеточной поверхности белок сортилин по настоящему описанию, культивируют в среде для культивирования клеток, содержащей уровень сортилинового лиганда по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения к среде для культивирования клеток добавляют известное количество сортилинового лиганда. В некоторых вариантах реализации изобретения можно использовать кондиционированную среду для культивирования клеток, например, в которой сортилиновый лиганд по настоящему описанию экспрессируется и секретируется в среду для культивирования клеток продуцирующей сортилиновый лиганд клеткой (причем кондиционированную сортилиновым лигандом среду для культивирования клеток отделяют от продуцирующей сортилиновый лиганд клетки и впоследствии добавляют к клетке, экспрессирующей белок сортилин).
Может применяться любая среда для культивирования клеток, пригодная для культивирования клетки, экспрессирующей на своей клеточной поверхности белок сортилин по настоящему описанию. Среды для культивирования клеток, пригодные для культивирования множества типов клеток известны в данной области техники и доступны для приобретения. Для культивирования клетки, экспрессирующей белок сортилин по настоящему описанию, могут подходить доступные для приобретения среды, например, среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла, модифицированная по Дульбекко ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве среды для культивирования можно использовать любую среду, описанную в Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), патент США № 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патент США Re. 30985. В любую из этих сред при необходимости можно добавлять соли (например, хлорид натрия, соли кальция, магния и фосфаты), буферы (например, HEPES), факторы роста или гормоны (например, инсулин или фактор роста эпидермиса), нуклеотиды, антибиотики, микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях, находящихся в микромолярном диапазоне), глюкозу и/или соответствующий источник энергии. В среду также можно включать любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области техники. Такие условия культивирования, как температура, pH и т. п., совпадают с условиями, использованными ранее при культивировании клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и очевидны для среднего специалиста в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе способы включают культивирование клетки, экспрессирующей на своей клеточной поверхности как белок сортилин, так и
- 91 043015 сортилиновый лиганд в среду, в условиях, в которых экспрессируются белок сортилин и сортилиновый лиганд, а сортилиновый лиганд высвобождается в среду; приведение в контакт клетки с агентом (например, антителом против сортилина) в условиях, в которых белок сортилин способен связываться с сортилиновым лигандом; и выявление увеличения уровня сортилинового лиганда в среде по сравнению с уровнем сортилинового лиганда в среде в отсутствие данного агента. Увеличение уровня сортилинового лиганда указывает, что агент является связывающим сортилин антагонистом. Не привязываясь к какойлибо теории, авторы считают, что взаимодействие между белком сортилином, экспрессированным на клеточной поверхности, и секретированным сортилиновым лигандом будет приводить к эндоцитозу и лизосомной деградации сортилинового лиганда. Поэтому считается, что уменьшение этого взаимодействия (например, путем добавления антагонист связывания сортилина по настоящему описанию) приводит к увеличению уровня сортилинового лиганда в среде с течением времени.
В этих вариантах реализации изобретения может использоваться любая клетка, экспрессирующая на своей клеточной поверхности белок сортилин по настоящему описанию и секретирует сортилиновый лиганд по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка может эндогенно экспрессировать на своей клеточной поверхности белок сортилин по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка может эндогенно экспрессировать и секретировать сортилиновый лиганд по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой клетку U-251, а сортилиновый лиганд представляет собой програнулиновый белок. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка может быть рекомбинантно сконструирована для экспрессии на своей клеточной поверхности белка сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка может быть рекомбинантно сконструирована для экспрессии и секретирования сортилинового лиганда по настоящему описанию.
В любых анализах на основе клеток, описанных в данном документе, может использоваться сортилиновый лиганд по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения сортилиновый лиганд представляет собой програнулиновый белок. Сортилиновый лиганд может быть полноразмерным белком, или он может быть фрагментом такого связывающего сортилин пептида.
Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева.
Антитела против сортилина по настоящему описанию можно получать с использованием рекомбинантых способов и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены выделенные нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, кодирующую любые антитела против сортилина по настоящему описанию. Такие нуклеиновые кислоты могут кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела против сортилина (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В некоторых вариантах реализации изобретения предложены один или более векторов (например, экспрессионных векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения также предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка-хозяин содержит (например, была трансдуцирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (CHO) или лимфоидной клеткой (например, клеткой YO, NSO, Sp20).
Предложены способы получения антитела против сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает культивирование клетки-хозяина по настоящему описанию, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против сортилина, в условиях, пригодных для экспрессии антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело затем извлекают из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Для рекомбинантной продукции антитела против сортилина по настоящему описанию выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против сортилина, и вставляют ее в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
Подходящие векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любое из антител против сортилина по настоящему описанию или фрагменты их полипептидов (включая антитела), описанные в данном документе, включают без ограничения, клонирующие векторы и экспрессионные векторы. Подходящие клонирующие векторы можно сконструировать в соответствии со стандартными методиками или могут быть выбраны из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области техники. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьировать в зависимости от клетки-хозяина, предназначенной для использования, подходящие клонирующие векторы обычно обла
- 92 043015 дают способностью к саморепликации, могут иметь одну мишень для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены для маркера, который может быть использован при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и их производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны у коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Stratagene и Invitrogen.
Экспрессионные векторы, как правило, представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему описанию. Экспрессионный вектор может реплицироваться в клетках-хозяевах в виде эписомы или в качестве неотъемлемой части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессионные векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессионный(ые) вектор(ы), раскрытые в публикации PCT № WO 87/04462. Векторные компоненты, в целом, могут включать, но не ограничиваются ими, одно или более из следующих: сигнальную последовательность; точку начала репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) обычно также необходимы один или более регуляторных элементов трансляции, такие как сайты связывания рибосом, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.
Векторы, содержащие интересующие нуклеиновые кислоты можно вводить в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию и инфекцию (например, когда вектор является инфекционным агентом, таким как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто зависит от особенностей клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую одну или более аминокислотных последовательностей, кодирующих антитела против сортилина по настоящему описанию.
Пригодные клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки. Например, антитела против сортилина можно продуцировать в бактериях, в частности, если гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. В отношении экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях (например, патент США №5648237, 5789199 и 5840523; и Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), p. 245-254, описывают экспрессию фрагментов антитела в E. coli.). После экспрессии антитело можно выделять из массы бактериальных клеток в растворимую фракцию, после чего дополнительно очищать.
В дополнение к прокариотам, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи, в том числе штаммы грибов и дрожжей с гуманизированными путями гликозилирования, что приводит к продукции антитела с профилем гликозилирования, частично или полностью характерным для человека (например, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006)).
Подходящие для экспрессии гликозилированного антитела клетки-хозяева могут также происходить от многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно применять в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Кроме того, в качестве хозяев можно использовать культуры клеток растений (например, патент США №5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429, где описана технология PLANTIBODIES™ относительно продукции антител в трансгенных растениях).
Кроме того, в качестве хозяев можно использовать клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, адаптированные к росту в суспензии. К другим примерам пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих относятся линия клеток CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7); линия человеческих эмбриональных клеток почки (клетки 293 или 293, описанные, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK); мышиные клетки Сертоли (клетки TM4, описанные, например, в Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, описанные, например, в Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), в том числе клетки DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)) и миеломные клеточные линии, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор по некоторым полученным из млекопитающих линиям клеток-хозяев, пригодных для получения антител, можно найти, например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), p. 255-268 (2003).
- 93 043015
Фармацевтические композиции.
Антитела против сортилина по настоящему описанию можно включать в различные лекарственные формы для терапевтического введения посредством комбинирования антител с соответствующими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и их можно готовить в виде препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах. Примеры таких лекарственных форм включают, без ограничения, таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, препараты для инъекций, средства для ингаляции, гели, микросферы и аэрозоли. В зависимости от лекарственной формы фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые, нетоксические носители разбавителей, которые являются традиционно применяемыми носителями для изготовления фармацевтических композиций для введения животным или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы не влиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются, без ограничения, дистиллированная вода, забуференная вода, физиологический раствор, ФСБ, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса. Фармацевтическая композиция или лекарственная форма по настоящему описанию может дополнительно включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы, вспомогательные вещества и тому подобное. Композиции также могут включать дополнительные вещества для достижения условий, приближенных к физиологическим, такие как буферные агенты, агенты, регулирующие pH и токсичность, увлажняющие агенты и детергенты.
Фармацевтическая композиция по настоящему описанию может также включать любой из множества стабилизирующих агентов, таких как, например антиоксидант. Когда фармацевтическая композиция включает полипептид, этот полипептид может образовывать комплекс с различными хорошо известными соединениями, которые усиливают устойчивость полипептида in vivo или иным образом повышают его фармакологические свойства (например, увеличивают период полувыведения полипептида, уменьшают его токсичность и повышают растворимость или поглощение). Примеры таких модификаций или комплексообразователей включают, без ограничения, сульфат, глюконат, цитрат и фосфат. Полипептиды композиции также могут образовывать комплексы с молекулами, которые усиливают их качества in vivo. Такие молекулы включают, без ограничения, углеводы, полиамины, аминокислоты, другие пептиды, ионы (например, натрий, калий, кальций, магний, марганец) и липиды.
Дополнительные примеры лекарственных форм, которые подходят для различных типов введения, можно найти в Remington Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985). Краткий обзор методов доставки лекарств см. Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
Для перорального введения активный ингредиент можно вводить в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в жидких дозированных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Активный компонент(ы) можно инкапсулировать в желатиновые капсулы вместе с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, такими как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахарин натрия, тальк, карбонат магния. Примерами дополнительных неактивных ингредиентов, которые могут быть добавлены для обеспечения желаемого цвета, вкуса, стабильности, буферной способности, дисперсности или других известных желательных свойств, являются красный оксид железа, силикагель, лаурилсульфат натрия, диоксид титана и съедобные белые чернила. Подобные разбавители можно использовать для изготовления прессованных таблеток. Как таблетки, так и капсулы можно изготовлять в виде продуктов с замедленным высвобождением для обеспечения непрерывного высвобождения лекарственного средства в течение нескольких часов. Прессованные таблетки могут быть покрыты сахаром или покрыты пленкой, чтобы замаскировать любой неприятный вкус и защитить таблетку от атмосферного влияния, или покрыты растворимой в кишечнике оболочкой для избирательного распадения в желудочно-кишечном тракте. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать красители и ароматизаторы, повышающие восприимчивость пациента.
Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты.
Компоненты, используемые для получения фармацевтических композиций, предпочтительно имеют высокую чистоту и практически свободны от потенциально опасных примесей (например, по меньшей мере степень чистоты для пищевых продуктов (NF), как правило, по меньшей мере аналитическую степень чистоты, а чаще всего по меньшей мере фармацевтическую степень чистоты). Кроме того, композиции, предназначенные для использования in vivo, обычно являются стерильными. В той мере, в которой данное соединение должно быть синтезировано перед использованием, конечный продукт, как правило, по существу не содержит никаких потенциально токсических агентов, особенно любых эндотоксинов, которые могут присутствовать в процессе синтеза или очистки. Композиции для парентерального введения также являются стерильными, по существу изотоническими и изготовлены в условиях
- 94 043015
GMP.
Препараты могут быть оптимизированы для удержания и стабилизации в головном мозге или центральной нервной системе. В случае если агент вводится в краниальный отдел, желательно, чтобы агент удерживался в отделе, а не диффундировал или иным образом не пересекал гематоэнцефалический барьер. Методы стабилизации включают перекрестное сшивание, мультимеризацию или связывание с группами, такими как полиэтиленгликоль, полиакриламид, нейтральные белковые носители и т.д. для достижения увеличения молекулярной массы.
Другие стратегии для увеличения удержания включают захват антитела, такого как антитело против сортилина по настоящему описанию, в биоразлагаемый или биоразрушаемый имплантат. Скорость высвобождения терапевтически активного агента регулируется скоростью транспорта через полимерную матрицу и биодеградацией имплантата. Транспортировка лекарственного средства через полимерный барьер также будет зависеть от растворимости соединения, гидрофильности полимера, степени перекрестного сшивания полимера, расширения полимера при поглощении воды, настолько чтобы сделать полимерный барьер более проницаемым для лекарственного средства, геометрии имплантата и тому подобного. Имплантаты имеют размеры, соизмеримые с размером и формой области, выбранной в качестве места имплантации. Имплантаты могут представлять собой частицы, листы, пластыри, диски, волокна, микрокапсулы и тому подобное и могут быть любого размера или формы, совместимой с выбранным местом введения.
Имплантаты могут быть монолитными, т.е. имеющими активный агент, однородно распределенный по полимерной матрице, или инкапсулированными, причем резервуар активного агента инкапсулирован полимерной матрицей. Выбор используемой полимерной композиции будет варьировать в зависимости от места введения, требуемого периода лечения, переносимости пациента, характера заболевания, подлежащего лечению, и тому подобного. Характеристики полимеров будут включать биодеградируемость в месте имплантации, совместимость с представляющим интерес агентом, легкость инкапсулирования, период полувыведения в физиологической среде.
Биодеградируемые полимерные композиции, которые можно использовать, включают, без ограничения, органические сложные или простые эфиры, разложение которых приводит к физиологически приемлемым продуктам деградации, включающим мономеры. Могут найти применение ангидриды, амиды, ортоэфиры и тому подобное самостоятельно или в комбинации с другими мономерами. Полимеры представляют собой конденсационные полимеры. Полимеры могут быть или не быть перекрестносвязанными. Особый интерес представляют полимеры гидроксиалифатических карбоновых кислот, как гомо-, так и сополимеры, и полисахариды. Представляющие интерес сложные полиэфиры включают полимеры D-молочной кислоты, L-молочной кислоты, рацемической молочной кислоты, гликолевой кислоты, поликапролактона и их комбинаций. Использование L-лактата или D-лактата обеспечивает получение медленно биодеградирующего полимера, вместе с тем деградация существенно усиливается при использовании рацемата. Сополимеры гликолевой и молочной кислот представляют особый интерес, для них скорость биодеградации контролируется отношением гликолевой кислоты к молочной кислоте. Наиболее быстро деградирующий сополимер имеет примерно равные количества гликолевой и молочной кислоты, причем каждый гомополимер более устойчив к деградации. Отношение гликолевой кислоты к молочной кислоте также влияет на хрупкость имплантата, причем более гибкий имплантат является более подходящим для больших геометрических размеров. Среди представляющих интерес полисахаридов альгинат кальция и функционализированные целлюлозы, в частности, сложные эфиры карбоксиметилцеллюлозы, характеризуются тем, что они нерастворимы в воде, имеют молекулярную масса от около 5 кДа до 500 кДа и т.д. Биодеградируемые гидрогели также могут быть использованы в импантатах по настоящему изобретению. Как правило, гидрогели представляют собой сополимерный материал, характеризующийся способностью впитывать жидкость. Типовые биодеградируемые гидрогели, которые могут быть использованы, описаны в Heller: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, p. 137-149.
Дозировки фармацевтических композиций.
Фармацевтические композиции по настоящего описанию, содержащие антитело против сортилина по настоящему описанию, могут быть введены индивиду, нуждающемуся в лечении антителом против сортилина, предпочтительно человеку, в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение определенного периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрицереброспинальным, внутричерепным, интраспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным, интратекальным, пероральным путем или посредством местных или ингаляционных путей введения.
Дозировки и желаемая концентрация лекарственных средств в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьировать в зависимости от конкретного предполагаемого использования. Определение подходящей дозы или способа введения находится в пределах компетенции среднего специалиста в данной области. Эксперименты на животных обеспечивают надежное руководство для определения эффективных доз для терапии человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может быть выполнено в соответствии с принципами, описанными в Mordenti, J. and Chappell, W. The
- 95 043015
Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics, In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al.,
Eds, Pergamon Press, New York 1989, p. 42-46.
Для введения in vivo любого из антител против сортилина по настоящему описанию нормальные количества дозирования могут варьировать от около 10 нг/кг до около 100 мг/кг от веса тела индивида в день или более, предпочтительно от около 1 мг/кг/день до 10 мг/кг/день, в зависимости от пути введения. При повторном введении в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от тяжести заболевания, нарушения или патологического состояния, подлежащего лечению, лечение поддерживается до достижения желаемого подавления симптомов.
Типовая схема применения может включать введение начальной дозы антитела против сортилина от около 2 мг/кг, с последующей еженедельной поддерживающей дозой от около 1 мг/кг каждую последующую неделю. Могут быть полезными и другие схемы дозирования, в зависимости от того, какой профиль фармакокинетического распада является желаемым для врача. Например, в данном документе рассматривается дозирование индивиду от одного до двадцати одного раза в неделю. В некоторых вариантах реализации изобретения может использоваться дозирование в диапазоне от около 3 мкг/кг до около 2 мг/кг (например, около 3 мкг/кг, около 10 мкг/кг, около 30 мкг/кг, около 100 мкг/кг, около 300 мкг/кг, около 1 мг/кг и около 2 мг/кг). В некоторых вариантах реализации изобретения частота приема лекарственного средства составляет три раза в день, два раза в день, один раз в день, один раз в два дня, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые пять недель, один раз каждые шесть недель, один раз каждые семь недель, один раз каждые восемь недель, один раз каждые девять недель, один раз каждые десять недель или один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца или дольше. Ход лечения легко наблюдать с помощью обычных методик и анализов. Схема дозирования, включая вводимое антитело против сортилина, может изменяться в динамике независимо от используемой дозы.
Дозы для конкретного антитела против сортилина могут быть определены эмпирически у индивидов, которым было назначено одно или более введений антитела против сортилина. Индивиды получают нарастающие дозы антитела против сортилина. Для оценки эффективности антитела против сортилина можно контролировать клинический симптом любого из заболеваний, нарушений или патологических состояний по настоящему описанию (например, лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов или нежелательных симптомов естественного старения).
Введение антитела против сортилина по настоящему описанию может быть непрерывным или периодическим в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, того является ли назначение введения терапевтическим или профилактическим и других факторов, известных квалифицированным практикам. Введение антитела против сортилина может быть по существу непрерывным в течение заранее выбранного периода времени или может происходить в виде серии интервальных доз.
Рекомендации в отношении конкретных доз и способов доставки приведены в литературе; см., например, патенты США № 4657760; 5206344 или 5225212. В пределах объема настоящего описания различные лекарственные формы будут эффективны для различных видов лечения и различных расстройств, и введение, предназначенное для лечения конкретного органа или ткани, может требовать доставки способом, отличным от способа доставки в другой орган или ткань. Кроме того, дозировки можно вводить посредством одного или более отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. При повторных введениях в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до желаемого подавления симптомов заболевания. Однако можно применять другие схемы лечения. Ход лечения можно контролировать с помощью обычных методик и анализов.
Терапевтическое применение.
В дополнительных аспектах по настоящему описанию предложены способы увеличения уровней програнулина у нуждающегося в этом индивида, например, в головном мозге, крови и/или периферических органах индивида, путем введения индивиду терапевтически эффективного количества одного или более антител против сортилина по настоящему описанию. В других аспектах по настоящему описанию предложены способы увеличения внеклеточных уровней програнулина путем приведения в контакт одной или более клеток с одним или более антител против сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни програнулина увеличиваются без уменьшения клеточных уровней сортилина. В дополнительных аспектах по настоящему описанию предложены способы увеличения клеточных уровней сортилина у нуждающегося в этом индивида, например, в головном мозге и/или периферических органах индивида, путем введения индивиду терапевтически эффективного количества одного или более антител против сортилина по настоящему описанию. В других аспектах по настоящему описанию предложены способы уменьшения клеточных уровней сортилина одной или более клеток, включающие приведение в контакт одной или более клеток с одним или более антител против сортилина по настоящему описанию.
В дополнительных аспектах по настоящему описанию предложены способы увеличения эффективных концентраций програнулина и/или уменьшения эффективных концентраций нейротрофина по на- 96 043015 стоящему описанию (например, пронейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, пронейротрофинов, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофина-3, нейротрофина-4/5, NGF, BDNF, т.д.), нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белка-предшественника (APP), А-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP) в организме нуждающегося индивида путем введения индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по настоящему описанию для ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, нейротрофином по настоящему описанию (например, пронейротрофинов, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF, т.д.), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и/или связанным с рецептором белком (RAP).
В настоящем описании также предложены способы ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, нейротрофином по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и/или связанным с рецептором белком (RAP); а также одной или более активностей сортилина, програнулина, нейротрофина по настоящему описанию (например, пронейротрофинов, пронейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, пронейротрофина, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофина-3, нейротрофина-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белка-предшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), PCSK9 и связанного с рецептором белка (RAP) в организме индивида путем введения индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по настоящему описанию.
Как описано в данном документе, антитела против сортилина по настоящему описанию можно также использовать для предупреждения, снижения риска или лечения лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, воспалительных нарушений, артрита, рассеянного склероза, нарушения метаболизма, ожирения, резистентности к инсулину, диабета 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранения и одного или более нежелательных симптомов естественного старения.
В некоторых вариантах реализации изобретения в настоящем описании предложены способы предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего лобно-височную деменцию, болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, эпилептические припадки, дистрофию сетчатки, травматическое повреждение мозга, повреждение спинного мозга, длительную депрессию, атеросклеротические заболевания сосудов, нежелательные симптомы естественного старения, деменцию, смешанную деменцию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, нормотензивную гидроцефалию, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, таупатию, инсульт, острую травму, хроническую травму, волчанку, острый и хронический колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, малярию, эссенциальный тремор, волчанку центральной нервной системы, болезнь Бехчета, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию, дегенерацию межпозвонковых дисков, синдром Шая-Дрейджера, прогрессирующий супрануклеарный паралич, кортикальную базальную ганглионарную дегенерацию, острый рассеянный энцефаломиелит, связанные с гранулематозом нарушения, саркоидоз, болезни старения, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому, пигментный ретинит, дегенерацию сетчатки, инфекцию дыхательных путей, сепсис, глазную инфекцию, системную инфекцию, воспалительные нарушения, артрит, рассеянный склероз, нарушения метаболизма, ожирение, резистентность к инсулину, диабет 2 типа, повреждения тканей или сосудов, ранение или один или более нежелательных симптомов естественного старения, у нуждающегося индивида путем введения индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по настоящему описанию для: (i) ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, нейротрофином по
- 97 043015 настоящему описанию (например, пронейротрофинов, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF, т.д.), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественником (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и/или связанным с рецептором белком (RAP); и/или (ii) ингибирования одной или более активностей сортилина, програнулина, нейротрофина по настоящему описанию (например, пронейротрофинов, пронейротрофина-3, пронейротрофина-4/5, пронейротрофина, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофина-3, нейротрофина4/5, NGF, BDNF, т.д.), нейротензина, p75, сортилинового пропептида (Sort-pro), амилоидного белкапредшественника (APP), A-бета-пептида, липопротеиновой липазы (LpL), аполипопротеина AV (APOA5), аполипопротеина E (APOE), и связанного с рецептором белка (RAP). В некоторых вариантах реализации в настоящем описании предложены способы стимулирования заживления ран у нуждающегося в этом индивида путем введения индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по настоящему описанию.
В настоящем описании также предложены способы облегчения выживания клеток, например выживания клеток нервной системы, путем введения антитела против сортилина по настоящему описанию для ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, нейротрофином по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, proBDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, амилоидным белком-предшественников (APP) и A-бета-пептидом. Антитело против сортилина можно вводить клеткам in vitro для облегчения выживания клеток. В альтернативном варианте антитело против сортилина можно вводить in vivo (например, путем введения антитела индивиду) для облегчения выживания клеток.
В настоящем описании также предложены способы ингибирования нейровоспаления, аксонопатии, характеризующейся коротким аксональным отростком и аномальным разветвлением, микроглиальной активации и воспалительной реакции и стимулирования выживания клеток, аутофагии и выведения агрегированных белков путем введения антитела против сортилина по настоящему описанию для ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином, нейротрофином по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, амилоидным белкомпредшественников (APP) и A-бета-пептидом. Антитело против сортилина можно вводить клеткам in vitro. В альтернативном варианте антитело против сортилина можно вводить in vivo (например, путем введения антитела индивиду).
В настоящем описании также предложены способы уменьшения экспрессии одного или более провоспалительных медиаторов путем введения нуждающемуся индивиду антитела против сортилина по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более провоспалительных медиаторов, выбирают из IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1e, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5.
Деменция.
Деменция представляет собой неспецифический синдром (т.е. набор признаков и симптомов), который представляет собой серьезную потерю глобальных когнитивных способностей у человека, ранее не имеющего отклонений, помимо того, что можно ожидать от нормального старения. Деменция может быть статической вследствие уникальной глобальной травмы головного мозга. В альтернативном варианте, деменция может быть прогрессивной, что приводит к долгосрочному ухудшению здоровья из-за повреждения или заболевания в организме. В то время как деменция является гораздо более распространенной среди гериатрического населения, заболевание также может наблюдаться в возрасте до 65 лет. Когнитивные области, страдающие в результате деменции включают, без ограничения, память, концентрацию внимания, язык и решение проблем. Как правило, симптомы должны проявляться в течение по меньшей мере шести месяцев до того, как у индивидуума будет диагностирована деменция.
Типовые формы деменции включают, без ограничения, лобно-височную деменцию, болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию, семантическую деменцию и деменцию с телами Леви.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать деменцию. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего деменцию (например, нейротрофическую и/или выживательную активность у нейронов и противовоспалительную активность).
Лобно-височная деменция.
Лобно-височная деменция (FTD) представляет собой патологическое состояние, которое приводит к прогрессирующему разрушению лобной доли головного мозга. Со временем дегенерация может перейти в височную долю. Уступая только болезни Альцгеймера (AD) в распространенности, FTD составляет 20% случаев пресенильной деменции. Клинические признаки FTD включают нарушения памяти, поведенческие отклонения, изменения личности и языковые нарушения (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet. 24: 186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51: 1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58: 1615-1621 (2002)).
- 98 043015
Значительная часть случаев FTD унаследована по аутосомно-доминантному типу, но даже в одной семье симптомы могут охватывать спектр от FTD с поведенческими нарушениями до первичной прогрессирующей афазии, до ганглиозной дегенерации кортико-базального отдела. FTD, как и большинство нейродегенеративных заболеваний, может характеризоваться патологическим присутствием специфических белковых агрегатов в пораженном головном мозге. Исторически первые описания FTD определяли наличие внутринейрональных скоплений гиперфосфорилированного тау-белка в нейрофибриллярных клубках или телах Пика. Причинная роль белка, связанного с микротрубочками, была подтверждена идентификацией мутаций в гене, кодирующем тау-белок в нескольких семьях (Hutton, M., et al., Nature 393: 702-705 (1998). Однако в большинстве случаев в головном мозге, пораженном FTD, не обнаруживают накопления гиперфосфорилированного тау-белка, но проявляется иммунореактивность к убиквитину (Ub) и ДНК-связывающему белку TAR (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch. Neurol. 64: 1388-1394 (2007)). Показано, что большинство из этих случаев FTD с включениями Uh (FTD-U) несут мутации в гене програнулина.
Мутации програнулина приводят к гаплонедостаточности и, как известно, представляют около 50% наследственных случаев FTD, делая мутации програнулина основным генетическим фактором в развитие FTD. Безотносительно к какой-либо теории, считается, что потеря функционирования гетерозиготного характера из-за мутаций програнулина указывает, что у здоровых индивидов, экспрессия програнулина играет дозозависимую критическую роль в защите здоровых индивидов от развития FTD.
Соответственно, увеличение уровней програнулина путем ингибирования взаимодействия между сортилином и програнулином может предотвращать, уменьшать риск и/или излечивать FTD.
Болезнь Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной формой деменции. Не существует лекарства от этой болезни, которая ухудшается по мере ее прогрессирования и в конечном итоге приводит к смерти. Чаще всего AD диагностируется у людей старше 65 лет. Тем не менее, менее распространенная болезнь Альцгеймера с ранним началом может возникнуть гораздо раньше.
Общие симптомы болезни Альцгеймера включают поведенческие симптомы, такие как трудности с запоминанием недавних событий; когнитивные симптомы, путаницу, раздражительность и агрессию, перепады настроения, проблему с речью и потерю долгосрочной памяти. По мере прогрессирования заболевания функции организма теряются, что в конечном итоге приводит к смерти. Болезнь Альцгеймера развивается в течение неизвестного и изменчивого количества времени, прежде чем стать полностью очевидной, и она может прогрессировать недиагностированной годами.
Было показано, что сортилин связывается с амилоидным белком-предшественником (APP) и ферментом APP-процессинга BACE1. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что рецептор эти взаимодействия задействованы в развитии болезни Альцгеймера. Соответственно и без ограничения какойлибо теорией полагают, что антитела против сортилина по настоящему описанию можно использовать для ингибирования таких взаимодействий и предотвращения, снижения риска и/или излечения болезни Альцгеймера у нуждающихся индивидов.
Последние исследования также показали, что уровни пронейротрофинов (например, pro-NGF, proBDNF и т.д.) увеличиваются на ранних стадиях болезни Альцгеймера (например, Fahnestock, M et al., (2001) Cell Neurosci. 18, 210-220; Michalski, B et al., (2003) Brain Res. Mol. Brain Res. 11l, 148-154; Pedraza, CE et al., (2005) Am. J. Pathol. 166, 533-543; и Peng, S et al., (2005) J. Neurochem. 93, 1412-1421). Более того, пронейротрофины претерпевают гликирование и липоокисление в гиппокампной и энторинальной области коры у пациентов с болезнью Альцгеймера (Counts, SE et al., (2004) Ann. Neurol. 56, 520-531; и Counts, SE et al., (2005) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 263-272). Этот факт делает пронейротрофины менее чувствительными для процессинга в зрелые нейротрофины. Кроме того, у пациента с болезнью Альцгеймера уменьшена экспрессия TrkA, тогда как экспрессия p75 и сортилина сохраняется неизменной.
Соответственно и без ограничения какой-либо теорией полагают, что антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), p75, амилоидным белком-предшественников (APP) и A-бета-пептидом; или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения, снижения риска и/или излечения болезни Альцгеймера у нуждающихся индивидов.
Сосудистая деменция.
Сосудистая деменция (VaD) представляет собой скрытно прогрессирующее ухудшение памяти и других когнитивных функций, которые, как считают, происходят из-за цереброваскулярного заболевания (заболевание кровеносных сосудов в головном мозге). Цереброваскулярное заболевание представляет собой прогрессирующее изменение в кровеносных сосудах (сосудистой системе) в головном мозге (большом мозге). Наиболее часто возникающее изменение сосудов, связанным с возрастом, является накоплением холестерина и других веществ на стенках кровеносных сосудов. Это приводит к утолщению и затвердению стенок, а также сужению сосудов, что может приводить к уменьшению и даже полной остановке потока крови в участки мозга, снабжаемые поврежденной артерией. Сосудистая деменция у паци
- 99 043015 ентов часто представлена сходными симптомами как у пациентов с болезнью Альцгеймера (AD). Тем не менее, близкие изменения в головном мозге происходят не из-за патологии AD, но из-за хронического пониженного потока крови в головной мозг, что в конце концов приводит к деменции. VaD считается одним из наиболее частых типов деменции у пожилых людей. Симптомы VaD включают сложности с памятью, сложности с организацией и решением сложных проблем, замедленным мышлением, рассеянностью или забывчивостью, сложностью извлечения слов из памяти, изменениями настроения или поведения, такими как депрессия, раздражительность или апатия, и галлюцинации или бредовые состояния.
Без ограничения какой-либо теорией полагают, что одна или более активностей сортилина или одно или более взаимодействий между сортилином и програнулином, нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, липопротеиной липазой, аполипопротеином AV или связанным с рецептором белком вовлечены в развитие сосудистой деменции. Соответственно и без ограничения какой-либо теорией полагают, что антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, proNGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, сортилиновым пропептидом (Sort-pro), амилоидным белком-предшественников (APP), A-бета-пептидом, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и/или связанным с рецептором белком (RAP); или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения, снижения риска и/или излечения сосудистой деменции у нуждающихся индивидов.
Эпилептические припадки, дистрофия сетчатки, травматические поражения головного мозга, повреждения спинного мозга и длителвная депрессия.
Как используется в данном документе, дистрофия сетчатки относится к заболеванию или патологическому состоянию, которое вовлекает дегенерацию сетчатки. Такие заболевания или патологические состояния могут приводить к потере зрения или полную слепоту.
Как используется в данном документе, эпилептические припадки также включают эпилептические припадки и относится к переходному симптому анормальной избыточной или синхронной нейрональной активности в головном мозге. Внешний эффект может быть настолько кардинальным, как дикие бьющиеся движения или умеренная, или кратковременная потеря сознания. Эпилептические припадки могут проявляться в виде изменения психического состояния, тонические или судорожные движения, конвульсии и различные другие психические симптомы.
Травматические повреждения головного мозга (TBI) также могут быть известны как внутричерепные повреждения. Травматические повреждения головного мозга происходят, когда головной мозг травматически повреждается внешней силой. Травматические повреждения головного мозга могут классифицироваться на основе тяжести, механизма (закрытое или проникающее повреждение головы) или других признаков (например, происходящих в конкретном расположении или на протяженной области).
Повреждения спинного мозга (SCI) включает любое повреждение спинного мозга, которое вызвано вместо заболевания травмой. В зависимости от того, где поврежден спинной мозг и корешки неровов, симптомы могут сильно различаться от боли до паралича и недержания. Повреждения спинного мозга описаны на различных уровнях недостаточности, которые могут отличаться от отсутствия влияния на пациента до полного поражения, которые означают полную потерю функции.
Длительная депрессия (LTD) представляет собой зависимое от активности снижение эффективности нейрональных синапсов, длящееся часы или дольше после длительно следовавшего стимула. Длительная депрессия может происходить во многих отделах центральной нервной системы с различными механизмами в зависимости от участка головного мозга и прогресса в развитии. Длительная депрессия может происходить в гиппокампе, большом мозге и различных типах нейронов, которые высвобождают различные нейротрансмиттеров. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что длительная депрессия может быть ассоциирована с нейродегенерацией, деменцией и болезнью Альцгеймера.
Было показано, что пронейротрофины (например, пронейротрофины-4/5, нейротрофин-4/5, proNGF, pro-BDNF и т.д.) играют роль при эпилептических припадках, дистрофии сетчатки, травматическом повреждении мозга, повреждении спинного мозга и длительной депрессии (например, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; и Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
Соответственно и без ограничения какой-либо теорией полагают, что антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.); или которые ингибиру- 100 043015 ют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения, снижения риска и/или излечения эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматических повреждений головного мозга, повреждений спинного мозга и/или длительной депрессии у нуждающихся индивидов.
Атеросклеротические заболевания сосудов.
Как используется в данном документе, термины атеросклеротическое заболевание сосудов, ASVD и атеросклероз используются взаимозаменяемо и относятся к любому патологическому состоянию, при котором утолщается стенка артерий в результате накопления жировых веществ, таких как холестерин, липиды и триглицериды. Атеросклеротические заболевания сосудов включают, без ограничения, любое связанное с ASVD патологическое состояние, нарушение или заболевание, включая без ограничения, тромбоэмболию, инсульт, ишемию, инфаркты, коронарный тромбоз, инфаркт миокарда (например, сердечный приступ) и динамическое нарушение кровообращения.
Атеросклеротическое заболевание сосудов представляет собой синдром, поражающий артериальные кровеносные сосуды, хроническую воспалительную реакцию в стенках артерий, вызванную накоплением белых клеток крови макрофагов, и стимулированную липопротеинами низкой плотности (ЛНП) без адекватного удаления жиров и холестерина из макрофагов функциональными липопротеинами высокой плотности (ЛВП). Атеросклеротическое заболевание сосудов обычно относится к затвердению или закупорке артерий и вызвано образованием множества бляшек внутри артерий.
Как описано в данном документе, сортилиновые белки по настоящему описанию вовлечены в липидную регуляцию путем связывания ассоциированных с белками липидов, таких как связанный с рецептором белок, липопротеиновая липаза и аполипопротеины APOA5 и APOE (например, Nisson, SK et al., (2007) Biochemistry 46: 3896-3904; Nisson, SK et al., (2008) J Biol Chem 283: 25920-25927; и Klinger, SC et al., J Cell Sci 124: 1095-1105). Показано также, что у дефицитных по сортилину мышей отмечается пониженная бляшковая нагрузка в аорте и пониженные уровни холестеринов в плазме в контексте дефицита рецептора ЛНП (например, Kjolby, M et al., Cell Metab 12: 213-223). В соответствии со сходными ролями сортилиновых рецепторов при липидном метаболизме, было показано, что SorLA оказывает сходное влияние на липидный метаболизм как сортилин, так как потеря SorLA является защитным фактором (например, Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794). SorLA находится под повышающей регуляцией в атероматозных бляшках в организме кроликов и мышей, а мыши с нокаутом защищены от покрывающего повреждения сосудов (например, Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794).
Соответственно и без ограничения какой-либо теорией полагают, что антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), аполипопротеином E (APOE) и/или связанным с рецептором белком (RAP); или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения, снижения риска и/или излечения атеросклеротических заболеваний сосудов у нуждающихся индивидов.
Нежелательные симптомы старения.
Как используется в данном документе, нежелательные симптомы старения включают, без ограничения, потерю памяти, изменения поведения, деменцию, болезнь Альцгеймера, дегенерацию сетчатки, атеросклеротические заболевания сосудов, потерю слуха и разрушение клеток.
Было показано, что пронейротрофины (например, пронейротрофин-3, нейротрофин-4/5, pro-NGF, pro-BDNF и т.д.) играют роль при старении и связанными со старением симптомами (например, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491; и Al-Shawi, R et al., Ann N Y Acad Sci. 2007; 1119: 208-15).
Соответственно, антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином, нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), и/или связанным с рецептором белком (RAP); или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения, снижения риска и/или излечения одного или более нежелательных симптомов старения.
Боковой амиотрофический склероз (ALS).
Как используется в данном документе, термины боковой амиотрофический склероз (ALS) или болезнь моторных нейронов, или болезнь Лу Герига используются взаимозаменяемо и относятся к изнурительной болезни с различной этиологией, характеризующейся быстро прогрессирующей слабостью, мышечной атрофией и фасцикуляциями, мышечной спастичностью, затруднением речи (дизартрией), затруднением глотания (дисфагией) и затруднением дыхания (одышкой).
Было показано, что програнулин играет роль при ALS (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg
- 101 043015
Psychiatry.; 78: 754-6) и защищает от повреждения, вызванного белками, вызывающими ALS, такими как
TDP-43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). Также было продемонстрировано, что pro-NGF индуцирует p75-опосредованную гибель олигодендроцитов и кортикоспинальных нейронов после повреждения спинного мозга (Beatty et al., Neuron (2002), 36, p. 375-386; Giehl et al, Proc. Natl. Acad. Sci
USA (2004), 101, pp 6226-30).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином, нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), и/или связанным с рецептором белком (RAP); или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения или лечения одного или более нежелательных симптомов ALS.
Депрессия.
Как используется в данном документе, депрессия или большое депрессивное расстройство (MDD), клиническая депрессия, большая депрессия, монополярная депрессия, униполярная депрессия, вторичная депрессия или дистимия используются взаимозаменяемо и относятся к психическому расстройству, харастеризующемуся эпизодами всеохватывающего плохого настроения из-за низкой самооценки и потери интереса или удовольствия от обычно доставляющих удовольствия видов активности. Этот кластер симптомов (синдром) называли, описывали и классифицировали как одно из расстройств настроения в издании 1980 года руководства по диагностике Американской психиатрической ассоциации. Термин депрессия является неоднозначным. Он часто используется для определения этого синдрома, но может относится к другим расстройствам настроения или к меньшим расстройствам настроения без клинической значимости. Большое депрессивное расстройство представляет собой инвалидизирующее состояние, которое негативно влияет на семейную жизнь лица, работу или школьную жизнь, привычки сна и питания и общее состояние здоровья. В США около 3, 4% людей с большим депрессивным расстройством совершают суицид, и до 60% людей, которые совершают суицид имеют депрессию или другое расстройство настроения.
Было показано, что нейротрофины вовлечены в проявление депрессии и антидепрессивного действия (Duman et al., Arch Gen Psychiatry (1997) 54: 597-606); например, вливание BDNF в гиппокамп вызывало антидепрессивный эффект в двух поведенческих моделях депрессии (Shirayama et al., (2002), J Neurosci 22: 3251-3261). Более того, обнаружено, что однонуклеотидный полиморфизм в гене bdnf, приводящий к замене валина (Val) на метионин (Met) в кодоне 66 в продомене (BDNFMet) связан с увеличенной чувствительность у людей, гетерозиготных по полиморфизму, к психоневрологическим расстройствам, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, депрессию и биполярное нарушение (Chen et al, J. Neuroscience (2005), 25: 6156-6166; Kuipers and Bramham, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. (2006) 9(5): 5806; и Bath and Lee, Cogn. Affect. Behav. Neurosci (2006) 1: 79-85). В дополнение к этому, показано, что у гетерозиготных по BDNFMet людей имеются нарушения памяти (Egan et al., Cell (2003). 112, p. 257-269).
В некоторых вариантах реализации изобретения антитела против сортилина по настоящему описанию, которые ингибируют взаимодействие между сортилином и програнулином, нейротрофинами по настоящему описанию (например, пронейротрофинами, пронейротрофином-3, пронейротрофином-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, нейротрофином-3, нейротрофином-4/5, NGF, BDNF и т.д.), нейротензином, p75, липопротеиновой липазой (LpL), аполипопротеином AV (APOA5), и/или связанным с рецептором белком (RAP); или которые ингибируют одну или более активностей сортилина, можно применять для предотвращения или лечения одного или более нежелательных симптомов депрессии.
Болезнь Паркинсона.
Болезнь Паркинсона, которую можно назвать идиопатическим или первичным паркинсонизмом, гипокинетическим ригидным синдромом (HRS) или дрожательным параличем, является нейродегенеративным заболеванием мозга, которое влияет на регуляцию двигательной системы. Прогрессирующая гибель дофамин-продуцирующих клеток головного мозга приводит к основным симптомам болезни Паркинсона. Чаще всего болезнь Паркинсона диагностируется у людей старше 50 лет. Болезнь Паркинсона является идиопатической (не имеющей известной причины) у большинства людей. Однако генетические факторы также играют определенную роль в заболевании.
Симптомы болезни Паркинсона включают, без ограничения, тремор кистей, рук, ног, челюсти и лица, мышечную ригидность в конечностях и туловище, медлительность движения (брадикинезию), постуральную нестабильность, затруднение при ходьбе, психоневрологические проблемы, изменение речи или поведения, депрессию, беспокойство, боль, психоз, слабоумие, галлюцинации и проблемы со сном.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать болезнь Паркинсона. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего болезнь Паркинсона.
Болезнь Хантингтона.
Болезнь Хантингтона (HD) является наследственным нейродегенеративным заболеванием, вызван- 102 043015 ным аутосомно-доминантной мутацией в гене Huntingtin (HTT). Распространение цитокин-аденингуанинового (CAG) триплетного повтора в гене Huntingtin приводит к получению мутантной формы белка Huntingtin (Htt), кодируемого данным геном. Этот мутантный белок Huntingtin (mHtt) является токсичным и способствует гибели нейронов. Симптомы болезни Хантингтона чаще всего появляются между и 44 годами, хотя они могут появляться в любом возрасте.
Симптомы болезни Хантингтона включают, без ограничения, проблемы с регуляцией моторики, отрывистые, случайные движения (хорею), аномальные движения глаз, нарушение равновесия, эпилептические припадки, затруднение жевания, затруднение глотания, когнитивные проблемы, измененную речь, недостаток памяти, трудности мышления, бессонницу, усталость, слабоумие, изменения в личности, депрессию, беспокойство и компульсивное поведение.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать болезнь Хатингтона (HD). В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего HD.
Таупатия.
Болезнь таупатия или таупатии являются классом нейродегенеративных заболеваний, вызванных агрегацией связанных с микротрубочками тау-белков в головном мозге. Болезнь Альцгеймера (AD) является самой известной тауопатией и включает накопление тау-белка в нейронах в виде нерастворимых нейрофибриллярных клубков (NFT). Другие болезни и расстройства таупатии включают прогрессирующий супрануклеарный паралич, деменцию боксеров (хроническую травматическую энцефалопатию), фронтотемпоральное слабоумие и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17, болезнь литико-бодиг (комплекс Паркинсона-деменции острова Гуам), деменцию с преобладанием клубков, ганглиоглиому и ганглиоцитому, менингиоангиоматоз, подострый склерозирующий панэнцефалит, свинцовую энцефалопатию, туберозный склероз, болезнь Галлервордена-Шпатца, липофусциноз, болезнь Пика, кортикобазальную дегенерацию, болезнь аргирофильных зерен (AGD), болезнь Хантингтона, лобно-височную деменцию и лобно-височную дегенерацию лобно-височной доли.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать таупатию. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего таупатию.
Рассеянный склероз.
Рассеянный склероз (MS) может также называться множественным склерозом или encephalomyelitis disseminata. MS представляет собой воспалительное заболевание, при котором жиросодержащие миелиновые оболочки вокруг аксонов головного и спинного мозга повреждаются, что приводит к демиелинизации и рубцеванию, а также широкому спектру признаков и симптомов. MS влияет на способность нервных клеток в головном и спинном мозге эффективно взаимодействовать друг с другом. Нервные клетки общаются посредством отправления электрических сигналов, называемых потенциалами действия, вдоль длинных волокон, называемых аксонами, которые находятся внутри изолирующего вещества, называемого миелином. При MS собственная иммунная система организма атакует и повреждает миелин. В случае потери миелина аксоны перестают эффективно проводить сигналы. Проявление MS обычно встречается у молодых людей и чаще встречается у женщин.
Симптомы MS включают, без ограничения, изменения в восприятии, такие как потеря чувствительности или покалывание; покалывание или онемение, такие как гипоэстезия и парестезия; мышечную слабость; клонус; мышечные спазмы; сложности с передвижением; сложности с координацией и равновесием, такие как атаксия; проблемы с речью, такие как дизартрия, или проблемы при глотании, такие как дисфагия; визуальные проблемы, такие как нистагм, неврит зрительного нерва, включая фосфены и диплопию; усталость; острую или хроническую боль; а также проблемы с мочевым пузырем и кишечником; когнитивные нарушения различной степени; эмоциональные симптомы депрессии или нестабильного настроения; феномен Ухтоффа, который является обострением существующих симптомов из-за воздействия более высоких, чем обычно окружающих температур; и симптом Лермитта, который является ощущением электрического разряда, проходящего вниз по спине при повороте шеи.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать рассеянный склероз. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего рассеянный склероз.
Глаукома и макулярная дегенерация.
Глаукома описывает, без ограничения, группу заболеваний, которые характеризуются повреждением зрительного нерва, приводящее к потере зрения и слепоте. Глаукома обычно вызвана увеличенным давлением жидкости (= внутриглазное давление) в переднем отделе нижней стороны роговицы. Глаукома приводит к последующей потере ганглионарных клеток сетчатки, которые являются важными для зрения. Возрастной макулярной дегенерации обычно подвержены пожилые люди, и она главным образом вызывает потерю зрения в желтом пятне, центральном поле зрения. Макулярная дегенерация, без огра- 103 043015 ничения, вызывает друзы, изменения пигментации, искаженное восприятие, кровоизлияние глаза, атрофию, пониженную остроту зрения, нечеткое зрение, центральную скотому, ухудшение цветового восприятия и ухудшение контрастной чувствительности.
Без ограничения теорией полагают, что введение антитела против сортилина по настоящему описанию может предотвращать, снижать риск и/или излечивать глаукому и макулярную дегенерацию. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела против сортилина может индуцировать одну или более активностей програнулина у индивида, имеющего глаукому или макулярную дегенерацию.
Дегенеративное заболевание межпозвонковых дисков (DDD).
Дегенеративное заболевание межпозвонковых дисков (DDD) описывает, без ограничения, группу заболеваний, в которых межпозвонковый диск (IVD) претерпевает интенсивные морфологические, а также биомеханические изменения, и обычно клинически проявляется у пациентов с болью в нижних отделах спины. Дегенеративные диски, как правило, демонстрируют дегенеративный соединительнотканный хрящ и кластеры хондроцитов, предполагаемого восстановления. Может иметь место или отсутствовать воспаление. Результаты патологических исследований при DDD включают протрузию, спондилолиз и/или смещение (спонилолистез) и спинальный стеноз.
Комплекты/изделия.
Настоящее описание также относится к комплектам, содержащим выделенное антитело по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе) или его функциональный фрагмент. Комплекты по настоящему описанию могут включать один или более контейнеров, содержащих очищенное антитело по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения комплекты дополнительно включают инструкции по применению в соответствии со способами настоящего описания. В некоторых вариантах реализации изобретения эти инструкции содержат описание введения выделенного антитела по настоящему описанию (например, антитела против сортилина, описанного в данном документе) для предупреждения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или повреждение, выбранное из лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, длительной депрессии, атеросклеротических заболеваний сосудов, нежелательных симптомов естественного старения, деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, болезни Насу-Хакола, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, нарушения заживления ран, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего супрануклеарного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, связанными с гранулематозом нарушениями, саркоидозом, болезней старения, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментного ретинита, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, волчанки, артрита, рассеянного склероза и нарушения заживления ран, в соответствии с данным описанием.
В некоторых вариантах реализации изобретения инструкции содержат описание того, как определять белок сортилин, например, у индивида в образце ткани или в клетке. Комплект может дополнительно содержать описание отбора индивидуума, подходящего для лечения, на основе определения того, имеет ли данный индивид заболевание на этой стадии заболевания.
В некоторых вариантах реализации изобретения комплекты могут дополнительно содержать другое антитело по настоящему описанию (например, по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с ингибирующей контрольную точку молекулой, по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с ингибирующим цитокином, и/или по меньшей мере одно агонистическое антитело, которое специфически связывается со стимулирующим контрольную точку белком) и/или по меньшей мере один стимулирующий цитокин. В некоторых вариантах реализации изобретения комплекты могут дополнительно включать инструкции для использования антитела и/или стимулирующего цитокина в комбинации с выделенным антителом по настоящему описанию (например, антителом против сортилина, описанным в данном документе), инструкции по применению выделенного антитела по настоящему описанию в комбинации с антителом и/или стимулирующим цитокином или инструкции по применению выделенного антитела по настоящему описанию и антитела и/или стимулирующего цитокина в соответствии с любым из способов по данному описанию.
Как правило, инструкции включают информацию о дозировке, схеме применения и способе введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут быть в виде единичных доз, многодозовых упаковок (например, упаковки для многократного приема) или субъединичных доз. Инструкции, поставляемые в комплектах по настоящему описанию, как правило, представляют собой письменные инструкции на этикетке или листке-вкладыше в упаковке (например, бумажном листе, включенным в комплект), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции, записанные на магнитном или оптическом накопи- 104 043015 тельном диске) также являются приемлемыми.
На этикетке или листке-вкладыше в упаковке указано, что композицию используют для лечения, например, заболевания по настоящему описанию. Инструкции могут быть предложены для практического применения любого из описанных в данном документе способов.
Комплекты по этому описанию помещают в подходящую упаковку. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается ими, флаконы, бутылки, сосуды, гибкую упаковку (например, герметические майларовые или пластиковые пакеты) и тому подобное. Также рассматриваются упаковки, предназначенные для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Комплект может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенных растворов или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер также может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенных растворов или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой выделенное антитело по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе). Контейнер может дополнительно содержать второе фармацевтическое действующее вещество.
В контейнерах могут необязательно предлагаться дополнительные компоненты, такие как буферы, и интерпретирующую информацию. В большинстве случаев, комплект содержит контейнер и связанную с контейнером или находящуюся на нем этикетку или вкладыш(и) в упаковке.
Диагностическое применение.
Выделенные антитела по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе) также имеют диагностическую ценность. Таким образом в данном описании предложены способы использования антител по этому описанию или их функциональных фрагментов для диагностических целей, таких как выявления сортилина у индивида или в образцах тканей, полученных от индивида.
В некоторых вариантах реализации индивид является человеком. В некоторых вариантах реализации индивид является пациентом-человеком, страдающим от или подверженный риску развития заболевания, нарушения или повреждения по настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения диагностические способы включают выявление белка сортилина в биологическом образце, таком как образец биопсии, ткань или клетка. Выделенное антитело по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе) контактирует с биологическим образцом и выявляет связанное с антигеном антитело. Например, образец биопсии может быть окрашен с помощью антитела против сортилина, описанного в данном документе, для выявления и/или количественного определения связанных с заболеванием клеток. Способ выявления может включать количественное определение связанного с антигеном антитела. Выявление антител в биологических образцах может происходить любым способом, известным в данной области техники, включая иммунофлюоресцентную микроскопию, иммуноцитохимию, иммуногистохимию, ELISA, анализ FACS, иммунопреципитацию или микропозитронную эмиссионную томографию. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело является меченным радиоактивным изотопом, например, 18F и впоследствии обнаруживается с использованием анализа микропозитронной эмиссионной томографии. Связывание антитела также можно количественно определить у пациента с помощью неинвазивных методик, таких как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), рентгеновская компьютерная томография, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), компьютерная томография (КТ) и аксиальная компьютерная томография (АКТ).
В других вариантах реализации изобретения выделенное антитело по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе) можно использовать для выявления и/или количественного определения, например, микроглии в образце головного мозга, взятом из модели доклинического заболевания (например, модели заболевания, не относящейся к человеку). По существу, выделенное антитело по настоящему описанию (например, антитело против сортилина, описанное в данном документе) может быть полезным при оценке терапевтического ответа после лечения на модели заболевания нервной системы или повреждения, такого как лобно-височная деменция, болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция, эпилептические припадки, дистрофия сетчатки, атеросклеротические заболевания сосудов, болезнь Насу-Хакола или рассеянный склероз по сравнению с контролем.
Настоящее описание будет более понятным при рассмотрении следующих примеров. В то же время эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего описания. Все ссылки по всему описанию изобретения явным образом включены в данный документ посредством ссылки.
- 105 043015
Примеры
Пример 1. Продуцирование, идентификация и определение параметров антител против сортилина. Введение.
Антитела против сортилина можно идентифицировать с использованием общепринятых библиотек репрезентации антител на основе дрожжей, например, как описанные в WO 2009/036379, WO 2010/105256, WO 2012/009568, US 2009/0181855 и uS 2010/0056386. Такие библиотеки можно применять для идентификации антител против сортилина, которые блокируют взаимодействие между сортилином и сортилиновым лигандом, таким как програнулин и/или pro-NGF, и/илиантитела против сортилина, которое перекрестно реагирует с другими сортилиновыми белками млекопитающих, таких как сортилин мыши, сортилин крысы и/или сортилин приматов.
В альтернативном варианте можно использовать стандартные протоколы для дисплейного скрининга на дрожжах, описанные в Patrick Chames (ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, Springer Science+Business Media, LLC 2012 Chapter 15, Selection of Antibody Fragments by Yeast Display by Nathalie Scholler.
Антитела также можно получать любым другим общепринятым способом продуцирования антител, таким как описанные в Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, Springer Science+Business Media, LLC 2012.
Способность антител ингибировать взаимодействия между сортилином и его лигандами затем можно валидировать множеством общепринятых и/или основанных на клетках анализах, включая, но не ограничиваясь ими, анализом поверхностного плазмонного резонанса, совместной иммунопреципитации, анализов pulldown, анализов со связанными с целлюлозой белками, анализами комплементации с βгалактозидазой, анализами популяций клеток с FRET, анализами с близостью лигирования и анализами связывания клеток.
Как описано данном документе, было идентифицировано и охарактеризовано 85 антител против сортилина.
Материалы и методы.
Продукция мономерного и Fc-конъюгированного сортилина человека и мыши.
Экспрессию в организме млекопитающего сортилинового антигена выполняли путем клонирования синтетических генов на основе кДНК в экспрессионные векторы млекопитающих, с последующей транзиентной трансфекцией и экспрессией в клетки HEK293T. Конструкции включали гетерологичный сигнальный пептид и Fc IgG1 человека для конструкции Fc-слияния. Вкратце, экспрессионные векторы, содержащие интересующий антиген, трансфицировали путем комплексообразования с реагентом для трансфекции с последующим воздействием на клетки HEK293T в течение одного часа с последующим разведением культуральной среды до конечной плотности 4 миллиона клеток на мл. Затем клетки культивировали в течение 7 суток с подпиткой свежей средой каждые 48 часов. Через 7 суток супернатант собирали с последующим выполнением центрифугирования и очистки, используя белковую Ni-сефарозу и при необходимости очистку на SEC-колонке до достижения> 95% содержания неагрегированного мономера. Антигены мономерного сортилина получали путем фрагментирования слитого антигена сортилина-Fc с модифицированным каркасным участком (Lynaugh et al., MAbs. 2013 Oct; 5(5): 641-45) с протеазой FabRICATOR (IdeS) (Genovis, № по кат. A2-FR2-1000), с последующей аффинной очисткой на белке А для удаления нерасщепленного слитого с Fc белка и SEC для удаления агрегированного мономера.
Биотинилированные сортилин и програнулин.
Биотинилирование с реагентом для белков проводили с использованием набора EZ-Link Sulfo-NHSBiotinylation (Thermo Scientific, № по кат. 21425).
Сортилин и програнулин концентрировали до ~1 мг/мл и буферный раствор заменяли на ФСБ перед добавлением 1: 7,5 молярного соотношения реагента для биотинилирования (набор EZ-Link Sulfo-NHSBiotinylation, Thermo Scientific, № по кат. 21425). Смеси выдерживали при 4°C в течение ночи перед другой заменой буферного раствора для удаления свободного биотина в растворе. Биотинилирование подтверждали посредством связывания стрептавидиновым сенсором меченых белков на приборе ForteBio.
Скрининг сортилиновых антител.
Как было описано ранее, были сконструированы, получены и размножены восемь наивных синтетических дрожжевых библиотек каждая по ~109 клеток (см., например: Xu et al, 2013; WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; Xu et al., Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26(10): 663-70). Выполняли десять параллельных отборов, используя восемь наивных библиотек для отборов слитых антигенов Fcсортилина человека и двух пулов восьми библиотек для отборов мономера сортилина человека. Для первых раундов отбора использовали методику сортировки магнитных гранул системы Miltenyi MACS, как было описано ранее (Siegel et al., J Immunol Methods. 2004 Mar; 286(1-2): 141-53). Вкратце, клетки дрожжей (~1010 клеток/библиотеку) инкубировали с 3 мл 10 нМ биотинилированного слитого антигена сортилин-Fc или 100 нМ биотинилированного антигена мономера сортилина в течение 15 мин при комнатной температуре в FACS-промывочном буфере ФСБ с 0,1% БСА. После однократного промывания с помощью 50 мл охлажденного льдом промывочного буфера осадок клеток ресуспендировали в 40 мл промы
- 106 043015 вочного буфера и 500 мкл микросфер со стрептавидином (Miltenyi Biotec, г. Бергиш-Гладбах, Германия, № по кат. 130-04 8-101) добавляли к дрожжам и инкубировали в течение 15 мин при 4°C. Далее дрожжи осаждали, ресуспендировали в 5 мл промывочного буфера и загружали в колонку MACS LS (Miltenyi Biotec, г. Бергиш-Гладбах, Германия, № по кат. 130-042-401). После загрузки 5 мл колонку промывали 3 раза с помощью 3 мл промывочного буфера для FACS. Затем колонку удаляли из магнитного поля и дрожжи элюировали 5 мл среды для роста и затем выращивали в течение ночи. Следующие четыре раунда сортировки были выполнены с использованием проточной цитометрии. Приблизительно 1х108 клеток дрожжей осаждали, промывали три раза промывочным буфером и инкубированы с 10 нМ биотинилированным слитым антигеном сортилин-Fc или 100 нМ биотинилированного антигена мономера сортилина в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем дрожжи дважды промывали и окрашивали с помощью козьего антитела с FITC к F(ab')2 каппа человека, разбавленным 1: 100 (Southern Biotech, г. Бирмингем, Алабама, № по кат. 2062-02) и либо стрептавидином-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, г. Гранд Айленд, Нью-Йорк, № по кат. S21375), разбавленным 1: 500, либо экстравидин-фикоэритрином (SigmaAldrich, г. Сент-Луис, № по кат. E4011), разбавленным 1: 50 вторичными реагентами в течение 15 мин при 4°C. После двукратного промывания ледяным буфером для промывки осадки клеток ресуспендировали в 0,4 мл промывочного буфера и переносили в пробирки для сортировки с фильтром. Сортировка проводилась с использованием сортера FACS ARIA (BD Biosciences) и были выбраны гейты для сортировки для отбора только связывающих сортилин клонов в течение одного раунда, а второй раунд представлял собой отрицательную сортировку для уменьшения количества связывающих реагенты белков, полиспецифических связывающих белков (Xu et al., PEDS. 2013 Oct; 26(10): 663-70), и связывающих белков с контрольным белковым меченым HIS мономером SorCS1 человека. В третьем раунде использовали маркирование 10 нМ слитыми антигенами Fc-сортилина человека и мыши, 100 нМ антигена мономерного сортилина человека и конкуренция с програнулином с использованием сортилиновых антигенов (10 нМ) предварительно образовавших комплексы с 500 нМ програнулина. Для выявления дрожжевых клеток, конкурирующих с програнулином, выполняли заключительный раунд для обогащения белков, связывающих слитый антиген сортилина-Fc. После заключительного раунда сортировки дрожжи высевали в чашки, а отдельные колонии собирали для определения характеристик.
Для получения библиотек диверсификации легких цепей, применяемых для дополнительных отборов, использовали тяжелые цепи из результатов второго и четвертого раунда отбора сортировкой FACS. Для этих отборов в первом раунде отбора применяли гранулы Miltenyi MACs и маркирование 10 нМ слитого антигена Fc-сортилина человека. Далее следовали четыре раунда сортировки FACS. В первом раунде применяли 100 нМ антигена мономера сортилина человека. Второй раунд FACS был отрицательной сортировкой для уменьшения связывания со связывающими реагенты белками, полиспецифическими связывающими белками и связывающими белками с контрольным белковым HIS-меченым SorCS1 человека. В последних двух раундах использовали титрование мономером сортилина человека (100 нМ, 10 нМ и 1 нМ) для выявления связывающих белков с наибольшей аффинностью, 100 нМ мономера сортилина мыши и конкуренцию с контрольным антителом 3E3 для оценки конкурентной репрезентации в обогащенной популяции. После заключительного раунда сортировки дрожжи высевали в чашки, а отдельные колонии собирали для определения характеристик.
Продукция и очистка IgG и Fab антител.
Дрожжевые клоны выращивали до насыщения и затем индуцировали в течение 48 ч при 30°C при встряхивании. После индукции дрожжевые клетки осаждали и супернатанты собирали для очистки. IgG очищали с использованием колонки с белком A и элюировали уксусной кислотой, pH 2,0. Фрагменты Fab получали с помощью расщепления папаином и очищали на аффинной матрице CaptureSelect IgG-CH1 (LifeTechnologies, № по кат. 1943200250).
Эксперименты связывания на ForteBio.
Аффинность антител к сортилину определяли путем измерения их KD методом ForteBio. Измерения аффинности методом ForteBio в целом проводили, как описано ранее (Estepet al., MAbs. 2013 Mar-Apr; 5(2): 270-8). Вкратце, измерения аффинности методом ForteBio проводили путем нанесения IgG в режиме онлайн на сенсоры AHQ. Сенсоры уравновешивали в режиме оффлайн в буфере для анализа в течение 30 мин и затем контролировали в режиме онлайн в течение 60 секунд для установления базовой линии. Для измерения авидного связывания сенсоры с нанесенными IgG подвергали воздействию 100 нМ антигена (слияние Fc-сортилин человека или мыши) в течение 3 минут, после чего их переносили в буфер для анализа в течение 3 мин для измерения скорости диссоциации. Дополнительное авидное связывание определяли нанесением биотинилированного мономера сортилина на сенсоры SA и воздействием в растворе ~100 нМ IgG. Получали результаты моновалентного связывания нанесением слитых антигенов Fcсортилина человека или мыши на сенсор AHQ с последующим воздействием ~100 нМ Fab антитела к сортилину. Проводили дополнительные моновалентные измерения нанесением биотинилированного мономера сортилина человека или мыши на сенсор SA с последующим воздействием ~100 нМ Fab в растворе.
Кинетические данные подбирали с использованием модели связывания 1:1 в программном обеспечении для анализа данных, предоставленным ForteBio.
- 107 043015
Сортировка эпитопов.
Сортировку эпитопов антител против сортилина проводили на системе Forte Bio Octet Red384 (ForteBio, г. Менло-Парк, штат Калифорния) с использованием стандартной сортировки в формате сэндвич-анализа. Контрольный IgG против мишени наносили на сенсоры AHQ, а незанятые Fcсвязывающие сайты на сенсоре блокировали с помощью нерелевантного человеческого антитела-IgGL Затем сенсоры подвергали воздействию 100 нМ антигена-мишени с последующим вторым антителом против мишени. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа данных ForteBio 7.0. Дополнительное связывание вторым антителом после связывания с антигеном указывает на незанятый эпитоп (неконкурирующий), в то время как отсутствие связывания указывает на блокирование эпитопа (конкурирующий). Данный процесс повторяли для четырех контрольных антител: (i) 3E3, которое связывается с доменом 1 сортилина (бин 1); (ii) S-29, которое связывается с доменом 2 сортилина (бин 2); (iii) S-3, которое связывается с доменом 3 сортилина (бин 3) и S-40, которое связывается с доменом 4 сортилина (бин 4). Вины антител перечислены ниже в табл. 5. Сходные способ сортировки можно применять для определения конкуренции между антителами против сортилина и полноразмерным програнулином человека или мыши, а также между антителами против сортилина и C-концевым програнулиновым пептидом.
Конкурентные анализы с програнулином.
Все эксперименты выполняли на приборе ForteBio HTX. Все образцы разбавляли в растворе PBSF (0,1% БСА в ФСБ). Во всех этапы погружения и считывания ForteBio использовали встряхивание при 1000 об/мин.
Конкуренцию с програнулином оценивали с применением трех анализов ForteBio.
Анализ 1. Эксперименты по определению конкуренции програнулина с биотинилированным програнулиновым C-концевым пептидом.
Перед анализом сенсоры SA замачивали в ФСБ в течение 10 мин. Пустые сенсоры погружали в раствор биотинилированного програнулинового (PGRN) С-концевого пептида (BioTkClRREAPRWDAPLRDPA LRQLL (SeQ ID NO: 693)) при концентрации 100 нМ, а затем перед анализом замачивали в PBSF в течение по меньшей мере 10 мин. Наконечники с нанесенным пептидом последовательно погружали в PBSF (60 с), мономер сортилина человека (100 нМ) в течение 3 мин и, наконец, в 100 нМ раствор антитела. Получали данные для анализа с помощью программного обеспечения для анализа данных ForteBio версии 8.1.0.36 следующим образом. Данные выравнивали по у-оси и корректировали по разнице между точками до начала этапа захвата сортилина, а затем обрезали только до этапов захвата сортилина и взаимодействия с антителами. Анализы, в которых не наблюдали сигнала связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что сайт связывания исследуемого антитела к сортилину перекрывается с сайтом связывания PRGN-пептида на поверхности сортилина. Анализы, в которых наблюдали сигнал связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что исследуемое антитело к сортилину не блокирует связывание PRGN-пептида с сортилином.
Анализ 2. Эксперименты по определению конкуренции програнулина с биотинилированным мономером сортилина человека.
Перед анализом сенсоры SA замачивали в ФСБ в течение 10 мин. Пустые сенсоры погружали в раствор биотинилированного мономера сортилина человека (100 нМ), а затем перед анализом замачивали в PBSF в течение 10 мин. Наконечники с нанесенным сортилином последовательно погружали в PBSF (1 мин), програнулин (1,0 мкМ) в течение 3 мин и, наконец, в 100 нМ раствор антитела. Получали данные для анализа с помощью программного обеспечения для анализа данных ForteBio версии 8.1.0.36 следующим образом. Данные выравнивали по y-оси и корректировали по разнице между точками до начала этапа захвата програнулина, а затем обрезали только до этапов захвата програнулина и взаимодействия с антителами. Анализы, в которых не наблюдали сигнала связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что сайт связывания исследуемого антитела к сортилину перекрывается с сайтом связывания програнулина на поверхности сортилина. Анализы, в которых наблюдали сигнал связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что исследуемое антитело к сортилину не блокирует связывание програнулина с сортилином.
Анализ 3. Эксперименты по определению конкуренции програнулина с биотинилированным програнулином.
Перед анализом сенсоры SA замачивали в ФСБ в течение 10 мин. Пустые сенсоры погружали в раствор биотинилированного програнулина (100 нМ), а затем перед анализом замачивали в PBSF в течение 10 мин. Наконечники с нанесенным програнулином последовательно погружали в PBSF (1 мин), 100 нМ мономера сортилина человека (3 мин) и, наконец, в 100 нМ раствор антитела. Получали данные для анализа с помощью программного обеспечения для анализа данных ForteBio версии 8.1.0.36 следующим образом. Данные выравнивали по у-оси и корректировали по разнице между точками до начала этапа захвата сортилина, а затем обрезали только до этапов захвата сортилина и взаимодействия с антителами. Анализы, в которых не наблюдали сигнала связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что сайт связывания антитела к сортилину перекрывает сайт связыва- 108 043015 ния програнулина на поверхности сортилина. Анализы, в которых наблюдали сигнал связывания при добавлении исследуемого раствора данного антитела к сортилину, указывали, что исследуемое антитело к сортилину не блокирует связывание програнулина с сортилином.
Результаты.
Активности антител против сортилина.
Антитела, которые связываются с сортилином, в частности, в пределах домена Vps10p, расположенные на аминокислотных остатках 78-611 сортилина человека (SEQ ID NO: 1), идентифицировали из восьми наивных синтетических библиотек человека на дрожжах, как описано выше. Всего было получено 85 антител (от S-1 до S-85). Затем антитела подвергали скринингу на связывание сортилина.
Последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи антител.
Используя стандартные методики, были определены аминокислотные последовательности, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи полученных антител. Последовательности CDR антител по EU и Kabat приведены в табл. 1. Последовательности каркасных участков легких цепей антител по EU и Kabat приведены в табл. 2. Последовательности каркасных участков тяжелых цепей антител по Kabat приведены в табл. 3.
Таблица 1
Последовательности CDR антител против сортилина по EU и Kabat
Антитело CDR LI CDR L2 CDR L3 CDR Hl CDR H2 CDR H3
s-- .4ASa3Va5SY2A (SEQ ID HO: 6) SASSRAI (SEQ ID NO:26) QQSPWI (SEQ ID KO:41) YTFT3YYMn (SEQ ID NO:126) W 2ΝΡΗ3 GSTHTAG XF 2 3 (SEQ ID NO:150) AHS₽SSAT13L'KiYYYYGI-E-Z (SEQ ID NO:179)
S-2 RASQSISSYLN (SEQ ID NO:7) AASSLQS (SEQ ID MO:27) QQSDVSPIT (SEQ ID WO:42) YTFTGYYMH (SEQ ID NO:126) WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:150) ARGKRSSGWYEGYGMDV (SEQ ID NO:180)
S-3 RASQSISSNLA (SEQ ID NO:8) KASSLES (SEQ ID NO:28) QQYKSYPIT (SEQ ID KO:43) YTFTGYYMH (SEQ ID NO :12 6) WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID 2: : _ Ξ : ARGGPQLRVAEYFQH (SEQ ID HO:181)
S-4 RASQSVSSKLA iSEQ ID КС:9) GASTPAT (SEQ ID BO:29) Q2FRVLPPT (SEQ ID NO:44) YTFTGYYMH (SEQ ID NO:12«) WINPNSGGTNYACKFQ 3 (SEQ ID NO:150) ARGGPQIR’.’AEYFQH (SEQ ID BO:181)
S-5 RSSQSLLHSHGYNYLD (SEQ ID NO:10} LGSNRAS (SEQ ID no :3S) MQVSTEPPT (SEQ ID ri YTFTGYYMH (SEQ ID NO:226) STHPHSGGTBYAQKFQG (SEQ ID 110:251.1 ARRHRSSTYGMDV (SEQ ID NO:182)
S-6 RA3QSV5SKLA (SEO ID NO:9) GASTRAT (SEQ ID NO:29) QTVAITYPAT (SEQ ID BO:«) YTFT3YY1® (SEQ ID NO:126) SIKPESGSTITYAGXFGG (SEQ ID NO:151) ARGVGSTv”2AYYYYSMIV (SEQ ID l»:183)
S-7 RASQSVRSSYLA (SEQ ID NO:6) GASSRAT (SEQ ID BO:26) ISLSSSPRT (SEQ ID NO:47) YTFT5YGTS (SEQ ID NO:127) 52Ξ AYH GNTIIYA1X2 2 S (SEQ ID NO:152) ARCP3GGTITHYTI GMT” (SEQ ID NO:184)
S-8 RASQ5V55SF2A (SEQ ID NO:11) GA33RAT (SEQ ID NO:26) QQAKWPYT (SEQ ID MO:«) YTFT3YG25 (SEQ ID NO:127) SISAYNGNTHYAGEIGG (SEQ^ I D NO:152) ARCGGHDSPTTYYYYEGMDV (SEQ ID NO:185)
S-9 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO:9) GASTRAT (SEQ ID NO:29) QQYNIYPLT (SEQ ID NO:49) nnSYGIS (SEQ ID NO:127) И1SAYNGNTNYAQKLQG (SEQ ID NO:153) ARDPGGYGPTLYYYYGMDV (SEQ ID NO:186)
S-10 RASQSVSSNLA (SEQ ID BO: 9) GASTRAT (SEQ ID NO:29) cqyatkpptt (SEQ ID NO:50) YTFTSYGIS (SEQ ID NO:127) KISAYMGUTNYA2X2QG (SEQ ID NO:153) ARDPGGYGPTLYYYYGMDV (SEQ ID ЯО:1Вв)
S-22 RASQSVSSNLA (SEQ ID RO:9) GASTRAT (SEQ ID HO:29) QQYNHBPPT (SEQ IS NO:52) YTFTSYGIS (SEQ ID NO:127) WISAYNGNTNYAQKLQG (SEQ IB NO:153) ARDLPKYWSWFDP (SEQ IB NO:188)
S-24 BASQSISSYLN (SEQ ID NO: 7) GASSLQS (SEQ ID NO:31) QQHYVGPFT (SEQ ID NO:54) YTFTSYYMS (SEQ ID NO:129) IIHPSGGST SYAQKFQG (SEQ IB NO:155) ARDPSGIAAAGPASRYYYGMDV (SEQ ID NO:190)
- 109 043015
S-15 RASQSVSSKLA (SEQ ID HO:9) GASTBAT (SEQ ID no:2 91 QQARC.GFWT (SEQ ID KD:55) YTFCSIYMS (SEQ ID NO:129) ICUP3 GGST5 IAGKFCG (SEQ ID NO:1551 ARDPSGIAAAGPASRYYYGMDV (SEQ ID NO:190)
s-ιβ RA3QGC5SWLA (SEQ ID NO:12) AASN1C5 (SEQ ID NO:32) QQGHSYP (SEC ID tG:5cl GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) GICPC FGTWf AQKFQG (SEQ ID NO:156) AR5PYSGTRCFCL (SEQ ID NO:191)
S-18 BASQSVSSYLA (SEQ ID NO:13) DASNRAT (SEQ ID NO:34) CCGA17AEFPT (SEC II 170: 52 1 GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) S11 ₽ IFGT ASYAQKFQG (SEQ ID NO:157) ARDKHGRRGYYYYMDV (SEQ ID NO:193)
3—19 RA3Q3ISSYLN (SEQ ID HO:7) SA5SLQS (SEQ ID NO:35) Q1HSKFPC (SEC ID KO :59) GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) GIIFIFGTAS YAQKFQG (SEQ ID КС :15 3 I ARE SRIPGSGYYYYYGMDV (SEQ ID NO :194)
S-20 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQYDGFECC (SEC IC KO:69) GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO:156) AREGRMSGWYYAYGMCV (SEQ ZD NO:195)
S-21 RASQSISSYLN (SEQIDNO:?) AASSLQS (SEQ ID NO:27) QQKASLPFT (SEQ ID KO :61) GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) S11 ₽ I FGTMYAQgFQG (SEQ ID NO:157) ARERRYDGYYYYYGMDV (SEQ ID NO:196)
S-22 RASQSISSWLA (SEQ ID HO:a) KASSLES (SEQ ID NO:28) GQADSECI (SEC ID NO:62) GTFSSYAIS (SEQ ID NO:130) G11PIFSTAS YA2KFCs (SBQ ID NO:158) ARQGRKTGYYYYYGMDV (SEQ ID NO :197)
5-24 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQVAV5PTT (SEQ ID KO :6-) FTFGDYAMH (SEQ ID NO:133) GISMSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:160) AKPLYRGGPFDI (SEQ ID NO:199)
S-25 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) iSEC CI NO:65) FTFDDYAMH (SEQ ID HO:134) GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:160) AKGVGQVPASVAFDI (SEQ ID NO :200)
S-26 RASQGIDSWLA (SEQ ID NO:16) AASSLQS (SEQ ID NO:27) «SNSLPPIT (SEQ ID --:66) FTFSSYSMN (SEQ ID NO:135) SISS S SS'YIYYADSVKG (SEQ ID NO:161) ARDRLGRGYKWNWFDP (SEQ ID NO:201)
5-28 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MCRLCSFLRC (SEC 11 KO:63) FTFSSYSMN (SEQ ID NO:135) SISSSSNYIYYADSVKG (SEQ ID NO:162) ARGGLDRWGSFDC (SEQ ID NO:203)
5-29 RSSCoLLHSHGIHrLC (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MCRIQGFPRI (SEQ IB NO:69) FTFSSYSMN (SEQ ID NO:135) SISSSSNYIYYADSVKG (SEQ ID KO:162) ARSGLCRK35FCI (SEQ ID NO:203)
S-30 rssqsllhsngynyld (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ I» DC : 3 : MQALGPFCT (SEC II NO :79) FTFSSYAMS (SEQ ID 170:15 6.1 AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID KO:163) ARGDGMDV (SEQ ID NO:204)
S-32 aSSCSILESNGYNYLI (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MQGIETPPT (SEQ ID NO:72) FTFSSYAMS (SEQ ID NO:136) AISASGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO :164) AKRGYPGYPAFDI (SEQ ID HO:206)
S-34 RASQ5TSSSF1A (SEQ ZD NO:11) GASSRAT (SEQ ID NO:26) CCYG5PFLT (SEQ ID NO:74) FTFSSYAMS (SEQ ID NO:136) S15G5GG=TYTAD=’.m (SEQ ID NO:165) AKTGGTYGMDV (SEQ ID NO:208)
S-39 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID HO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MQAIQGPIT (SEQ ID NO:79) FTFSSSAMS (SEQ ID NO:137) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:1€3) AKPLSSTGGGNI (SEQ ID NO:213)
S-40 RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:13) DASNRAT (SEQ ID NO:34) «ЖЗАЬРЕТ (SEQ ID NO:80) FTFSSYAMS (SEQ ID NO:136) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO :163) AREVMARARTYGMBV (SEQ ID ЯО:214)
S-42 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQALRSPLT (SEQ ID NO:82) FTFSNYAMS (SEQ ID NO:138) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID AKLYQGTPDFDL (SEQ ID »:216)
S-43 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQLGSHPPT (SEQ ID NO:83) FTFSSYAMS (SEQ ID NO:136) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:163) AKVGGMYDGGVYYYGMDV (SEQ ID NO:217)
S-44 RASQSVRSSYLA (SEQ ID NO:6) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQLDSSPIT (SEQ ID NO:84) FTFSTYAMS (SEQ ID NO:139) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID KO :163) AKTPSSIYAAGMDV (SEQ ID NO:218)
S-45 RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) GASSRAT (SEQ ID HO :26) QQSGSVPPIT (SEQ ID HO:35) FTFSSYAMS (SEQ ID 110:13 61 ATSGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID HO :1631 ARVRGYGGSNYFDY (SEQ ID NO:219)
S-48 RAS CSVS SULA (SEQ ID NO:9) SASTRAT (SEQ ID NO:37) QCYNSWPCT (SEQ ID NO:88) FCFSSYGMH (SEQ ID NO:140) VISIDGSKKvvADSVKG (SEQ ID NO:166) AAESGDRACLVYYYIYGMCV (SEQ ID NO:222)
S-49 RASQSVRSSYLA (SEQ ID NO:6) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQAGDYPPT (SEQ ID NO:89) FTFSSYGMH (SEQ ID NO:140) VI5YDG5HKIYAD3VKG (SEQ ID NO:166) ARDRGGYSSLLPYYYYMDV (SEQ ID NO:223)
S-50 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MQALERPPT (SEQ ID NO:90) FTFSSYGMH (SEQ ID NO:140) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO:166) ARDAYEGRVDV (SEQ ID NO:224)
S-51 RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:13) DASKRAT (SEQ ID NO:33) QQRSNYPIT (SEQ ID NO:91) FTFSSYGMH (SEQ ID NO:140) •’сзтсзснсттас·:” (SEQ ID NO:166) AZGLEIH S SRL’C YE 11ITMCV (SEQ ID HO:225)
S-55 RASQGISRWLA (SEQ ID NO:21) AASSLQS (SEQ ID NO:27) QQANALPT (SEQ ID NO:95) YSISSGYWG (SEQ ID NO:142) SIYBSGSTYYSPSLKS (SEQ ID NO :169) ARGRPELGWDJCYFQH (SEQ ID HO:229)
- 110 043015
S-57 RASQSVSSSYLA (SEO ID HO:14) GASSRAT (SEQ ID NO:26) EQYGGSPIT (SEQ ID HO:97) YSISSGYYWG (SEQ ID NO:142) SIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ IB NO:1€9) ARGPLKFYYGSGSYGFFDY (SEQ ID NO:231)
S-58 :rasosvsshla (SEQ ID NO:9) GASTRAT (SEQ ID HO:29) QQDRKGPLT (SEQ ID ИЗ:9S) YSISSGYYWG (SEQ ID I7C :142) SIYHSGNTYYNPSLKS (SEQ ID :' : И - 1 ARGPPELeKMYFQH (SEQ ID 110:232)
S-59 RASQSVSSSYLA (SEO ID HO:14) GASSRAL (SEQ ID NO:.26) QQEGRLPFIT (SEQ ID NO:99) :5I55SYWG (SEQ ID NO:142) 5ΙΥ-:53ΝΐϊϊΚΡ=ΙΧ3 (SEQ ID KO:171) ARGPEiLGariFCH (SEQ ID BO:232)
S-60 R3S Q SILnSK S'lNUD (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) H2QCETPLT (SEQ ID NO:10G) ISLSSGxlfKG (SEQ ZD NO:142) TIYHSGSTrYtZPSLKS (SEQ ID NO:170) ARQGSIKQGYYGMLV (SEQ ID HO:233)
S-61 RASQSVSSNLA (SEQ ID HO: 9) GASTRAT (SEQ ID NO:29) QEYLNYPIT (SEQ ID NOilOl) YSISSGYYWG (SEQ ID NO:142) SIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:169) ARGSPRFYYGSGSYLDLFDI (SEQ ID NO:234)
S-63 RASQSVSSSFLA (SEQ ID NO:11) GASSRAT (SEQ ID NO:26) QQLGIAPIT (SEQ ID NO:103) YSISSGYYWG (SEQ ID NO:142) SIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:169) ARAEHRGPRYFDL (SEQ ID NO:236)
S-64 RAS25INSILN (SEQ ID NO:15) AASSLQS (SEQ ID NO:27) QQLI3IPLT (SEQ ID NO:1Q4) YSISSSURG (SEQ ID NO:142) 511“3 3 SIIINP S LS3 (SEQ ID HO:169) ARAEHRGPRYFLL (SEQ ID NO:236)
S-65 RSSQSLLBSHOYireLD (SEQ ID 10:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:30) MOARDGPIT (SEQ ID BO:105) YSISSGYYWG (SEQ ID NO:142) SIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:169) AREGQLPTGTFDY (SEQ IO NO:237)
S-66 RAS2LL55WLA (SEQ ID NO:22) AASSLQS (SEQ ID NO:27) EIADSLFEIT (SEQ ID KO :19 6) GSI5SGG7YW5 (SEQ ID IIO :1--4 1 YLYYSS5TVYKPSLK3 (SEQ ID КС:1^2) ARDVGRISPI-iYYGMDV (SEQ ID HO:238)
S-67 RS525LLH5KG7NYLI (SEQ ID NO:10) LGSNRAS (SEQ ID NO:38) MQRLEAPLL (SEQ ID HO:107) GSISSGGYYW5 (SEQ ID NO:144) SIYYSGSTIYKPSLKS (SEQ ID NO:173) ARLHSBYSVLYBGMDV (SEQ ID NO:239)
S-69 RA5QSV5SSLA (SEQ ID NO:20) GASTRAT (SEQ ID NO :.29) qqaadwpit (SEQ ID NO:109) GSISSGGYYWS (SEQ ID NO:144) YIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:175) ARDRGGTHFGADHYYYGMDV (SEQ ID NO:241)
S-71 RASQSVSSSYLA ISE! 11 HC :-.4( GASSRAT (SEQ ID ЯО :.26) QQAASSPTT (SEQ ID 110:111) 3SZ33G^i'^3 (SEQ ID NO:144) YIYYSGSTVYNPSLKS (SEQ ID NO:172) ARLPGYPLGLFDI (SEQ ID NO:243)
S-72 BASQGISSWLA (SEQ ID NO:12) AASSLQS (SEQ ID NO:32) QQAPSVPPIT (SEQ ID 110:112) GSISSGTYYWS (SEQ ID NO:145) YIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:175) ARDRGRTESYYYWDV (SEQ ID NO:244)
S-75 RASQSVSSYLA (SEQ ID NO :13) 'EASKRM (SEC IB NO:34) QQASVYPPIT (SEQ ID NO :113) GSISSGTYMS (SEQ ID N0:145) YIYYSGSTYYNP SLKS (SEC IB NO:175) AS.GVG3YR7AE’i (SEQ ID HO:M5i
S-74 RASQSVSSYLA (SEQ ID TO:13) DSSNRAT (SEQ ID KO:39) QQETNMPPIT (□BQ ID NO :114) GSISSGTYVWS (SEQ ID N0:145) YIYYSGSTYYNPSLKS (3EQ IE N0:17S) ARGVGttYRTAIM (SEQ ID NO:245i
S-75 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO : 9) SASTRM (SEC ID NO:37) qqynalprt (SEQ ID NO:115) GSISSGGYYWS (SEQ ID NO :144) KIYISGSTYWPSLKE (SEC ID NO:174) АлЗлЗИЗРКВУТТУЗМВО (SEQ ID NO:2461
S-76 RASQSISSFLN (SEQ ID HO:24) AASSLQS (SEQ ID NO:27) QQSYRSPIT (SEQ ID N0:U6) GSISSGGYYWS (SEQ IB NO:144) a IYYSGSTVYNPSLKS (SEQ ID NO:173) ARGVGIQQQLVLGFDP (SEQ ID NO:2471
S-78 KS SQSVLYS SNNKNYLA (SEQ ID NO :25) SASTRES (SEQ ID NO:36) QQ7ANAPIT (SEQ ID NO:118) GSISSSDYYWG (SEQ ID ЯО:147) SIYYSGSTYTNPSLKS (SEQ ID NO :173) ARSLAMSGAYFDL (SEQ ID NO :249)
S-81 RSSQSLLHSNGVNYLD (SEQ ID HO :10) LGSNRAS (SEQ ID no:30) MQALB7PLI (SEQ ID NO:121) GSISSSSYWG (SEQ ID NO:148) = IYI=GSTYIIIPSLK3 (SEQ ID NO:17’) ARERsCLGrOMCV (SEQ ID NO:2521
S-82 BASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:14) gashrai (SEQ ID NO:26) QQSHVSPWT (SEQ ID NO:122) GSZScSDxiWG (SEQ ID NO:147) SIYSSSSTYWPSLKS (SEC IE NO :173) ARGVGSGYSYGTRYEDY (SEQ ID NO:2531
S-83 RASQSVSSNLA ( 3EO ID BO; Э J GASTRAT (SEQ ID NO:24) QQYNATFPT (SEQ ID WO :123) GSZ5555Y!WG (SEQ ID «:14Я) = L735GSTYIITPSLK= (SEQ IE ИО:173) MBSFTWbMDWMW (ЖО IO ЖЭ :25^1
S-84 RSSCSLLHSNGITIYID (SEQ ID NO:10) LASKRAS (SEC ID NO:4O) MQAIDTPPT (SEQ ID NO:124) GSISS5SYWG (SEQ ID so: MB) SISYSGSTYWPSLKS (SEC IB NO :177) ARGGITWL7AD7 (SEQ IB NO:2551
S-85 BASQSVSSSFLA (SEQ ID NO:11) GASSRAT (SEQ ID NO:26) FQi.ASSPYI (SEQ ID NO:125) VS~TSsWIG (SEQ ID SO:149) II7EGESETIx5E£FZS (SEQ ID NO :178) U.SAGRYSISIHZAAFII (SEQ ID NO:2561
- Ill 043015
Таблица 2
Каркасные последовательности легких цепей антител против сортилина по EU и Kabat
Антитело *И!Я······
S-1 21VLT15P3TL3L3?GSaAT1SC (SEQ IB КТО: 2571 HYQCKP C-QAERLZ1 Y (SS£ ZZ NC:2€9) GZPZLFSGSGSGTZFTZTZSRLEPSZFAVYYC (SEQ IB NO:276) FGGGTiB’ElK (3ΞΖ IL FC:l=3i
3-2 DIQMTQSP5 SL3ASVGDaVTITC (SEQ ID HO:258) WYQQKPGKAIKLLIY (SEQ ID NO:270) GYP 3KFSG3G3GTDFTLT13 3LQPEDFATYYC (SEQ ID NO:277) ΓΘ33Τί7.=ΞΙΚ (522 IT HO:2=5.
S-3 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:259) WYQQKPGKAPKLLTY (SEQ IB NO:270) GVPSRFSGSGSGTEFT LT13S LQPDDFATYYC (SEQ ID NO:278) FGGGTKVETK (SEQ ID NO:283)
S-4 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID HO:260) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GZPARFSSSGSGTEFTLTZSSLZSEDFAVYYC (SEO ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEO ID NO:283)
S-5 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID №:261j KHQKPGQSPLLLIY (SEQ ID NO:271) GVPDRF S S S S3 GTD FT LKI3RVEΑΞDV37Y YD (SEZ DD ПС:2=:) 13537:^1=: (SEQ ID NO:283)
S-6 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ IB NO:260) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GZPARES GE GS STEFT L T Z S S L Q=E Γ ПТ” 0 (SEQ ID HD:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
5-7 EIVLTQSPGTLS L SPGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO :269) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S—8 EIVLTQSFOILSbS PGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID HO:269) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID BO:276) FGGGTKVEIK (521 11 NC:2=3.
S-9 EIVMTQS PATLSVS PGERATLSC (SEQ ID 110:261 I WYQQKP3QAPRL17Y (SEQ ID NS:269'i GZPARFSGSGSGTEFTLTZSSLQSEEFA'.=YYC (SEI ZD US :27 = ) FGGGTKVEIK (320 ID NO:223>
S-1O EIVMTQ5PATDSV3PSERATDSC (SEQ ID NO:260) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO :269) GDPARFSGSGSGTEFTLTZSSLQSEDFAV'xYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKV2TZ (SEQ ID NO:283)
S-12 EIVLTQS PATLSVSPGERATLSC (SEQ ID BO:262) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GTPARFS5535GTEFTLTD35LQSEDFA'xYC (SEC DD ПС:27=1 FGGGTKVEIK (322 ID NO:223'·
3-14 D1QMTC5PS3L3A5VGD9.VT1TC (SEQ IB NO:258) WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:270) GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
5-15 EIVMTQS PATLSVS PGERATLSC (SEQ ID NO:260) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GDPARF3G3G3GTEFTLTD33LDSEDFA’7YYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-16 DIQMTQS P S SVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:263) WYQQKPGKAPKLLTY (SEQ IO NO:270) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (323 DD i:e :277 1 FGGGTKVEIK (SEQ ID ЯО:283)
S-18 EIVLTQSPATLSLS PGERATLSC (SEQ DD NO:264) KYZDKP5QAPRLLDY (SET ZD 170:269) GDPARFSGSGSGTDFTLTDSSLEPEDFA'TYYC (SEC DD 170:251) FGGGTKVEIK 1321 ID 170:223.
S-19 E DGMTIS PS SL SA3VGD5VTDIC (SEQ ID NO:258) WYCQKPGKAPKLLZY (SEQ IB NO:270) GVPSRFSGSGSGTDFTLTDSSLCPEBFATYYC (SEQ ID NO:277) FGGGTXVEIK (SEQ ID NO:283)
S-20 EIVMTQS PGTLS LSPGERATLSC (SEQ DD 110:2651 WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO :269) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (322 DD HO :276) FGGGTKVEIK (527 ID 170:223)
5-21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:258) WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:270) GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 3LQPEDFATYYC (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
5-22 DDQMTQSP5TD3A5V3DS.-ZTDTD (SEQ ID NO:259) WYQZKPGXAPXLLZY (SEQ ID NO :270) GVP5RF3G5G5GTEFTLTD55L1PDDFATYYC (SEQ ID HO:278) ΡΟΞΟυΟΓΕΙΧ (SEQ ID ЯО:283)
S-24 EIVLTQS PGTLSLS PGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NG :269) GIPMFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (321 DD № :2761 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-25 EIVLTQSPGTLS LSPGERATLSC (SEQ ID NO:257) KYQQXP3QAPRLLIY (SEQ IB NO :269) GDPD5FSG3GSGTDFTLTDSRDEPEDFA7YYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-26 DIQMTQSPS SVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:263) WYQQKPSKAPKLLZY (SEQ ID NO:270) SVP3RF3G3S3GDDFTLTD3SLQ₽EDFATY1C (SEQ ID NO:277j FGSGTS^IK (SEQ ID NO:283)
S-28 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO:261) WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ IB NO:271) GVPDRFSGSGSGTDFT»! SRVEAE'DTCVYYC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-29 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO:261) WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO:271) GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:233)
S-30 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO:261) WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO :271) GD’PDRFSGSGSGTDFTLKDSR’.'EAEDVGTTYC izEl 11 Hl :1®: FGGGTKVEIK =il ::
S-32 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO:261) WYLZKFD2SPQLLZF (SEQ DD HO:272i GVPDRFSGSGSGTDFTLKDSRVEAE DVG^YC (SEQ ID HO:2BO) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-34 EIVLTQSPSTLSLSPSERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPERFSGSGSGTDFDLTISRLEPEDFA^YC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-39 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NO:261) ятщквеазравык (SEQ ID NO:272) GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC (SEQ ID MO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID »0:283)
S-40 EIVWQS₽ATLSI.SPGERATI.SC (SEQ DD NC:266) WYQQKPGQAPRLLIY (SET ZD № :2691 SI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFWYYC (BED DD NC:28D) FGGGTKVEIK (3SC
3-42 ETVLTQSPGTLSISPSERATLSC (SEQ ID NO:257) WYGQKF GCAPRLLDY (SEQ ID NO:269) GDPDRFSGSGSGTDFTLTDSRLEPEDFA’^’YC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
5-43 EDVLTDSPGTLSDSPGERATLSC (SEQ ID BO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GDFDRFSG3G3GTDFTLTD3RLE₽EDFAVYY0 (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
5-44 EIVLTQS PGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPttRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID 80:283)
S-45 EIVLTQS PGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID BO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID »0:269) GIPDRFSGSGSGT DFT LTISRLEPEDFAVYYC (SEQ IO HO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID 110:283)
S-48 EIVMTQS PATLSVS PGERATLSC (SEQ ID NO:260) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID KO:269) GDPARF5G5GS3T2FTLTTS3L132DFAVYTD (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
3-49 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
3-50 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NG:261) WYLQKPGQ3PQLLIY (SEQ ID NO:271) GVPDRF5GSGSGTDFTLKI3RVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID ЯО:2ВЗ)
3-51 ETVLTQSPATDSLSPGERATDSC (SEQ ID NC:264) К x QQKPGQAP RIL ZY (SEQ ID NO :269) SIPARTSG 3GSG TDFTLT13 SL2P22FAVYxC (S2Q IT NO:281) FGGGTKVEIK (SEC IT КС :253)
S-55 D 1 QMS DSPS 5VSASVGDRVT 1T C (SEQ ID NO:263) WxQQKFGKAPKLL Zr (SEQ ID NO:270) GVPSRFSGSGS3TDFTLTDS5LQP2DFATYYD (SEQ ID NO:277) FG3GT5O.=E1K (SEQ ID NO:283)
3-57 EI VLTQS PGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
8-58 EIVLTQS PATLSVSPGERATLSC (5EQ ID NO:262) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ TO NO:269) GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
3-59 EI VLTQSPGTLS LSPGERATLSC WYQQKPGQAPRLLIY GIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYC FGGGTKVEIK
- 112 043015
(3EQ 12 MG :257) (SEQ 12 KC:26=) (SEQ 12 110:27 61 (SEQ 12 110:2 = 3)
S-60 2 1 VMT’Q 5 FL 31 PVT P GE PAS ISC (SEQ ID NO:261) WYLQKPGQSFQLLIY (SEQ ID NO:271) GVPDaFSGSGSGTDFTLKISaVEAEDVGVYYD (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO :283)
S-61 EIVMTQSPAT LSVSPGERATLSC (5’0 12 00:260.1 »¥ООКРвОАРКЬЫ ¥ (SEQ ID NG:263 I GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAV¥¥C (SEQ ID №:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID 170:25 = )
S-63 EIVLTQ5FGILSL5PGERATL5C (SEQ ID NO:257) WYQQKPGCAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GlFZrtFSGSSSGTDFTLTISRLEFETFAVYYC (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ ID HO:283)
S-64 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTIC (SEQ ID NO:258) WYQQKPGKAmbLIY iSEQ ID NC:272) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-6S DIVMTQS PLSDPVT PGE PASISC (SEQ ID ND :261) mbQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO:271) GVPDRFSGSGSCTDFTbKISRVEAE'DVGVYYC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO :283)
S-66 LZCLZOoFSSVoASVGERVTZZC (SEQ ID NO:268) WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:270) GVPSRFSGSGSGTDFTXTISSLQPEDFKWC (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO :283)
Ξ-67 DIVMTQSPLS LPVTPGE PASISC (SEQ ID NO:261) тьакрводвоилт (SEQ ID NO:271) OTP№FSGSGSGTDFTLKISBVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
Ξ-69 EIVMTQS PATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO:260) »¥ООКР6ОАРК1.Ы¥ (SEQ ID NO:269) GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAlZYYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-71 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID M0:269j GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEFEDFATYYI: (SEQ ID NO:276) FGGGTKVEIK (SEQ 12 K0:2=31
S-72 DIQMTQSPSSVSASVGORVTIic (SEQ 22 NC:265) W¥QQKPGKAPKLLIY (SEQ ID KO:270) GVFSRFSG5G5GTDFTLT1SSLQPE2FAIYYC (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-73 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:264) KYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPARF5GSG5GTDFTLTI5SLEFEDFAVYYC (SEQ ID NO:281) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:283)
S-74 EIVMTQSMCTLSLSPGEBATI.SC (SEQ ID NO:266) ВГСХЖРвСЖРЖЬЫТ (SEQ ID NG :269) GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:281) FGGGTKVEIK (SEQ 12 HC:2=3)
S-75 Ξ ZVMT QS PAT L SV5PS3 PAT13 C (SEQ ID NO :265) WYQQKP SQAPRLlI¥ (SEQ ID NG :269) GIPARF3GSG3GTEFTZT1SSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO;283)
S-76 D Z GMT C S FSS L SASVGDRVT Z T 0 (SEQ ID NO:258) WYQQKPGKAPKLL1S (SEQ ID NO:274) GVF3RF5GSG53ZEFTLTIS3LQPE2FATYYZ (SEQ ID NO:277) FGGGTKVEIK iSEQ 11 11:15=:
S-78 DIVMTQSPDSLAVSLGERATliJC (SEQ ID NO :267) WYQQKPSQPPKLLIY (SEQ 12 NG :2731 GVFDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ 12 »0:2=21 FGGGTKVEIK (SEQ ID HC:2==)
S-81 2 :ж Q S P L S L PVT P GE P AS Z S C (SEQ ID NO:261) WYLQKPGQSPQVLDY (SEQ ID NO:275) G3PDRFSGSGSGTDFT1K1SRVEADDVG'.T7YC (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ ID BO:283)
S-82 EIVLTQSPjTLSISPGERATISC (SEQ ID 110:257) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:269) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYG (SBQ IO NO :276) FGGGTKVEIK (SEQ 12 NO :2 = 3 J
S-83 EIVLTQSPAT LSVSPGERATLSC (SEQ ID NO :262) WY CQ KPGQAPALLIY (SEQ ID NO:269) GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO:279) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO :283)
S-84 DIVMTQSPDSLPVTPGEPASISC (SEQ ID NG :261) K' ----· iSEQ ID KG :2711 GVPDRF5G5GSGTDFT1KI3RVTAEDVGVY¥C (SEQ ID NO:280) FGGGTKVEIK (SEQ 12 110:2551
S-85 EIVLTQSPGTLSLSFGEAATLSC (SEQ 12 KO :257) WYDDKPGCAPRLLIY (SEQ 12 NS :269) GIPlRFSGSG3GTDFTLZlSRLEPE2FA-¥2 (SEC 22 N2:276) FGGGTK^IE (SEC ZE N0:2S3j
Таблица 3
Каркасные последовательности тяжелых цепей антител против сортилина по EU и Kabat
Антитело
S-1 QVQ LVQ 3 GAEVKKPGAS TVS 2 KAS G (SEQ 12 KO :254) WVRQAPGQGLEWMG (SEQ 72 NO:296) V i<2 KOT 31S 2 ΑΥΜΞ 2 3 IL AS 2 2 2 AVY Y1 (SEQ 22 NO: SC-2) WC-QGTZTTV53 (3EQ 72 NO:5111
S-2 QTQLVQSGAEVKKPGASVKVSDKASG (SEQ ID KC:l=4j WRQAESQGLEftT-G (SEQ 12 110:296) avzic azz 3 Z S 2ΑΥΝΞ L 5IL as 21TAVYY7 (SEQ ZL № :51-2) W0-QGT7VTV53 (5EQ 71 »2:5111
S-3 Q7 Q LV QS GAELTKKFGAS Τ?Ύ5 2 KAS G (SEQ 22 RD :2841 WV?QAPGQG7.EKMG (SEQ 12 NO:296) aioca 2 2313 2 ayme l з azas 2 eta-iy yc (SEC 12 NO :3021 WC-QGTLVTV5S (SEQ 72 N0:312i
S-4 QVQ LVQSGAEVKKP GA5VKVS QKA3G (SEQ 12 KS:2S4) r.^QAPGQGLEK-G (SEQ ID NO:296) avri-.T az 3 : S 2 Α ΥΜΞ 2 512 as 2 E 2 AVY Y c (SEC 11 NO :51-21 WGQGZLVTV5S (5SQ IT NO :3121
S-S 27 2 LVC 3 GAEIGCKFGAS’.TT’S 2 KAS G (SEQ ID 110:284) WVROAPGOGLEWMG (SEQ ID NO:296) aVTMTRDT SI STAYMEbSllRSDDTAWYC (SEQ ID NO:302) WGOGTTVTVSS (SEQ И ND; 311)
S-6 CVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASG (SEQ ID ИО:284) WVROAPGOGLEWMG (SEQ ID NO:296) WTMIRDT SISTAYMELSRLRSDDT AVYYC (SEQ ID NO:302) BEOGTTVTVSS (SEQ^ ID 1© :311)
Я-7 Q'TQ’ VQ S -5 ~ (SEQ 12 KO :2=4) WVRQS PGQG'.-WMG (SEQ ID NOi296) (SEQ ID NO:303) W-PQRT-’VTV^S (SEQ ID Я0:311)
S-8 ,V2LV„3SiE,„<E„,3,T^^ (SEQ ID SO:284) WyWABGQGLEWMG (SEQ ID NO:296) =0 KT T IT ST S ΖΆΏ-Ε LA 3 LAS 11TAV^’YC (SEQ ID NO:303) WGQGTTVTVSS (SEQ ID ND:311)
S-9 Q’.’Q IV Q S GAS VZZ P GAS VZVS C G (SEQ 12 110:2 = 4) Kl’RQAE GQG1EKMG (SEQ 12 110:2 96) aVTMTTDT ST STATUELRSLRSDDTAVYYC (SEQ ID NO:303) WC-QGTTVTV5S (SEQ ID ND:311)
S-10 QQ IV 2 3 САЗТ T<ZP GAS^ 13XSG (SEQ ZD K:2=4) WWRQABGQGLEW1E (SEQ ID NO:296) 3”Τ1-.ΤΤ1737ΒΖΑ¥1Ε1Α=17 32ΓΤΑ^ΎΤ€ (SEQ ID NO:303) WCQGT7VTVSS (SEQ ID ND:311)
S-12 Q7Q LTQ 3 GA31CKV3 CKTiS G ίΖΞΙ Z7 71:1:41 (SEQ ID NO:296) RWETTBr ST STMMSLRS LRSDDT W¥Y C (SEQ ID NO:303) W^eQGTWTVSS (SEQ ID ND:312)
S 11 QV 2IV Q E G ΑΞ’ΤΖΓ GAS ’T’S G KASS (SEQ 12 KO: KVTQAIG 2G1ZW1K (SEQ ID NO:296) ?νντΤ:7Α1ΤΞΤ£Τ7Τ^Ξ1561ΑΞΕΕΤΑν¥Ύ1 (SEQ ID NO: WCQCTTVTVGS (SEQ ID ND: 311)
S IS QV Q LVQ Ξ Г G AS VKVS G KAS G (SEQ 12 K0:2=4) WVTQABC QGlEKMG (SEQ ID NO:296) BVTKTRDTSTSTV¥MELSSI.llSEDTAVr¥C (SEQ ID »0:304) WCQGTTVTVSS (SEQ ID ND:311)
s-ie QV Q LVQ 3 ЭАЕ VKKF SI JΤΞΤ. 1 KAO 3 (SEQ 12 KO :28 = ) WraQMGQGLEWMS (SEQ ID NO:296) RVT IT ADE ST ST AYMEDS S bRSEDT AWYC (SEQ ID SO:305) WGRGTLVTV5 S (SEQ IB ND:314)
5-15 QVQ LV Q 3 SAE VSKPGS 31DT/S СКАЗ G (SEQ 12 KO:25=1 WRQAPSQSLEiflS (SEQ ID NO:296) BVT IT ADE ST STAYMEDS SbRSEOTAVYTC (SEQ ID NO:305) WGKGTTVTV55 (SEQ ID KD:315)
5-1“ QVQDVQSGAEWKPGSSVWSCKASG WVRQABGQGIEWMG BVT IT ADE ST STAYMEDS SbRSEUTAVYTC WGQGTTVTV55
- 113 043015
(SEQ ID Ж»:2Я5) (SEQ ID NO:296) (SEQ ID NO:305) (SEQ ID NO:311)
д-20 r 3--:2 233.22 (SEC IE NO :2 = 5) NVAQAPGCGLDNMG (SEC ID NC:296| .-.’.tddaddgdcta’.:!LL_’ll:-._'eddav.-.-'j (EEQ DD KO:3051 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-21 ITO LVS S 3ΑΣ VKKPG5 S TOTO CKASG (SEC IE N0:2=5j WVRQAPSQGbEWMG (SEQ ID NO:296) RVTLDADESTSTAYNELSSLRSEDDAVEYQ (SEQ IB NO:305) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-22 ITOLV2 s GAETOKP GS STOVE CKA3G (SEC IL NG :235) WRQAPSQGbEWMG (SEQ ID NO:296) RVT IT ABE ST ST ΑΤΜΕ LSSLSSE DTAVYYC (SEQ IB NO:305) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-24 ZVCΙΤΞ 3SS SLVC₽ 3R5 LRLΞCAASG (SEC IE WTOOAPSKGLEKTO (SEQ ID NO:295) ЯFTISRDNAKNS LYLQMNSLSAEDTALYTC (SEQ IB NO:307) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
Ξ-25 ETOLTO5GSSLV2PGRSL?.LSCAA5G (SEC IE NG :287) WVRQAPGKGLEWVS (SEQ IO NO:298) ЯFTISRONAKNSLYLOMNSLSAEDTALYYC (SEQ IB NO:307) WGQGTMVTVSS (3EQ ID NO:313)
S-26 EVCIVE 3 G S GLVKP GG3L= L3CAA=G (SEC IE №:228) WTO CAP GKGLE WS (SEQ ID NO:298} AFT T 3.ADKAKN3 L YL CMN5 L PAD DD AVY Y Z (SEQ ID NO:30«) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-28 ETOLTO 3 GG GLTOPGG3LSI3СААЗ G (SEC IE NO :288) WVTOAPGKGTOWV5 (SEQ ID NO:298) RFTISRDNAKNSLYbQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:306) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-29 EV3 LVE 333SLVKFGG SEALSCAASG (SEC IL NO :228) WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:298) KFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:306) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-30 EVCLLESGGGLVCPGSSLALSCAASG (SEC IE NG :289) WAQAPGKSL-WS (SEC DD Ν0:29=ι RFTD3ADK3K1” LYL QMN3L RADDTAVYYC (SEQ I® NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-32 EVCIIE 5 3G GLVQPGGSLRLSCAASG (SEC IE NO :289) W-Γί QAPAXGLZWS (SEC DD NC:298j RFT15КПЖЗКЯТВ¥ЪОМИ5ЬМЕПТА’ЛГ¥С (SEQ ID NO:308) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-34 EVC LIE 3 G GGLTO F GG SIRL SCAASG (SEQ ID NO:289) VRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:298) RFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-39 EVQLbESGGGbVQPGSSMbSCAASG (SEC II NO :289) WTOQAP 3KSLE W- ’3 (SEQ ID NO:298) BETISRDNSKNTLYbQMNSLaAEDTAVYYC (SEQ IB NO:303) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-40 EVCLLESGGGLVCPGGSLALS7AA3S (SEC IE NO:259) WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:298) RFT ISRDNSKNT LYLQMNS LRAE DTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:3U)
S-42 EVCLLESGGGLTOPGGSLRLSCAASG (SEC II NO :28 91 WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID KO:298) AFTD0BDi:SSTTLYDQMN=L?ADDTAVYYD (SDL DD IIO: = Dil WGRGTLVTVSS (SEQ ID SO:314)
S-43 EVCLIE3 G GSLVCPGGSIALSСААЗ3 (3EQ IE NO:289) WTO. CAP 3KGTO WS (SEQ ID NO:298) BFTI5BnHSWTLYL®eSDRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:303) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-44 EVGLLSSGSGLVCPGSSLRLSOAASG (SEC TO NO:2?9i WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:298) BET I S RDNSKNT L YbOMNSLHAEOTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:3U)
S-45 EVCLLE533GLVCPGG5LAL50AA5G (SEC TO NO :2 8 9) WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:298) RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-48 С V СIVE 3 3 G S’.”' ΰ P GA S1513 2 AA 3 G (SEQ ID NO:29j) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:297) RFTISRDNSKHT LYLQMKSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-49 IVOIVE 3G 3 GWC P G?.3 LA L 3 С AA5 G (SEC TO NO :292) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:297) RFTISRDNSKNTLYMMNSLRAE-DTAVYYC (SEQ ID NO:308) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-50 WQEWSGGGWQPGRSL^ (SEQ ID NO:290) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:297) BFTDSADNS ΧΪΙΤ L YL CMHSLRAEOT AVYYC (SEQ ID NO:30B) WGQGT1WTVS5 (SEQ ID NO:313)
S-51 QVQLVE SGGGWQPGRSLRLSCAAS G (SEQ ID NO:290) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:297) AETIYATPATVLY-^AYLPAYDTAVYY. (SEQ ID NO:308) (SEQ ID NO:315)
S-55 QVQLQESGPGEVKP5ETLSI.TCAV5G (SEC TO HC:291) WIRQPPGKGLBWIG (SEQ ID NO:299) BVTISTOT SKNQFSDKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-57 QVQWESGPGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) итворрсюзьЕшв (SEQ ID NO:299) rvtis vdt s:knqfsdkls SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-58 ОТОЬОЕЗбРбИЖРЗЕТЬЗЬТСАУЗб (SEQ ID NO:291) WISQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-59 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-60 QVQbQESGPGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) WTBQPPGKGLEWIG iSEC DD NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-61 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) WIRQPPGKGLEWIG (EEC TO №2:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ 1П NO:309) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-63 QVQLQESGPGLVKPSETLSbTCWSG (SEQ ID NO:291) WIRQPPGKGLEWIG (SEC DD NC:2991 RVTISVDT soars LKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:314)
S-64 QVQWSePGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) НТО D 5TO T □ KNCF5 L EL □ STD AAD DA’.^ YC (SEQ I» NO:309) WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:314)
S-65 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSG (SEQ ID NO:291) MRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-66 QVQLQESePGLVKFSQTLS'LTCTVSG (SEQ ID NO:292) WIRQH₽G«SLEWIG (SEQ ID NO:300) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-67 QVQLQE SGPGbVKPSQTL S LTCTVSG (SEQ ID NO:292) WDRCHPGKSLEHDG (SEQ DD №:3C'C·) RVTISVDT SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-69 QVQbQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSG (SEQ ID NO:292) WIUdHP^GRGbEWIG (SEC DD NC:30D) RVTISVDT SKNQFSLKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTMVTVSS (SSQ ID NO:313)
S-71 QVQLQESGPGLVKFSQTLSLTCTVSG (SEQ ID NO:292) WDRCHPGK3LENDG (SEQ DD PG:3001 RVTISVDT SMQFSLKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-72 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSG (SEQ ZD NO: 292) WDRQHPGKDLESDG (SEQ DD NC:307) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ IB NO:309) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 311)
S-73 QVQLQESGPGLVKPSQTLΞLTCTVSG (SEQ ID NO:292) KDRQHPGKGLESDG (SEC DD NC:3C<4 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-74 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSG (SEQ ID NO:292) KDAQHPGKGLEXLG (SEQ ID NO:300) RVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-75 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSG (SEQ ID NO:292) WiaQHPGKGLEWIG (SEQ ID NO:300) RVTISTOTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) w&QGTTVTVSg (SEQ ID NO:311)
S-76 отоьаЕзервтекрзотьзистезв (SEQ ID NO:292) WIRQBPGKSbEWIG (SEQ ID NO:300) RVTISVDT SKNQFSLKLS SVTAADTAVYYC (SEQ IB BO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID BO:312)
S-78 QLQLQE SGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO:294) wihqppgkglewig (SEQ ID NO:299) IWTIS VDT SKBQFSLKLSSVTAADTAWYC (SEQ IB NO:309) WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:314)
S-81 QbQbQESGPGbrePSETDSLTOVSe (SEQ ID NO:294) WIRQPPGKGbEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDT SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ IB NO:309) WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:311)
S-82 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO:294) WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:312)
S-83 QLQLQESGPGLTOPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO:294) WIHQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:299) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO:309) WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:315)
S-84 QLQLQESGPGLVKPSET LSLTCTVSG (SEQ ID NO:294) WIRQPPGKGLEKIG (SEQ ID NO:299) j^ISVDTSM0FSWLSSVrMDTAW^ (SEQ ID NO:309) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
S-85 EVQLVQSGAEVKKPGE SLKISCKGSG (SEQ ID NO:295) WVAQUPGKGLEiMS (SEQ ID NO:301) QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYC (SEQ IB NO:310) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:313)
Определение параметров связывания антител к сортилину.
Начальное определение параметров антител против сортилина включало определение их способности связывания сортилина, экспрессируемого на эмбриональных клетках почки человека (293), экспрессирующих либо рекомбинантный сортилин человека (hSort), либо рекомбинантный сортилин мыши (mSort). Клетки собирали, помещали в концентрации 105/мл в 96-луночный планшет, промывали и инкубировали в 100 мкл ФСБ, содержащем 10 мкг/мл Mab и 2% FBS в течение 1 ч на льду. Затем клетки дважды промывали и инкубировали в 100 мкл ФСБ+2% FBS, содержащем 5 мкг/мл вторичного античеловеческого антитела, конъюгированного с PE, в течение 30 мин на льду. Клетки дважды промывали в хо- 114 043015 лодном ФСБ и данные получали с помощью BD FACS Canto. Анализ данных и расчет значений MFI выполняли с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar) версии 10.0.7.
Медианные значения интенсивности флуоресценции (MFI) для типов клеток, связывающихся антителами к сортилину S1-S85, приведены в табл. 4. Связывание сравнивали с исходной линией клеток (293). Результаты в табл. 4 показывают, что S1-S85 специфически связывается с клеточными линиями, сверхэкспрессирующими сортилин человека и мыши на клеточной мембране, но не с контрольными клеточными линиями, которые не экспрессируют сортилин.
Таблица 4 ______Связывание антитела к сортилину с клетками человека и мыши______
Антитело MFI связывания hSort на клетках 293 MFI связывания mSort на клетках 293 MFI связывания с исходными клетками 293
S-1 10019 23720 68
S-2 8427 22413 96
S-3 8863 18775 62
S-4 9124 15696 38
S-5 10566 8817 133
S-6 11089 25632 45
S-7 10657 23714 88
S-8 14184 28089 41
S-9 10272 22166 40
S-10 8661 19377 98
S-11 2286 7064 106
S-12 9759 18830 38
S-13 5439 8692 134
S-14 8008 16531 106
- 115 043015
S-15 8745 17598 34
S-16 6279 1777 131
S-17 2409 2011 74
S-18 9347 21722 46
S-19 11724 28245 107
S-20 9390 23831 129
S-21 9382 22946 109
S-22 8935 23188 52
S-23 6682 8635 65
S-24 4381 10520 63
S-25 8376 5818 68
S-26 9018 20856 77
S-27 4302 9828 82
S-28 8564 21616 123
S-29 9604 21845 131
S-30 9433 19598 108
S-31 6082 9899 69
S-32 7898 4679 107
S-33 5996 4896 95
S-34 6217 8974 101
S-35 5798 5891 52
S-36 6331 8183 36
S-37 5949 4931 41
S-38 4678 11706 82
S-39 8178 8436 66
S-40 7411 2628 68
S-41 6498 963 34
S-42 7153 8247 66
S-43 6950 2016 64
S-44 6510 12288 42
S-45 8812 7788 41
S-46 6363 1459 43
S-47 5639 1785 47
S-48 8145 11921 114
S-49 11561 24088 34
S-50 7628 17540 33
S-51 12196 21931 137
S-52 5652 1380 115
- 116 043015
S-53 4813 1456 136
S-54 6021 12448 52
S-55 9478 21359 46
S-56 6059 4343 39
S-57 9126 20843 97
S-58 7773 15090 52
S-59 7970 14213 111
S-60 7978 858 105
S-61 7476 21797 61
S-62 6534 20619 74
S-63 7689 19361 41
S-64 7932 3672 146
S-65 8072 17890 30
S-66 9010 7452 67
S-67 9129 2563 48
S-68 3872 1886 144
S-69 8585 1893 43
S-70 3544 1141 152
S-71 7505 2472 62
S-72 8992 7746 24
S-73 8073 7673 79
S-74 9207 7296 50
S-75 7131 12415 139
S-76 9680 4175 142
S-77 6224 13030 127
S-78 7117 7931 79
S-79 4294 1308 116
S-80 5110 579 112
S-81 8935 16565 108
S-82 10087 5196 35
S-83 9298 484 77
S-84 9242 15364 105
S-85 8356 20416 69
Изотипный контроль 1 44 43, 6 21
Изотипный контроль 2 38 41, 7 22
Аффинность связывания каждого антитела против сортилина определяли путем измерения их KD методом ForteBio или MSD-SET при комнатной температуре. Измерения аффинности методом ForteBio проводили, как описано раннее (Estepet al., (2013) MAbs 5(2):270-8). Вкратце, измерения аффинности методом ForteBio проводили путем нанесения IgG в режиме онлайн на сенсоры AHQ. Сенсоры уравновешивали в режиме оффлайн в буфере для анализа в течение 30 мин и затем контролировали в режиме онлайн в течение 60 секунд для установления базовой линии. Датчики с загруженными IgG подвергали воздействию 100 нМ антигена в течение 5 мин, затем переносили в буфер для анализа в течение 5 мин для измерения скорости диссоциации. Кинетику анализировали с использованием модели связывания 1:1.
Измерения равновесной аффинности проводили, как описано раннее (Estepet al, (2013) MAbs 5(2): 270-8). Титрования при равновесии сортилина (SET) проводили в ФСБ+0,1% БСА без IgG (PBSF) при постоянной концентрации антигена 50 пМ и инкубировали с от 3- до 5-кратными серийными разведениями антитела, начиная с 10 нМ. Антителами (20 нМ в ФСБ) покрывали стандартные планшеты связывания для MSD-ECL в течение ночи при 4°С или при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем планшеты блокировали в течение 30 мин при встряхивании со скоростью 700 об/мин, после чего проводили три промывки промывочным буфером (PBSF+0,05% Tween 20). Вносили образцы SET и инкубиро
- 117043015 вали на планшетах в течение 150 с при встряхивании со скоростью 700 об/мин с последующей однократной промывкой. Антиген, захваченный на планшете, выявляли с помощью 250 нг/мл маркированного сульфометкой стрептавидина в PBSF путем инкубации на планшете в течение 3 мин. Планшеты три раза промывали промывочным буфером, а затем считывали на приборе MSD Sector Imager 2400 с использованием 1x буфера для считывания T с поверхностно-активным веществом. Процент свободного антигена наносили на график как функцию титрируемого антитела в программе Prism и подбирали квадратное уравнения для получения значения KD. Для повышения производительности использовались роботы для манипуляций с жидкостями во всех экспериментах MSD-SET, включая подготовку образцов SET.
В табл. 5 перечислены значения, отражающие аффинность связывания (KD) антител S1-S85 к слитому белку Fc-сортилина человека (hSort-Fc) и слитому белку Fc-сортилина мыши (mSort-Fc), а также бин, которому они принадлежат. Антитела, которые принадлежат к таким же бинам, конкурируют друг с другом за связывание с сортилином. В табл. 5, N. B. соответствует отсутствию связывание; а P. F. соответствует слабому соответствию кривой.
Таблица 5 ______________Аффинность связывания антител к сортилину______________
Антитело Номер бина IgG KD hSort-Fc (Μ) , авид IgG KD mSort-Fc (Μ) , авид
S-1 3/4 1. 87Ε-08 1. 22Е-08
S-2 1/2 5. 17Ε-10 1. 07Е-09
S-3 3/4 1. 24Ε-08 3. 29Е-09
S-4 3/4 4. 50Ε-09 1. 55Е-09
S-5 4 2. 46Ε-09 Р. F.
S-6 3/4 3. 55Ε-09 1. 21Е-09
S-7 3 4. 20Ε-09 1. 26Е-09
S-8 3. 25Ε-09 1. 09Е-09
S-9 3/4 6. 98Ε-09 2. 16Е-09
S-10 3/4 1. 10Ε-08 2. 29Е-09
S-11 3/4 7. 04Ε-08 3. 63Е-08
S-12 4 9. 35Ε-09 N. В.
S-13 3/4 1. 53Ε-08 N. В.
S-14 3 5. 74Ε-09 2. 74Е-09
S-15 3 2. ЗОЕ-09 1. 40Е-09
S-16 1 3. 80Е-09 N. В.
S-17 1/2 7. 59Е-09 N. В.
S-18 2 4. 75Е-10 2. ЗОЕ-09
S-19 2 8. 43Е-10 7. ЗЗЕ-10
S-20 2 1. OOE-09 9. 57Е-10
S-21 2 1. 87Е-09 2. 80Е-09
S-22 2 9. 90Е-10 1. 12Е-09
S-23 3/4 2. 22Е-08 Р. F.
S-24 4 2. 74Е-08 1. 32Е-08
S-25 4 7. 07Е-09 N. В.
S-26 3/4 2. 88Е-09 6. 81Е-10
S-27 3/4 1. 28Е-08 2. 17Е-08
- 118 043015
S-28 2 2 . 99E-10 1. 25E-09
S-29 2 3. 70E-10 1. 37E-09
S-30 4 1. 55E-09 6. 11E-10
S-31 3/4 1. 17E-08 P . F.
S-32 3/4 9. 39E-09 P . F.
S-33 4 1. 19E-08 P . F.
S-34 4 1. 24E-08 P . F.
S-35 4 9. 87E-09 P . F.
S-36 4 9. 93E-09 P . F.
S-37 4 7 . 69E-09 N . B.
S-38 3/4 1. 32E-08 1. 09E-08
S-39 4 5. 15E-09 1. 83E-08
S-40 4 2. 43E-09 P . F.
S-41 4 6. 51E-09 2 . 38E-08
S-42 4 5. 86E-09 P . F.
S-43 4 1. 13E-08 P . F.
S-44 4 7 . 81E-09 7 . 96E-09
S-45 4 2 . 07E-09 2 . 96E-08
S-46 3/4 4. 31E-09 N . B.
S-47 4 5. 08E-09 2 . 66E-08
S-48 3 4. 96E-09 1. 53E-09
S-49 1. 34E-09 1. 09E-09
S-50 2. 14E-09 1. 92E-09
S-51 3 4 . 12E-09 1. 21E-09
S-52 3/4 7 . 81E-09 4. 03E-08
S-53 1/2 8. 76E-09 2. 29E-08
S-54 3/4 5. 40E-09 2. 48E-09
S-55 3 2. 28E-09 1. 13E-09
S-56 1/2 2. 08E-08 3. 31E-08
S-57 3 2 . 97E-09 1. 62E-09
S-58 3 2 . 59E-09 8 . 00E-10
S-59 3 6. 01E-09 1. 21E-09
S-60 4 9. 97E-10 N . B.
S-61 3 4 . 26E-09 2 . 45E-09
S-62 3/4 1. 16E-08 3. 24E-09
S-63 4 8 . 95E-10 7 . 23E-09
S-64 4 1. 24E-09 2 . 42E-08
S-65 4 2. 92E-09 6. 90E-09
S-66 4 2 . 37E-09 1. 78E-08
- 119 043015
S-67 4 2. 66Е-09 2. 01Е-08
S-68 3/4 2. 26Е-08 Р. F.
S-69 3/4 4. 29Е-09 2. 01Е-08
S-70 3/4 9. 17Е-09 N. В.
S-71 3/4 2. 82Е-09 1. 75Е-08
S-72 4 1. 32Е-09 1. 25Е-08
S-73 3/4 3. ЗЗЕ-09 1. 97Е-08
S-74 3/4 3. 05Е-09 N. В.
S-75 3/4 7. 07Е-09 1. 01Е-08
S-76 4 1. 58Е-09 1. 90Е-08
S-77 3/4 5. 31Е-09 4. ЗЗЕ-09
S-78 4 3. 51Е-09 1. 06Е-08
S-79 3/4 2. 36Е-08 N. В.
S-80 3/4 1. 95Е-08 N. В.
S-81 4 2. 20Е-09 1. 59Е-09
S-82 2 3. 94Е-10 1. 87Е-08
S-83 4 1. 79Е-09 N. В.
S-84 4 4. 40Е-09 N. В.
S-85 3/4 7. 63Е-09 3. 99Е-09
Изотип-ный контроль 1 NA NA
Изотипный контроль 2 NA NA
Пример 2. Картирование эпитопов антител к сортилину.
Антитела к сортилину тестировали на их способность связывать пептиды в виде 15-мера или 25мера, охватывающие весь белок сортилин человека и мыши.
Линейные пептиды в виде 15-мера синтезировали на основе последовательности сортилина человека (SEQ ID NO: 1) с перекрытием длиной 14 остатков. В дополнение к этому, линейные пептиды в виде 25-мера синтезировали на основе последовательности сортилина человека (SEQ ID NO: 1) с перекрытием длиной 24 остатков. Пептиды синтезировали с использованием стандартной Fmoc-химии и снятия защиты с использованием трифторуксусной кислоты с антиоксидантами. Связывание антител к сортилину с каждым из синтезированных пептидов исследовали методом на основе ELISA. В этом анализе пептидные матрицы инкубировали с раствором первичных антител (в течение ночи при 4°C). После промывки пептидные матрицы инкубировали с разведенным 1/1000 конъюгатом антитело-пероксидаза (SBA, № по кат. 2010-05) в течение одного часа при 25°C. После промывки добавляли субстрат пероксидазы 2, 2'азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфоната (ABTS) и 2 мкл/мл 3% H2O2. Через час измеряли образование окрашивания. Развитие окрашивания количественно определяли с помощью камеры с прибором с зарядовой связью (ПЗС) и системы обработки изображений.
Участок соединения сортилина определяли для шести антител против сортилина: S-1, S-8, S-44, S49, S-65 и S-78. Участки связывания перечислены в табл. 6. На фиг. 1 показано схематическое представление сортилина человека, указывая участки связывания шестью антителами против сортилина.
Таблица 6
Участки связывания антител к сортилину
Антитело Участок связывания сортилина Аминокислотный участок из SEQ ID: 1
S-1 623HSTDPEDYED632 (SEQ ID NO: 708) 623-632
S-8 429ITFDQGGRWTHLRKP443 (SEQ ID NO: 709) 429-443
S-44 740CTSNFLSPEK749 (SEQ ID NO: 710) 740-749
S-49 233LSTENGLWVSK243 (SEQ ID NO: 711) 233-243
S-65 175GPENSGK181 (SEQ ID NO: 712) 175-181
S-78 212LPFHPLTQMM221 (SEQ ID NO: 713) 212-221
Как указано в табл. 6, пептид, распознаваемый антителом S-1, соответствует аминокислотным остаткам 623-632 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: HSTDPEDYED (SEQ ID NO: 708). Пептид, распознаваемый антителом S-8, соответствует аминокислотным остаткам 429-443 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: ITFDQGGRWTHLRKP (SEQ ID NO: 709). Пептид, распознаваемый антителом S-44, соответствует аминокислотным остаткам 740-749 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: CTSNFLSPEK (SEQ ID NO: 710). Пептид, распознаваемый антителом S-49, соответствует аминокислотным остаткам 233-243 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: LSTENGLWVSK (SEQ ID NO: 711). Пептид, распозна
- 120 043015 ваемый антителом S-65, соответствует аминокислотным остаткам 175-181 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: GPENSGK (SEQ ID NO: 712). Пептид, распознаваемый антителом S-78, соответствует аминокислотным остаткам 212-221 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: LPFHPLTQMM (SEQ ID NO: 713). Пептиды, связывающиеся каждым антителом, описаны на фиг. 1. Пептид, распознаваемый S-1, показан зеленым цветом, пептид, распознаваемый S-65, показан красным цветом, пептид, распознаваемый S-49, показан синим цветом, пептид, распознаваемый S-78, показан желтым цветом, пептид, распознаваемый S-44, показан розовым цветом, и пептид, распознаваемый S-8, показан фиолетовым цветом.
Пример 3. Определение параметров взаимодействия между сортилином и програнулином.
Введение.
Взаимодействие между сортилином и програнулином характеризовали с использованием анализа ForteBio и поверхностного плазмонного резонанса (например, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287: 43798; и Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222).
Материалы и методы.
Взаимодействие между сортилином (SORT1) и програнулином (PGRN) характеризовали с использованием анализа и поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (см., например, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287: 43798; и Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 12210-12222).
Определение непосредственного связывания програнулина человека или мыши с иммобилизированным сортилином, а также связывание сортилина человека или мыши с иммобилизированным програнулином в присутствие или отсутствие блокирующих антител против сортилина выполняли на приборе Biacore2000 (Biacore, Швеция) с использованием CaHBS в качестве стандартного подвижного буфера (10 мМ HEPES, pH 7, 4, 140 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ EGTA и 0,005% Tween 20).
Биосенсорный чип от Biacore (CM5, № по каталогу BR-1000-14) активировали с использованием способа NHS/EDC, описанного поставщиком, с последующим покрытием сортилином до плотности белка 79 фмоль/мм2 и применяли измерение аффинности нативного програнулинового белка. Регенерацию проточной ячейки после каждого цикла эксперимента определения связывания лигандов осуществляли двумя импульсными введениями по 10 мкл регенерирующего буфера (10 мМ глицин-HCl, pH 4,0, 500 мМ NaCl, 20 мМ ЭДТК и 0,005% Tween 20) и одним введением 0,001% ДСН. Подбор сенсограмм для оценки аффинности выполняли, например, используя BIAevaluation, версия 3.1. После сходных протоколов также проводили иммобилизацию His-програнулина на биосенсорном чипе CM5 с использованием набора для связывания NHS/EDC, в соответствии с инструкциями производителя (Biacore, Швеция), давая сходные плотности иммобилизированого белка на поверхности (~300 фмоль/мм2). Биосенсорный чип с иммобилизированным програнулином также использовали для проверки связывания сортилина в отсутствие или присутствие конкурирующих антител к сортилину.
Конкуренцию лигандов между програнулином и антителами против сортилина сходным образом осуществляли для сортировки эпитопов антител к сортилину, описанной выше в примере 1. Вкратце, конкурентный анализ проводили на системе Forte Bio Octet Red384 (Pall Forte Bio Corporation, г. МенлоПарк, штат Калифорния) с использованием стандартной сортировки в формате сэндвич-анализа. Контрольный IgG против мишени наносили на сенсоры AHQ, а незанятые Fc-связывающие сайты на сенсоре блокировали с помощью нерелевантного человеческого антитела-IgG1. Затем сенсоры подвергали воздействию 100 нМ антигена-мишени с последующим вторым антителом против мишени. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа данных ForteBio 7.0. Дополнительное связывание вторым антителом после связывания с антигеном указывает на незанятый эпитоп (неконкурирующий), в то время как отсутствие связывания указывает на блокирование эпитопа (конкурирующий).
Результаты.
Определение параметров связывания програнулина с сортилином.
Взаимодействия между сортилином и програнулином сначала охарактеризовали с использованием анализа ППР и ELISA. На фиг. 2A показаны данные кинетического анализа связывания PGRN с Hisзахваченным SORT1 с использованием анализа ППР Biacore. Вкратце, сортилин захватывался на сенсорном чипе CM5, на котором было иммобилизировано антитело против His (набор от GE). Програнулин пропускали в буфере для связывания с HBS в различных концентрациях. Подбор сенсограмм для оценки аффинности выполняли, например, используя BIAevaluation, версия 3.1. Результаты указывают, что програнулин человека связывается с сортилином человека с KD равной 14,3 нМ.
Связывание между сортилином и програнулином также подтверждали анализом ELISA. Вкратце, сортилин человека или мыши (R&D Systems) иммобилизировали в течение ночи на планшете для ELISA (2 мкг/мл в ФСБ). Планшеты промывали в промывочном буфере (ФСБ+0,05% TWEEN20) и блокировали в течение одного часа при 37°C с помощью буфера для связывания (ФСБ+1% БСА). Рекомбинантный програнулин человека или мыши (Adipogen) биотинилировали с помощью набора EZ-Link Micro NHSPEG4 от ThermoScientific/ Pierce. Биотинилированный програнулин добавляли в различных концентрациях к иммобилизированному сортилину и инкубировали при КТ в течение 30 мин. Планшеты промыва- 121 043015 ли трижды в промывочном буфере и инкубировали со стрептавидин-HRP (1:200 в буфере для связывания, R&D Systems) в течение 20 мин. Планшеты снова трижды промывали и инкубировали с субстратом
ТМВ до развития окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2N серной кислоты и количественно определяли окрашивание с использованием считывающего устройства для планшетов Biotek
Synergy H1. Данные анализировали и подбирали в программе Prism.
На фиг. 2B показано связывание биотинилированного програнулина человека с иммобилизированым сортилином человека на планшете для ELISA (OD= оптическая плотность), а на фиг. 2C показано связывание биотинилированного програнулина мыши с иммобилизированым сортилином мыши на планшете для ELISA. Результаты указывают, что програнулин человека связывается с сортилином человека с KD равной 14 нМ, а програнулин мыши связывается с сортилином мыши с KD равной 40 нМ.
Анализы конкуренции антител с програнулиновыми пептидами.
На фиг. 3A изображена схема анализа ForteBio для определения способности антител против сортилина связывать сортилин и для количественного определения параметров связывания (т.е. KD). На этой фигуре RU относится к единицам ответа. Типовые результаты показаны с антителом S-14, для которого рассчитанное значение KD составляет 0,8 нМ.
Анализы конкуренции антител с сортилиновыми пептидами.
На фиг. 3B изображено различные схемы конкурентных анализов ForteBio. На левой колонке изображено конкурентный анализ ForteBio с использованием биотинилированных програнулиновых пептидов, связанных на сенсорах SA, и рекомбинантного сортилина человека (мономер) и антител-IgG против сортилина (см. левую колонку; SORT= сортилин, PGRN= програнулин, b=биотинилированный, H= человека, mono=мономерный).
На средней колонке фиг. 3B изображено конкурентный анализ ForteBio с использованием биотинилированного мономерного белка сортилина человека, связанного на сенсорах SA, и нативного полноразмерного програнулина человека и антител против сортилина.
На правой колонке фиг. 3B изображено конкурентный анализ ForteBio с использованием биотинилированного програнулинового белка человека, связанного на сенсорах SA, и сортилиновых мономеров человека и антител против сортилина.
Результаты конкурентных анализов для антител.
На фиг. 4A изображено результаты трех различных анализов ForteBio, изображенных на фиг. 3A и 3B, и показано несколько примеров антител против сортилина, которые блокируют связывание програнулина (PGRN) с сортилином (SORT1).
На левой колонке фиг. 4A показана настройка связывания, описанного на левой колонке фиг. 3B, где пептид PGRN, связывающий SORT1, иммобилизирован на SensorChip. Связывали SORT1, а затем исследовали может ли он связывать испытуемое антитело против сортилина. Антитела, способные связывать сортилин, считали неконкурирующими. Результаты показывают, что антитела S-20 и S-22 являются неконкурирующими, тогда как антитело S-14 является конкурирующим.
На средней колонке фиг. 4A показана настройка связывания, описанного на средней колонке фиг. 3B, где биотинилированный мономер SORT1, иммобилизирован на SensorChip. Связывали полноразмерный белок PGRN, а затем исследовали может ли он связывать испытуемое антитело против сортилина. Антитела, способные связывать сортилин, считали неконкурирующими. Результаты показывают, что антитело S-20 является неконкурирующим, тогда как антитела S-14 и S-22 являются конкурирующими.
На правой колонке фиг. 4A показана настройка связывания, описанного на средней колонке фиг. 3B, где биотинилированный белок PGRN, иммобилизирован на SensorChip. Связывали SORT1, а затем исследовали может ли он связывать испытуемое антитело против сортилина. Антитела, способные связывать сортилин, считали неконкурирующими. Результаты показывают, что антитела S-20 и S-22 являются неконкурирующими, тогда как антитело S-14 является конкурирующим.
Результаты на фиг. 4A, показывают, что не все антитела против сортилина являются конкурирующими и что некоторые, например антитело S-22, может действовать как неконкурирующее в одном или двух форматах, в то же время действуя как конкурирующее в другом(их) формате(ах).
На фиг. 4B показано связывание антител против сортилина (S-5, S-8, S-49, S-60, S-63, S-64, S-72 и S-83) с His-захваченным сортилином (SORT1) с использованием Biacore SPR при pH 6,4 и pH 7,4.
В табл. 7 показаны результаты конкурентных анализов ППР, выполненных с антителами S1-S85. Колонка 2 табл. 7 соответствует анализу, описанному в левой колонке фиг. 3B. Колонка 3 табл. 7 соответствует анализу, описанному в средней колонке фиг. 3B. Колонка 4 табл. 7 соответствует анализу, описанному в правой колонке фиг. 3B. В табл. 7, hPGRN относится к програнулину человека; Да показывает, что антитело блокирует в данном формате, а Нет показывает, что антитело не блокирует в данном формате.
- 122 043015
Таблица 7
Конкурентные анализы ForteBio с антителами
Антитело Конкуренция петида hPGRN ForteBio, Пептидный формат Конкуренция с нативным hPGRN ForteBio, Нативный формат 1 Конкуренция с нативным hPGRN, ForteBio, Нативный формат 2
S-1 Да Да Да
S-2 Нет Нет Нет
S-3 Да Да Да
S-4 Нет Нет Да
S-5 Да Нет Да
S-6 Нет Нет Да
S-7 Нет Нет Нет
S-8 Нет Нет Нет
S-9 Нет Нет Нет
S-10 Да? Да Да
S-11 Нет Да Да
S-12 Да Нет Да
S-13 Да Да Да
S-14 Да Да Да
S-15 Да Нет Да
S-16 Нет Нет Нет
S-17 Нет Нет Нет
S-18 Нет Нет Нет
S-19 Нет Нет Нет
S-20 Нет Нет Нет
S-21 Нет Нет Нет
S-22 Нет Нет Нет
S-23 Да Да Да
S-24 Да Да Да
S-25 Да Нет Да
S-26 Да Нет Да
S-27 Да Нет Да
S-28 Нет Нет Нет
S-29 Нет Нет Нет
S-30 Да Нет Да
S-31 Да Да Да
S-32 Да Да Да
S-33 Да Да Да
S-34 Да Да Да
S-35 Да Да Да
S-36 Да Да Да
- 123 043015
S-37 Да Да Да
S-38 Да Да Да
S-39 Да Да Да
S-40 Да Нет Да
S-41 Да Да Да
S-42 Да Да Да
S-43 Да Да Да
S-44 Да Да Да
S-45 Да? Нет Да
S-46 Да Да Да
S-47 Да Да Да
S-48 Нет Нет Нет
S-49 Нет Нет Нет
S-50 Нет Да Нет
S-51 Нет Нет Нет
S-52 Да Да Да
S-53 Нет Нет Нет
S-54 Да Да Да
S-55 Да Нет Да
S-56 Нет Да Да
S-57 Нет Нет Да
S-58 Нет Нет Да
S-59 Нет Да Да
S-60 Да Нет Да
S-61 Да Да Да
S-62 Да Да Да
S-63 Да Нет Да
S-64 Да Нет Да
S-65 Да Нет Да
S-66 Да Нет Да
S-67 Да Нет Да
S-68 Да Да Да
S-69 Да Нет Да
S-70 Да Да Да
S-71 Да Нет Да
S-72 Да Нет Да
S-73 Да Да Да
S-74 Да Да Да
S-75 Нет Нет Да
S-76 Да Нет Да
S-77 Нет Да Да
S-78 Да Да Да
S-79 Да Да Да
S-80 Да Да Да
S-81 Да Нет Да
S-82 Нет Нет Нет
S-83 Да Нет Да
S-84 Да Да Да
S-85 Да? Да Да
Изотипный контроль 1 Нет Нет Нет
Изотипный контроль 2 N/D N/D N/D
- 124 043015
Пример 4. Определение параметров взаимодействия между сортилином и програнулином с использованием анализов на основе клеток.
Материалы и методы.
Рекомбинантный програнулин человека или мыши (Adipogen) биотинилировали с помощью набора EZ-Link Micro NHS-PEG4 от ThermoScientific/ Pierce в соответствии с инструкциями производителя. Стабильную линию клеток, экспрессирующую полноразмерный немаркированный сортилин человека получали путем вирусной инфекции клеток HEK293T, и проводили положительный отбор с гигиромицином (специальный проект Genscript). Полноразмерный сортилин мыши клонировали в pCMV-ACIRES-GFP (Origene) и клетки HEK293T транзиентно трансфицировали этой плазмидой с использованием Fugene HD (Promega). В качестве контрольных клеток использовали либо исходные клетки HEK293T, либо клетки HEK293T, экспрессирующие полноразмерный SORCS1 человека (клонированный в pCMVAC-IRES-GFP).
Экспрессирующие сортилин клетки или контрольные клетки собирали и промывали в ФСБ. Биотинилированный програнулин человека или мыши добавляли в ФСБ+2% FBS с антитела против сортилина (10 мкг/мл) или без него или контрольными антителами человека с изотипом IgG1 и инкубировали на льду в течение 2 ч. После промывания клеток 3 раза в ФСБ+2% FBS, клетки инкубировали в стрептавидине-АРС (BD Biosciences, 1:100) на льду в течение 30 мин. Затем клетки снова промывали, ресуспендировали в ФСБ+2% FBS и анализировали на проточном цитометре FACSCanto™ (BD Biosciences, Миссисауга, Онтарио, Канада). Связывание PGRN измеряли как медианную интенсивность флуоресценции APC экспрессирующей сортилин популяции клеток.
Результаты.
Связывание програнулина с сортилином.
Анализировали способность биотинилированного програнулина человека (PGRN) или биотинилированного PGRN мыши связываться с сортилином (SORT1) человека или мыши, экспрессированного на поверхности клеткок HEK293T. Биотинилированный програнулин добавляли в возрастающих концентрациях (0 нМ - 100 нМ) к клеткам HEK293T, экспрессирующим сортилин, или контрольным клеткам, а связывание анализировали с использованием FACSCanto™.
На фиг. 5A представлен график FACS, демонстрирующий дозозависимое связывание PGRN человека с рекомбинантным SORT1, экспрессируемым на клетках HEK293T. Как показано на фиг. 5B, PGRN не показывает сильного связывания с контрольными клетками.
На фиг. 5C и 5D показано медианную интенсивность флуоресценции (MFI), отложенную на графике по отношению к концентрации PGRN человека, связывающегося с рекомбинантным сортилином (SORT) человека на клетках HEK293T (фиг. 5C), или PGRN мыши, связывающегося с сортилином (SORT1) мыши, экспрессируемым на клетках HEK293T (фиг. 5D), по сравнению с контрольными клетками, которые не экспрессируют рекомбинантный сортилин. Результаты демонстрируют, что PGRN связывается с сортилином дозозависимым образом.
Сортилиновые антитела, способные блокировать связывание програнулина.
Для исследования того, могут ли антитела против сортилина блокировать связывание програнулина с сортилином, экспрессирующие сортилин клетки инкубировали с 15 нМ биотинилированного програнулин человека или мыши с 67 нМ антител против сортилина. Результаты конкурентного анализа с програнулином на основе клеток показаны в табл. 8. Антитела против сортилина показывают диапазон значений для блокирования програнулина. Антитела S-64, S-63, S-60, S-05, S-49, S-72, S-06, S-76, S-83 и S-65 идентифицировали как самые эффективные антитела для блокирования програнулина.
В табл. 8, hPGRN относится к програнулину человека, mPGRN относится к програнулину мыши, hSort относится к сортилину человека и mSort относится к сортилину мыши.
- 125 043015
Таблица 8
Конкуренция антител в анализе на основе клеток
Антитело Конкуренция с FL hPGRN на экспрессирующих hSort клетках ( % блокирования связывания hPGRN) Конкуренция с FL mPGRN на экспрессирующих mSort клетках ( % блокирования связывания mPGRN)
S-1 57, 05 61, 54
S-2 17, 88 -10, 83
S-3 26, 26 11, 25
S-4 30, 06 11, 06
S-5 81, 22 31, 30
S-6 69, 54 71, 66
S-7 9, 30 N/D
S-8 58, 02 26, 53
S-9 4, 58 -9, 97
S-10 5, 14 -7, 84
S-11 7, 25 N/D
S-12 55, 04 -7, 06
S-13 41, 49 -о, 22
S-14 35, 93 15, 56
S-15 35, 71 23, 87
S-16 29, 17 N/D
S-17 18, 83 N/D
S-18 9, 07 6, 99
S-19 19, 69 10, 60
S-20 11, 74 -5, 70
- 126 043015
S-21 11, 12 -2, 99
S-22 15, 51 -1, 90
S-23 37, 09 15, 56
S-24 28, 41 66, 57
S-25 41, 55 2, 35
S-26 57, 05 75, 88
S-27 18, 35 N/D
S-28 7, 42 5, 72
S-29 11, 32 1, 24
S-30 63, 75 94, 58
S-31 27, 31 N/D
S-32 41, 61 -1, 00
S-33 38, 13 -3, 01
S-34 52, 37 26, 06
S-35 43, 53 6, 03
S-36 45, 14 7, 60
S-37 23, 29 N/D
S-38 26, 50 4586
S-39 52, 00 50, 17
S-40 46, 60 0, 24
S-41 43, 14 -1, 29
S-42 41, 66 27, 39
S-43 52, 86 -7, 75
S-44 37, 39 63, 67
S-45 53, 05 23, 18
S-46 43, 93 -2, 68
S-47 36, 72 -7, 65
S-48 18, 36 -20, 32
S-49 74, 62 -43, 64
S-50 12, 47 -26, 16
S-51 49, 71 -9, 22
S-52 28, 25 N/D
S-53 31, 77 -4, 41
S-54 31, 83 18, 15
S-55 36, 68 8, 32
S-56 19, 77 N/D
S-57 44, 46 37, 02
- 127 043015
S-58 39, 91 18, 13
S-59 30, 64 13, 27
S-60 81, 61 -7, 93
S-61 23, 81 9, 05
S-62 4, 47 -10, 15
S-63 81, 81 15, 90
S-64 82, 11 8, 32
S-65 68, 27 26, 10
S-66 60, 52 7, 75
S-67 54, 12 11, 41
S-68 22, 98 N/D
S-69 67, 10 9, 72
S-70 12, 75 N/D
S-71 55, 05 6, 16
S-72 70, 56 6, 22
S-73 48, 53 3, 86
S-74 61, 72 6, 67
S-75 12, 92 -0, 67
S-76 69, 39 7, 21
S-77 12, 33 23, 35
S-78 45, 95 42, 58
S-79 31, 10 5, 63
S-80 17, 07 N/D
S-81 64, 24 81, 99
S-82 8, 32 N/D
S-83 68, 67 4, 64
S-84 49, 76 9, 22
S-85 46, 41 75, 33
Изотипный контроль 1 -6, 06 1, 73
Изотипный контроль 2 -2, 95 5, 67
Для исследования блокирующей способности наиболее эффективных для блокирования програнулина антител против сортилина, экспрессирующие сортилин клетки HEK293T инкубировали с 15 нМ биотинилированного програнулина человека или мыши вместе с увеличивающимися концентрациями антител против сортилина или контрольных антител. Измеряли медианную интенсивность флуоресценции и подбирали кривые в программе Prism (нелинейная регрессия: log ингибитора по сравнению с эффектом дозы с тремя параметрами) для определения констант блокирования.
На фиг. 6A-6D продемонстрировано, что антитела против сортилина ингибируют дозозависимым способом связывание програнулина человека с сортилином человека, а програнулин мыши с сортилином мыши, экспрессируемых на клетках HEK293T. На фиг. 6A и 6B показано, что антитела S-5, S-60, S-63, S64, S-49, S-8, S-76, S-83, S-6, S-65 и S-72 ингибируют связывание програнулина человека с сортилином человека. На фиг. 6C и 6D показано, что антитела S-1, S-6, S-26, S-30, S-39, S-44, S-24, S-81 и S-85 ингибируют связывание програнулина мыши с сортилином мыши, тогда как антитело S-49 неспособно было ингибировать связывание програнулина мыши с сортилином мыши, но вместо этого увеличивало связывание програнулина с сортилином. Результаты на фиг. 6A-6D указывают, что определенные антитела против сортилина, такие как антитело S-6, способны ингибировать связывание и програнулина человека и програнулин мыши с соответствующим белком сортилином.
На фиг. 6E изображено, что существует непрерывный диапазон способности антител против сортилина блокировать связывание PGRN с сортилином. Антитела против сортилина, которые снижают связывание програнулина с сортилином на 20% или меньше при насыщающей концентрации антител (67 нМ), обозначены неблокирующими програнулин антителами.
В табл. 9 отмечена количественная способность антител против сортилина ингибировать связывание програнулина (PGRN) с сортилином на основе данных, изображенных на фиг. 6. В табл. 9 изображено полумаксимальные концентрации (IC50) блокирования и процент от максимального блокирования сортилина: связывание програнулина указанными антителами против сортилина (при 150 нМ IgG). NT обозначает, что антитела не исследовали.
- 128 043015
Таблица 9
Блокирующие антитела, которые ингибируют взаимодействие PGRN/SORT1
Антитело ICso блокир. Bi о-hPGRN (нМ) % макс . блокир. при 150 нМ Biо-hPGRN ICso блокир. Bio-mPGRN (нМ) Макс . блокир. при 150 нМ Bio-mPGRN
S-83 2, 4 77, 4 NT NT
S-64 2, 6 82, 5 NT NT
S-5 2, 7 78, 5 NT NT
S-63 2, 8 82, 4 NT NT
S-60 3, 2 85, 6 NT NT
S-76 3, 2 79, 2 NT NT
S-6 12, 2 50, 1 7, 7 79, 8
S-72 14, 7 68, 7 NT NT
S-65 36, 2 63, 4 NT NT
S-49 36, 6 82, 3 NT NT
S-8 47, 3 62, 73 NT NT
S-1 NT NT 12, 9 77, 9
S-24 NT NT 12, 1 70, 1
S-26 NT NT 3, 6 80, 6
S-30 NT NT 0, 8 92, 2
S-39 NT NT 28, 2 54, 4
S-44 NT NT 5, 0 73, 0
S-81 NT NT 1, 6 80, 8
S-85 NT NT 1, θ 81, 6
Блокирование програнулина увеличивалось с комбинациями антител к сортилину.
На фиг. 7 показано синергическое влияние комбинаций антител против сортилина, которые блокируют связывание програнулина. Вкратце, клетки HEK293T, экспрессирующие рекомбинантный сортилин человека, инкубировали с 15 нМ биотинилированного програнулина с 67 нМ антител S-49 или S-64, или S-16, вместо с 67 нМ изотипного контрольного антитела или различных комбинаций S-49 или S-64 друг с другом или с S-16 (каждое антитело при 67 нМ). Связанный програнулин выявляли стрептавидином-APC (1:100, BD Biosciences) и количественно определяли, как медианную интенсивность флуоресценции APC. Результаты на фиг. 7 демонстрируют, что блокирование програнулина человека увеличивается в комбинации антител S-49 и S-16, комбинации антител S-64 и S-16 и комбинации антител S-49 и S64, по сравнению с блокирующей програнулин способностью любого из антител самостоятельно. Эти результаты указывают, что комбинации антител против сортилина могут быть более эффективными, чем антитела против сортилина поодиночке.
Экспрессирующие сортилин клетки связывают и поглощают эндоцитозом програнулин.
Для получения результатов, изображенных на фиг. 8, клетки HEK293T, экспрессирующие сортилин или LacZ (контроль), инкубировали с програнулином (PGRN) до 60 мин при 37°C. Наблюдали времязависимое связывание и эндоцитоз PGRN флуоресцентной микроскопией. Рекомбинантный програнулин человека (Adipogen) метили DyLight 650 (Life Technologies, г. Карлбад, штат Калифорния). Клетки транзиентно трансфицировали сортилином человека или lacZ (контроль) и GFP с использованием Fugene, и собирали через 24 ч. GFP экспрессировался либо вторым вектором (Topo3. 3, Invitrogen), либо располагался на том же векторе, разделенном IRES (pCMV6-AC-IRES-GFP, Origene). Полноразмерный сортилин использовали либо немаркированным (Topo3. 3), либо с C-концевым маркером myc (pCMV6-AC-IRESGFP). Затем клетки помещали на предметные стекла с камерой, покрытые поли-1-лизином. Через 4-6 ч клетки промывали бессывороточной средой OptiMem и добавляли 40 нМ програнулина-650 с 10 мкМ сортилинового пропептида в качестве блокатора или без него. Клетки инкубировали при 37°C до 60'. Впоследствии клетки фиксировали в 4% параформальдегида, промывали в ФСБ и визуализировали на флуоресцентном микроскопе Nikon.
На фиг. 8A показано увеличенное связывание и эндоцитоз програнулина с экспрессирующими сортилин клетками при увеличенном времени инкубации, как проанализировано флуоресценцией DyLight650. Наблюдали только пренебрежимо малое связывание програнулина, когда клетки экспрессировали контрольный белок LacZ или когда клетки совместно инкубировали с 10 мкМ блокирующего сортилинового пропептида.
На фиг. 8B-8E изображено анализ FACS, количественно определяющий эндоцитоз програнулина и способность блокирующего сортилинового пропептида ингибировать эндоцитоз програнулина. Флуоресцентно меченый програнулин (PGRN-DyLight650) человека добавляли к сортилину человека (Sort)
- 129 043015 (фиг. 8B) или сортилину мыши (Sort) (фиг. 8C), или контрольным клеткам HEK293T, а количество связанного и поглощенного эндоцитозом програнулина определяли FACS путем измерения медианной интенсивности флуоресценции экспрессирующих сортилин клеток. На фиг. 8D и 8E продемонстрировано количественное определение способности сортилинового пропептида ингибировать эндоцитоз програнулина Sort человека (фиг. 8D) или Sort мыши (фиг. 8E).
Пример 5. Увеличение уровней секретированного програнулина в клетках, обработанных антителами к сортилину.
Увеличение внеклеточных уровней програнулина.
Клетки астроцитомы человека U-251 помещали на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. На следующее утро добавляли блокирующие антитела против сортилина (от S-1 до S-10, S-12, от S-14 до S-16, от S-18 до S-22, от S-24 до S-26, от S-28 до S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, от S-42 до S-45, от S-48 до S-51, S-55, от S-57 до S-61, S-63, S-64, S-65, S-67, S-69, от S-71 to S-76, S-78 и от S-81 до S-85), а также позитивное блокирующее антитело (козла против сортилина человека (gtSort) от R&D Systems, AF3154) и изотипное контрольное антитело (IgG козла (gt), ADI-88 (IgG1 человека) и ADI-89 (IgG1 человека) в конечном разбавлении 50 нМ или 5 нМ, и таким образом инкубировали клетки в течение 72 ч. Затем собирали среду и концентрацию програнулина в образцах среды измеряли с использованием набора ELISA Duoset для програнулина человека.
Как показано на фиг. 9A-9D, блокирование связывания програнулина с сортилином с использованием различных антител против сортилина приводило к 3-кратнму увеличению уровня програнулина, секретируемому в среду клеток U-251. Фиг. 9A и 9C показаны результаты для 50 нМ добавленных антител и фиг. 9B и 9D показаны результаты для 5 нМ добавленных антител. Результаты на фиг. 9A и 9B демонстрируют, что субпопуляция одного класса антител против сортилина, принадлежащего к бинам 3/4 и 4 (включая, например, S-8, S-49 и S-60) не только блокирует связывание програнулина с сортилином, но фактически увеличивает уровень эндогенного програнулина в клетках U-251, которые естественным образом экспрессируют и сортилин и програнулин. Более того, результаты на фиг. 9C и 9D дополнительно демонстрируют, что второй класс антител против сортилина, принадлежащих к бинам 1/2, 2 и 3 (включая, например, S-2, S-14, S-15, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-29, S-51, S-57, S-61 и S-82), которые не блокируют связывание програнулина с сортилином, или только слабо блокируют связывание програнулина с сортилином, тоже способен индуцировать увеличение уровень эндогенного програнулина в клетках U-251.
Уменьшение уровней сортилина на клеточной поверхности.
После инкубирования клеток U-251 с 50 нМ антител против сортилина в течение 72 ч, как описано выше, клетки собирали с помощью трипсина, промывали в ФСБ и маркировали антителом против сортилина S-20 (связывание которого значимо не конкурировало с блокирующими програнулин антителами). После инкубирования клеток с 5 мкг/мл S-20 в течение одного часа на льду, клетки промывали три раза в ФСБ+2% FBS, а затем инкубировали с 5 мкг/мл вторичного антитела против PE человека (Southern Biotech). Затем клетки снова промывали и количественно определяли связывание S-20 с использованием FACSCanto™, как медианную интенсивность флуоресценции PE.
На фиг. 10A показано, что определенные антитела против сортилина снижают уровни сортилина на клеточной поверхности у клеток U-251, с антителами, которые индуцируют самое сильное увеличение секретированного програнулина (например, S-2, S-19 и S-22) также индуцируют самое сильное уменьшение уровней сортилина на клеточной поверхности. Такие антитела, как S-64 и S-5, которые не увеличивают уровни сортилина на клеточной поверхности, были неспособны увеличивать внеклеточные уровни програнулина, несмотря на их способность блокировать связывание програнулина с сортилином, а также, или лучше чем способность блокировать програнулин антител S-49, S-60. На фиг. 10B показано, что определенные антитела против сортилина снижают уровни сортилина на клеточной поверхности у мышиных клеток Neuro-2A (N2A). В общем, антитела, которые снижают уровни сортилина на клеточной поверхности у клеток U-251 человека, также снижают уровни сортилина на клеточной поверхности у мышиных клеток N2A. Эти результаты указывают, что снижение уровней сортилина на клеточной поверхности представляет собой универсальную активность этих антител и, таким образом, антитела также возможно способны снижать уровни сортилина на клеточной поверхности у других типов клеток как in vitro, так и in vivo.
На фиг. 10C и 10D изображено уровни сортилина на клеточной поверхности в клетках U-251, которые инкубировали с другой концентрацией антител против сортилина в течение 72 ч. Антитела против сортилина индуцируют дозозависимое уменьшение в экспрессии сортилина на клеточной поверхности. Уменьшение уровней сортилина отображено уменьшенной интенсивностью флуоресценции (MFI) для антитела S-20, связывающегося с сортилином. На фиг. 10E изображено количественное определение (с использованием анализа ELISA) соответствующих уровней PGRN в среде клеток U-251, которых инкубировали с перечисленными антителами в течение 72 ч. Антитела против сортилина, которые уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности, также вызывают дозозависимое увеличение уровней внеклеточного PGRN.
На фиг. 10F показано, что уровни сортилина на клеточной поверхности сильно и обратимо корре
- 130 043015 лировали с кратностью увеличения внеклеточных уровней програнулина (PGRN). На основе этих результатов, антитела против сортилина, которые уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности, также увеличивают внеклеточные уровни програнулина. Более того, антитела против сортилина, которые уменьшают уровни сортилина на клеточной поверхности и увеличивают внеклеточные уровни програнулина (например, S-49, S-60 и S-8), принадлежат к бинам антител 2, 3, 4 или бинам без категории (табл. 5). Таким образом, результаты показывают, что дополнительные антитела против сортилина, которые принадлежат к таким же бинам, что и антитела S-49, S-60 и S-8 (антитела, которые принадлежат к такому же бину, конкурируют друг с другом за связывание с сортилином), также будут способны снижать уровни сортилина на клеточной поверхности и увеличивать внеклеточные уровни програнулина.
В табл. 10 указаны антитела, которые способны уменьшать уровни сортилина на клеточной поверхности уклеток U-251 человека и/или мышиных клеток N2A и/или увеличивать внеклеточные уровни програнулина. Антитела перечислены в порядке от самой сильной до самой слабой активности. N. T. обозначает, что антитела не исследовали.
Таблица 10 ________________Активности антител против сортилина_________________
Антитело Процент снижения уровней сортилина у клеток U251 Процент снижения уровней сортилина у клеток N2A Кратность увеличения уровней програнулина у клеток U251
S-02 96, 24 65, 95 2, 07
S-19 93, 37 86, 51 1, 64
S-82 92, 95 Ν. Т. 1, 79
S-22 92, 74 87, 68 1, 68
S-29 90, 76 53, 81 1, 50
S-20 89, 54 94, 01 1, 80
S-15 87, 82 76, 08 1, 90
S-18 85, 69 57, 95 1, 44
S-28 85, 00 51, 14 1, 40
S-21 78, 70 71, 88 1, 57
S-57 77, 86 74, 55 1, 79
S-51 75, 92 80, 67 1, 60
S-14 75, 38 58, 54 1, 62
S-55 73, 02 67, 72 1, 45
S-61 70, 33 62, 68 1, 51
S-49 64, 59 56, 74 2, 19
S-60 59, 45 Ν. Т. 2, 24
S-08 55, 82 78, 42 1, 85
S-83 48, 11 Ν. Т. 1, 46
S-45 45, 80 Ν. Т. 1, 35
S-63 45, 03 22, 21 1, 50
S-06 42, 47 45, 14 1, 43
S-72 39, 29 39, 57 1, 51
S-64 37, 43 Ν. Т. 1, 21
S-65 37, 34 Ν. Т. 1, 37
S-66 27, 22 Ν. Т. 1, 19
S-69 23, 04 Ν. Т. 1, 08
- 131 043015
S-74 22, 11 Ν. Т. 1, 18
S-76 20, 32 Ν. Т. 1, 15
S-05 18652 Ν. Т. 1, 18
S-81 18, 23 51, 26 1, 24
S-30 17, 98 35, 16 1, 24
S-26 17, 06 47, 30 1, 32
S-12 12, 01 Ν. Т. 1, 18
S-67 11, 08 Ν. Т. 1, 00
S-44 9, 40 27, 97 1, 08
S-39 9, 31 14, 93 1, 05
S-71 9, 26 Ν. Т. 1, 04
S-43 6, 06 Ν. Т. 1, 03
S-85 4, 92 31, 56 1, 11
S-34 4, 49 Ν. Т. 0, 94
S-01 2, 84 15, 74 1, 15
S-24 0, 35 35, 88 0, 78
Увеличение уровней програнулина в головном мозге мышей.
Мышам Tg2576 возрастом четырнадцать месяцев вливали инфузией (через имплантированные наносы Alzet 1002) в течение двух недель всего 240 мкг антитела козла (gt) против сортилина мыши (R&D Systems, AF2934) или полоклонального антитела-IgG козла (gt), или только буферный раствор aCSF (п=3/группу). Мышей впоследствии умервщляли и головной мозг рассекали на левосторонний и правосторонний гиппокамп, лобную кору и затылочную кору, всего на 6 блоков для каждого животного. Блоки немедленно экстрагировали в N-Per (Thermo Scientific Pierce) или быстро замораживали и впоследствии экстрагировали позже. Для выделения агрегированного пептида Абета42, осадок фракции нерастворимых белков промывали TBSX, ресуспендировали в 70% муравьиной кислоты до 150 мг/мл на основе массы осадка и смешивали путем вращения при комнатной температуре в течение 2 ч с периодическим перемешиванием на вихревой мешалке. Образцы центрифугировали (100000xg, 1 ч при 4°C), а растворимую в муравьиной кислоте фракцию нейтрализовали 20 объемами 1 M основания трис, разлитого по аликвотам и замороженного при -80°C. Во всех экстрактах проводили измерения на содержание белка с использованием BCA (Thermo Scientific Pierce) или спектрофотометрии при A280.
Уровни програнулина мыши измеряли с использованием набора R&D Systems Duoset ELISA. Уровни растворимого и нерастворимого A-бета42 измеряли с использованием набора ELISA от Life Technologies. Уровни в головном мозге антитела козла против сортилина измеряли с использованием специально разработанного анализа ELISA. Вкратце, 2 мкг/мл рекомбинантного сортилина мыши (R&D Systems) в ФСБ связывали с планшетом в течение ночи при 4°C на планшете Immulon для ELISA. На следующий день планшет промывали в ФСБ+0,05% TWEEN20 и блокировали в ФСБ+1% БСА в течение 1 ч при КТ. Добавляли 100 мкл разбавленных образцов и инкубировали в течение 1 ч при КТ. Планшеты промывали и впоследствии инкубировали с 100 мкл антитела против антитела козла для выявления с HRP (1:20000, Jackson Immuno). Планшеты снова промывали и инкубировали с 100 мкл субстрата TMB до развития окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2N серной кислоты и количественно определяли развитие окрашивания с использованием считывающего устройства для планшетов Biotek.
По сравнению с контрольными группами (gt IgG и самостоятельно буферный раствор aCSF) вливание в головной мозг мышей поликлонального антитела козла против сортилина приводило к сильному увеличению уровней програнулина в всех трех животных во всех трех изученных участках головного мозга (фиг. 11A и 11B). Увеличение уровней програнулина было самым сильным в правом полушарии, которое находится с одной стороны с местом влиявания (фиг. 11B). В соответствии с этими результатами уровни антитела против сортилина были самыми высокими в участках головного мозга с той же стороны (гиппокамп > лобная кора > затылочная кора) (фиг. 11C). Когда концентрацию антитела откладывали на графике с уровнями програнулина, наблюдали сильную положительную корреляцию со значением R квадрат 0,92 (фиг. 11D).
На фиг. 11E и 11F показаны уровни пептида A-бета42, измеренные в экстрактах головного мозга с использованием ELISA от Life Technologies. На фиг. 11E показано уровни пептида A-бета42 в нерастворимой, экстрагированной муравьиной кислотой, белковой фракции, а фиг. 11F показано уровни пептида A-бета42 в растворимой белковой фракции. Результаты показывают, что оказывается антитело против сортилина влияет на уровни пептида A-бета42 в нерастворимой, экстрагированной муравьиной кислотой, белковой фракции.
Пример 6. Блокирование связывания pro-NGF с сортилином.
Анализ ППР Biacore T200 применяли для проверки блокирования связывания pro-NGF с сортилином антителами против сортилина S-28, S-5, S-1, S-6, S-65, S-83, S-72, S-8, S-49, S-60, S-63, S-64 и S-76. Данные ППР собирали при 25°С на приборе BiaCore T200 и анализировали с использованием программ- 132 043015 ного обеспечения для оценки BiaCore T200, версия 2.0. Использовали HBS-EP+ (100 мМ HEPES, 1, 5 M
NaCl, 30 мМ ЭДТК, 0,5% об/об поверхностно-активного вещества P20, pH 7,4) в качестве подвижного буфера и для подготовки реактивов.
His-меченый сортилин человека (200 нМ, R&D Systems) захватывали на сенсорном чипе СМ5, иммобилизированном с анти-His IgG мыши (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 0 с). Пропускали pro-NGF человека (400 нМ) или буферный раствор HBS-EP+ через поверхность чипа (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 0 с). Пропускали антитело против сортилина (200 нМ) через поверхность чипа (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 30 с). Поверхность чипа регенерировали между циклами с использованием 10 мМ глицин-HCl, pH 1,7 (время контактирования 75 с, скорость потока 30 мкл/мин, время стабилизации 60 с). Получали результирующий сигнал ППР как разность в ответе от измерений, выполненных на пустой проточной ячейке.
Результаты, показанные на фиг. 12A-12C, демонстрируют, что связывание определенных антител против сортилина с сортилином может частично блокироваться pro-NGF. На фиг. 12A показано экспериментальные настройки. На фиг. 12B показано графики ответа для контрольного антитела (S-28), которое не блокирует програнулин. Связывание S-28 с сортилином не блокируется предварительным инкубированием с pro-NGF. Фиг. 12C показано, что связывание антител против сортилина S-1 и S-65 с сортилином наиболее сильно блокируется связыванием pro-NGF с сортилином (RU=единица ответа).
Пример 7. Определение параметров терапевтического применения блокирующих сортилин антител с использованием достоверных животных моделей травматического повреждения головного мозга.
Терапевтическое применение блокирующих сортилин антител можно исследовать на достоверных животных моделях травматического повреждения головного мозга (Tanaka, Y et al., (2013) Neuroscience 231 49-60).
Например, можно использовать модель травматического повреждения головного мозга, которая вызывает активацию микроглий и астроцитов. Используются самцы мышей C57BL/6J ДТ возрастом восьми или девяти недель, или гетерозиготные по програнулину мыши. Мышей приобретали в Charles River Laboratories или Jackson labs. Мышей анестезируют путем внутрибрюшинного введения гидрохлорида ксилазина (8 мг/кг) и хлоралгидрата (300 мг/кг), растворенного в стерильном физиологическом растворе и затем помещают в стереотаксический аппарат (Narishige, г. Токио, Япония). Производят разрез по скальпу и оголяют череп. С черепа удаляют надкостную плеву, просверливают отверстие над правым полушарием головного мозга с помощью бормашины и твердую мозговую оболочку удаляют концом иглы. Используют катетер из нержавеющей стали с наружным диаметром 0,5 мм для нанесения продольной колотой раны в правом полушарии. Канюлю располагают на 1,3 мм латерально от средней линии и на 1 мм сзади от брегмы, и вводят в мозг до тех пор, пока конец не достигнет глубины 2 мм. Затем канюлю смещают на 2 мм каудально (брегма 3 мм) и затем сдвигают назад рострально на 2 мм в исходное положение. Наконец, канюлю удаляют из мозга и рану скальпа зашивают. Затем мышей лечат блокирующими сортилин антителами в соответствии со стандартными процедурами и затем анализируют гистологически и с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, и поведенческих тестов.
Пример 8. Определение параметров терапевтического применения блокирующих сортилин антител с использованием модели нейровоспалительной болезни Паркинсона и потери нейронов после индуцированного токсином или индуцированного синуклеином повреждения.
Терапевтическое применение блокирующих сортилин антител также можно исследовать на модели нейровоспаления и потери нейронов после индуцированного токсинами повреждения (Martens, LH et al., (2012) The Journal of Clinical Investigation, 122, 3955).
Трехмесячным мышам вводят 4 в. 6. инъекции MPTP в сутки в течение 2 дней (4 мкг/г массы тела) (Sigma-Aldrich) или ФСБ. MPTP разрушает дофаминергические нейроны, что перерастает в болезнь Паркинсона. Мышей лечат блокирующими сортилин антителами в соответствии со стандартными протоколами, а затем анализируют с помощью стереологического подсчета для количественного определения дофаминовых нейронов и микроглий в SNpc. Как описано. В альтернативном варианте можно использовать модели болезни Паркинсона с экспрессией генетических мутаций в гене альфа-синуклеина (A53T, A30P и E46K) или сверхэспрессии альфа-синуклеина (Maguire-Zeiss (2008) Pharmacol Res; 58(5-6): 271280; Chesselet (2008) Exp Neurol 209: 22-27).
Пример 9. Определение параметров терапевтического применения блокирующих сортилин антител с использованием животных моделей старения, эпилептических припадков, повреждения спинного мозга, дистрофии сетчатки, лобно-височной деменции и болезни Альцгеймера.
Терапевтическое применение блокирующих сортилин антител также можно исследовать на животных моделях старения, эпилептических припадков, повреждения спинного мозга, дистрофии сетчатки, лобно-височной деменции и болезни Альцгеймера, как описано раннее (например, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al., (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007)
- 133 043015
Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Nykjaer, A et al., (2004)
Nature 427, 843-848; Harrington, AW et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 6226-6230; Teng, HK et al., (2005) J. Neurosci. 25, 5455-5463; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fan, YJ et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2380-2390; Al-Shawi, R et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2103-2114; и Yano, H et al., (2009) J. Neurosci. 29, 14790-14802).
Пример 10. Определение параметров терапевтического применения блокирующих сортилин антител с использованием моделей атеросклероза.
Терапевтическое применение блокирующих сортилин антител можно также исследовать на моделях атеросклероза, как описано раннее (например, Lance, A et al., (2011) Diabetes, 60, 2285; и Kjolby, M et al., (2012) Cell Metabolism 12, 213-223).
Пример 11. Определение параметров терапевтического применения блокирующих сортилин антител с использованием модели инфекции.
Терапевтическое применение блокирующих сортилин антител можно также исследовать на модели инфекции. Например, можно использовать Listeria monocytogenes или другую инфекцию у нормальных или гетерозиготных по програнулину мышей, как описано ранее (например, Yin, F et al., (2009) J. Exp. Med, 207, 117-128).
Пример 12. Защита от EAE и купризона интактного животного in vivo.
Взрослым самкам мышей C57BL/6 в возрасте 7-9 недель (полученным от Charles River Laboratories) вводят в основание хвоста с обоих сторон 200 мкл инокулята, содержащего 100 мкг миелинового пептида гликопротеина олигодендроцитов 35-55 (аминокислоты MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 707); Seqlab) и 1 мг Mycobacterium tuberculosis H37 Ra (Difco) в неполном адъюванте Фрейнда (Difco). Коклюшный токсин (200 нг, List Biological Laboratories) вводят в день 0 и на день 2 после иммунизации. Клинические признаки оценивают следующим образом: 0, отсутствие клинических признаков; 1, полностью поврежденный хвост; 2, полностью поврежденный хвост и ненормальная походка; 3, парапарез одной задней конечности; 4, полный парапарез задних конечностей и 5, паралич или отмирание передних и задних конечностей. Для экспериментов используют мышей только с проявлением заболевания (клинический показатель 1 или более) на день 14. Агонистические антитела против сортилина и/или биспецифические антитела к сортилинувводят внутрибрюшинно или внутривенно мышам, больным EAE, в день первых клинических симптомов или в любое другое желаемое время (PLoS Med (2007) 4(4):e124).
Молодые или взрослые мыши дикого типа (WT) получают стандартную диету (Harlan), содержащую 0,2% купризона (CPZ) порошокообразный оксалат бис(циклогексилиденгидразид) (Sigma-Aldrich) в течение 4,6 или 12 недель. Для гистологического и иммуногистохимического анализов головной мозг удаляют после перфузии мыши 4% параформальдегидом (ПФА), фиксируют в 4% ПФА в течение 24 часов с последующим погружением в 30% сахарозу в течение 24-48 часов. Для оценки целостности и повреждения миелина, а также клеточной пролиферации и секторов воспаления головной мозг мыши окрашивают с помощью антитела к MBP (1:100; Abcam, ab7349), к dMBP (1:2000; Millipore, ab5864), к β APP (1:100, Invitrogen, 51-2700), к SMI-31 (1:1000, Covance, smi-31R), к Iba1 (1:600, Wako, 019-19741), к BrdU (1:250, Abcam, Ab1893), к GFAP (1:200, Invitrogen, 13-0300), к iNOS (1:100, BD Pharmingen, 610329), к LPL (1:400, от Dr. G. Olivecrona) и к MHC II (1:100; BD Pharmingen, 553549). Для определения поведенческого влияния антител мышей анализировали на локомоторную активность с использованием прозрачного ограждения из полистирола и компьютеризированного оборудования с фотодатчиками. Были проанализированы общие переменные активности (общая способность передвигаться, вертикальное вставание на задние конечности), а также показатели эмоциональности, включая проведенное время, пройденное расстояние и вхождения. Ряд сенсомоторных тестов проводится для оценки баланса (планка и платформа), силы (перевернутая решетка), координации (стержень и наклонные экраны) и инициации движения (инициация ходьбы). Координация движения и равновесие изучают с использованием протокола с использованием вращающегося стержня (Cantoni et al., Acta Neuropathol (2015)129(3): 429-47).
Пример 13. Определение параметров терапевтического применения антагонистических или биспецифических антител к сортилину на достоверных животных моделях травматического повреждения головного мозга.
Терапевтическое применение сортилина и/или биспецифических антител к сортилинуисследовали на достоверных животных моделях травматического повреждения головного мозга (Tanaka, Y et al., (2013) Neuroscience 231 49-60). Например, используется модель травматического повреждения головного мозга, которая вызывает активацию микроглий и астроцитов. Используются самцы мыши C57BL/6J WT возрастом восьми или девяти недель, или гетерозиготные по програнулину мыши (приобретенные у Charles River Laboratories или Jackson Laboratories). Мышей анестезируют путем внутрибрюшинного введения гидрохлорида ксилазина (8 мг/кг) и хлоралгидрата (300 мг/кг), растворенного в стерильном физиологическом растворе и затем помещают в стереотаксический аппарат (Narishige, г. Токио, Япония). Производят разрез по скальпу и оголяют череп. С черепа удаляют надкостную плеву, просверливают отверстие над правым полушарием головного мозга с помощью бормашины и твердую мозговую оболочку удаляют концом иглы. Используют катетер из нержавеющей стали с наружным диаметром 0,5 мм для
- 134 043015 нанесения продольной колотой раны в правом полушарии. Канюлю располагают на 1,3 мм латерально от средней линии и на 1 мм сзади от брегмы, и вводят в мозг до тех пор, пока конец не достигает глубины 2 мм. Затем канюлю смещают на 2 мм каудально (брегма 3 мм) и затем сдвигают назад рострально на 2 мм в исходное положение. Наконец, канюлю удаляют из мозга и рану скальпа зашивают. Затем мышей обрабатывают антагонистическими антителами против сортилина и/или биспецифическими антителами к сортилинув соответствии со стандартными процедурами и затем анализируют гистологически и с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, и поведенческих тестов.
Пример 14. Определение параметров терапевтического применения антител к сортилину и/или биспецифических антител к сортилину на модели нейровоспаления и потери нейронов после индуцированного токсином повреждения.
Терапевтическое применение антител к сортилину и/или биспецифических антител к сортилину исследуют на модели нейровоспаления и потери нейронов после индуцированного токсинами повреждения (Martens, LH et al., (2012) The Journal of Clinical Investigation, 122, 3955). Трехмесячным мышам вводят 4 внутрибрюшинные инъекции MPTP (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) в сутки в течение 2 дней (4 мкг/г массы тела) (Sigma-Aldrich) или ФСБ. Мышей обрабатывают агонистическими антителами против сортилина и/или биспецифическими антителами к сортилинув соответствии со стандартными протоколами, а затем анализируют с помощью стереологического подсчета для количественного определения дофаминовых нейронов и микроглий в компактной части черного вещества (SNpc), как описано.
Пример 15. Анализ способности антител против сортилина стимулировать жизнеспособность врожденных иммунных клеток и/или нейронов.
Макрофаги, полученные из костного мозга мышей дикого типа (WT), культивировали в присутствие М-КСФ, или культуры нервных клеток в стандартных условиях подвергали воздействию антитела к сортилину и измеряли жизнеспособность клеток. Макрофаги, выделенные из костного мозга мышей WT и KO, высевали на необработанные для культивирования тканей 96-луночные планшеты, предварительно покрытые либо антителами против сортилина, либо контрольными антителами. Клетки культивировали в течение 48 часов в присутствие 10 нг/мл М-КСФ. Анализ жизнеспособности проводили с использованием набора Cell Titer Glo (Promega). Планшеты считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов BioTek Synergy с использованием программного обеспечения GEN5 2.04.
Пример 16. Анализ противоинсультного эффекта антител к сортилину.
Временная окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) -модель, которая является очень похожей на человеческий инсульт и используется для индукции ишемического инсульта у мышей. Хирургическую мононить (70SPRe, Doccol Corp, США) вводят во внутреннюю сонную артерию через разрез правой общей сонной артерии. Среднюю мозговую артерию окклюдируют в течение 30 мин с интервалом времени реперфузии (6 часов, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 7 дней и 28 дней). Влияние хирургического вмешательства контролируют с использованием контрольных животных через 12 ч и на 7 день. Контрольные животные подвергаются той же хирургической процедуре, но без окклюзии средней мозговой артерии. Животные с MCAO лечат агонистическими антителами против сортилина или контрольными антителами и исследуют на инфарктную волюметрию, острый воспалительный ответ (12 ч реперфузии), транскрипцию провоспалительных цитокинов TNFa, IL-1a и IL-1b, активность микроглий (CD68, Iba1), транскрипцию хемокинов CCL2 (МХБ1), CCL3 (MIP1a) и рецептора хемокина CX3CR1, и инвазию CD3позитивных T-клеток (Sieber et al. (2013) PLoS ONE 8(1): e52982).
Пример 17. Анализ влияния антител против сортилина на болезнь Альцгеймера.
Для оценки способности антител против сортилина замедлять, предотвращать или способствовать регрессии развития болезни Альцгеймера (AD), использовали мышей 5X FAD. Мыши 5X FAD сверхэкспрессируют мутантный APP человека (695) вместе со шведской (K670N, M671L), флоридской (I716V) и лондонской (V717I) мутациями наследственной болезни Альцгеймера (FAD) вместе с PS1 человека, несущей две FAD-мутации, M146L и L286V. Оба трансгена регулируются промотором Thy1 мыши для направления сверхэкспрессии на мозг и повторения основных особенностей AD. Мыши, получавшие агонистические антитела против сортилина или контрольные антитела, исследовали на нагрузку бляшками A-бета с помощью иммуногистохимии и ELISA тканевых экстрактов. Их дополнительно исследовали на количество микроглий в головном мозге и на уменьшение когнитивного дефицита с использованием водного лабиринта Морриса, пространственного обучения и задач на память, радиального водного рукавного лабиринта, пространственного обучения и задач на память, Y-лабиринта (количественно определяет спонтанное чередование как меру восприятия пространства), предпочтения новизны в тесте открытое поле, оперантного научения для оценки обучения и памяти и условно-рефлекторного замирания (вебсайт mousebiology. org; Wang et al., (2015) Cell, pii: S0092-8674 (15) 00127-0).
Пример 18. Анализ защитного эффекта антител к сортилину при заживлении ран.
Для оценки способности антител против сортилина улучшать заживление ран толстой кишки после травмы, использовали мышиную модель биопсийного повреждения в толстой кишке. В этой модели эндоскоп с внешней операционной оболочкой вставляется в среднюю нисходящую ободочную кишку, а слизистая оболочка обследуется до аноректального перехода. Затем одну полнослойная площадь всей слизистой и подслизистой оболочек удаляют с помощью гибких биопсийных щипцов с диаметром 3 по
- 135 043015 французской шкале диаметров, избегая при этом проникновения в мышечную оболочку. Каждая мышь получила биопсийное повреждение в 3-5 участках вдоль дорсальной стороны толстой кишки (см., например, Seno H, 2008, Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6; 106(1):256-261). Когорты мышей лечили антителами к сортилину через 2 или 3 дня после биопсийного повреждения. Мыши отслеживаются каждый день в течение 15 дней для проверки потери веса и заживление ран путем измерения площади поверхности повреждений.
Пример 19. Анализ защитного эффекта антител к сортилину при заживлении ран.
Антагонистические антитела против сортилина уменьшают накопление и/или функционирование воспалительных макрофагов и, как следствие, замедляют, предупреждают и/или лечат возрастную макулярную дегенерацию (AMD). AMD является дегенеративным заболеванием наружной сетчатки. Считается, что воспаление, особенно воспалительные цитокины и макрофаги, способствуют прогрессированию заболевания AMD. Наличие макрофагов в непосредственной близости от очагов AMD документировали в друзах, мембране Бруха, сосудистой оболочке глаза и сетчатке. Макрофаги выделяют тканевой фактор (ТФ) и фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), который запускает образование новых кровеносных сосудов у пациентов, показывающих хориоидальную неоваскуляризацию.
Тип макрофагов, присутствующих в макулярной сосудистой оболочке глаза, изменяется с возрастом, демонстрируя повышенные уровни макрофагов M2 в глазах пожилых людей по сравнению с глазами более молодых людей. Тем не менее, у прогрессирующей AMD желтого пятна имелись более высокие отношения M1 к M2 по сравнению с обычными аутопсированными глазами аналогичного возраста. (см., например, Cao X et al, (2011), Pathol Int 61(9): pp528-35). Это предполагает связь между классической активизацией макрофагов M1 в глазу при позднем проявлении прогрессирования AMD.
Клетки-микроглии сетчатки представляют собой резидентные тканевые макрофаги, которые также обычно присутствуют во внутренней сетчатке. В случае повреждения микроглия может быть активирована и действовать как медиатор воспаления. Активированная микроглия была обнаружена в образцах тканей AMD и была предложена в качестве одного из потенциальных участников процесса воспаления, которые приводят к патогенезу AMD (Gupta et al., (2003) Exp Eye Res., 76(4):463-71). Способность антагонистических антител к сортилину предотвращать, замедлять или способствовать регрессии развития AMD исследуют на одной или более моделях AMD (см., например, Pennesi et al., (2012) Mol Aspects Med.; 33(4): 487-509).
Общие воспалительные макрофаги (или M1 и/или активированная микроглия) документируют как такие, которые коррелируют с прогрессированием заболевания AMD и поэтому представляют собой терапевтическую мишень для антагонистических антител к сортилину. Подобная терапевтическая польза может быть достигнута при глаукоме и генетических формах дегенерации сетчатки, таких как пигментный ретинит.
Способность антител против сортилина предотвращать, замедлять или способствовать регрессии развития дегенерацию ганглионарных клеток сетчатки при глаукоме исследуют на модели глаукомы (см., например, El-Danaf et al., (2015). J Neurosci. 11; 35(6): 2329-43; Demetriadeset al., (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54: Abstract 4940). Аналогичным образом исследуют терапевтическую пользу антител против сортилина в генетически индуцированной дегенерации сетчатки и пигментном ретините, как описано в Chiang et al., (2002) Vision Res.; 42(4): 517-25, и в Gargin et al, (2007) J Comp Neurol. 500(2): 222-238; и в Retinal Degeneration Rat Model Resource Availability of P23H and S334 the Mutant Rhodopsin Transgenic Rats and RCS Inbred and RCS Congenic Strains of Rats, MM LaVail, June 30, 2011. Аналогичным образом исследуют терапевтическую пользу антител против сортилина на индуцированных вирусами или токсинами моделях хондроидальной и ретинальной неоваскуляризации, как описано в Hans et al., (2010) Prog Retin Eye Res.; 29(6): 500-519. Конечные точки таких исследований включают электроретинографию и визуализацию дна глаза, оптическую когерентную томографию, а также гистопатологический анализ.
Пример 20. Определение параметров терапевтического применения антител к сортилину и/или биспецифических антител к сортилину на модели инфекции.
Терапевтическое применение агонистических антител против сортилина и/или биспецифических антител к сортилину исследуют на модели инфекции. Например, можно использовать Listeria monocytogenes или другую инфекцию у нормальных мышей или гетерозиготных по програнулину мышей, как описано ранее (например, Yin, F et al., (2009) J. Exp. Med, 207, 117-128).
Пример 21. Определение параметров терапевтического применения антител к сортилину и/или биспецифических антител к сортилину на модели воспалительных заболеваний и патологии костей.
Терапевтическое применение антител против сортилина и/или биспецифических антител к сортилину исследуют на модели воспалительных заболеваний. Например, ревматоидный артрит или достоверная модель другого воспалительного заболевания (Mizoguchi (2012) Prog Mol Biol Transl Sci., 105: 263320; and Asquith et al., (2009) Eur J Immunol. 39: 2040-4). В альтернативном варианте антитела против сортилина и/или биспецифические антитела к сортилину исследуют на модели дегенерации межпозвонковых дисков (IVD) (Zhao, PY et al., (2015). SCIENTIFIC REPORTS. 5: 9102).
Пример 22. Скрининг на антитела против сортилина и/или биспецифические антитела к сортилину,
- 136 043015 которые способствуют выживаемости остеокластов, микроглий и/или нейронов.
Клетки-предшественники из мышиного костного мозга получали путем промывки клеток тибиальных и феморальных клеток костного мозга холодным ФСБ. После одной промывки с помощью ФСБ эритроциты лизировали с использованием лизирующего буфера АСК (Lonza), дважды промывали с помощью ФСБ и суспендировали при 0,5х106 клеток/мл в полной среде RPMI (10% FCS, пен/стреп, Gln, neAA) с указанными количествами 50 нг/мл М-КСФ для получения макрофагов или 10 нг/мл ГМ-КСФ. Для макрофагов типа M2 к культивируемым клеткам добавляли 10 нг/мл IL-4. Для макрофагов типа Ml к культивируемым клеткам добавляли 50 нг/мл IFN-γ. В некоторых экспериментах на день 5 к культуре клеток добавляли LPS или зимозан в диапазоне концентраций 1 мкг/мл - 0,01 нг/мл. Рекомбинантные цитокины приобретали у Peprotech. Для анализа жизнеспособности макрофагов, полученных из BM, клетки указанного генотипа получали, как описано выше, и культивировали в ступенчато изменяющихся концентрациях МКСФ. Клетки высевали в количестве 105/200 мкл в 96-луночный планшет (для анализа жизнеспособности с использованием анализа на основе люциферазы) или в количестве 0,5х106/1 мл в 6луночный планшет (для подсчета методом исключения с помощью трипанового синего) на необработанных для культивирования тканей планшетах. На день 3 добавляли среду, содержащую свежий М-КСФ. В указанные моменты времени клетки осторожно снимают с планшетов с помощью 3 мМ ЭДТК и подсчитывали, используя камеру Бюркера. В некоторых экспериментах клетки также окрашивали для FACSанализа с использованием антител к CD11b и DAP1. В альтернативном варианте клетки непосредственно инкубируют с реагентом ToxGlo (Promega) и определяли люциферазную активность. В некоторых экспериментах из культуральной среды на день 5 удаляли или не удаляли МКСФ и жизнеспособность клеток анализировали через 36 часов анализом FACS.
Зрелые клеточные культуры остеокластов дифференцируют в 24-луночных чашках с RANKL и МКСФ. Через 4 дня полную среду заменяют бессывороточной средой для индукции апоптоза. Клетки, обработанные RANKL, ФСБ и антителом против сортилина и/или биспецифическим антителом к сортилину или изотипически сходным контрольным антителом во время ночного сывороточного голодания. Клетки фиксируют в 1% параформальдегиде и окрашивают набором на основе TUNEL (Millipore Corporation) в соответствии с инструкциями производителя. Апоптотические ядра подсчитывают с помощью микроскопа Nikon TE2000-E с увеличением 20х. Результаты выражают как процент апоптических клеток относительно общего количества клеток в шести случайно выбранных полях двух лунок, как описано (например, Peng et al., (2010) Sci Signal., 3(122): ra38). Аналогичные анализы проводят с первичными микроглиальными клетками.
Пример 23. Продуцирование, идентификация и определение параметров аффинно зрелых антител против сортилина.
Материалы и методы.
Скрининг сортилиновых антител.
Антитела против сортилина S-2, S-15, S-22, S-60 и S-82 (называемые исходными антителами) были аффинно зрелыми. Вкратце, создавали диверсифицированные библиотеки антител в дрожжах для каждого из начальных исходных антител. Разнообразие создавали путем использования стандартных методик молекулярного клонирования для объединения исходного CDR-H3 тяжелой цепи и легкой цепи (LC) с существующим генетическим разнообразием в участках CDR-H1 и CDR-H2 тяжелой цепи (HC) (называется оптимизация H1/H2). Это привело к получению шести библиотек приблизительно размером 108, которые были готовы для отбора из антител с улучшенной аффинностью. Для скрининга библиотек, использовали виды давления отбора, включавшие антигенное равновесное титрование сортилином человека и мыши, конкурентные кинетические анализы для Fab исходного антитела и применение делеселекции с полиспецифическим реагентом (как описано, например, в WO 2014/179363; Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol. 26(10), p. 663-670). Затем применяли проточную цитометрию с FACS для визуализации и отбора антител, с использованием стандартных методик (см., например, Chao et al. Nature Protocols, 2006). Затем требуемую популяцию проводили через дополнительные раунды отбора. Через 6 раундов обогащения высевали дрожжи с целью получения изолятов одного антитела, которое затем продуцировали и характеризовали как описано в примере 1. Таким образом получили пятьдесят антител с улучшенной аффинностью из каждого из шести начальных исходных антител.
Для второго раунда созревания аффинности выбирали три клона исходных антител: 1) S-60, так как первый раунд созревания аффинности не дал ни одного клона со значительно улучшенной аффинностью; 2) клон S-15-6 афинно зрелого антитела и 3) клон S-15-10 аффинно зрелого антитела. Афинно зрелые клоны отобрали для второго раунда созревания аффинности, так как отличия в аффинности и функционировании этих клонов не сильно улучшились после первого раунда созревания. Для второго раунда созревания аффинности оптимизировали как последовательности вариабельного участка (VH) тяжелой цепи, так и вариабельного участка (VK) легкой цепи, с частичными фокусированием на CDR-H3.
Продукция и очистка IgG и Fab антител.
Дрожжевые клоны выращивали до насыщения и затем индуцировали в течение 48 ч при 30°C при встряхивании. После индукции дрожжевые клетки осаждали и супернатанты собирали для очистки. Им- 137 043015 муноглобулины очищали с использованием колонки с белком A и элюировали уксусной кислотой, pH
2,0. Фрагменты Fab получали с помощью расщепления папаином и очищали на аффинной матрице CaptureSelect IgG-CH1 (LifeTechnologies).
Определение аффинности.
Аффинность антител против сортилина определяли путем измерения их KD методом ForteBio и MSD. Измерения аффинности методом ForteBio проводили при комнатной температуре, в целом как описано ранее (Estepet al., MAbs. 2013 Mar-Apr; 5(2): 270-8). Вкратце, измерения аффинности методом ForteBio проводили путем нанесения иммуноглобулинов (IgG) в режиме онлайн на сенсоры AHQ. Сенсоры уравновешивали в режиме оффлайн в буфере для анализа в течение 30 мин и затем контролировали в режиме онлайн в течение 60 секунд для установления базовой линии. Для измерения авидного связывания сенсоры с нанесенными IgG подвергали воздействию 100 нМ антигена (слияние Fc-сортилина человека или мыши) в течение 3 мин, после чего их переносили в буфер для анализа в течение 3 мин для измерения скорости диссоциации. Дополнительное авидное связывание определяли нанесением биотинилированного мономера сортилина на сенсоры SA и воздействием в растворе ~100 нМ IgG. Получали результаты моновалентного связывания нанесением слитых антигенов Fc-сортилина человека или мыши на сенсор AHQ с последующим воздействием ~100 нМ Fab антитела к сортилину. Проводили дополнительные моновалентные измерения нанесением биотинилированного мономера сортилина человека или мыши на сенсор SA с последующим воздействием ~100 нМ Fab в растворе. Кинетические данные подбирали с использованием модели связывания 1:1 в программном обеспечении для анализа данных, предоставленным ForteBio.
Для измерений значений MSD-SET KD проводили титрования при равновесии сортилина (SET) в ФСБ+0,1% БСА без IgG (PBSF) с рекомбинантным сортилином человека или мыши, получали константу при 100 пМ и инкубировали с от 3- до 5-кратными серийными разведениями антитела, начиная с около 50 нМ. Антителами (20 нМ в ФСБ) покрывали стандартные планшеты связывания для MSD-ECL в течение ночи при 4°C или при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем планшеты блокировали 1% БСА в течение 30 мин при встряхивании со скоростью 700 об/мин, после чего проводили три промывки промывочным буфером (PBSF+0,05% Tween 20). Вносили образцы SET и инкубировали на планшетах в течение 150 с при встряхивании со скоростью 700 об/мин с последующей однократной промывкой. Антиген, захваченный на планшете, выявляли с помощью 250 нг/мл маркированного сульфометкой стрептавидина в PBSF путем инкубации на планшете в течение 3 мин. Планшеты три раза промывали промывочным буфером, а затем считывали на приборе MSD Sector Imager 2400 с использованием 1х буфера для считывания T с поверхностно-активным веществом. Процент свободного антигена наносили на график как функцию титрируемого антитела в программе Prism и подбирали квадратное уравнения для получения значения KD. Для повышения производительности использовались роботы для манипуляций с жидкостями во всех экспериментах MSD-SET, включая подготовку образцов SET.
Измерения аффинности связывания клеток выполняли при 4° с использованием клеток HEK293T либо транзиентно трансфицированных сортилином мыши, либо стабильно экспрессирующих сортилин человека. Вкратце, собирали клетки, промывали в ФСБ и инкубировали с количеством антитела, близким к KD антитела (KD парентерального введения для связывания сортилином человека: S2=1,1 нМ, S15=3,3 нМ, S22=2,4 нМ, S60=1,0 нМ, S82=1,4 нМ; Kd для связывания с сортилином мыши: S2=6,6 нМ, S15=6,4 нМ, S22=5,0 нМ). Антитела разбавляли в буфере для FACS (ФСБ+2% FBS + 0,01% азид Na). После инкубации на льду в течение 1 ч, клетки промывали три раза в буфере для FACS и инкубировали с античеловеческим вторичным антителом конъюгированным с PE (BD Biosciences, разведение 1:100) в течение 30 мин на льду. Затем клетки дважды промывали в 200 мкл буфера для FACS и впоследствии анализировали на FACS Canto или приборе для скрининга iQE FACS (Intellicyt Corp). Для дальнейшего анализа отбирали лучшие три антитела с увеличенным связыванием с сортилином человека и мыши (измеренным как медианная интенсивность флуоресценции PE).
Для определения кажущейся аффинности к экспрессирующим сортилин клеткам добавляли антитела к клеткам в виде титрования 0,16-40 нМ для сортилина человека и 0,39-50 нМ для сортилина мыши и определяли их KD связывания путем нелинейного подбора кривых (модификация OneSiteTotal, Graph Pad Prism).
Выполняли понижение регулирования сортилина в клетках U-251 и N2A, блокирование програнулина (PGRN) на клетках и секретирование PGRN клетками U-251, как описано в примере 5.
Результаты.
Активности антител против сортилина.
Клоны аффинно зрелых антител против сортилина, которые показали улучшенную аффинность по сравнению с соответствующим исходным антителом характеризовали дополнительно. После начального скрининга для дополнительного анализа отбирали все клоны аффинно зрелых антител, клоны для каждого исходного антитела.
Последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи антител.
Используя стандартные методики, были определены аминокислотные последовательности, кодирующие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи отобранных клонов аффинно зрелых анти- 138 043015 тел. Последовательности CDR по EU или Kabat вариантов антитела S-2 указаны в табл. 11, вариантов антитела S-15, указаны в табл. 12, вариантов антитела S-22 указаны в табл. 13, вариантов антитела S-60 указаны в табл. 14 и вариантов антитела S-82 указаны в табл. 15.
Таблица 11
Последовательности CDR вариантов антитела против сортилина S-2 по Kabat (Antibody - Антитело)
Antibody CDR LI CDR L2 CDR L3 CDR Hl CDR B2 CDR H3
S-2 RASQS2SSYLN (SEQ 22 NCOi AASSLQS (SEQ 11 SC :271 QQS2VSP22 (SEQ 22 no :4.-. ΪΤΓΧιΧζϊΧ$ΜΧ4 Xi Z, G, V, P, 2, F, A, R Xi 3, A, :. S Xi Y, M, . . L Xi H :.W (52Q 22 NO: 452t XiXiXsPXiXsSXiCX-YAQK FQG x. :, s X: I, 7,::-.:-2 Xi - K, 3, .. .:: b Xi - N, 3, -.: M Xi - S, 3, w, 0 X« G, F, A, Y, S, N, :,. .· R X- К, R, S, . :.- Μ (SEQ 11 КО: 452) A5GKRSSGXY2GYGM2·.(S2Q 22 NO:2=2)
s-2-2 RA5QS2SSYLK (SEQ 11 NO :7) AASSLQS (Sit :c NO :27) QQS27SP22 (SEQ 22 NO :42) YQFGAYYMH (SEQ 22 КС: 4 = 2) a’2NFNSSFCR:AQXF23 (SEQ 22 КС:493) ARG KP S S3 К Y 2 3 Y SIC*.· (S2Q 11 NO :222)
S-2-2 ?as2s:sssik (SEQ 22 КС :7) AASSLQS (520 22 KO :27) QQS07SP2T (SEQ 22 ::: :42 хееуауумн (SEQ 22 KO: 453) WLNPNSSAER’AQXFQS (SEQ 11 KO :494) ARSKRSSSyiEGYGMEV (82Q 22 NO:2521
S-2-3 RASQS2SSYLK (SEQ 22 KOO) AASSLQS (SEQ 22 NG :2-4 QQSDVSP2T (SEQ 22 KO :42) YTFSAYYMH (SEQ 22 NO: 452) imJPNSGGrAYAQKFQG (SEQ 22 KO :495) ARGKRSS3WY2SYSM2Y (S2Q 22 NO:252)
S-2-4 RASOS2SSYLK (SEQ 22 N0:7i AASSLQS (SEQ 23 КС :27) QQS2VSFC7 (SEQ 22 KO :42) YEFTSY74HH (SEQ 22 КС: 4:4) 223PS33YCSYAQKF03 (SEQ 22 NO :4 90 AR3KRSS3WY23YGM27 iSEG 22 КС:2:21
S-2-S RASQS2SSYLN (SEQ NO :7) AASSLQS (SEQ 22 NO :27Ί QQS2VSP22 (520 22 KO :42) Y2FP3YLMH (SEQ 22 NO: 4551 K2NFVS3S2NYAQKFQ3 (SEQ 22 KO:497) AASKRS S GWYE SY GMEY (SEQ 22 NO:2=2)
3-2-e KASCSCSSYLK (SEQ 12 NG: О AASSLQS (SEQ 22 NG :27) QQS2VSP2C (SEQ 22 NO :42( YCFGΑΧΥΜΗ (SEQ 22 KG: 452j ΓΚ;Ρ№33Υ17'Α0ΚΓ03 (SEQ 22 KG :495/ ARG2<KSS3WYEGY3M~V (SEQ 22 NO :2521
s-2-7 .RASQSZSSYLN (S£C 23 no :7) AASSLQS (SEQ ZZ KO :271 QQS27SP (SEQ 22 NC:42) Y7FLAYYMH (SEQ 22 KG: 450 W2KFKS332AYAQKFQ3 (SEQ 22 NO:499) ARGKRSSGWYEGEGMLV (SEQ 22 NO: 2:0
S-2-2 RASQS1SSYLK (SEQ 12 КОП) AASSLQS (SEQ 22 NO :27) QQS27SP27 (SEQ 22 NO :42) YQFFSYYMH .522 2 2 ::.2 : 42- KLKPSSGKYRYA'QKFGG )52Q 22 KO:502) A=.3XRS5GWY2SYGM2 (SEQ 22 NO:252i
5-2-9 RA5Q52SSYLN (SEQ 22 NOOi _____ (SEQ 22 NO :24 QQS2V5P2C (SEQ 22 NO:421 YCFTAYLMH (SEQ 22 NO: 4 = 0 X2NF5GGSESYAQXFQ3 (S2Q 22 N0:52L) ARGXRSS GWYEGYGMO7 (S2Q 22 K0:25O
S-2-12· RASQS2SSYLN (SEC 11 HCK1 AASSLQS (SEQ 22 KC:27| QQ827SP2~ (SEQ 22 О :42 YEFASYO® (SEQ 12 KO: 4 = 0 32LPSS3ACSYAGKFQ3 (520 22 NG:522) ARGKRSSGWYESYGIC’.(SEQ 22 КО ОSO)
5-2-22 RASQ52SSYLN (SEQ 2“ КС:7 j AASSLQS (SEQ 22 N0:27| QQS2VSP2T (SEQ 22 NG:421 iTFLAYYMH (SEQ 22 KG: 455) KZKPSXGSrSYA-QKFQS (S2Q 22 NO :525) ARGRRSSGKEEGYSMC .(SEQ 22 NO:252i
S-2-12 RASQS2SSYLN {5EQ 11 NG :O AASSLQS (520 11 N0:27j 0QS27SP2T (SEO 11 NG :421 YOFCAYYHH (SEQ 22 NO: 4SO i-T^’PNSSGCMYAQKFQS (SEQ 22- KG :5 241 ARGKRSSGWYEGYGMOV (SEQ 22 NO:252i
S-2-13 RASOSOSSYLN (520 11 КС:7) AASSLQS (SEQ 11 N0:273 QQ32V5P22 (520 22 NO: 40 YQFCGYYMH (SEQ 22 KC:12€i X2KFNS3G2RYAQKFQG (SSQ 22 NO:575! AAGXRS 5GWYEGYGM27 (SEO 22 NO:25 2-)
S-2-14 RASQS2SSYLN (520 11 NO :7) AASSLQS (SEQ 22 WO:27) QQS2VSP22 (SEQ 22 NO:42) Y2F33YL2K-: (SEQ 22 KG: 492» » ONPHSSSEAYAOKFaS (SEQ 11 NO:526) ARGKRSS GWYEGYGM2V (SEQ 22 КС: 1:0
5-2-25 RASQSLSSYLN (520 22 ΝΟ-Οϊ AASSLQS (520 22 ::: :.. QQS275P22 (SEQ 22 NO :42) Y2FRAYYMH (SEQ 11 КС: 492) X2NPS QGS2SYAQKFQ3 )520 22 КС :5 2-7) A=GK=S5SWYEGYGM27 (SEQ 22 N0:l:O
Таблица 12
Последовательности CDR вариантов антитела против сортилина S-15 по Kabat (Antibody - Антитело)
Antibody CDR 11 CDR 12 CDR 13 CDR Hl CDR H2 CDR H3
S-15 L ..2.4.2 RASQSXcXiSNLA Xi - V. 2 Xi S . .. G (SEQ 22 ЖС: = 3 3 > GAS2RA.2 (SEQ 22 NO :291 QQARLGFW2 I SEQ 22 NO :55) YCXiXjXiXiXsXeS X : F . 2 X; ' 2 .. .: A X; S -. X Xi - Ό z, 3., 2, G, 0,: ..- И Χί Y, Z, L Xi M.: .: I (SEQ 11 KO: 5791 XiONFxiGGXiXiSYAXiX^FX --3 X; 2 -: 1-7 Xz ” Wr Υ» N, 1, 1 Xj - 5. ' Z Xi 2. . A Л5 _ ? Xi К .- ;. R x - 1 i (SEQ 11 NO: SI О XiRDPXiGXjXiXiXiX-PXs XjRXicXitXiiGXijCV :o A, 7, .. 2 Ki - 5, F, .. ., G Xi 2 . .- A Xi A.-.- G Xi A, 1, . . V Xi - A, 1, F X- - G, F, -. Y X« - A, G, .: -.- F X& S, G, A Xu Y, G, F, H, : : S
- 139 043015
3-15-1 RASQSVSSN1.A (SEC 12 770 : 9) 3ASTRAT (SEC EE )70:2 = 1 CCAREGPKT (SEC CT KO :55) VCPTST'MS (SEC ID 170:515) _ Σί:ρ.Α.35~-,5νΑςκΓ23 (SEQ EC KO:525J Xi: is ϊ :: К Хц is ϊ, 1, Q, :r R X:t 13 M or 1 (SEQ CO KO: 511) AROPSGTAAAGPASRYYY GMOV (SEQ EC 170:1 = 11
5-15-2 5ASQSTSSKLA ЗАЗIRAI QQARTGPKT YTFTSYTMS EENPYGGSTSYAQXFQG ARTPSGEAAAGPASRYYY
(SEQ 12 КС : Э i (SEQ IT K0:29) (SEC CT 170:551 (SEC- ID КС :514 J (SEQ EC 770:526) GTCv (SEQ CO 770:153)
5-15-3 aASCSVSSKLA GASTRAT QQAROGKCT YTFTSTYMS EENFYGGSTS'CA-QKFQG AROFSSEAAAGPASRYIi
(SEQ 12 KO :5} (SEC IT NC:29) (SEC EE 770:5 = ) iTEQ 21 Eiilli· (SEQ ET 770:526) GMEV (SEQ EC 170:193)
S-15-4 RASQ5VSS771A GASTRAT QQAROGPaT YTFTSYOMS E ENPVGGSTS:AQKFQG ARTPSGEAAAGPASRYYY
(SEQ IE K0-5J (SEC IT ”0:29) (SEC TE NO:55) (SEQ ID KO:515) (SEQ EC 770:521] G77TV (SEQ CT £70:1511
5-1=-= RASQSVSSK1A GASTRAT QQARTGPKT YTFTSEIMS VINPFGGSTSIACKFQG ARTPS3CAAAGPASRYYY
css: co EC : Si (SEC TO 770:29) (SEC ET 170:= = ) (SEC EC 770: 515) (SEC TO 710:32 = ) GMTV (SEQ CO 770:1911
S-15-6 RASQSVSSNQA GASTRAT QQARTGPKT iTFTSRYMS 1 ENPVGGSTSiA-QKFCC ARTPSGCAAAGPASRYxE
(SET TO NO : 5. (SEC EE KO :291 (SEC EE 770:551 (SEC EC NO:516) (SEQ EE 170:52-71 340V (SEQ EC 770:1311
5-15-6-1 RASQSVSS171A SASTRAT QQARTGPKT YCFASRH-IS E1KFVGGS CS YAQKFQG AROPSGCAAAGPAGRYYY
(SET EE NO: 91 (SEC EE £70:2 = 1 (SEC CT £70:55) (SEC ET 770:511) (SEQ EC 770:=20) 30 TV (SEC CO £70:=-3)
S-15-6-2 RASQSVSSN1A GASTRAT QQARLGPKT •'TFTSRYMS EENPVGGSTSEAQKFEG AROPSGEAAAGPAGRiEY
(SEQ EE :;c: ? 1 (SEC TO KO :29l (SEC TO 770:551 (SEC EC 170:516) (SEE EE 770::2-7) GMEV (SEQ EC £70:5411
5-15-6-5 GASQSVSSNOA GASTRAT QQARLGPWT ETFTSRYMS E1KFVGGSTSYACKFC3 AROPSGCAAAGPASRE'Y
(SEQ EE 770: 91 (SEQ KO:29) (SEC CD 170:55) (SET EE KO:516) (SEQ CO 770:527} GMTV (SEQ EC £70:=-2)
5-15-6-4 RASQSVSS171A 3ASTRAT CCARLGPKE ™LTSRYHS E ENPVGGSTSEAQKFRG AROPSGTAAAGPASRyiY
(SEQ EE №:=) (SEC EE 170:291 (SEC IT KO :55) (SEC EC NO :51 = ) (SEQ ET 170:529} GMTV iSEQ CO £70:193-)
5-15-6-5 EASCSVSSKLA SASE RAE QCAREGPKC ECFTSRTHS 1CNPVGSSASYARKFQG ARTPSGCAAAGPASRYYi
S-15-6-6 (SEC. TO КС :=) (SEC TO KO :512) (SEC IT КС:2=) GASTRAT (SEC TO 770:291 (SEC EC KO :551 GQAR1GPKT (SEC EC NO :55} (SEC EE 170:516.) YTFTSRYMS (SEC ET 770: 516) (SEQ CO KO :531) EEKFVGGSCSYAQKFQG (SEQ EC 770:52-5) GMTV (SET EC 770:193) ARC PSGEAAAGPASRYYY GMTV (SEQ EC 770:193)
S-15-6-1 RASQSVSSN1A. (SEC IB KO: 9 1 GASTRAT (SEC EC NO :29) CCAREGPKT (SEC TO 770 : 55) YTFTSRYMS (SEC ЕЕ КС :516) 1TNPVGGSTSYAQKFQG (SEQ TO 770:52-5) AR0FSGCAAPGFA3RGYY GMTV (SEQ 10 40:543)
3-1=-6-5 KAS CSVS SITE A (SEC TO £70:9) GASTRAT (SEC TO 770:29) CCAREGPWT (SEC ID NO :55) YCFTSRYMS (SEC EC 770:516) CT77PVGGSTSYAQKFGG (SEQ CT NO :527) AROPSGEAIAGPAGRYYY- GMOR7 (SEC ET 770:54-1
S-15-6-9 RASCSVSSKEA .-El 11 КС :9) GASTRAT (SEC TO NO :29) QQAROGKiT (SEC EE KO :55) YTFCSR’iMS (SET EC 770:516) CCNPVGGSTSYACKFQG (SEQ CO 40:521) ARCPSGEA1A3PASRGYY GMTV (SEQ ET NO:=4=)
3-15-6-12- SASCSVSSKIA 5 EQ EC 170:91 GASTRAT (SEC EC NO :29) QQAROGPWT (SEC EE KO:55i YTFTSRYMS (SEC EC 770:=16} TliTFVGGSTSYAQKFCG (SEC CT 770:5211 ARTPSGEAlAGPASRPYx 3’4TV (SEQ CO 40:546)
S-15-6-11 AASOSVSSKEA (SEQ CO KO: 91 GASTRAT (SEC EE 770:29) OCARLGFWT (SEC EC KO :551 YTFTSRYHS (SEE EC 770:516) 1 li’PVGGSTSYAQKFQG (SEC CO NC:52~) ART P S GE AC.AG PAS R Y Y 0 GliZV (SEQ CT 40:54-1)
S-15-6-12 RASCSV55K1A (SEC EE KO : 9 i GASTRAT (SEC EE 770:29) QQAROGPaT (SEQ ID NO:55i YTFTSRYHS (SEC ET NO:516) E ENPVGGSTSYAQKFQG (SEQ EC 40:521) ARTPSGEA1AGPGSRYYR GMTV (SEQ TO £70:54 5)
5-15-6-13 HASCSV5SKLA (SEC ID KO: 9) GASTRAT (SEC TO N0:29) QQAR1GFWT (SEC ID KO :55) YCFISRYMS (SEC EC 770:516) 1CNPVGGSTSYAQKFQG (SEQ TO 770:521) AROPSGEAVAGPASRYYY GMTV (SEC CD KO:549)
S—15—7 RASQSV5SN1A (SEC EE КС: 9) GASTRAT (SEC TO KO :29) QQARDGPKT (SEC CT KO:55) YTFTSYLMS (SEC EC 770:515) EENP1GGSTSYAQKF2G (SEQ CO 770:531) AR0PSG1AAAGPASRYYY 3740 V (SEQ TO 770:193)
5-15-= RASCSVSSKEA (SEQ ID KO :9) GASTRAT (SEC TO 770:29) CCARTGPliT (SEQ ID 170:55) YTriSlYES (SEC EC 170:=19) V1KFVGGSTSYAQKFQ3 (SEQ EC 170:=32) ARCPSGCAAAGPASRYYY V 77 V (SEQ CO 770:19-}
S-15-S RASCSVSSKEA (SEQ ED KO: 91 GASTRAT (SEO ED KO :2 = } QQAROGPXT (SEC EE KO :55) YTFCSR1HS (SEC ET NC:516j EC77F1GGSTSYAQKFQG (SEQ ET 40:5211 ARCPSGCAAAGPASRYYY GMTV (SEQ CT £70:193)
S-15-11 RASESVSSKIA (SEC CT KO: 9) GASTRAT (SEC EC KO :29) QQAROGPWT (SEC EC 170 : 551 YCFTKYYMS (SEC CT 170:52 9) TCNFEGGSTSYACKFQG (SEQ CO NO :5331 ARCPSGCAAAGPASRYYY GMOV (SEQ CO 170:193·)
5-15-11-1 «AS2SV5SK1A (SEQ EE KO: 9) GASERAT (SEC EC 170:29) QQARLGPXT (SEC EC NO:55} YTFTKYYHS (SEC EC NO :5211 TT77PEGGST5YAQKFQG (SEQ EC 770:553) v= 0PSGTAAAGPASRYYY GMTV (SEQ TO 770:55 2 i
- 140 043015
8-1=-13-2 RASQSVSSKLA (SEQ ID KG : S) GASTRAT (SEQ ID КС :291 QQARI3FXT (SEC 10 110:=51 YOFTXYYMS (SEQ 10 KO:520) 11KP1GGSTSYAQKFRG (SEQ 10 NO :=34) ARDPSGIAAAGPASRYYY GMOS’ (SEC ID 110:1911
5-1=-::-3 RASCSVS5NDA (2x2 :: NO: 9) GASTRAT (SEC 10 £10:29) QQARDGPWT (SET ID NO :5 = ) YTFTXYYMS (SEQ 10 NO :520) IINPIGGSASYAQKFQG (SEC II NO:=35) ARDPS GIAAAGFAGRYYY GMOV (SEQ ID M0:541)
5-:5-::-4 RASQSVSSNLA (5Ξ2 id KG :=) GASTRAT (SEC ID 110:2 = ) QQARLGPWT (SET ID KO:551 YTFTKYYMS (SEQ ID KO:=23) IINPIGSS-SEAQKFRG (SET IT KO:534) TROPSGIAAAGPASR’YY GMOV (SEC ID KO:551)
5-1=-::-= RASQSVSSNDA (SEQ :□ ng:=j GASTRAT (SEC 10 Κ:2 = Ί QQAR1GPWT (SEQ ID NO:551 YTFTKYYMS (SEC 10 NO:=23) IINFIGGSOSEAQRFQG (SEQ IO KO:533) ARD P S GIAAAGFAGRYYY -GMO” (SEQ ID NO:541)
5-:=-::-6 RASQSVSSKDA (SET IO· NO :9) GASTRAT (SEO ID SC :23i QQARDSPWT (SEQ ID 110:551 YOFTKYYMS (SEQ ID 110:523) I1NPIGGSTSYAQXFQG (SEQ 10 110:= = = ) ARDFSG1A1AGFASRYYGMDV (SSQ IT КС :552)
3-15-::-7 RASQSVSSKDA (SEQ 10 MG: 9 t GASTRAT (SEC ID NO :23j QQARDGPXT (SET 10 NC:55) ΪΙFORYEMS (SEC 10 NO :52 0 J IINPIGGSTSYAQKFCG (SEQ IT KG:=331 ARDPSGIAIA.GFASRGYQ GMOV (SEC ID 110:553)
5-1=-::-5 RASQSVSSNDA (SEQ 10 110:9) GASTRAT (SEQ ID NO : 2 = ) QQARLGPWT (SEQ ID WO :5 = 1 YTFTXYYMS (SEQ 10 NO:520) IIKFIG35TSYAQKFQG (SEQ 10 110:5331 AROPSGIAI.AFPASRYYY GMO (SET ID NO:5541
5-:5-::-5 RAS25VSSULA (SEC 10 NO: 9) GASTRAT (SET 10 KG:29) QQAR1GPWT (SEC 10 NC:55) YTFTK'YMS ....... (SEQ 10 110:=23) IINPIGGSTSYAQKFQG (SET 11 110: 5331 ARDFSGIA1AGPASRGYY GMOV (SEQ ID NO:54=)
3-15-15-10 RASCSVSSKLA (SEQ 10 NO: 9) GASTRAT (SEO 10 1(0:2 = ) QQAR.DGPWT (SEC ID NO :551 YTFCKYYMS (SEQ 10 NO:520t IINFIGGSTSEAQKFQG (SEC 10 NO :533) ARDPSG1AAAGPAARHYY GMOV (SEQ ID 110:555)
S-15-10-11 RASQSTSSIIDA (SEQ 10 KO: 9) GASTRAT (SEC 10 N0:29) QQARDGPWT <SET 10 KO:==i ETFTKEYMS iSZ2 10 NO:520» IIKPIGGSTSYAQKFQG (SET 10 KO:533) ARDPFGIADAGPASRYYY GMD” (SEQ ID NO:556)
5-15-::-12 PASQSVSSNDA (SIC ID KO: 91 GASTRAT (SEO 10 110:291 CQAR1GPXT (SEQ ID NO :5 =1 ETFTKYYMS (SEQ TO NO :520-1 IINPIGGSTSYAQXFQG (SEC IT NC:533) ARDPSGIAAAFFAGRYYY GMOV (SEC ID NO :557)
5-15-10-13 RASQSVSSNDA (SI2 I» KO: 91 GASTRAT (SET 10 NO :2=1 CCARDSPKT (SEC ID КС :55) ECFTNEEMS (SEQ 20 110:=20) IIKPIGG50SYARXFQG (SET IT 110:536) ARDPSGIAAAYPASRYNY GMDV (SEC ID NO :555)
5-15-::-14 RA5CSVSSNDA (SEO 10 NO :9) GASTRAT (SEO 10 KO :29) QCAROGPKT (SEC 10 NO:55i YTFTKEYMS (SEQ IT Κ0:5201 IINPIGGSISYATXFQG (SET IT KO :537 1 ARDPSGIAAAGFASRYYY GMT” (SEQ ID KO:193)
5-15-::-15 RA8Q5VSSN1A (SEC ID NO :91 GASTRAT (SEQ IT NO:!?) CCAR1GPWT (SEC ID КС:55) YTFTKYYliS (SEQ 10 110:521) iikfiggstsyackfqg ISEQ IT 110:533) ARDPGGAAAAGPASRYYY GMT*,' (SEQ ID NO :5591
5-15-::-16 RASQSVSSNDA (SEQ ID NG: 9) GASTRAT (5EQ ID КС:29) CQARDGFWT (SEC ID KO :55) YTFTKYYM5 (SET IT KO:520) IIKPIGSSTSYACKFTG (SEC 10 KO:533) AR1PSGIAAAYPASRYYR 3MIT (SEC ID NO :56 3)
5-15-10-17 RASCSV3SK0A (SEC ID ND :31 GASTRAT (SEQ ID 170:29) CQARDGPWT (SEC 1D KO :55) YTFTKYEMS (SEQ 10 NO :52li I'-HPIGGSTSYACRFCG (SEC 10 110:53 = 1 ARDFSGDGDAGFFSRYYY GMOV (SEQ ID KO :5611
5-15-::-15 RASQSVSSN1A SEI 11 KO: 9) GASTRAT (SEC ID NO :03) CQARDGFKT (SEC 10 NO:551 YTFTKYY-MS (SEQ IT 110:521) IINPIGGSTSYAQKFQG (SEQ IT £10:5 33) ARDPSGIADAGPASRSYY GMT” (SEQ ID KO:=62)
5-15-1:-13 RASQSVSSKDA (SEQ ID NO :9) GASTRAT (SEC 10 NO :2 9i CCAR1GFWT (SEQ 10 110:551 YTFTKEYMS (SEQ 10 KO :=20) IIKPIGGSTSYACKFQG (SEC IT £10:=33) ARDPSGIAAAFPASRSYY RWl·.· (SEQ ID NG :563)
S-15-1C—20 RA3CSV33K0A (SEC 10 KO :9) GASTRAT (SEQ 10 NO :29) CCARIGFXT (SET ID NO :55) YCFTKYiUS (SEQ 10 KO:5201 1INFIGGSTSYAQKFQG (SEQ 10 NO :5331 ARDFSGIA”G₽ASRYYY GMDV (SEQ ID £10:564)
3-15-::-21 RASQSVSSNIA (SEC ID 00:91 GASTRAT (SEC ID KO :29) CQARIGPXT (SEQ ID NO : 5 5) ETFTKEYMS (SEQ 10 NO :520) I1NPIGGSTSYACKFQG (SEQ ID 110:5331 ARD PS 3IAAAGFAGRYYY GMOV (SEQ ID 1-10:5411
5-15-11 RASQSVSSN1A (SEC ID KO : 3) GASTRAT (SEC 10 КС :2 = ) CQAR1GFWT (SEQ 10 NC:55) YTFTSTEM5 (SEC 10 KO:513) IINPVGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO:527) ARD F S GIAAASPASRΥYY GMOV (SEC ID КС: 19-3)
5-1=-12 RASOSVSSKLA (SEQ 10 NO: 3) GASTRAT (SEC 11 KO :29) QQARLGPWT (SEQ 10 NO:551 YTFTSLYMS (SEQ 11 110:521» IIKPVGSSTSYACKFQG (SEQ ID KO:527i ARDPSGIAAAGFASRYYY GMDV (SEQ ID NO:19 3j
S-15-13 RASQSVSSKDA (SEO 10 ::: : = GASTRAT (SEQ 10 1)0:29) QCARLGPWT (SEQ ID NO :5 5) YTFTSGEMS (SEQ 10 NO :522) I1NPYGGTTSYACXFQG (SEQ ID i:O:=59i ARDPSGIAAAGFASRYYY GMDV (SEQ ID KO:193)
S-15-14 RAS0SVS5K1A (SEC ID NO:=j GASTRAT (SEC TO КС :2 31 CCAR1GPWT (SEQ ID NO :55) YTFTSCYM5 (SEQ TO 110:52’1 IIKPYGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO :526) ARDFSGIAAAGFASRYEY GMDV (SEQ ID KC:193i
5-15-15 RAS0SVS5K1A (SEC ID SO :3) GASTRAT CQARDGFKT (SEC 10 ::0:==1 YTFTSQEMS (SEQ 10 KO : 523) IIKPVGGSTSYAQKFQG (SEQ ID KO :527) ARDFSGIAAAGPASRYYY GMDV (SEQ ID 110:193)
5-15-16 RA50SV5SKLA (SEQ 10 WO: 9) (SEQ 10 NO :29) QQARDGPWT (SEC 10 WO:5=1 YTFTSHYMS (SET IT NO :524) IINFIGGSTSYAQXFQG (SEQ ID KO:=33) ARDPSGIAAAGFASRYYY GMDV (SEC ID KO:193)
- 141 043015
Таблица 13
Последовательности CDR вариантов антитела против сортилина S-22 по Kabat (Antibody - Антитело)
Antibody CDR LI CDR L2 CDR L3 CDR Hl CDR H2 CDR H3
S-22 вариамвм RASQSZSSWLA (522 ZD NO: 5 i KASSL2S (S2Q ZD IX :2=1 QQADGHZO (SEQ ZD KO:€% XiDFXiXsYAXiXs Xl 3 Y X: ~ 3, R, 3, и =: 0 Xi - S, 3, .. .: К X, Z;-::M Xs S .- .. A (520 ID KO:565} SZXiFXiXsSXiAXsYAQKFQG Xi I.-...: V Xi · Z, R, G, A, S, T, :. .: 0 Xi F . G Xi 7, R, =: W Xi - s, K, 0, u ; X (520 ZD KO:5 66) ARQGRKDGYYYY'iSMDV (520 ZD 170:197)
5-22-1 RASQSISSWLA (SEC ZD 170:5) KAS5L25 (S2Q ZD IX :2:1 QQADGiXD (SEQ ZD KO:€2) GTFSSYAIS (520 ZD NO :13% GIVPRFGTANYAQKFQG (520 ID IX:5“1) ARQ3RKIGYYYYYGMD” (520 ZD 170:157)
S-22-2 RASQSISSWLA (S2Q ZD 170: = . KASSLSS (520 ZD IX :2% союзное ¢520 ZD NO :62) GTFSSYAIS {520 ZD KO :13% GIIPGFGTAQYAQKFQG (520 ZD 170:=721 aRQGRKTSYYYYYSMTv (520 ZD 170: 197)
5-22-3 RASQSZSSKLA (SEQ ID 170: 2 j KASSL2S (SEQ ZD N0:25) QQADGHID (520 ID 17O:€2i 3TFRSYAIS (520 ZD KO:567) 3ZZP3FG7AXYA0XF0G (520 ZD IX:57-i AR03RK73YYYYY3MDV {520 ZD lX:197j
S-22-4 RASQSISSaLA (520 ZD NO: = ) KASSLES iseg id 170:251 Q0AD3HI0 (520 ZD IX: 62 j 3TFGSYAIS (520 ID KO:565) 311FAFGTAWYAQKFQG (520 ZD KO:=76j ARQGRKTGYYYYYGMD” (520 ZD 170:197)
S-22-5 RASQSISSKLA (S2Q IC KO: =) KASSCES (SEQ DD IX : 25 j QQADGHIO ¢520 ZD KO :62. GTFSSYAIS (520 ID KO:133) GZIPSFGTASYAQKFQG (520 ZD K0:=7=j AR03RK73YYYxY3MDV (520 ZD NO:197)
S-22-6 RASQSISSX1A (S2Q ZD IX : 5 ) KASSLES (SEQ ZD КС :2=1 QQAD3HZ0 (S2Q ZD KO :62j Y7F7GYAMA (S2Q ZD 170:569) 3Z 7P7F37AWYA0XF03 (520 ZD KC:=76) ARQGRKTGYYYYYGMD (520 ZD 170:197)
S-22-7 RASOSZ55aLA ( = 2Q ZD IX: 5) KA5SL25 (520 ZD 170: 25) QQADGHZO (520 ZD КС :62) GTFSSYAIS (520 ZD KO:13% GIZPSFSRANYAQXFQS (S2Q ZD IX:577) ARQ3RKT3YYYYYGMDV (320 ZD IX: 197 1
5-22-2 RASQSZS5WLA (S2Q ZD IX: = ) KA5SL2S (SzQ ZD 170: 25) QQAD3HID (S2Q ZD IX :62) 37FGSYAZS (520 ZD KO :56=) GZZF0F37AKYAOKFO3 (520 ZD KO :57 = ) AR.QGRKT3YYYYY3MD” (520 ID 170: 197,
5-22-= RASQSIS5WLA (S2Q ZD IX : 5) KASSDES cseo id 1 IX :25) QQADGHZO ¢520 ZD KO:62 j GTFRNYAI5 (520 ZD 170:57% 3:: f : ggkaixaokfоз (=20 ID IX :=79) AROSRKDSYYYYYGMDY (520 ZD IX :197i
Таблица 14
Последовательности CDR вариантов антитела против сортилина S-60 по Kabat (Antibody - Антитело)
Antibody .CDR' LI/:· . . . . CDR L2 CDR L3 XDR .Hl. .:. . CDR H2 CDR-H3. .. . :
s-ez • RSSQXXLXiSKG YIXDD X: - S 1 Xi Η. ·:R (S2Q ZD IX :5=% L33KRX15 X: - A г .X .520 ID IX :=:% M0QG2TPLC (=20 ZD IX :i:0) YSISSXiXiYXG X· = .V X - Ϊ :. (SEC ID 170:=5% XX YXcS 350 YYKPSLKS X: ~ 0, 5 : ... A Xt “ H P (520 ID 170:5:3} ARQGSi:<Q3YY3MX· (520 ZD IX :233)
s-ez-i RSSGSLLHSKGY KYLD (SEQ DD IX :1% LG3KRAS (SEO ID IX :5% MOQQEDFLO (320 ZD K0:13C| YSISSVRYKG (SEQ ID 170:=57) SIYHSG50YYKP5DKS (S20 ID 1X:169) aRQGSIKOGYYGMDV (SEQ ID NO :2 = 3 I
S-61-2 RSSCSLDHSKGY KXLD (S-G ID IX :1% D3S17RA5 (520 ID 170:3% 1X0020520 (520 ZD EC:130} YSISSVRYWG (520 DD NO: 55% AIYPSGSTYYKPSDKS (5EQ ID 170:5 = 5^ AROGSZKOGYYGMDV (520 ID IX :233)
3-60-3 RS50S1LR3K3Y KYLD (SEO ZD 170:5 = 4) D3SKRVS (SEO ID 1-70: = =61 MQQ02DFLO (520 ZD txx:% : = :В53УЖ (SEO ZD IX: 142) DZYHSGS-YYKPSDKS (S2Q ZD KO: 17% ARQGSIXQGYYGMDV (SEC ID IX :23%
5-=:-= R5503LLRSKGY KYLD (SEC ID KO :5 = 5) L35KRA5 (SEC ID IX : 3 % M0QO2-FLD (SEO ZD NO:1-0% Y5I553YYW3 (S20 ID KG :1 = % 01YHSGSOYOKESDKS (520 ID NO:ln% ARQ3S0KQ3YYGH0Y (SEO ID NO:233i
S-60-5 RSSOSL-RSKGY HYLD (520 ID IX: =S% LG5KRAS (S20 ID 1X:3O) MQQOSCFLO (SEO ZD 170’11% YSZS53YYK3 (SEQ ID 170:142, 0ΖΥΗ=350ΥΥΚΡ5Χ<= (SEQ ID 170:17% ARQGSZKQGYYSMDV (SEO ID KOX33S
S-60-6 RSSGSLDRSKGY IXLD (SEO ID K0:53% D3SKRAS (SEQ IB KO :3% MOQOEDPLD (SEO ID КО: IX·) Y3ZS53YYK3 (SEQ ID NO: 1 = 2 I DZYHSSSTYYKPSLKS (SEO ID NO: IX) ARQ3SZXQGYYGMDV (SEO ZD 170:233(
5-=0-7 RSSCSL'RSKGY LG5KRAS M00Q2DPLD YSISSGYYKG OIYHSGSTYYKPSDKS ARQGSOKQGYYGMD·.’
KYDD (SEO ZD IX :35=) (S2Q ZD KO :30) (S2Q ID IX :100) (SEQ ID NX :1421 (SEQ ID 170:17% (SEQ 00 KO:233?
S-60-3 RSSGSLLRSKGY DEED (SEQ ID 170:554) LGSWRAS (520 ZD IX; 3% MQQQ2DP” (520 ID IX: 10% YSISSGYYTiG (520 ID КС:142i -lYnSGSOYYKPSLKS (SEQ ZD KG:17% ARQSSIKQGYYSMDV (520 ID N0:233)
S-6%9 RSS0SLDH5KGY KYDD (S20 ID KO:1% D3SKRAS >320 ID KO :3% MQOOEDFLT (320 ID 170:17% YSISS3YYW3 (SEO ID IX: 142) D:YH53SOYYKPSLXS (SEQ ID IX: 17% ARQGSIKQGYYGIXV (SEQ ID 170:2 = 3)
- 142043015
Таблица 15
Последовательности CDR вариантов антитела против сортилина S-82 по Kabat (Antibody - Антитело)
Antibody CDR LI . CDR L2 CDR 13 CDR Hl CDR H2 CDR H3
S- = 2 RA5DSVSSSYDA (SEO 22 NO:24r GASSRAD (SEQ DD ГС:Q€i CCSHVSPWT iSEQ DD ::1:222. XxSDXiSXjXiYYWG Xt 3. 'i Xi 5, V, Y, K, . .. ₽ Xs S ; .: R X< D Ξ (SEQ 22 80:5=9» XiDYXiXsGSTXiYNPSLXS X: S, 3, Q, .· .· 1 X; Y. 7, . = Xi S, 5., Ж, ·-. :.: A Xi - Yr. .,-7 (SEQ DD 80:5=11 ARG7GSGYSYGYRYF DY (SEQ 20 KO:253)
5-=2-0 RAS0SV5S5YDA (SEQ 22 ::0:24 1 SASSRAT (SEQ 22 :X:2€> QQSHVSPXT iSEQ 22 80:1221 GSDVSSDYYWG (SEQ 2D NO:S =-2) GDYYRGSTYYNPSLKS (SEQ 2D 80:5=7) ARGVG5GYSYGYRYF DY (SEO DD КС :2 = 31
3-:2-2 RASDSVSSSYLA (SEC OD NO :14) GASSRAT (SEQ 22 N0:26) QQSHVSPWT (SEQ DD 80:1221 GSOSSSDYYWG (SEQ 2D NO :247) GDYYRGSTYYKPSDKS (SEQ 2D 80:5=7i ARGVGSGYSYGYRYF DY (SEQ 2D- 80:2:3)
S_£2-3 RASDSVSSSYDA (SEO 22 80:241 GASSRAD (SEQ 22 K0:2€i QQSH7SPKT (SEQ 22 80:2221 3S2SSSDYYW3 (SEQ 2D 80:147) QDYiXGSTYYKPSLKS (SEE 2D 80:59=1 ARGV3SGYSYGYRYF И (SED 2D 80:2531
S-22-4 RASCSVSOSiLA (SEQ ID NO :14) SASSRAT (SEQ OD NC:26) qqshvspkt (SEQ 2D КС:222) GS2YSSDYYX3 (SEQ 2D 80:552) s dynrgsdyynpsdks (SEQ DD 80:===1 ARGV3S3YSYGYRYF BY (SEO 2D КС :2 = 3)
S-22-5 RASQSVSSSxLA (SEQ 22 NO :14) GASSRAO (SEQ 22 N0:26i QQSEVSPWT (EEC 22 80:122) 352К55ЕГЖ (SEQ 2D KO:593] SDYRAGSDYYNPSDKS (SEQ 2D NO:622i AR3VGS3YSYGY5YF DY (SEO 2D NO :253)
S-82-6 RASS3VSSSY1A tSSQ 2D КС:14) GASSRAD (SEO 22 KO:26) QQSH7SFK0 (SEQ 20 KO:122) YS2PS-DYYKG (SEC 20 KO :594) S2YYRG5TVYKFSDKS (SEC 2D NC :611) AR3VSSGYSY3YRYF DY (SEO 2D 80:253)
3-=2-7 RASCSVSSSYLA (SEQ 2D 80:14( GA5SRAT (SEQ 20 KO:26) QQSHVSFKT (SEO 2D KO:222> GS1SSSEYYXG (SEQ 2D KC:595j L 2YYRGSTYYKF5DKS (SEC 20 КС:622) ARGVG5 GY SVG YRYF DY (SEO 2D NO:255)
S-52-2 RAS 0SYSSSYDA tSEQ 22 80:241 SASSRAO (SEQ 22 KO :26) QOSHVSFXD (SEQ 2D 80:1221 GSDSSREYYWG (SEQ 2D 80:=96) SDYRSGSDYYKPSDKS (SEQ 20 NC:€23j ARGVGSGYSYGYRYF DY (SEO 2D 80:253)
Определение параметров связывания аффинно зрелых антител против сортилина.
Аффинности связывания клеток для отобраных аффинно зрелых антител против сортилина показаны в табл. 16A и 16B. В таблице N. B. обозначает отсутствие связывания, P. F. обозначает плохое соответствие, N. D. обозначает не выявлено, Bt- обозначает биотинилированное, hSort обозначает сортилин человека, msSort обозначает сортилин мыши, а (M) обозначает моновалентный.
Таблица 16A
Аффинности лучших клонов аффинно зрелых антител
Антитело MSD Fab KD MSD Fab KD Fortebio Fab KD ForteBio Fab KD
Bt-hSort (M) Bt-msSort (M) Bt-hSort (M) Bt-msSort (M)
S-2-1 2. 90E-11 7. 30E-10 6. 14E-10 1. 92E-09
S-2-2 2. 70E-11 7. 90E-10 3. 08E-10 2. 68E-09
S-2-11 1. 10E-11 N. D. 2. 61E-10 7. 59E-09
s_15_3 2. 60E-10 1. 10E-10 9. 43E-10 7. 69E-10
S-15-6 2. 30E-10 7. OOE-11 9. 84E-10 6. 78E-10
S-15-6-12 2. 30E-11 N. D. 9. 57E-10 7. 65E-10
S-15-10-12 7. 60E-11 N. D. 1. 24E-09 1. 21E-09
S-15-10-13 3. 20E-11 N. D. 1. 18E-09 1. 11E-09
s_15_14 1. 90E-10 1. 00E-10 1. 04E-09 7. 58E-10
S-22-3 9. 70E-11 1. 20E-09 6. 98E-10 1. 43E-09
S-22-7 9. 80Ε-1Ϊ 5. 70E-10 i5. 08Ε-Ϊ0 7. 51E-10
S-22-9 4. 80E-12 N. D. 5. 75E-10 3. 29E-09
S-60-4 9. 40E-11 N. D. 2. 49E-09 Ν. B.
S-60-5 6. 50E-11 N. D. 2. 00E-09 Ν. B.
S-60-6 9. 30E-11 N. D. 2. 28E-09 Ν. B.
S-82-3 5. 60E-10 Ν. B. P. F. Ν. B.
S-82-5 N. D. Ν. B. 3. 96E-09 Ν. B.
S-82-8 N. D. Ν. B. P. F. Ν. B.
- 143 043015
Таблица 16B
Аффинности лучших клонов аффинно зрелых антител
Антитело Связывание c HEK293T+ hSort Связывание с HEK293T+
I (KD в M) 1 msSort (Kd в M)
S-2-1 6. 91E-10 1 2. 65E-09
S-2-2 1. 21E-09 1 2. 27E-09
S-2-11 3. 77E-10 1 1. 54E-09
S-15-3 . 5. 25E-09 1 1. 79E-08
S-15-6 6. 74E-09 1 1. 89E-08
S-15-6-12 3. 84E-09 1 6. 62E-09
S-15-10-12 4 . 3E-09 1 8. 89E-09
S-15-10-13 2 . 88E-09 1 4. 07E-09
S-15-14 5. 25E-09 1 1. 94E-08
S-22-3 ' ' 1. 08E-09 1 ' 3. 63E-09
S-22-7 2 . 05E-09 1 4. 78E-09
S-22-9 ' ' 8. 10E-10 1 5. 12E-09
S-60-4 ' ' 7. 3E-10 1 Ν. B.
S-60-5 . 5. 6E-10 1 Ν. B.
S-60-6 ' 7. 8E-10 1 Ν. B.
S-82-3 ' 5. 90E-10 ' 1 Ν. B.
S-82-5 ' 3. 74E-10 1 Ν. B.
S-82-8 3. 99E-10 1 Ν. B.
Далее аффинно зрелые антитела сравнивали друг с другом и их соответствующим исходным антителом на способность снижать уровни сортилина на клеточной поверхности в клетках U-251 человека и клетках N2A мыши. Антитела добавляли к клеткам в течение 72 часов в различных концентрациях и уровни сортилина измеряли методом FACS, используя конъюгированное с DyLight антитело бина, отличающегося от бина исследуемого антитела (либо S-29-DyLight650, либо S-30-DyLight650). Аффинно зрелые антитела в общем показали улучшенную способность снижать нативные уровни сортилина клеточной поверхности как в клетках человека, так и мыши (фиг. 13A-13G), особенно в наименьшей концентрации антитела (IgG) равной 1,25 нМ.
Исходное антитело S-15 и аффинно зрелые антитела, полученные из него, исследовали на способность блокировать связывание 15 нМ PGRN с экспрессирующимся на клетках HEK293T сортилином. Как показано на фиг. 14, клоны аффинно зрелого антитела S-15 (например, от S-15-1 до S-15-7 и от S-1512 до S-15-14) индуцировали небольшие увеличения способности блокировать связывание 15 нМ PGRN с сортилином, по сравнению с исходным антителом S-15.
В итоге, авторы идентифицировали до трех аффинно зрелых клонов с улучшенным связыванием сортилина и человека и мыши, и с улучшенной функциональностью при понижении регулирования уровней белка сортилина и/или блокирование связывания PGRN.
Результаты указывают на идентифицию аффинно зрелых антител против сортилина, которые имеют улучшенное связывание как с сортилином человека, так и сортилином мыши, и которые имеют улучшенную функциональность по снижению нативных уровней сортилина на клеточной поверхности и/или блокированию связывания PGRN с сортилином, по сравнению с соответствующим исходным антителом.
Пример 24. Картирование эпитопов антител против сортилина.
Материалы и методы.
Связывание с линейными эпитопами.
Эпитопы антител картировали, как описано ниже. Для определения параметров антигена выполняли измерения с использованием Ultraflex III MALDI ToF (Bruker), оборудованного модулем изучения взаимодействий HM4. Этот модуль содержит специальную систему выявления, предназначенную для оптимизации выявления до 2 МДа с наномолярной чувствительностью.
Образцы антигена и антитела смешивали до конечной концентрации от 1 мкМ до 0,5 мкМ, соответственно. Смешивали 1 мкл полученной смеси с 1 мкл матрицы, состоящей из перекристаллизированной матрицы синапиновой кислоты (10 мг/мл) в ацетонитриле/воде (1:1, об/об), ТФУ 0,1% (набор K200 MALDI). После смешивания 1 мкл каждого образца помещали на планшет для MALDI (SCOUT 384). После перекристаллизации при комнатной температуре планшет вводили в масс-спектрометр MALDI и немедленно анализировали, анализ повторяли три раза.
Смесь, приготовленную для контрольного эксперимента, перекрестно сшивали с использованием набора для анализа MS K200 MALDI. Девять микролитров смеси смешивали с 1 мкл реагентастабилизатора K200 (2 мг/мл) и инкубировали при комнатной температуре. После завершения времени
- 144 043015 инкубации (180 минут) готовили образцы для анализа MALDI, как для контрольных экспериментов. Образцы анализировали методом высокомолекулярного MALDI немедленно после кристаллизации.
Для исследования того, находится ли эпитоп связывания в линейной форме, выполняли протеолиз рекомбинантного сортилинового антигена человека иммобилизированным пепсином. Пятьдесят микролитров антигена в концентрации 4 мкМ смешивали с иммобилизированным пепсином в концентрации 2,5 мкМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения времени инкубации образец центрифугировали, а супернатант пипетировали. Завершение протеолиза контролировали высокомолекулярной MALDI масс-спектрометрией в линейном режиме и рефлектронном режиме. Для получения больших количеств пептида в диапазоне 1000-3500 Да протеолиз пепсином оптимизировали. Пяти микролитров антигенных пептидов, полученных протеолизом, смешивали с 5 мкл антитела S-2-11, S-15-6, S-60, S-22-9 или S-82-8 в концентрации 2 мкМ и инкубировали при 37°C в течение 2 часов. После этого смесь смешивали с 5 мкл интактного антигена в концентрации 2 мкМ. Взаимодействие между антителом и антигеном выполняли, как описано выше.
Характерные линии масс пептида сортилинового антигена и определение параметров поверхностей связывания.
Для определения характерных линий пептида смешивали 10 мкл сортилина (5 мкМ) с 10 мкл антитела (2,5 мкМ). Добавляли 2 мкл DSS d0/d12 (2 мг/мл; DMF) с последующей инкубацией 3 часа при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл бикарбоната аммония в концентрации 400 мМ (конечная=20 мМ) с последующей инкубацией 1 час при комнатной температуре. Раствор высушивали с использованием speedvac перед суспензированием с помощью 20 мкл H2O 8 M мочевины. После смешивания к раствору добавляли 2 мкл DTT (500 мМ). Затем смесь инкубировали 1 час при 37°C. После инкубации добавляли 2 мкл йодацетамида (1 М) перед инкубацией 1 час при комнатной температуре в темном помещении. После инкубации добавляли 80 мкл протеолитического буфера. Впоследствии смешивали 100 мкл восстановленного/алкилированного антигена с ферментами расщепления от Roche Diagnostics (1,66 мкл трипсина или 0,83 мкл химотрипсина, или 0,83 мкл ASP-N, или 1,66 мкл эластазы, или 3,32 мкл термолизина) и инкубировали в течение ночи при 37°C (трипсин, ASP-N, эластаза), 25°C (химотрипсин) или 70°C (термолизин). После расщепления к раствору добавляли муравьиную кислоту до конечной концентрации 1%. Затем образцы подавали на промывку SPE на колонке Atlantis dC18 3 мкМ 2, 1x30 мм.
После протеолиза 10 мкл полученных пептидов наносили на наносистему для жидкостной хроматографии (Ultimate 3000, Dionex) и выполняли масс-спектрометрию с LTQ orbitrap.
Для определения эпитопа антител S-2-11, S-15-6, S-22-9, S-60 и S-82-8 на сортилиновом антигене с высоким разрешением, комплексы антитела/антигена инкубировали с дейтерированнымикросслинкерами и подвергали мультиэнзимному расщеплению. После обогащения перекрестно сшитых пептидов анализировали образцы методом масс-спектрометрии с высоким разрешением (MS nLC-Orbitrap) и полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения XQuest и Stavrox. Использовали nLC в комбинации с масс-спектрометрией Orbitrap. Пять микролитров образца антигена (концентрация 4 мкМ) смешивали с 5 мкл образца антитела (концентрация 2 мкМ) с целью получения смеси антитело/антиген с конечной концентрацией 2 мкМ/1 мкМ. Затем смесь инкубировали при 37°C 180 минут. На первом этапе 1 мг кросс-линкера d0 смешивали с 1 мг кросс-линкера d12. Смешивали 2 мг полученной смеси с 1 мл DMF с целью получения раствора 2 мг/мл DSS do/d12. Десять микролитров раннее полученной смеси антитела/антигена смешивали с 1 мкл раствора кросс-линкеров d0/d12 (2 мг/мл). Раствор инкубировали 180 мин при комнатной температуре с целью завершения реакции перекрестного сшивания. Десять микролитров раствора с прекрестными сшивками смешивали с 40 мкл бикарбоната аммония (25 мМ, pH 8,3). После смешивания к раствору добавляли 2 мкл DTT (500 мМ). Смесь инкубировали 1 час при 55°C. После инкубации добавляли 2 мкл йодацетамида (1 М) и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темном помещении. После инкубации раствор разбавляли 1/5 добавлением 120 мкл буферного раствора, используемого для протеолиза. Смешивали 145 мкл восстановленного/алкилированного антигена с каждым из 0,7 мкл трипсина, 0,35 мкл химотрипсина, 0,35 мкл ASP-N, 0,7 мкл эластазы, либо 1,4 мкл термолизина. Протеолитические смеси инкубировали в течение ночи при 37°C (трипсин, ASP-N, эластаза) или 25°C (химотрипсин), или 70°C (термолизин). Затем анализировали перекрестно сшитые пептиды, используя Xquest, версия 2.0, и программное обеспечение Stavrox 2.1.
Результаты.
Связывание с линейными эпитопами.
Каждое из аффинно зрелых антител против сортилина S-2-11, S-15-6 и S-60 связывается с сортилином в комплекс со стехиометрией 1:1. Связывание не ингибировалось присутствием пептидов (фиг. 15). Каждое из аффинно зрелых антител против сортилина S-22-9 и S-82-8 образует комплексы с сортилином в соотношении как 1:1, так и 1:2 (антитело: антиген). Эти комплексы не ингибировались присутствием какого-либо пептида. Фиг. 15 также показано, что сортилиновые пептиды не конкурировали за связывание с сортилином с антителом S-2-11. Авторы наблюдали сходное отсутствие конкуренции сортилиновых пептидов, также наблюдаемой для антител S-15-6, S-22-9, S-82-8 и S-60. Результаты показывают, что
- 145 043015 эпитопы связывания для антител S-2-11, S-15-6, S-22-9, S-82-8 и S-60 являются конформационными и/или прерывными. Этот факт согласуется с неспособностью картировать антитела S-2-11, S-15-6, S-22-9,
S-82-8 и S-60 на сортилине, используя подход с пептидными библиотеками.
Характерные линии масс пептида сортилинового антигена и определение параметров поверхностей связывания.
После протеолиза трипсином идентифицировали 52 пептида в последовательности сортилина, охватывающих 57, 72% последовательности. После протеолиза химотрипсином идентифицировали 73 пептида в последовательности сортилина, охватывающих 81, 12% последовательности. После протеолиза ASPN идентифицировали 12 пептидов в последовательности сортилина, охватывающих 24, 22% последовательности. Ни одного пептида не идентифицировали в последовательности сортилина после протеолиза эластазой. После протеолиза термолизином идентифицировали 2 пептида в последовательности сортилина, охватывающих 1, 47% последовательности. Объединение пептидов из всех результатов протеолиза охватывало 94, 78% последовательности сортилина (фиг. 16A). Пептидами, полученными путем протеолиза, охватывалось 94, 78% внеклеточного домена сортилина, считается, что при использовании данного способа не был пропущен ни один эпитоп.
В табл. 17 обобщены результаты экспериментов по перекрестному сшиванию для определения эпитопов. Расщепление термолизином не привело к получению какого-либо выявляемого пептида для какого-либо из антител. Для антител S-2-11, S-15-6 и S-22-9, были идентифицированы два различных эпитопа. Для антител S-60 и S-82-8 идентифицирован единственный эпитоп. В табл. 17 перекрестно сшитые аминокислоты отмечены жирным шрифтом.
Таблица 17A Количество пептидов
Антитело Количество пептидов после трипсина Количество пептидов после химотрипсина Количество пептидов после ASP-N
S-2-11 7 5 0
S-15-6 8 4 0
S-22-9 2 8 3
S-60 0 2 4
S-82-8 1 2 0
Таблица 17B
Участки связывания антител к сортилину
Антитело Участок связывания сортилина Аминокислотный участок из SEQ ID NO: 1
S-2-11 237NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK260 (SEQ ID NO: 703) и 297KTIGVKIYSFGLGGRFLFASV317 (SEQ ID NO: 699) 237-260 и 297-317
S-15-6 237NGLWVSKNFGG247 (SEQ ID NO: 700) и 314FASVMADKDTTRRIHVSTDQGDTWS338 (SEQ ID NO: 701) 237-247 и 314-338
S-22-9 207FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNS227 (SEQ ID NO: 702) и 237NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK260 (SEQ ID NO: 703) 207-227 и 237-260
S-60 207FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNSDYLL231 (SEQ ID NO: 704) 207-231
S-82-8 367EPGDTGFGTIFTSDDRGIVYSKSLD391 (SEQ ID NO: 705) 367-391
Как указано в табл. 17, пептиды, распознаваемые антителом S-2-11, соответствуют аминокислотным остаткам 237-260 и 297-317 из SEQ ID NO: 1 и имеют аминокислотные последовательности: NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID NO: 703) и KTIGVKIYSFGLGGRFLFA SV (SEQ ID NO: 699). Дополнительно, перекрестно сшитые остатки внутри пептидов соответствуют остаткам K243 и K248 внутри аминокислотных остатков 237-260 из SEQ ID NO: 1; а остатки S305, R311 и S316 внутри аминокислотных остатков 297-317 из SEQ ID NO: 1. Пептиды, распознаваемые антителом S-15-6, соответствуют аминокислотным остаткам 237-247 и 314-338 из SEQ ID NO: 1 и имеют аминокислотные последовательности: NGLWVSKNFGG (SEQ ID NO: 700) и FASVMADKDTTRRIHVSTDQGDTWS (SEQ ID NO: 701). Дополнительно, перекрестно сшитые остатки внутри пептидов соответствуют остаткам S242 и K243 внутри
- 146 043015 аминокислотных остатков 237-247 из SEQ ID NO: 1; а остатки S316 и R325 внутри аминокислотных остатков 314-338 из SEQ ID NO: 1. Пептиды, распознаваемые антителом S-22-9, соответствуют аминокислотным остаткам 207-227 и 237-260 из SEQ ID NO: 1 и имеют аминокислотные последовательности: FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNS (SEQ ID NO: 702) и NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID NO: 703). Дополнительно, перекрестно сшитые остатки внутри пептидов соответствуют остаткам T210, T218 и S223 внутри аминокислотных остатков 207-227 из SEQ ID NO: 1; а остатки K243, K248 и K254 внутри аминокислотных остатков 237-260 из SEQ ID NO: 1. Пептид, распознаваемый антителом S-60, соответствует аминокислотным остаткам 207-231 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNSDYLL (SEQ ID NO: 704). Дополнительно, перекрестно сшитые остатки внутри пептида соответствуют остаткам T218, Y222, S223 и S227 внутри аминокислотных остатков 207-231 из SEQ ID NO: 1. Пептид, распознаваемый антителом S-82-8, соответствует аминокислотным остаткам 367-391 из SEQ ID NO: 1 и имеет аминокислотную последовательность из: EPGDTGFGTIFTSDDRGIVYSKSLD (SEQ ID NO: 705). Дополнительно, перекрестно сшитые остатки внутри пептидов соответствуют остаткам S379, R382 и Y386 внутри аминокислотных остатков 367-391 из SEQ ID NO: 1.
Функциональное картирование.
Сортилиновые мутантные варианты HVPLVIMT131QVPLVIVS (SEQ ID NO: 706) (в которых подчеркнутые остатки H, M и T из аминокислотной последовательности сортилина дикого типа были заменены на Q, V и S, соответственно), a S595R получали с использованием мутантных праймеров и клонировали в плазмидном векторе pCMV-AC-IRES-GFP (от Origene). Антитела против сортилина S-30 и S-60 конъюгировали с помощью набора для маркирования антител DyLight 650 (Thermo Scientific Pierce) в соответствии с инструкциями производителя.
Клетки HEK293T транзиентно трансфицированные плазмидами с использованием плазмиды с использованием Fugene HD (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированные клетки HEK293T собирали после 24 часов, промывали ФСБ и инкубировали с 5 мкг/мл антитела в течение одного часа на льду в буферы для FACS (ФСБ+2% FBS). Впоследствии клетки промывали дважды 200 мкл буфера для FACS и анализировали на FACS Canto и программном обеспечении FlowJo. Отбирали GFP-позивные клетки и измеряли экспрессию сортилина как медианную интенсивность флуоресценции на канале APC.
Сортилиновый мутант HVPLVIMT131QVPLVIVS сильно снижал связывание антитела S-30 (фиг. 16B), в то же время как не снижал связывание антитела S-60. Напротив, сильно снижалось связывание антитела S-60 с сортилиновым мутантом S595R (фиг. 16C), в то же время как не снижал связывание антитела S-30. Эти результаты показывают, что аминокислоты в пределах 131HVPLVIMT138 пептида сортилина необходимы для связывания S-30, а остаток S595 является критическим для связывания S-60 с сортилином.
Пример 25. Определение параметров взаимодействия между сортилином и нейротензином. Материалы и методы.
Данные поверхностного плазмонного резонанса (ППР) собирали при скорости сканирования 1 Гц при 25°С на приборе BiaCore T200. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения BiaCore T200, версия 2.0. Использовали HBS-EP+ (100 мМ HEPES, 1, 5 M NaCl, 30 мМ ЭДТК, 0,5% об/об поверхностно-активного вещества P20, pH 7,4) в качестве подвижного буфера и для подготовки реактивов.
Меченый гистидином сортилин человека (25 нМ; R&D Systems) захватывали (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 0 с) на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare), иммобилизированном с антигистидиновым IgG. Програнулин человека (PGRN; 50 нМ; AdipoGen), содержавший 0 нМ, 100 нМ или 500 нМ нейротензина (NTS; Sigma), затем пропускали через поверхность с захваченным сортилином (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 30 с). Поверхность чипа регенерировали между циклами с использованием 10 мМ глицин-HCl, pH 1,7 (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время стабилизации 60 с). Получали результирующий сигнал ППР как разность в ответе от измерений, выполненных на пустой проточной ячейке.
Антитела против сортилина S-15 (25 нМ), S-22 (25 нМ), S-49 (25 нМ) и S-60 (25 нМ) захватывали (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 0 с) на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare), иммобилизированном с античеловеческим IgG (Jackson Labs). Сортилин человека (100 нМ; R&D Biosystems), предварительно инкубировали с 0 нМ, 100 нМ, 500 нМ или 10000 нМ нейротензина (NTS; Sigma) и затем пропускали через поверхность с захваченным антителом к сортилину (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время диссоциации 30 с). Поверхность чипа регенерировали между циклами с использованием 10 мМ глицин-HCl, pH 1,7 (время контактирования 60 с, скорость потока 30 мкл/мин, время стабилизации 60 с). Получали результирующий сигнал ППР как разность в ответе от измерений, выполненных на пустой проточной ячейке.
Результаты.
Как показано на фиг. 17A, соместное введение нейротензина блокировали связывание рекомбинантного програнулина человека (PGRN) с сортилином человека, подтверждая, что PGRN и нейротензин связывается с тем же сайтом на сортилине. Для исследования того, связывается ли антитела против сор
- 147 043015 тилина (S-15, S-22, S-49 и S-60) с тем же сайтом на сортилине, что и нейротензин, захватывали антитела на чипе и затем совместно вводили различные дозы нейротензина с предварительно инкубированным сортилином. Наблюдали только минимальное снижение связывания с сортилиновым антигеном антител S-15, S-22 и S-49 (фиг. 17B, 17C и 17D). Тем не менее не наблюдали снижение связывания S-60 с сортилином (фиг. 17E). Как показано в примере 4, антитело S-60 представляет собой PGRN-блокирующее антитело, которое блокирует связывание PGRN с сортилином. Результат указывает, что антитела S-15, S22, S-49 и S-60 не связывают сортилин в сайте связывания нейротензина. Так как нейротензин может блокировать связывание PGRN с сортилином, но не антитело S-60, то считается, что способность антитела S-60 блокировать связывание PGRN с сортилином достигается путем связывания S-60 возле сайта связывания PGRN на сортилине, и вероятно скорее закрывает сайт связывания PGRN путем стерического блокирования, чем прямой конкуренцией с сайтом связывания PGRN на сортилине. Кроме того, антитела S-15, S-22, S-49 и S-60, представленные бинами 2, 3, 4 и 5 (n. d.), предположительно соответствующие перечисленным в примерах 1 и 23 антителам против сортилина, принадлежащим бинам 2, 3 и 4, также не связывают сортилин в сайте связывания нейротензина.
Пример 26. Снижение уровней сортилина в клетках.
Материалы и методы.
Первичные моноциты человека выделяли из гепаринизированной крови человека (Центры получения крови на тихоокеанском побережье) с использованием смеси для обогащения моноцитов человека RosetteSep (STEMCELL Technologies), в соответствии с протоколом производителя. Моноциты высаживали на RPMI (Invitrogen), содержащую 10% фетальной сыворотки теленка (Hyclone) и либо 50 мкг/мл М-КСФ (Peprotech) для индукции дифференцировки в макрофаги, либо 100 мкг/мл IL-4+100 мкг/мл ГМКСФ (Peprotech) для индукции дифференцировки в дендритные клетки. Через 5 дней клетки собирали. Для макрофагов собирали только клетки, прикрепленные к планшету с использованием скребка для клеток. Для дендритных клеток собирали клетки в суспензию. После промывки в ФСБ, клетки высевали по 0,4 Mi/лунку в 12-луночные планшеты.
К каждой лунке добавляли пятьдесят наномолей полноразмерного антитела (IgG) против сортилина или Fab антитела против сортилина и инкубировали в течение 48 ч. Затем клетки лизировали на льду с использованием буфера RIPA (Thermo Fisher Scientific) с ингибиторами протеаз (Life Technologies). Собирали лизаты и центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин при 4°C. Собирали супернатанты и измеряли концентрацию белка с использованием набора BCA в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Pierce). Использовали следующие антитела против сортилина: S-2-11, S-5, S-15-6, S-22-9, S-60 и S-82-8.
Наносили пятьдесят микрограмм белка на дорожку в геле для белков 4-12% Bolt Bis-Tris (Life Technologies) и анализировали в течение 45 мин при 150 В. Переносили белок на мембрану PVDF с использованием iBlot в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Затем мембрану промывали в TBS+0,05% тритона (TBST) и блокировали в течение по меньшей мере одного часа при КТ в TBST+5% БСА. Сортилин метили с использованием антитела к нейротензину (BD Biosciences, 1:200), а актин с использованием антитела к бета-актину (Santa Cruz, 1: 500), разбавленными в TBST, с инкубацией в течение ночи при 4°C. Затем мембраны промывали три раза TBST и инкубировали в течение одного часа при КТ со вторичным антимышиным антителом, конъюгированным с HRP (Jackson Laboratories). Мембраны снова промывали три раза в TBST и инкубировали в течение 1 мин в реагенте для выявления ECL Western (GE Life Sciences) и проводили визуализацию на устройстве Amersham Imager 600 (GE Life Sciences).
Результаты.
По сравнению с контролями (контроль, контрольный IgG1 человека и Fab IgG1 человека) обработка 50 нМ полноразмерных антител или фрагментов Fab против S-2-11, S-15-6, S-22-9 и S-82-8 приводит к сильному снижению экспрессии белка сортилина в первичных макрофагах человека (фиг. 18A) и первичных дендритных клетках человека (фиг. 18B) в пределах 48 ч. Антитело против сортилина S-60 индуцировало только слабое снижение экспрессии белка сортилина в первичных моноцитах человека, несмотря на его способность почти полностью убирать уровни сортилина на клеточной поверхности (фиг. 18A и 18B). Антитело против сортилина S-5 не индуцировало снижение экспрессии белка сортилина в первичных моноцитах человека (фиг. 18A и 18B). Результаты с антителом S-5 согласуются с неспособностью антитела S-5 снижать уровни сортилина на клеточной поверхности в клетках U-251 (пример 5 и фиг. 10). Эти результаты показывают, что антитело против сортилина S-5 представляет собой чистый блокатор связывания PGRN.
Для получения результатов, изображенных на фиг. 18, показывают, что первичные миелоидные клетки, полученные из образцов крови пациентов, можно использовать для измерения активности in vivo антител против сортилина, которые снижают уровни белка сортилина. Были также продемонстрированы сходные результаты in vivo с мышами.
Пример 27. Определение параметров взаимодействия между сортилином и програнулином in vivo. Материалы и методы.
Рекомбинантные антитела против сортилина клонировали в экспрессионных плазмидах и продуци- 148 043015 ровали в клетках HEK293T стандартными процедурами, как описано в William J. Harris & John R. Adair,
Eds. (Antibody Therapeutics, 1997). Экспрессионные плазмиды, в которых клонировали антитела, содержали консенсусную последовательность константных участков тяжелой и легкой цепи IgG1 человека или мыши, включая мутацию N297A в Fc тяжелой цепи, которая предотвращает гликозилирование антитела.
Мышам C57BL6 (Taconic), мышам с нокаутом по сортилину или гетерозиготным по сортилину мышам внутрибрюшинно вводили 40 мг/кг IgG на день 0. Использовали следующие антитела против сортилина: S-2-11, S-15-6, S-20 и S-30.
Для выделения плазмы и лейкоцитов собирали кровь через 4 ч на дни 2, 5, 8 и 12. Для выделения плазмы собирали кровь в гепаринизированные пробирки и центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин при 4°C. Собирали супернатант плазмы для хранения при -80°C. Для последующего выделения лейкоцитов добавляли 1х объем ФСБ+1 мМ ЭДТК и клетки ресуспендировали на вихревой мешалке. Добавляли 10х объем 1х лизирующего буфера АСК (Lonza) и клетки инкубировали на льду в течение 10 мин и впоследствии центрифугировали при 500xg в течение 10 мин при 4°C. Удаляли супернатант и клетки ресуспендировали в 10х объеме лизирующего буфера ACK (Lonza) и снова инкубировали на льду в течение 5 мин и впоследствии центрифугировали при 500xg в течение 10 мин при 4°C. Клетки промывали в 1 мл ФСБ+1 мМ ЭДТК, снова центрифугировали и отбрасывали супернатант, а осадок клеток хранили при -80°С.
Для выделения белка из лейкоцитов осадки клеток ресуспендировали в 50 мкл N-Per (Thermo Scientific Pierce), содержавшем смесь ингибиторов протеаз. Раствор инкубировали на льду в течение 20 мин и центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин при 4°C. Собирали супернатант, проводили измерение методом ВСА и наносили на гель для белка, как описано в предыдущем разделе. Уровни антител IgG1 человека в плазме определяли с использованием разработанного анализа ELISA. Вкратце, 96-луночные планшеты покрывали в течение ночи при 4°C 0,1 мкг/лунку антитела козла к фрагменту Fab человека, специфического к IgG (Jackson Immuno). Планшеты промывали три раза в 200 мкл промывочного буфера (ФСБ+0,05% Tween) и блокировали в буфере для связывания (ФСБ+1% БСА) в течение 1 ч при КТ. Разбавляли плазму в буфере для связывания и добавляли к блокированным планшетам и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Впоследствии планшеты промывали три раза в 200 мкл промывочного буфера и инкубировали со специфическим к Fc вторичным античеловеческим антителом, конъюгированным с HRP (Jackson Immuno Research), разбавленным 1:10000 в буфере для связывания в течение 1 ч при КТ. Промывали планшеты три раза в промывочном буфере, а затем добавляли 100 мкл субстрата TMB и инкубировали до достаточного развития окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2 N серной кислоты и планшет считывали на считывающем устройстве для планшетов Synergy H1 (Biotek). Применяли контрольное антитело IgG1 как стандарт в концентрации 16-1000 пМ. Уровни антител IgG1 мыши исследовали с использованием сходных параметров ELISA. Планшеты покрывали 0,1 мкг/лунку рекомбинантным белком сортилином мыши (R&D Systems) и использовали специфический к Fc антимышиный IgG козла (Jackson Immuno Research) в качестве антитела для выявления при разведении 1:10000 в буфере для связывания (ФСБ+3% БСА). Введенное антитело применяли как стандарт в концентрации 37-3000 пМ.
Уровни програнулина (PGRN) мыши измеряли с использованием набора Duoset ELISA от R&D Systems в соответствии с протоколом производителя. Уровни белка сортилина измеряли в лизатах лейкоцитов с использованием вестерн-блоттинга и проводили их количественное определение, как описано в примере 25.
Для ICV-вливания в головной мозг мыши имплантировали подкожно мышам осмотические мининасосы Alzet (модель 1002, скорость потока=0,25 мкл/ч), которые покрывали и предварительно заполняли антителом (2 мг/мл) и присоединяли к канюле Alzet (набор 3 для вливания в головной мозг) для одностороннего ICV-введения. Перед хирургической операцией мининасосы заправляли, следуя предоставленным Alzet указаниям. Вкратце, все пакеты, бутылки, шприцы и перчатки опрыскивали 70% этанолом. Мининасос заполняли требуемым исследуемым образом, используя чистую иглу и шприц. Затем его очищали пропитанной изопропанолом тканью и помещали в контейнер со стерильным 0,9% физиологическим раствором на ночь при 37°С для заправки насосов.
Мышей подвергали эвтаназии с использованием изофлурана+кислород с использованием испарителя, оборудованного маской. После этого каждую мышь помещали в стереотаксическую рамку на площадку с регулируемым подогревом. Во время нахождения на стереотаксической рамке мыши продолжали получать анестезию изофлураном через носовой конус. Затем мыши получали местное применение маркаина (бупивакаин+эпинефрин) в месте надреза на черепе. Кожу, покрывающую череп, очищали хирургической марлей и бетадиновым скрабом, а затем протирали 75% этанолом на хирургической марле. Использовали скальпель для нанесения по средней сагитальной линии надреза, длиной 1 см, покрывающей череп кожи, открывающего кость. Для очистки от крови в хирургическом поле использовали стерильные ватные палочки с O, 9% физиологическим раствором или 3% H2O2. Использовали кровеостанавливающий зажим для захвата лоскутов и для бокового оттягивания кожи. Сразу после соскребания скальпелем соединительнотканной оболочки и надкостницы представилась возможность визуализиро- 149 043015 вать брегму. Сначала мининасос имплантировали подкожно вдоль лопатки/спины, либо слева, либо справа от позвоночника. Далее расположение отмечали окончатый дефект концом скальпеля или острым концом маркера и сверлили отверстие в черепе ручной дрелью, соблюдая осторожность, чтобы не повредить нижележащую твердую оболочку или ткань головного мозга. В боковой вентральный отдел или гиппокамп вставляли канюлю Alzet (набор 3), присоединенную к мининаносу. Координаты концов канюлю для бокового вентрально отдела следующие: передний-задний (АР)=-0,3 мм до брегмы, срединнобоковой (ML)=-1,0 мм от средней линии и вентральный (V)=-l,7 мм до твердой оболочки, установка зубца на 0 мм. После хирургической операции мышей поселяли отдельно в клетки и обеспечивали пищей и водой ad libitum. После хирургической операции состояние мышей отслеживали ежедневно. В момент времени завершения всех мышей подвергали эвтаназии. После эвтаназии или спонтанной смерти открывали место имплантации мининасоса и записывали наблюдения, включая любые признаки некроза или накопления жидкости.
Для перитонеальных инъекций мышам антитела в стерильном ФСБ вводили либо внутрибрюшинно (IP) либо внутривенно (IV) в соответствии со стандартными процедурами. Отбирали образцы крови по 50-200 мкл и собирали их в гепаринизированные пробирки. Впоследствии центрифугировали образцы крови в течение 10 мин при 2000xg при 4°C и собирали плазму.
Головной мозг рассекали на левый и правый гиппокамп, лобную кору и затылочную кору. Для получения лизатов головного мозга добавляли 20 мкл N-Per/мг ткани вместе с ингибиторами протеаз и фосфатаз. Ткани и клетки разрушали приборами для ультразвуковой обработки. После разрушения инкубировали смесь ткани и N-per на льду в течение 30 мин и впоследствии центрифугировали при 20000xg в течении 30 мин. Супернатант собирали и до анализа хранили при -80°C. Уровни антител против сортилина и PGRN мыши в образцах лизатов головного мозга измеряли с использованием анализов ELISA.
Результаты.
Антитела против сортилина S-2-11, S-15-6, S-20 и S-30 инъецировали мышам внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг на день 0. Уровни антител измеряли в дни 0 (4 ч после инъекции), 2, 5, 8 и 12 с использованием разработанных анализов ELISA. Измеряли периоды полувыведения из сыворотки с использованием разработанной дополнительной программы Excel. Как показано на фиг. 19A, антитело S-20, как huIgG1 N297A, имеет период полувыведения равный 0,9 суток, тогда как изотипное контрольное антитело (huIgG1N297A) имеет период полувыведения равный 4,2 суток. В этих экспериментах применяли мышиные или человеческие антитела IgG1 N297A, которые имели мутацию N297A в своем Fc-участке, которая предотвращает гликозилирование и таким образом связывание с рецептором Fc.
Как показано на фиг. 19B, варианты мышиного IgG1 N297A в виде антител против сортилина S-211, S-15-6, S-20 и S-30 имели периоды полувыведения в диапазоне от 0,5 суток до 2,0 суток.
Антитела против сортилина имели более короткий период полувыведения, чем контрольный IgG, который предположительно является результатом захвата мишени. Как показано на фиг. 19, антитела S15-6 и S-20 имеют самые длительные периоды полувыведения из антител против сортилина.
Затем антитела против сортилина исследовали для определения их возможности индуцирования изменений уровней белка PGRN в плазме крови мышей, используя набор для PGRN Duoset ELISA (R&D Systems). Антитела против сортилина S-2-11, S-15-6 и S-20, которые индуцируют снижение уровней сортилина в клетках (фиг. 10 и 18), также были способны индуцировать приблизительно 4-кратное увеличение уровней белка PGRN в плазме крови мышей (фиг. от 20A до 20D). Когда увеличение уровней белка PGRN, индуцируемый антителом S-2-11, оказывается кратковременным, антитела S-20 и S-15-6 индуцируют значимое увеличение уровней белка PGRN вплоть до 8 суток (фиг. от 20A до 20D). Чистое блокирующее связывание PGRN антитело, S-30, также способно значительно увеличивать уровни PGRN через 4 часа (фиг. 20A и 20B). Результаты дают возможность предположить, что блокирующие PGRN антитела против сортилина, которые не индуцируют снижение клеточных уровней сортилина, также увеличивают уровни белка PGRN. Тем не менее, антитела против сортилина, которые индуцируют снижение клеточных уровней сортилина, такие как антитела S-15-6 и S-20, и которые также способны индуцировать пролонгированное влияние на уровни белка сортилина, по сравнению с антителами против сортилина, которые только блокируют взаимодействие между сортилином и PGRN, считаются более подходящими для исследований эффективности in vivo.
Для подтверждения, того что увеличение уровней белка PGRN, индуцированного антителами против сортилина S-2-11, S-15-6 и S-20, происходило благодаря индукции снижения клеточных уровней сортилина, лизаты из образцов лейкоцитов, полученных из леченных мышей, анализировали на геле для белков и исследовали вестерн-блоттингом. Через пять дней после инъекции антитела S-2-11, S-15-6 и S20 индуцировали сильное снижение уровней белка сортилина в лейкоцитах (фиг. 21A и 21B). Образцы лейкоцитов, взятых у мышей через двенадцать дней после лечения антителами S-2-11, S-20 и S-30, показали уровни белка сортилина, который вернулся к контрольным уровням (фиг. 21C и 21D). Однако образцы лейкоцитов, взятых у мышей через двенадцать дней после лечения антителом S-15-6 все еще показывали пониженные уровни белка сортилина (фиг. 21C и 21D). Оказалось, что антитело S-30 не индуци- 150 043015 рует снижения уровней белка сортилина (фиг. 21A-21D), что согласуется с результатами in vitro (табл.
10). Антитело против сортилина S-30 представляет собой специфический блокатор PGRN.
Для измерения захвата мишени после длительных инъекций, мышам инъецировали раз в неделю в течение шести недель 20, 40 или 80 мг/кг антитела S-15-6 или контрольного антитела msIgG1. Через 35 дней выделяли лейкоциты из образцов цельной крови. Сильное снижение уровней белка сортилина наблюдали в образцах, полученных от мышей, при всех инъецированных дозах (фиг. 21E и 21F). Эти результаты показывают, что может быть достигнут длительный захват мишени.
Для измерения захвата мишени антителами к сортилину в головном мозге, варианты N297A IgG1 человека антител против сортилина S-15, S-20, S-30, а также изотипных контрольных антител человека, вливали в правый боковой вентральный отдел головного мозга мышей, используя осмотический мининасос Alzet. Через две недели после вливания головной мозг рассекали на левосторонний и правосторонний гиппокамп, лобную кору и затылочную кору. Из этих областей получали лизаты и измеряли уровни IgG человека с использованием анализов ELISA. Как показано на фиг. от 22A до 22C, когда уровни антител (IgG) откладывали на графике относительно уровней белка PGRN, обнаружили сильную положительную корреляцию между этими двумя переменными, указывающую, что увеличенные дозы антитела против сортилина могут увеличивать уровни белка PGRN в головном мозге. Таких корреляций не наблюдали между уровнями контрольного IgG и уровнями белка PGRN (фиг. 22D).
Для определения того, индуцируется ли влияние антител против сортилина на уровни белка PGRN благодаря снижению уровней сортилина и нет ли каких-либо нецелевых влияний, исследовали вариант N297A IgG1 антитела S-15-6 (huIgG) на мышах с нокаутом (KO) по сортилину и однопометных гетерозиготных (Het) по сортилину мышах и однопометных мышах дикого типа (WT). В плазме измеряли уровни антитела S-15-6 и наблюдали, что период полувыведения антитела значительно увеличивался, когда уменьшались уровни экспрессированного сортилина (фиг. 23A). Результаты показывают, что антитело S15-6 специфически распознает сортилин и вероятно рециклируется и деградирует при рецепторном захвате (т.е. при связывании с сортилином).
Определяли также уровни PGRN у мышей с нокаутом по сортилину. У мышей с нокаутом (KO) по сортилину базовые уровни белка PGRN были в 4-раза выше, по сравнению с однопометными мышами дикого типа (WT) (фиг. 23B). В дополнение к этому, 40 мг/кг антитела S-15-6 инъецировали в виде однократной дозы мышам с нокаутом по сортилину, а также однопометным гетерозиготным (Het) мышам и однопометным мышам дикого типа (WT), и измеряли уровни белка PGRN с использованием анализов ELISA. Результаты на фиг. 23C показывают, что при инъекции антитела S-15-6 у мышей дикого типа и гетерозиготных по сортилину мышый сильно увеличились уровни белка PGRN, но не наблюдали дополнительного увеличения уровней белка PGRN у мышей с нокаутом сортилина, указывая, что антитело S15-6 увеличивает уровни белка PGRN исключительно путем снижения уровней белка сортилина.
Пример 28. Антитела против сортилина облегчают симптомы индуцированного коллагеном артрита у мышей.
Материалы и методы.
На дни 0 и 21 исследования мышей подвергали эвтаназии изофлураном и давали им внутрикожные инъекции в целом из 100 мкл коллагена II типа в полном адъюванте Фрейнда в основание хвоста. Коллаген готовили, делая раствор 4 мг/мл в 0,01 N уксусной кислоты. Путем смешивания вручную эмульгировали равные объемы коллагена и 5 мг/мл адъюванта Фрейнда. На день 0 исследования, мышей рандомизировали в группы лечения, на основе массы тела. После комплектования начинали лечение. Коллаген инъецировали на день 0 и 21. На дни 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 и 28 исследования внутрибрюшинно инъецировали 40 мг/кг антитела S-15-6 в виде IgG1 N297A мыши или контрольного антитела MOPC-21. Ежедневно вводили дозы дексаметазона.
После комплектования фиксировали массу тела и клиническую оценку в баллах для всех четырех лап мышей. Затем измеряли показатели для лап ежедневно со дня исследования 18 по 35. Общую эффективность исследуемых препаратов оценивали на основе ежедневных показателей для лап и расчета площади под кривой (AUC) показателей для лап с течением времени.
Клинические показатели для лап определяли следующим образом.
0=Нормальное состояние.
1=Поражен 1 сустав задней или передней лапы, или наблюдается минимальная диффузная эритема и расширение.
2=Поражены 2 сустава задней или передней лапы, или наблюдается слабая диффузная эритема и расширение.
3=Поражены 3 сустава задней или передней лапы, или наблюдается умеренная диффузная эритема и расширение.
4=3аметная диффузная эритема и расширение или поражены 4 пальцевых сустава.
5=Сильная диффузная эритема и сильное расширение целой лапы, неспособность сгибать пальцы.
Результаты.
Введение животным доз из 40 мг/кг антитела против сортилина S-15-6 привело к ограниченному, но статистически значимому снижению клинических показателей для лап, а также задержке на один день
- 151 043015 проявления заболевания (фиг. 24). В табл. 18А и 18В показаны p-значения, рассчитанные с использованием t-теста и двухфакторного анализа ANOVA, подтверждающие статистическую значимость результатов, изображенных на фиг. 24.
Таблица 18А Т-тест
Дни S15-6 (40) пс сравн. с ФСБ S15-6 (40) ПО сравн. с МОРС-21 МОРС-21
25 0, 299 о, 299 0, 797
26 о, 083 0 048 0, 905
27 о. 046 0 002 0, 417
28 о. 031 0 000 0, 263
29 о, 055 0 001 0, 252
30 о. 031 0 002 0, 368
31 о. 048 0 002 0, 188
32 о. 040 0 003 0, 279
33 о. 046 0 005 0, 335
34 о. 037 0 007 0, 474
35 о. 037 0 007 0, 474
Таблица 18В Двухфакторный анализ ANOVA
Отдельное сравнение р-значение
ФСБ по сравн. с наивным < 0, 0001
ФСБ по сравн. сМОРС-21 0, 8379
ФСБ по сравн. cDEX < 0, 0001
ФСБ по сравн. CS15-6 (40 мг/кг) 0, 0003
Эти результаты указывают, что индуцированное антителами против сортилина увеличение уровней програнулина может снижать клинические уровни артрита.
Пример 29. Определение параметров активности сортилина in vivo.
Материалы и методы.
Внутрибрюшинно инъецировали липополисахарид (LPS) из Е. coli 0111: В4 в дозах 0 мг/кг, 0,4 мг/кг и 4 мг/кг мышам возрастом 9-10 недель дикого типа С57В16 и мышам сортилин-/-(нокаут по сортилину). Через 1,5 часа и через 6 часов после введения LPS у мышей собирали образцы сыворотки. Затем оценивали уровни цитокинов и хемокинов с использованием набора для определения воспаления у мышей с цитометрическим массивом гранул BD, включающим IL-6, TNF альфа (TNF-α), IFN гамма (IFN-y), IL-10, IL12p70 и CCL2 и дополняющего набора, содержащего IL12/IL-23p40, IL-1 бета (IL-Ιβ), IL-1 альфа (IL-la), CXCL1, CCL3, CCL4 и CCL5. Через 6 часов после введения LPS для оценки миграции и инфильтрации клеток выполняли смыв брюшинной полости. Анализ выполняли с использованием системы BD FACSCanto II.
Результаты.
Результаты на фиг. 25А показывают, что через 6 часов после введения LPS сывороточные уровни програнулина были повышены у мышей с нокаутом по сортилину по сравнению с мышами дикого типа. В дополнение к этому, внутрибрюшинная инъекция 0 мг/кг, 0,4 мг/кг или 4 мг/кг LPS не оказывала влияния на сывороточные уровни програнулина (фиг. 25А). Как показано на фиг. 25b-25D, отсутствовали изменения в количестве нейтрофилов, больших перитонеальных (CD1 lb+F4/80hi) макрофагов или малых перитонеальных (CD1 lb+F4/801o) макрофагов.
Как показано на фиг. 26А-26Н, сывороточные уровни провоспалительных цитокинов IL-6, IL12p70, IL12p40 и IL-1 бета были уменьшены у мышей с нокаутом по сортилину через 1,5 часа после введения 4 мг/кг LPS, по сравнению с мышами дикого типа. Наблюдали увеличение сывороточных уровней противовоспалительного цитокина IL-10 у мышей с нокаутом сортилина, которым вводили О, 4 мг/кг LPS (фиг. 26D). Как показано на фиг. 27А-27Е, снижались уровни хемокинов, таких как CXCL1, CCL2, CCL3 и CCL5, которые отвечают за рекрутирование моноцитов, дендритных клеток, Т-клеток, нейтрофилов и других гранулоцитов, у мышей с нокаутом по сортилину через 1, 5 часа после введения LPS.
Как показано на фиг. 28А-28Н, у мышей с нокаутом по сортилину, которым за 6 часов вводили 0,4 мг/кг LPS, показано умеренное увеличение сывороточных уровней IL-6, а мышей с нокаутом по сорти- 152043015 лину, которым за 6 часов вводили 4 мг/кг LPS, показано уменьшение сывороточных уровней TNF альфа.
Как показано на фиг. 29Л-29Е, сывороточные уровни CCL2, CCL3 и CCL4 были снижены у мышей с нокаутом по сортилину, которым за 6 часов вводили LPS.
Результаты показывают, что увеличенные уровни програнулина у мышей с нокаутом сортилина могут обуславливать благоприятное влияние на ослабление воспалительного ответа на LPS. Антитела против сортилина, которые блокируют сортилин, обладают способностью поднимать уровни програнулина, которые также происходят у мышей с нокаутом по сортилина. Соответственно, считается, что антитела против сортилина по настоящему описанию могут обладать перекрывающимися действиями для мышей с нокаутом по сортилину, включая снижение провоспалительных цитокинов IL-6, TNF альфа, IL-12p40, и IL-1 бета; а также хемокинов CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5. Дополнительно считается, что антитела против сортилина могут также индуцировать дополнительные виды активности, индуцированные снижением или ингибированием сортилина, как это происходит у мышей с нокаутом по сортилину.
Перечень последовательностей < 110> ROSENTHAL, Arnon < 120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ СОРТИЛИНА И СПОСОБЫ
ИХ ПРИМЕНЕНИЯ < 130> 735022000240 < 140> Не назначено < 141> Согласовано настоящим <150> US 62/144270 <151> 2015-04-07 <160> 714 < 170> FastSEQ для системы Windows, версия 4.0 < 210> 1 <211> 830 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 1
Met Glu Arg Pro Trp Gly Ala Ala Asp Gly Leu Ser Arg Trp Pro His
5 1015
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Pro Pro Ser Thr Leu
2530
Ser Gln Asp Arg Leu Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Pro 35 4045
Arg Trp Ser Gly Pro Ile Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg Ala Ala Ala
5560
Ala Gly Gly Ala Phe Pro Arg Gly Gly Arg Trp Arg Arg Ser AlaPro
70 7580
Gly Glu Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val Ala LysLeu
9095
Ala Asn Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Val
100 105110
Ser Leu Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu Val Leu Thr
115 120125
Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln Ser Lys Leu
130 135140
Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile Thr AspLeu
145 150 155160
Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala Ile GlyPro
165 170175
Glu Asn Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser
- 153 043015
Arg
Gln
Gln 225 Val
Cys
Ala
Thr
Ser 305 Lys
Trp
Ile
Gly
Val 385 Glu
Ser
Gln
Asp
Ser 465 Glu
Ala
Tyr
Asp
Asn 545 Thr
Gly
Leu
Glu
Thr 625 Gln
Tyr
Phe
180
Gly Gly Arg 195
Thr Asp Leu 210
Asn Ser Asp
Ser Lys Asn
Leu Ala Lys 260
Asn Gly Ser 275
Ser Asp Leu 290
Phe Gly Leu
Asp Thr Thr
Ser Met Ala
340
Leu Ala Ala 355
Asp Thr Gly 370
Tyr Ser Lys
Thr Asp Phe
Val Leu Ser
420
Gly Gly Arg 435
Ala Thr Ala 450
Tyr Ser Ile
Pro Asn Ala
Ile Ser Val
500
Ser Trp Thr 515
Ser Gly Gly 530
Val Ile Lys
Phe Thr Arg
Ala Arg Ser 580
Thr Ser Gln 595
Arg Asn Cys 610
Asp Pro Glu
Phe Leu Arg
Val Val Thr
660
Leu Cys Asp 675
Ile Phe
Pro Phe
Tyr Leu
230 Phe Gly 245 Trp Gly
Cys Lys
Gly Lys
Gly Gly
310 Arg Arg 325 Gln Leu
Asn Asp
Phe Gly
Ser Leu
390 Thr Asn 405 Glu Asp
Trp Thr
Lys Asn
Ser Gln
470
Val Gly 485
Met Val
Lys Met
Ile Ile
Phe Ser
550 Asp Pro 565 Met Asn
Trp Val
Glu Glu
Asp Tyr 630
Leu Arg 645
Lys Gln
Phe Gly
185190
Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe 200205
His Pro Leu Thr Gln Met Met Tyr Ser 215220
Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu 235
Gly Lys Trp Glu Glu Ile His Lys Ala 250255
Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe Thr Thr 265270
Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Leu Trp 280285
Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val Lys Ile 295300
Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val Met Ala 315
Ile His Val Ser Thr Asp Gln Gly Asp 330335
Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln Phe Tyr 345350
Asp Met Val Phe Met His Val Asp Glu 360365
Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly 375380
Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly 395
Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile 410415
Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr Phe 425430
His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser Glu 440445
Lys Asn Glu Cys Ser Leu His Ile His 455460
Lys Leu Asn Val Pro Met Ala Pro Leu 475
Ile Val Ile Ala His Gly Ser Val Gly 490495
Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp Asp Gly 505510
Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr Thr Ile 520525
Val Ala Ile Glu His Ser Ser Arg Pro 535540
Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp Gln Thr 555
Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Ser Glu 570575
Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr Glu Ser 585590
Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys Asp Ile 600605
Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu Ala His 615620
Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly Tyr Lys 635
Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn Gly Arg 650655
Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser Leu Glu 665670
Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp Ser Lys 680685
Val
Pro
Trp 240 Val
Tyr
Arg
Tyr
Asp 320 Thr
Ser
Pro
Ile
Gly 400 Thr
Asp
Cys
Ala
Ser 480 Asp
Gly
Leu
Ile
Tyr 560 Pro
Phe
Leu
Ser
Glu 640 Asp
Asp
Cys
- 154 043015
Val Glu Gln Pro Glu 690
Gly Arg Glu Glu His 705
Asp Lys Cys Gln Gly
725
Lys Lys Lys Cys Thr 740
Lys Ser Asn Ser Val 755
Val Thr Val Val Ala 770
Gly Arg Phe Leu Val 785
Ala Asn Gly Val Asp
805
Asn Lys Ser Gly Tyr 820
Leu Lys 695 Gly His Asp Leu Glu 700 Phe Cys Leu Tyr
Leu 710 Thr Thr Asn Gly Tyr 715 Arg Lys Ile Pro Gly 720
Gly Val Asn Pro Val 730 Arg Glu Val Lys Asp 735 Leu
Ser Asn Phe Leu 745 Ser Pro Glu Lys Gln 750 Asn Ser
Pro Ile Ile 760 Leu Ala Ile Val Gly 765 Leu Met Leu
Gly Val 775 Leu Ile Val Lys Lys 780 Tyr Val Cys Gly
His 790 Arg Tyr Ser Val Leu 795 Gln Gln His Ala Glu 800
Gly His Val Asp Asp Asp Ala Ser 825 Leu 810 Asp Asp Glu Thr Asp Ala Leu Ser Leu 830 His 815 Thr
<210> 2 <211> 825 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 2
Met Glu Arg Pro Arg Gly Ala Ala Asp Gly Leu Leu Arg Trp Pro Leu 1 5 1015
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Pro Pro Ala Ala Val Gly Gln 20 2530
Asp Arg Leu Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Leu Leu Arg Trp 35 4045
Ala Gly Pro Val Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg Ala Ala Ala Pro Gly 50 5560
Gly Pro Val Pro Arg Ala Gly Arg Trp Arg Arg Gly Ala Pro AlaGlu
70 7580
Asp Gln Asp Cys Gly Arg Leu Pro Asp Phe Ile Ala Lys Leu ThrAsn
9095
Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Ser Gly Ser Val Ser Leu 100 105110
Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu Val Leu Thr Thr Phe 115 120125
Gln Val Pro Leu Val Ile Val Ser Phe Gly Gln Ser Lys Leu Tyr Arg 130 135140
Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile Thr Asn Leu IleAsn
145 150 155160
Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala Ile Gly Pro GluAsn
165 170175
Ser Gly Lys Val Ile Leu Thr Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser Arg Gly 180 185190
Gly Arg Val Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe Val Gln Thr 195 200205
Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met Tyr Ser Pro Gln Asn 210 215220
Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu Trp ValSer
225 230 235240
Lys Asn Phe Gly Glu Lys Trp Glu Glu Ile His Lys Ala Val CysLeu
245 250255
Ala Lys Trp Gly Pro Asn Asn Ile Ile Phe Phe Thr Thr His Val Asn 260 265270
- 155 043015
Gly
Asp
Gly 305 Thr
Met
Ala
Thr
Ser 385 Asp
Leu
Gly
Thr
Ser 465 Asn
Ser
Trp
Gly
Ile 545 Thr
Arg
Arg
Asn
Pro 625 Leu
Val
Cys
Gln
Glu 705 Cys
Lys
Asn
Val
Ser Cys Lys Ala Asp 275
Leu Gly Lys Thr Phe 290
Leu Gly Gly Arg Phe
310
Thr Arg Arg Ile His 325
Ala Gln Leu Pro Ser 340
Ala Asn Glu Asp Met 355
Gly Phe Gly Thr Ile 370
Lys Ser Leu Asp Arg
390
Phe Thr Asn Val Thr 405
Ser Glu Asp Asn Ser 420
Arg Trp Glu His Leu 435
Ala Lys Asn Lys Asn 450
Ile Ser Gln Lys Leu
470
Ala Val Gly Ile Val 485
Val Met Val Pro Asp 500
Ala Lys Met Leu Glu 515
Gly Ile Ile Val Ala 530
Lys Phe Ser Thr Asp
550
Gln Glu Pro Ile Tyr 565
Ser Met Asn Ile Ser 580
Gln Trp Val Ser Tyr 595
Cys Glu Glu Asp Asp 610
Gly Asp Tyr Lys Asp
630
Arg Leu Arg Lys Ser 645
Ala Lys Gln Pro Ser 660
Asp Phe Gly Tyr Phe 675
Pro Glu Leu Lys Gly 690
Glu His Leu Thr Thr
710
Gln Gly Gly Met Asn 725
Cys Thr Ser Asn Phe 740
Ser Val Pro Ile Ile 755
Val Ala Gly Val Leu
Leu Gly Ala Leu Glu 280
Lys Thr Ile Gly Val 295
Leu Phe Ala Ser Val
315
Val Ser Thr Asp Gln 330
Val Gly Gln Glu Gln 345
Val Phe Met His Val 360
Phe Thr Ser Asp Asp 375
His Leu Tyr Thr Thr
395
Ser Leu Arg Gly Val 410
Ile Gln Ser Met Ile 425
Arg Lys Pro Glu Asn 440
Glu Cys Ser Leu His 455
Asn Val Pro Met Ala
475
Ile Ala His Gly Ser 490
Val Tyr Ile Ser Asp 505
Gly Pro His Tyr Tyr 520
Ile Glu His Ser Asn 535
Glu Gly Gln Cys Trp
555
Phe Thr Gly Leu Ala 570
Ile Trp Gly Phe Thr 585
Thr Val Asp Phe Lys 600
Tyr Thr Thr Trp Leu 615
Gly Cys Ile Leu Gly
635
Ser Val Cys Gln Asn 650
Val Cys Pro Cys Ser 6 65
Arg Pro Glu Asn Ala 680
His Glu Leu Glu Phe 695
Asn Gly Tyr Arg Lys 715
Pro Ala Arg Glu Val 730
Leu Asn Pro Thr Lys 745
Leu Ala Ile Val Gly 760
Ile Val Lys Lys Tyr
Leu Trp Arg Thr Ser 285
Lys Ile Tyr Ser Phe 300
Met Ala Asp Lys Asp
320
Gly Asp Thr Trp Ser 335
Phe Tyr Ser Ile Leu 350
Asp Glu Pro Gly Asp 365
Arg Gly Ile Val Tyr 380
Thr Gly Gly Glu Thr
400
Tyr Ile Thr Ser Thr 415
Thr Phe Asp Gln Gly 430
Ser Lys Cys Asp Ala 445
Ile His Ala Ser Tyr 460
Pro Leu Ser Glu Pro
480
Val Gly Asp Ala Ile 495
Asp Gly Gly Tyr Ser 510
Thr Ile Leu Asp Ser 525
Arg Pro Ile Asn Val 540
Gln Ser Tyr Val Phe
560
Ser Glu Pro Gly Ala 575
Glu Ser Phe Ile Thr 590
Asp Ile Leu Glu Arg 605
Ala His Ser Thr Asp 620
Tyr Lys Glu Gln Phe
640
Gly Arg Asp Tyr Val 655
Leu Glu Asp Phe Leu 670
Ser Glu Cys Val Glu 685
Cys Leu Tyr Gly Lys 700
Ile Pro Gly Asp Lys
720
Lys Asp Leu Lys Lys 735
Gln Asn Ser Lys Ser 750
Leu Met Leu Val Thr 765
Val Cys Gly Gly Arg
- 156 043015
770
Phe Leu Val His Arg 785
Gly Val Glu Ala Leu 805
Asp Asp Ser Asp Glu 820
775
Tyr Ser Val Leu Gln 790
Asp Ser Thr Ser His
810
Asp Leu Leu Glu
825
780
Gln His Ala Glu Ala Asp
795 800
Ala Lys Ser Gly Tyr His
815 <210> 3 <211> 825 < 212> ПРТ < 213> Искусственная <220>
< 223> Синтетическая < 400> 3
Met Glu Arg Pro Arg 1 5
Gly Leu Leu Leu Leu 20
Asp Arg Leu Asp Ala 35
Ala Gly Pro Val Gly 50
Gly Pro Val Pro Arg 65
Asp Gln Asp Cys Gly 85
Asn Thr His Gln His 100
Ser Trp Val Gly Asp 115
Gln Val Pro Leu Val
130
Ser Glu Asp Tyr Gly 145
Asn Thr Phe Ile Arg 165
Ser Gly Lys Val Ile 180
Gly Arg Val Phe Arg 195
Asp Leu Pro Phe His 210
Ser Asp Tyr Leu Leu 225
Lys Asn Phe Gly Glu 245
Ala Lys Trp Gly Pro 260
Gly Ser Cys Lys Ala 275
Asp Leu Gly Lys Thr 290
Gly Leu Gly Gly Arg 305
Thr Thr Arg Arg Ile 325
Met Ala Gln Leu Pro 340
Ala Ala Asn Asp Asp последовательность конструкция
Gly Ala
Leu Gln
Pro Pro
Val Ser
Ala Gly 70 Arg Leu
Val Phe
Ser Thr
Ile Val
135 Lys Asn 150
Thr Glu
Leu Thr
Ser Ser
Pro Leu
215 Ala Leu 230 Lys Trp
Asn Asn
Asp Leu
Phe Lys
295 Phe Leu 310 His Val
Ser Val
Met Val
Ala Asp Gly Leu Leu 10
Leu Leu Pro Pro Ala 25
Pro Pro Ala Pro Pro 40
Trp Gly Leu Arg Ala 60
Arg Trp Arg Arg Gly 75
Pro Asp Phe Ile Ala 90
Asp Asp Leu Ser Gly 105
Gly Val Ile Leu Val 120
Ser Phe Gly Gln Ser
140
Phe Lys Asp Ile Thr 155
Phe Gly Met Ala Ile 170
Ala Glu Val Ser Gly 185
Asp Phe Ala Lys Asn 200
Thr Gln Met Met Tyr
220
Ser Thr Glu Asn Gly 235
Glu Glu Ile His Lys 250
Ile Ile Phe Phe Thr 265
Gly Ala Leu Glu Leu 280
Thr Ile Gly Val Lys
300
Phe Ala Ser Val Met 315
Ser Thr Asp Gln Gly 330
Gly Gln Glu Gln Phe 345
Phe Met His Val Asp
Arg Trp Pro Leu 15
Ala Val Gly Gln 30
Leu Leu Arg Trp 45
Ala Ala Pro Gly
Ala Pro Ala Glu 80
Lys Leu Thr Asn 95
Ser Val Ser Leu
110
Leu Thr Thr Phe 125
Lys Leu Tyr Arg
Asn Leu Ile Asn
160
Gly Pro Glu Asn 175
Gly Ser Arg Gly 190
Phe Val Gln Thr 205
Ser Pro Gln Asn
Leu Trp Val Ser 240
Ala Val Cys Leu 255
Thr His Val Asn
270
Trp Arg Thr Ser 285
Ile Tyr Ser Phe
Ala Asp Lys Asp 320
Asp Thr Trp Ser 335
Tyr Ser Ile Leu 350
Glu Pro Gly Asp
- 157 043015
Thr Gly
370 Ser Lys 385 Asp Phe
Leu Ser
Gly Arg
Thr Ala
450 Ser Ile 465
Asn Ala
Ser Val
Trp Ala
Gly Gly
530 Ile Lys 545 Ser Gln
Arg Ser
Arg Gln
Asn Cys
610 Pro Gly 625
Leu Arg
Val Ala
Cys Asp
Gln Pro
690 Glu Glu 705 Cys Gln
Lys Cys
Ser Ser
Val Val
770 Phe Leu 785 Gly Val
Asp Asp
355 Phe Gly
Ser Leu
Thr Asn
Glu Asp
420 Trp Glu 435 Lys Asn
Ser Gln
Val Gly
Met Val
500 Lys Met 515 Ile Ile
Phe Ser
Glu Pro
Met Asn
580 Trp Val 595 Glu Glu
Asp Tyr
Leu Arg
Lys Gln
660 Phe Gly 675 Glu Leu
His Leu
Gly Gly
Thr Ser
740 Val Pro 755 Ala Gly
Val His
Glu Ala
Ser Asp 820
Thr Ile
Asp Arg
390
Val Thr 405
Asn Ser
His Leu
Lys Asn
Lys Leu
470 Ile Val 485 Pro Asp
Leu Glu
Val Ala
Thr Asp
550
Val Tyr 565
Ile Ser
Ser Tyr
Asn Asp
Lys Asp
630
Lys Ser 645
Pro Ser
Tyr Phe
Lys Gly
Thr Thr
710 Met Asn 725
Asn Phe
Ile Ile
Val Leu
Arg Tyr
790 Leu Asp 805
Glu Asp
360365
Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly Ile Val Tyr 375380
His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Gly Glu Thr 395400
Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile Thr Ser Thr 410415
Ile Gln Ser Met Ile Thr Phe Asp Gln Gly 425430
Gln Lys Pro Glu Asn Ser Lys Cys Asp Ala 440445
Glu Cys Ser Leu His Ile His Ala Ser Tyr 455460
Asn Val Pro Met Ala Pro Leu Ser Glu Pro
475480
Ile Ala His Gly Ser Val Gly Asp Ala Ile 490495
Val Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Gly Tyr Ser 505510
Gly Pro His Tyr Tyr Thr Ile Leu Asp Ser 520525
Ile Glu His Ser Asn Arg Pro Ile Asn Val 535540
Glu Gly Gln Cys Trp Gln Ser Tyr Val Phe 555560
Phe Thr Gly Leu Ala Ser Glu Pro Gly Ala 570575
Ile Trp Gly Phe Thr Glu Ser Phe Leu Thr 585590
Thr Ile Asp Phe Lys Asp Ile Leu Glu Arg 600605
Tyr Thr Thr Trp Leu Ala His Ser Thr Asp 615620
Gly Cys Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Gln Phe 635640
Ser Val Cys Gln Asn Gly Arg Asp Tyr Val 650655
Ile Cys Pro Cys Ser Leu Glu Asp Phe Leu 665670
Arg Pro Glu Asn Ala Ser Glu Cys Val Glu 680685
His Glu Leu Glu Phe Cys Leu Tyr Gly Lys 695700
Asn Gly Tyr Arg Lys Ile Pro Gly Asp Arg 715720
Pro Ala Arg Glu Val Lys Asp Leu Lys Lys 730735
Leu Asn Pro Lys Lys Gln Asn Ser Lys Ser 745750
Leu Ala Ile Val Gly Leu Met Leu Val Thr 760765
Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg 775780
Ser Val Leu Gln Gln His Ala Glu Ala Asp 795800
Thr Ala Ser His Ala Lys Ser Gly Tyr His 810815
Leu Leu Glu
825 <210> 4 <211> 8
- 158 043015 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = S или T <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 2 < 223> Xaa = Любая аминокислота <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 3 < 223> Xaa = D или N <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4, 5, 6, 7 < 223> Xaa = Любая аминокислота <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = W, F или Y < 400> 4
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
5 <210> 5 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1, 2, 4, 6, 8, 11 < 223> Xaa = Любая аминокислота <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 3 < 223> Xaa = S или T <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = D или N <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 < 223> Xaa = T или S
- 159 043015 <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 10 <223> Xaa = W, F или Y <400> 5
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 <210> 6 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Tyr Leu Ala
5 10 <210> 7 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 7
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
5 10 <210> 8 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 8
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
5 10 <210> 9 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 9
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
5 10
- 160 043015 <210> 10 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 11
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
5 10 <210> 12 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 12
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
5 10 <210> 13 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
5 10 <210> 14 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 14
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
5 10
- 161 043015 <210> 15 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asn
5 10 <210> 16 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 16
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
5 10 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 20
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Leu Ala
5 10 <210> 21 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 162 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 21
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala <210> 22 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 22
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
5 10 <210> 23 <400> 23 000 < 210> 24 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe Leu Asn
5 10 < 210> 25 < 211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность < 220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 25
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
5 10 15
Ala <210> 26 < 211> 7 < 212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 163 043015 <400> 26
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210> 27 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 27
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
5 < 210> 28 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 28
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
5 < 210> 29 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 29
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
5 < 210> 30 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 30
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
5 <210> 31 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 164 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 31
Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser < 210> 32 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 32
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
5 < 210> 33 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 33
Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr
5 < 210> 34 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 34
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
5 < 210> 35 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 35
Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser
5 <210> 36 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 165 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 36
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
5 <210> 37 <211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 37
Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr
5 <210> 38 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 38
Leu Gly Ser His Arg Ala Ser <210> 39 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 39
Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr <210> 40 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 40
Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser <210> 41 <211> 6
- 166 043015 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 41
Gln Gln Ser Pro Trp Thr
5 <210> 42 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 42
Gln Gln Ser Asp Val Ser Pro Ile Thr <210> 43 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 43
Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Ile Thr <210> 44 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 44
Gln Gln Phe Arg Val Leu Pro Pro Thr <210> 45 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 45
Met Gln Val Ser Thr Glu Pro Pro Thr
- 167 043015 <210> 46 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 46
Gln Gln Val Ala Asn Tyr Pro Arg Thr <210> 47 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 47
Asp Gln Leu Gly Ser Ser Pro Arg Thr <210> 48 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 48
Gln Gln Ala Lys Val Trp Pro Tyr Thr <210> 49 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 49
Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr <210> 50 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 50
Gln Gln Tyr Ala Asp Trp Pro Pro Ile Thr
5 10
- 168 043015 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 52
Gln Gln Tyr Asn Asn His Pro Pro Thr <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 54
Gln Gln His Tyr Val Gly Pro Phe Thr <210> 55 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 55
Gln Gln Ala Arg Leu Gly Pro Trp Thr <210> 56 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 56
Gln Gln Gly Asn Ser Tyr Pro Ile Thr
- 169 043015 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 58
Gln Gln Gly Ala Asn Ala Pro Pro Arg Thr
5 10 <210> 59 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 59
Gln Gln Thr Asp Gly Lys Pro Pro Thr < 210> 60 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 60
Gln Gln Tyr Asp Gly Phe Pro Ile Thr
5 <210> 61 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 61
Gln Gln Lys Ala Ser Leu Pro Phe Thr <210> 62 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 170 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 62
Gln Gln Ala Asp Gly His Ile Thr
5 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 64
Gln Gln Val Ala Val Ser Pro Ile Thr <210> 65 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 65
Gln Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Ile Thr <210> 66 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 66
Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
- 171 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 68
Met Gln Arg Leu Gln Ser Pro Leu Arg Thr
5 10 <210> 69 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 69
Met Gln Arg Ile Gln Gly Pro Pro Arg Thr
5 10 < 210> 70 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 70
Met Gln Ala Leu Gly Pro Pro Ile Thr
5 <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 72
Met Gln Gly Ile Glu Thr Pro Pro Thr
5 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 172 043015 <400> 74
Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Thr
5 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 79
Met Gln Ala Ile Gln Gly Pro Ile Thr <210> 80 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 80
Gln Gln Arg Ser Ala Leu Pro Phe Thr <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <211> 9 < 212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 173 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 82
Gln Gln Ala Leu Arg Ser Pro Leu Thr
5 <210> 83 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 83
Gln Gln Leu Gly Ser His Pro Pro Thr <210> 84 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 84
Gln Gln Leu Asp Ser Ser Pro Ile Thr <210> 85 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 85
Gln Gln Ser Gly Ser Val Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
- 174 043015 <400> 88
Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Pro Ile Thr
5 <210> 89 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 89
Gln Gln Ala Gly Asp Tyr Pro Pro Thr <210> 90 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 90
Met Gln Ala Leu Glu Arg Pro Pro Thr <210> 91 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 91
Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Ile Thr <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <211> 8 <212> ПРТ
- 175 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 95
Gln Gln Ala Asn Ala Leu Pro Thr <210> 96 <400> 96 000 <210> 97 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 97
Glu Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Ile Thr <210> 98 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 98
Gln Gln Asp Arg Lys Gly Pro Leu Thr <210> 99 <211> 10 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 99
Gln Gln His Gly Arg Leu Pro Pro Trp Thr
5 10 <210> 100 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 100
- 176 043015
Met Gln Gln Gln Glu Thr Pro Leu Thr <210> 101 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 101
Gln Glu Tyr Leu Asn Tyr Pro Ile Thr <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 103
Gln Gln Leu Gly Ile Ala Pro Ile Thr <210> 104 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 104
Gln Gln Leu Asp Ser Thr Pro Ile Thr <210> 105 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 105
Met Gln Ala Arg Asp Gly Pro Ile Thr <210> 106 <211> 10
- 177 043015 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 106
Glu Gln Ala Asn Ser Leu Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 107 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 107
Met Gln Arg Leu Glu Ala Pro Leu Thr <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 109
Gln Gln Ala Ala Asp Trp Pro Ile Thr <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 111
Gln Gln Ala Ala Ser Ser Pro Ile Thr <210> 112 <211> 10 <212> ПРТ
- 178 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 112
Gln Gln Ala Pro Ser Val Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 113 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 113
Gln Gln Ala Ser Val Tyr Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 114 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 114
Gln Gln Glu Thr Asn Met Pro Pro Ile Thr
5 10 <210> 115 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 115
Gln Gln Tyr Asn Ala Leu Pro Arg Thr <210> 116 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 116
Gln Gln Ser Tyr Arg Glu Pro Ile Thr <210> 117
- 179 043015 <400> 117 000 <210> 118 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 118
Gln Gln Tyr Ala Asn Ala Pro Ile Thr <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 121
Met Gln Ala Leu Asp Val Pro Leu Thr <210> 122 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 122
Gln Gln Ser His Val Ser Pro Trp Thr <210> 123 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
- 180 043015 <400> 123
Gln Gln Tyr Asn Ala Phe Pro Pro Thr
5 <210> 124 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 124
Met Gln Ala Ile Asp Thr Pro Pro Thr <210> 125 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 125
Glu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr <210> 126 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 126
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His <210> 127 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 127
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser <210> 128 <400> 128 000 <210> 129
- 181 043015 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 129
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met Ser <210> 130 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 130
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
5 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 133
Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Met His <210> 134 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 134
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His <210> 135 <211> 9
- 182 043015 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 135
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn <210> 136 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 136
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser <210> 137 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 137
Phe Thr Phe Ser Ser Ser Ala Met Ser <210> 138 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 138
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser <210> 139 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 139
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Ser
- 183 043015 <210> 140 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 140
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His <210> 141 <400> 141 000 < 210> 142 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 142
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
5 10 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 144
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
5 10 <210> 145 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 145
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr Trp Ser
5 10 <210> 146
- 184 043015 <400> 146 000 < 210> 147 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 147
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asp Tyr Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 148 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 148
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 149 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 149
Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
5 <210> 150 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 150
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 151 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 185 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 151
Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 152 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 152
Ser Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 1 5 10 15
Gly <210> 153 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 153
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 1 5 10 15
Gly <210> 154 <400> 154 000 <210> 155 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 155
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
Gln <210> 156 <211> 17 <212> ПРТ
- 186 043015 < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 156
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 157 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 157
Ser Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 158 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 158
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 159 <400> 159 000 <210> 160 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 160
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
Lys <210> 161
- 187 043015 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 161
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly <210> 162 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 162
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly <210> 163 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 163
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly <210> 164 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 164
Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 10 15
Gly <210> 165 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность
- 188 043015 <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 165
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15
Gly <210> 166 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 166
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15
Gly <210> 167 <400> 167 000 <210> 168 <400> 168 000 <210> 169 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 169
Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 <210> 170 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 170
Thr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
5 10 15
Lys
Lys
Ser
Ser <210> 171
- 189 043015 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 171
Ser Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 172 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 172
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 173 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 173
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 174 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 174
Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 175 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 175
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15
- 190 043015 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 177
Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 <210> 178 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 178
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 1 5 10 15
Gly <210> 179 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 179
Ala Arg Ser Pro Gly Gly Ala Thr Asp Gly Leu Val Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val <210> 180 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 180
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met
5 10 15
Val
Ser
Gln
Tyr
Asp
- 191 043015 <210> 181 <211> 15 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 181
Ala Arg Gly Gly Pro Gln Leu Arg Val Ala 10 Glu Tyr Phe Gln His 15
1 5
<210> 182 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 182 Ala Arg Arg His Arg 1 5 <210> 183 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 183 последовательность конструкция Ser Ser Thr Tyr Gly 10 последовательность конструкция Met Asp Val
Ala Arg Gly Val Gly 1 5 Met Asp Val Ser Thr Val Thr Leu 10 Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 15
< 210> 184 < 211> 18 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 184
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Gly Thr Thr Leu His Tyr Tyr Tyr Gly Met
5 10 15
Asp Val <210> 185 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 192 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 185
Ala Arg Gln Gly Gly His Asp Ser Pro Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15
Gly Met Asp Val <210> 186 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 186
Ala Arg Asp Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
5 10 15
Met Asp Val <210> 187 <400> 187 000 <210> 188 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 188
Ala Arg Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Trp Gly Trp Phe Asp Pro
5 10 <210> 189 <400> 189 000 <210> 190 <211> 22 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 190
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 191
- 193 043015 <211> 13 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 191
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Thr Arg Asp Phe Asp Leu
5 10 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 193
Ala Arg Asp Lys His Gly Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
5 10 15 <210> 194 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 194
Ala Arg Glu Ser Arg Ile Pro Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
5 10 15
Met Asp Val <210> 195 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 195
Ala Arg Glu Gly Arg Met Ser Gly Trp Tyr Tyr Ala Tyr Gly Met Asp
5 10 15
Val <210> 196 <211> 17 <212> ПРТ
- 194 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 196
Ala Arg Glu Arg Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
5 10 15
Val <210> 197 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 197
Ala Arg Gln Gly Arg Lys Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
5 10 15
Val <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 199
Ala Lys Pro Leu Tyr Arg Gly Gly Pro Phe Asp Ile
5 10 <210> 200 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 200
Ala Lys Gly Val Gly Gln Val Pro Ala Ser Val Ala Phe Asp Ile
5 10 15 <210> 201 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 195 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 201
Ala Arg Asp Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Lys Trp Asn Trp Phe Asp Pro
5 10 15 <210> 202 <400> 202 000 <210> 203 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 203
Ala Arg Gly Gly Leu Asp Arg Trp Gly Ser Phe Asp Ile
5 10 <210> 204 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 204
Ala Arg Gly Asp Gly Met Asp Val <210> 205 <400> 205 000 <210> 206 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 206
Ala Lys Arg Gly Tyr Pro Gly Tyr Pro Ala Phe Asp Ile
5 10 <210> 207 <400> 207
000
- 196 043015 <210> 208 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 208
Ala Lys Thr Gly Gly Thr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 <210> 209 <400> 209 000 <210> 210 <400> 210 000 <210> 211 <400> 211 000 <210> 212 <400> 212 000 <210> 213 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 213
Ala Lys Pro Leu Ser Ser Thr Gly Gly Gly Asn Ile
5 10 <210> 214 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 214
Ala Arg Glu Val Met Ala Arg Ala Arg Thr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15 <210> 215 <400> 215
000
- 197 043015 <210> 216 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 216
Ala Lys Leu Tyr Gln Gly Thr Pro Asp Phe Asp Leu
5 10
<210> 217 <211> 18 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 217
Ala Lys Val Gly Gly Met Tyr Asp Gly Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> <211> <212> <213> 218 14 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> <400> Синтетическая 218 конструкция
Ala Lys Thr Pro Ser 1 5 Ser Ile Tyr Ala Ala Gly Met Asp Val 10
<210> <211> <212> <213> 219 14 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая <400> 219 Ala Arg Val Arg Gly конструкция Tyr Gly Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <400> 221
000
- 198 043015 <210> 222 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 222
Ala Arg Glu Ser Gly Asp Arg Ala Thr Leu Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15
Gly Met Asp Val <210> 223 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 223
Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Leu Pro Tyr Tyr Tyr Tyr
5 10 15
Met Asp Val <210> 224 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 224
Ala Arg Asp Ala Tyr Glu Gly Arg Val Asp Val
5 10 <210> 225 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 225
Ala Lys Gly Leu Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Leu Tyr Tyr Pro Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Met Asp Val <210> 226 <400> 226
000
- 199 043015 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 229
Ala Arg Gly Arg Pro Glu Leu Gly Trp Asp Lys Tyr Phe Gln His
5 10 15 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 231
Ala Arg Gly Pro Leu Lys Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Phe
5 10 15
Phe Asp Tyr <210> 232 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 232
Ala Arg Gly Pro Pro Glu Leu Gly Lys Met Tyr Phe Gln His
5 10 <210> 233 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 200 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 233
Ala Arg Gln Gly Ser Ile Lys Gln Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15 <210> 234 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 234
Ala Arg Gly Ser Pro Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 15
Leu Phe Asp Ile <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 236
Ala Arg Ala Glu His Arg Gly Pro Arg Tyr Phe Asp Leu
5 10 <210> 237 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 237
Ala Arg Glu Gly Gln Leu Pro Thr Gly Thr Phe Asp Tyr
5 10 <210> 238 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 238
- 201 043015
Ala Arg Asp Val Gly Arg Thr Gly Pro His
5 10
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 239 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 239
Ala Arg Leu His Ser Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 241
Ala Arg Asp Arg Gly Gly Thr His Phe Gly Ala Asp His Tyr Tyr Tyr
5 10 15
Gly Met Asp Val <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <211> 13 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 243
Ala Arg Leu Pro Gly Tyr Pro Leu Gly Leu Phe Asp Ile
5 10 <210> 244 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 202 043015 <400> 244
Ala Arg Asp Arg Gly Arg Thr Glu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
5 10 15 <210> 245 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 245
Ala Arg Gly Val Gly Arg Tyr Arg Val Ala Asp Tyr
5 10 <210> 246 <211> 18 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 246
Ala Arg Asp Arg Gly Met Gly Pro Lys Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
5 10 15
Asp Val <210> 247 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 247
Ala Arg Gly Val Gly Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Gly Phe Asp Pro
5 10 15 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 249
Ala Arg Ser Leu Ala Met Ser Gly Ala Tyr Phe Asp Leu
5 10
- 203 043015 <210> 250 <400> 250 000 <210> 251 <400> 251 000 <210> 252 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 252
Ala Arg Glu Arg Trp Asp Leu Gly His Gly Met Asp Val
5 10 <210> 253 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 253
Ala Arg Gly Val Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp
5 10 15
Tyr <210> 254 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 254
Ala Arg Gly Ser Pro Thr Trp Leu Arg Asp Tyr Tyr Met Asp Val
5 10 15 <210> 255 <211> 12 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 255
Ala Arg Gly Gly Thr Thr Trp Leu Val Ala Asp Val
5 10
- 204 043015 <210> 256 <211> 18 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 256
Ala Arg Gly Arg Gly Arg Tyr Ser Tyr Gly Tyr His Lys Ala Ala 1 5 10 15
Asp Ile <210> 257 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 257
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys <210> 258 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 258
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys <210> 259 <211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 259
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
Phe
Gly
Gly
Gly <210> 260
- 205 043015 < 211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 260
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys <210> 261 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 261
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys <210> 262 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 262
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys <210> 263 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 263
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys <210> 264 <211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность
- 206 043015 <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 264
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys < 210> 265 < 211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 265
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys < 210> 266 < 211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 266
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys <210> 267 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 267
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys <210> 268 <211> 23 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
- 207 043015 <400> 268
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
<210> 269 последовательность
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная
<220> <223> Синтетическая <400> 269 Trp Tyr Gln Gln Lys конструкция Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 <210> 270 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 270 Trp Tyr Gln Gln Lys 10 последовательность конструкция Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 15 Tyr
1 5 <210> 271 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 271 Trp Tyr Leu Gln Lys 10 последовательность конструкция Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 15 Tyr
1 5 <210> 272 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 272 Trp Tyr Leu Gln Lys 10 последовательность конструкция Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 15 Phe
1 5 10 15
<210> 273 <211> 15 <212> ПРТ
- 208 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 273
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 274 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 274
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 <210> 275 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 275
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 276 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 276
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 20 25 30 <210> 277 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 277
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
Thr
Cys
Thr
Cys
- 209 043015 <210> 278 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 278
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 279 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 279
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 280 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 280
Gly Val Pro Asp 1
Leu Lys Ile Ser 20
Arg Phe Ser Gly 5
Arg Val Glu Ala
Ser Gly Ser Gly 10
Glu Asp Val Gly 25
Thr Asp Phe Thr 15
Val Tyr Tyr Cys 30 <210> 281 <211> 32 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 281
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 1 5
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 20
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
10 15
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30
- 210 043015 <210> 282 <211> 32 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 282
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys <210> 283 <211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 283
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10 < 210> 284 < 211> 26 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 284
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly < 210> 285 < 211> 26 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 285
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly <210> 286 <400> 286 000
- 211 043015 <210> 287 <211> 26 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 287
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
<210> 288 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 288
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25
<210> 289 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 289
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Gly < 210> 290 < 211> 26 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 290
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
25 <210> 291 <211> 26 <212> ПРТ
- 212 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 291
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly
25
Glu <210> 292 <211> 26 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 292
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
25
Gln <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 294
Gln 1 Leu Gln Leu Gln 5 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 10 Lys Pro Ser 15
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly
Glu <210> 295 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 295
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly
25
Glu <210> 296
- 213 043015 <211> 14 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 296
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
5 10 <210> 297 <211> 14 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 297
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
5 10 <210> 298 <211> 14 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 298
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10 <210> 299 <211> 14 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 299
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
5 10 <210> 300 <211> 14 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 300
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
5 10
- 214 043015 <210> 301 <211> 14 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 301
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
5 10 < 210> 302 < 211> 30 < 212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 302
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 303 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 303
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 304 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 304
Arg Val Thr Met 1
Leu Ser Ser Leu
Синтетическая конструкция
Thr Arg Asp Thr 5
Arg Ser Glu Asp
Ser Thr Ser Thr 10
Thr Ala Val Tyr 25
Val Tyr Met Glu
Tyr Cys <210> 305 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 215 043015
Thr Ser Thr Ala Tyr Met
15
Ala Val Tyr Tyr Cys <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 305
Arg Val Thr Ile 1
Leu Ser Ser Leu
Thr Ala Asp Glu Ser 5
Arg Ser Glu Asp Thr
Glu <210> 306 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 306
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 307 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 307
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 308 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 308
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
Gln
Gln
Gln <210> 309 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 216 043015 <400> 309
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30 <210> 310 <211> 30 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 310
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 311 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 311
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
5 10 < 210> 312 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 312
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10 < 210> 313 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 313
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
5 10 <210> 314
- 217 043015
Ser <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 314
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
5 10 <210> 315 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 315
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
5 10 <210> 316 <400> 316 000 <210> 317 <211> 105 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 317
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 65 7075
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Pro Trp Thr 85 9095
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu 80
Phe <210> 318 <211> 128 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая последовательность конструкция
- 218 043015 <400> 318
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Ser Pro 100
Tyr Gly Met Asp 115
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Asn Ser Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Gly Gly Ala Thr
Val Trp Gly Gln 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Asn Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Asp Gly Leu Val 105
Gly Thr Thr Val
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Gly Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Tyr Tyr Tyr 110
Thr Val Ser Ser 125
319
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 319
Asp Ile Gln Met 1
Asp Arg Val Thr 20
Leu Asn Trp Tyr 35
Tyr Ala Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Ile Thr Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Ser Leu Gln Ser 55
Thr Asp Phe Thr 70
Thr Tyr Tyr Cys 85
Gly Thr Lys Val
Ser Ser Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Lys Ala Pro
Gly Val Pro Ser 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Ser Asp 90
Glu Ile Lys 105
Ala Ser Val Gly 15
Ile Ser Ser Tyr 30
Lys Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Gln Pro 80
Val Ser Pro Ile 95 <210> 320 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 320
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
- 219 043015
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp 8590
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr 100105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115120
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Glu Gly Tyr Gly Met Asp 110
Ser Ser
321
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 321
Asp Ile Gln Met 1
Asp Arg Val Thr
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Lys Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Asp Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Ile Thr Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Ser Leu Glu Ser 55
Thr Glu Phe Thr 70
Thr Tyr Tyr Cys 85
Gly Thr Lys Val
Ser Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Lys Ala Pro
Gly Val Pro Ser 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Tyr Lys 90
Glu Ile Lys 105
Ala Ser Val Gly 15
Ile Ser Ser Trp 30
Lys Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Gln Pro 80
Ser Tyr Pro Ile 95 <210> 322 <211> 122 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 322
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Gly Pro Gln Leu Arg Val Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp 100 105110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120 <210> 323 <211> 107 <212> ПРТ
- 220 043015 < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 323
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Arg Val Leu Pro 85 9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 324 <211> 112 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 324
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 9095
Ser Thr Glu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105110
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Pro
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Val
Lys <210> 325 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 325
Gln Val Gln 1
Ser Val Lys
Tyr Met His 35
Gly Ser Ile
Синтетическая конструкция
Leu Val Gln 5
Val Ser Cys 20
Trp Val Arg
Asn Pro Asn
Ser Gly Ala
Lys Ala Ser 25
Gln Ala Pro 40
Ser Gly Gly
Glu Val Lys 10
Gly Tyr Thr
Gly Gln Gly
Thr Asn Tyr
Lys Pro Gly 15
Phe Thr Gly 30
Leu Glu Trp 45
Ala Gln Lys
Ala
Tyr
Met
Phe
- 221 043015
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Arg His
100
Gly Thr Thr Val 115
Thr Met Thr 70
Arg Leu Arg 85
Arg Ser Ser
Thr Val Ser
Arg Asp Thr Ser Ile 75
Ser Asp Asp Thr Ala 90
Thr Tyr Gly Met Asp 105
Ser
120
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Val Trp Gly Gln 110
326
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 326
Glu Ile Val Met 1
Glu Arg Ala Thr 20
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Gly Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Thr Arg Ala Thr 55
Thr Glu Phe Thr 70
Val Tyr Tyr Cys 85
Gly Thr Lys Val
Ala Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Gln Ala Pro
Gly Ile Pro Ala 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Val Ala 90
Glu Ile Lys 105
Val Ser Pro Gly 15
Val Ser Ser Asn 30
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Gln Ser 80
Asn Tyr Pro Arg 95 <210> 327 <211> 126 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 327
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Val Gly Ser Thr Val Thr Leu Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120125
- 222 043015 <210> 328 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 328
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg LeuGlu
70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Gln Leu Gly Ser SerPro
9095
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 329 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 329
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala 3540
Gly Ser Ile Ser Ala Tyr Asn Gly 5055
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr 6570
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser 85
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Gly Thr 100
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115120
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1015
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 2530
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45
Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 60
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 7580
Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Thr Leu His Tyr Tyr Tyr Gly Met 105110
Val Thr Val Ser Ser
125 <210> 330 <211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 330
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 10 15
- 223 043015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 2025
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 3540
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 5055
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 6570
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100105
Ser Gln Ser Val Ser Ser 30
Gly Gln Ala Pro Arg Leu 45
Gly Ile Pro Asp Arg Phe 60
Leu Thr Ile Ser Arg Leu 75
Gln Gln Ala Lys Val Trp 90 95
Glu Ile Lys
Ser
Leu
Ser
Glu 80 Pro <210> 331 <211> 127 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 331
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 2530
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045
Gly Ser Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 7075
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Gln Gly Gly His Asp Ser Pro Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120125 <210> 332 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 332
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro 85 9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
Ala
Tyr
Met
Leu
Tyr 80
Cys
Tyr
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Leu
- 224 043015
100
105 <210> 333 <211> 126 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 333
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 2530
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 7075
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Asp Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120125 <210> 334 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 334
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Trp Pro 85 9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Ala
Tyr
Met
Leu
Tyr 80
Cys
Gly
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Pro <210> 335 <400> 335 000 <210> 336 <400> 336 000
- 225 043015 <210> 337 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 337
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnSer
70 7580
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn His ProPro
9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 338 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 338
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Trp Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115120 <210> 339 <400> 339 000 <210> 340 <400> 340 000
- 226 043015 <210> 341 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 341
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 Asp Arg Val Thr 5 Ile Thr Cys Arg Ala 10 Ser Gln Ser Ile Ser 15 Ser Tyr
Leu Asn Trp 20 Tyr Gln Gln Lys Pro 25 Gly Lys Ala Pro Lys 30 Leu Leu Ile
Tyr Gly 35 Ala Ser Ser Leu Gln 40 Ser Gly Val Pro Ser 45 Arg Phe Ser Gly
Ser 50 Gly Ser Gly Thr Asp 55 Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Gln Pro
65 Glu Asp Phe Ala Thr 70 Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 His Tyr Val Gly Pro 80 Phe
Thr Phe Gly Gly 100 85 Gly Thr Lys Val Glu 105 90 Ile Lys 95
<210> 342 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 342
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 343 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая последовательность конструкция
- 227 043015 <400> 343
Glu Ile Val
Glu Arg Ala
Leu Ala Trp 35
Tyr Gly Ala 50
Ser Gly Ser 65
Glu Asp Phe
Thr Phe Gly
Met Thr Gln 5
Thr Leu Ser 20
Tyr Gln Gln
Ser Thr Arg
Gly Thr Glu 70
Ala Val Tyr 85
Gly Gly Thr 100
Ser Pro Ala
Cys Arg Ala 25
Lys Pro Gly 40
Ala Thr Gly 55
Phe Thr Leu
Tyr Cys Gln
Lys Val Glu 105
Thr Leu Ser 10
Ser Gln Ser
Gln Ala Pro
Ile Pro Ala 60
Thr Ile Ser 75
Gln Ala Arg 90
Ile Lys
Val Ser Pro 15
Val Ser Ser 30
Arg Leu Leu 45
Arg Phe Ser
Ser Leu Gln
Leu Gly Pro 95
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Trp <210> 344 <211> 107 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 344
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Tyr Pro 85 9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Trp
Ile
Gly
Pro 80 Ile <210> 345 <211> 120 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 345
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser 20 2530
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ser
Tyr
Met
Phe
Tyr 80
Cys
- 228 043015
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Thr Arg Asp Phe
100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
Asp Leu Trp Gly Arg 110 <210> 346 <400> 346 000 <210> 347 <400> 347 000 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 348
Glu Ile Val Leu 1
Glu Arg Ala Thr 20
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Asp Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Arg Thr Phe Gly
100
348
108
ПРТ
Искусственная
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Asn Arg Ala Thr 55
Thr Asp Phe Thr 70
Val Tyr Tyr Cys 85
Gly Gly Thr Lys
Ala Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Gln Ala Pro
Gly Ile Pro Ala 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Gly Ala 90
Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Pro Gly 15
Val Ser Ser Tyr 30
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Glu Pro 80
Asn Ala Pro Pro 95
349
123
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 349
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Ser Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Lys
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
His Gly Arg Arg
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Asn Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Gly Tyr Tyr Tyr
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Met Asp Val
- 229 043015
100 105
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
110 <210> 350 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 350
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 Asp Arg Val Thr 5 Ile Thr Cys Arg Ala 10 Ser Gln Ser Ile Ser 15 Ser Tyr
Leu Asn Trp 20 Tyr Gln Gln Lys Pro 25 Gly Lys Ala Pro Lys 30 Leu Leu Ile
Tyr Ser 35 Ala Ser Ser Leu Gln 40 Ser Gly Val Pro Ser 45 Arg Phe Ser Gly
Ser 50 Gly Ser Gly Thr Asp 55 Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Gln Pro
65 Glu Asp Phe Ala Thr 70 Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 Thr Asp Gly Lys Pro 80 Pro
Thr Phe Gly Gly 100 85 Gly Thr Lys Val Glu 105 90 Ile Lys 95
<210> 351 <211> 126 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 351
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Glu Ser Arg Ile Pro Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210> 352 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 230 043015
Синтетическая <223>
<400> 352
Glu Ile Val Met 1
Glu Arg Ala Thr 20
Tyr Leu Ala Trp 35
Ile Tyr Gly Ala 50
Gly Ser Gly Ser 65
Pro Glu Asp Phe
Ile Thr Phe Gly
100 конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys 40
Ser Ser Arg Ala 55
Gly Thr Asp Phe 70
Ala Val Tyr Tyr 85
Gly Gly Thr Lys
Gly Thr Leu Ser
Ala Ser Gln Ser
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro 60
Thr Leu Thr Ile 75
Cys Gln Gln Tyr 90
Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Pro Gly
Val Ser Ser Ser
Pro Arg Leu Leu 45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu 80
Asp Gly Phe Pro 95 <210> 353 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 353
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Arg Met Ser Gly Trp Tyr Tyr Ala Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
354
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 354
Asp Ile Gln Met 1
Asp Arg Val Thr 20
Leu Asn Trp Tyr 35
Tyr Ala Ala Ser 50
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Ile Thr Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Ser Leu Gln Ser 55
Ser Ser Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Lys Ala Pro
Gly Val Pro Ser 60
Ala Ser Val Gly 15
Ile Ser Ser Tyr 30
Lys Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
- 231 043015
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 75
Gln Gln Lys Ala Ser Leu Pro 90 95
Glu Ile Lys
105
Pro 80 Phe <210> 355 <211> 124 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 355
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser 20 2530
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045
Gly Ser Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Glu Arg Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Ser
Tyr
Met
Phe
Tyr 80
Cys
Asp <210> 356 <211> 106 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 356
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Gly His Ile 85 9095
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Trp
Ile
Gly
Pro 80
Thr <210> 357 <211> 124 <212> ПРТ
- 232 043015
Искусственная <213>
<220>
<223>
<400> 357
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly
100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val
120
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys
Ser Gly Gly Thr
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Ser Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser
Phe Ser Ser Tyr
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110 <210> 358 <400> 358 000 <210> 359 <400> 359 000 <210> 360 < 211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 360
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg LeuGlu
70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Val SerPro
9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 361 <211> 119 < 212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 233 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 361
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 2530
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr TyrCys
9095
Ala Lys Pro Leu Tyr Arg Gly Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
362
108
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 362
Glu Ile Val Leu 1
Glu Arg Ala Thr 20
Tyr Leu Ala Trp 35
Ile Tyr Gly Ala 50
Gly Ser Gly Ser 65
Pro Glu Asp Phe
Ile Thr Phe Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys 40
Ser Ser Arg Ala 55
Gly Thr Asp Phe 70
Ala Val Tyr Tyr 85
Gly Gly Thr Lys
Gly Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro 60
Thr Leu Thr Ile 75
Cys Gln Gln Tyr 90
Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Pro Gly 15
Val Ser Ser Ser 30
Pro Arg Leu Leu 45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu 80
Asp Ser Ala Pro 95 <210> 363 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 363
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 2530
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
- 234 043015
Ser Gly Ile Ser 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Lys Gly Val 100
Gly Gln Gly Thr 115
Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp 5560
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 7075
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 8590
Gly Gln Val Pro Ala Ser Val Ala Phe Asp 105110
Met Val Thr Val Ser Ser
120
Ser Val
Leu Tyr 80
Tyr Cys 95
Ile Trp
364
108
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 364
Asp Ile Gln Met 1
Asp Arg Val Thr
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Ala Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Ile Thr Phe Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Ile Thr Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Ser Leu Gln Ser 55
Thr Asp Phe Thr 70
Thr Tyr Tyr Cys 85
Gly Gly Thr Lys
Ser Ser Val Ser 10
Ala Ser Gln Gly 25
Gly Lys Ala Pro
Gly Val Pro Ser 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Gly Asn 90
Val Glu Ile Lys 105
Ala Ser Val Gly 15
Ile Asp Ser Trp 30
Lys Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Gln Pro 80
Ser Leu Pro Pro 95 <210> 365 <211> 123 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 365
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Lys Trp Asn Trp Phe Asp Pro 100 105110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115120
- 235 043015 <210> 366 <400> 366 000 <210> 367 <400> 367 000 <210> 368 <211> 113 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 368
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Thr Pro 15 Gly
Glu Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Leu Leu 30 His Ser
Asn Gly Tyr 35 Asn Tyr Leu Asp Trp 40 Tyr Leu Gln Lys Pro 45 Gly Gln Ser
Pro Gln 50 Leu Leu Ile Tyr Leu 55 Gly Ser Asn Arg Ala 60 Ser Gly Val Pro
Asp 65 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80
Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Val 90 Tyr Tyr Cys Met Gln 95 Arg
Leu Gln Ser Pro 100 Leu Arg Thr Phe Gly 105 Gly Gly Thr Lys Val 110 Glu Ile
Lys <210> 369 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 369
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Gly Leu Asp Arg Trp Gly Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115120
- 236 043015 <210> 370 <211> 113 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 370
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg
85 90 95
Ile Gln Gly Pro Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys <210> 371 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 371
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 372 <211> 115 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 372
- 237 043015
Glu Val Gln Leu Leu 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser 20
Ala Met Ser Trp Val 35
Ser Ala Ile Ser Gly 50
Lys Gly Arg Phe Thr 65
Leu Gln Met Asn Ser 85
Ala Arg Gly Asp Gly 100
Val Ser Ser
115
Glu Ser Gly Gly Gly 10
Cys Ala Ala Ser Gly 25
Arg Gln Ala Pro Gly 40
Ser Gly Gly Ser Thr 55
Ile Ser Arg Asp Asn 70
Leu Arg Ala Glu Asp 90
Met Asp Val Trp Gly 105
Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Gln Gly Thr Thr 110 Val Thr
<210> 373 <400> 373 000 <210> 374 <400> 374 000 <210> 375 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 375
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Ile Glu Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 376 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 376
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
Val Gln Pro Gly Gly
- 238 043015
Ser Leu
Ala Met
Ser Ala 50
Lys Gly 65
Leu Gln
Ala Lys
Gly Thr
Arg Leu 20
Ser Trp 35
Ile Ser
Arg Phe
Met Asn
Arg Gly
100 Met Val 115
Ser Cys
Val Arg
Ala Ser
Thr Ile 70
Ser Leu 85
Tyr Pro
Thr Val
Ala Ala
Gln Ala 40
Gly Gly 55
Ser Arg
Arg Ala
Gly Tyr
Ser Ser
120
Ser Gly 25
Pro Gly
Ser Thr
Asp Asn
Glu Asp 90
Pro Ala 105
Phe Thr Phe Ser Ser 30
Lys Gly Leu Glu Trp 45
Tyr Tyr Ala Asp Ser 60
Ser Lys Asn Thr Leu 75
Thr Ala Val Tyr Tyr 95
Phe Asp Ile Trp Gly 110
Tyr
Val
Val
Tyr 80
Cys
Gln <210> 377 <400> 377 000 <210> 378 <400> 378 000 <210> 379 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 379
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 65 7075
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro 85 9095
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu 80 Pro <210> 380 <211> 118 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15
Gly
- 239 043015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 3540
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly 5055
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 6570
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85
Ala Lys Thr Gly Gly Thr Tyr Gly 100
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 7580
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 105110 <210> 381 <400> 381 000 <210> 382 <400> 382 000 <210> 383 <400> 383 000 <210> 384 <400> 384 000 <210> 385 <400> 385 000 <210> 386 <400> 386 000 <210> 387 <400> 387 000 <210> 388 <400> 388 000 <210> 389 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 240 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 389
Asp Ile Val Met 1
Glu Pro Ala Ser
Asn Gly Tyr Asn 35
Pro Gln Leu Leu
Asp Arg Phe Ser 65
Ser Arg Val Glu
Ile Gln Gly Pro
100
Thr Gln Ser Pro 5
Ile Ser Cys Arg
Tyr Leu Asp Trp 40
Ile Phe Leu Gly 55
Gly Ser Gly Ser 70
Ala Glu Asp Val 85
Ile Thr Phe Gly
Leu Ser Leu Pro
Ser Ser Gln Ser
Tyr Leu Gln Lys
Ser Asn Arg Ala 60
Gly Thr Asp Phe 75
Gly Val Tyr Tyr 90
Gly Gly Thr Lys 105
Val Thr Pro Gly
Leu Leu His Ser
Pro Gly Gln Ser 45
Ser Gly Val Pro
Thr Leu Lys Ile 80
Cys Met Gln Ala 95
Val Glu Ile Lys 110 <210> 390 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 390
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Ser
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys Pro Leu 100 Ser Ser Thr Gly Gly 105 Gly Asn Ile Trp Gly 110 Gln Gly
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
391
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 391
Glu Ile Val Met 1
Glu Arg Ala Thr 20
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Asp Ala Ser 50
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Asn Arg Ala Thr 55
Ala Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Gln Ala Pro
Gly Ile Pro Ala 60
Leu Ser Pro Gly 15
Val Ser Ser Tyr 30
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
- 241 043015
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 75
Gln Gln Arg Ser Ala Leu Pro 90 95
Glu Ile Lys
105
Pro 80 Phe <210> 392 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 392
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 20 2530
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 4045
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 7075
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Glu Val Met Ala Arg Ala Arg Thr Tyr Gly Met Asp Val 100 105110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Tyr
Val
Val
Tyr 80
Cys
Trp <210> 393 <400> 393 000 <210> 394 <400> 394 000 <210> 395 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 395
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu
- 242 043015
70
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 85
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100
80
Tyr Cys Gln Gln Ala Leu Arg Ser Pro
95
Lys Val Glu Ile Lys
105 <210> 396 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 396
Glu Val Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu 20
Ala Met Ser Trp 35
Ser Ala Ile Ser 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Lys Leu Tyr 100
Thr Leu Val Thr 115
Leu Glu Ser Gly 5
Ser Cys Ala Ala
Val Arg Gln Ala 40
Gly Ser Gly Gly 55
Thr Ile Ser Arg 70
Ser Leu Arg Ala 85
Gln Gly Thr Pro
Val Ser Ser
Gly Gly Leu Val 10
Ser Gly Phe Thr 25
Pro Gly Lys Gly
Ser Thr Tyr Tyr 60
Asp Asn Ser Lys 75
Glu Asp Thr Ala 90
Asp Phe Asp Leu 105
Gln Pro Gly Gly 15
Phe Ser Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Val 45
Ala Asp Ser Val
Asn Thr Leu Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Trp Gly Arg Gly 110 <210> 397 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 397
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg LeuGlu
70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gly Ser HisPro
9095
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 398 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 243 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 398
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 3540
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly 5055
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 6570
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85
Ala Lys Val Gly Gly Met Tyr Asp 100
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115120
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1015
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 2530
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 7580
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Gly Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met 105110
Val Thr Val Ser Ser
125
399
108
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 399
Glu Ile Val Leu 1
Glu Arg Ala Thr 20
Tyr Leu Ala Trp 35
Ile Tyr Gly Ala 50
Gly Ser Gly Ser 65
Pro Glu Asp Phe
Ile Thr Phe Gly
100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys 40
Ser Ser Arg Ala 55
Gly Thr Asp Phe 70
Ala Val Tyr Tyr 85
Gly Gly Thr Lys
Gly Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro 60
Thr Leu Thr Ile 75
Cys Gln Gln Leu 90
Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Pro Gly 15
Val Arg Ser Ser 30
Pro Arg Leu Leu 45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu 80
Asp Ser Ser Pro 95 <210> 400 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 400
Glu Val Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu 20
Ala Met Ser Trp 35
Синтетическая конструкция
Leu Glu Ser Gly 5
Ser Cys Ala Ala
Val Arg Gln Ala 40
Gly Gly Leu Val 10
Ser Gly Phe Thr 25
Pro Gly Lys Gly
Gln Pro Gly Gly 15
Phe Ser Thr Tyr 30
Leu Glu Trp Val 45
- 244 043015
Ser Ala Ile Ser 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Lys Thr Pro
100
Gln Gly Thr Thr 115
Gly Ser Gly Gly Ser Thr 55
Thr Ile Ser Arg Asp Asn 70
Ser Leu Arg Ala Glu Asp
90
Ser Ser Ile Tyr Ala Ala 105
Val Thr Val Ser Ser
120
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Met Asp Val Trp Gly 110
401
109
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 401
Glu Ile Val Leu
Glu Arg Ala Thr 20
Tyr Leu Ala Trp 35
Ile Tyr Gly Ala 50
Gly Ser Gly Ser 65
Pro Glu Asp Phe
Pro Ile Thr Phe 100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys 40
Ser Ser Arg Ala 55
Gly Thr Asp Phe 70
Ala Val Tyr Tyr 85
Gly Gly Gly Thr
Gly Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro 60
Thr Leu Thr Ile 75
Cys Gln Gln Ser 90
Lys Val Glu Ile 105
Leu Ser Pro Gly 15
Val Ser Ser Ser 30
Pro Arg Leu Leu 45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu 80
Gly Ser Val Pro 95
Lys <210> 402 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 402
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Val Arg Gly Tyr Gly Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
- 245 043015 <210> 403 <400> 403 000 <210> 404 <400> 404 000 <210> 405 <400> 405 000 <210> 406 <400> 406 000 <210> 407 <211> 107 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность < 220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 407
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 4045
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnSer
70 7580
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp ProIle
9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
408
127
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 408
Gln Val Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu 20
Gly Met His Trp 35
Ala Val Ile Ser 50
Синтетическая последовательность конструкция
Val Glu Ser Gly 5
Ser Cys Ala Ala
Val Arg Gln Ala 40
Tyr Asp Gly Ser 55
Gly Gly Val Val 10
Ser Gly Phe Thr 25
Pro Gly Lys Gly
Asn Lys Tyr Tyr 60
Gln Pro Gly Arg 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Val 45
Ala Asp Ser Val
- 246 043015
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Arg Glu Ser
100
Gly Met Asp Val 115
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 7075
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 8590
Gly Asp Arg Ala Thr Leu Val Tyr Tyr 105
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
120125
Thr Leu Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Tyr Tyr Tyr 110
Ser Ser
409
108
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 409
Glu Ile Val Leu
Glu Arg Ala Thr 20
Tyr Leu Ala Trp 35
Ile Tyr Gly Ala 50
Gly Ser Gly Ser 65
Pro Glu Asp Phe
Pro Thr Phe Gly 100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys 40
Ser Ser Arg Ala 55
Gly Thr Asp Phe 70
Ala Val Tyr Tyr 85
Gly Gly Thr Lys
Gly Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro 60
Thr Leu Thr Ile 75
Cys Gln Gln Ala 90
Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Pro Gly 15
Val Arg Ser Ser 30
Pro Arg Leu Leu 45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu 80
Gly Asp Tyr Pro 95 <210> 410 < 211> 126 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 410
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Leu Pro Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210> 411
- 247 043015 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 411
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Glu Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
412
118
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 412
Gln Val Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu 20
Gly Met His Trp 35
Ala Val Ile Ser 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Ala Arg Asp Ala 100
Met Val Thr Val 115
Синтетическая последовательность конструкция
Val Glu Ser Gly 5
Ser Cys Ala Ala
Val Arg Gln Ala 40
Tyr Asp Gly Ser 55
Thr Ile Ser Arg 70
Ser Leu Arg Ala 85
Tyr Glu Gly Arg
Ser Ser
Gly Gly Val Val 10
Ser Gly Phe Thr 25
Pro Gly Lys Gly
Asn Lys Tyr Tyr 60
Asp Asn Ser Lys 75
Glu Asp Thr Ala 90
Val Asp Val Trp 105
Gln Pro Gly Arg 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Val 45
Ala Asp Ser Val
Asn Thr Leu Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Gln Gly Thr 110 <210> 413 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 413
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
- 248 043015
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Asp Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Gln Gln Lys
Lys Arg Ala 55
Thr Asp Phe 70
Val Tyr Tyr 85
Gly Thr Lys
Pro Gly Gln Ala Pro 40
Thr Gly Ile Pro Ala 60
Thr Leu Thr Ile Ser
Cys Gln Gln Arg Ser 90
Val Glu Ile Lys
105
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Glu Pro 80
Asn Tyr Pro Ile 95 <210> 414 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 414
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr LeuTyr
70 7580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Lys Gly Leu Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Arg Leu Tyr Tyr Pro Tyr 100 105110
Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 415 <400> 415 000 <210> 416 <400> 416 000 <210> 417 <400> 417 000 <210> 418 <400> 418 000 <210> 419
- 249 043015 <400> 419 000 <210> 420 <400> 420 000 <210> 421 <211> 106 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 421
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val 1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 4045
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ala Leu Pro 85 9095
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 422 <211> 122 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 422
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 7075
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Gly Arg Pro Glu Leu Gly Trp Asp Lys Tyr Phe Gln His 100 105110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Trp
Ile
Gly
Pro 80
Thr
Glu
Gly
Trp
Leu
Ser 80 Cys
Trp <210> 423 <400> 423
- 250 043015
000 <210> 424 <400> 424 000 <210> 425 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 425
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg LeuGlu
70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Gly Gly SerPro
9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 426 <211> 126 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 426
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln PheSer
70 7580
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Pro Leu Lys Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Phe 100 105110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210> 427 <211> 107 <212> ПРТ
- 251 043015 < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 427
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Arg Lys Gly Pro 85 9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 428 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 428
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 7075
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Gly Pro Pro Glu Leu Gly Lys Met Tyr Phe Gln His Trp 100 105110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
Leu
Glu
Gly
Trp
Leu
Ser 80 Cys
Gly <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 429
Glu Ile Val 1
Glu Arg Ala
Tyr Leu Ala
429
109
ПРТ
Искусственная
Синтетическая последовательность конструкция
Leu Thr Gln 5
Thr Leu Ser 20
Trp Tyr Gln
Ser Pro Gly
Cys Arg Ala
Gln Lys Pro
Thr Leu Ser 10
Ser Gln Ser
Gly Gln Ala
Leu Ser Pro 15
Val Ser Ser 30
Pro Arg Leu
Gly
Ser
Leu
- 252 043015
Ile Tyr 50
Gly Ser 65
Pro Glu
Pro Trp
Gly Ala
Gly Ser
Asp Phe
Thr Phe
100
Ser Ser
Gly Thr 70
Ala Val 85
Gly Gly
Arg Ala 55
Asp Phe
Tyr Tyr
Gly Thr
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 60
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 75
Cys Gln Gln His Gly Arg Leu 90 95
Lys Val Glu Ile Lys 105
Ser
Glu 80 Pro <210> 430 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 430
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 9095
Gln Glu Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105110 <210> 431 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 431
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Ile Gly Thr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 7075
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Gln Gly Ser Ile Lys Gln Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80 Gln
Lys
Glu
Gly
Trp
Leu
Ser 80 Cys
Trp
- 253 043015 <210> 432 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 432
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnSer
70 7580
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Tyr Leu Asn Tyr ProIle
9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 433 <211> 127 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 433
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln PheSer
70 7580
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Ser Pro Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Asp 100 105110
Leu Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210> 434 <400> 434 000 <210> 435 <400> 435 000 <210> 436
- 254 043015 <211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 436
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 65 7075
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gly Ile Ala 85 9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 437 <211> 120 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 437
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 7075
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Ala Glu His Arg Gly Pro Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu 80 Pro
Glu
Gly
Trp
Leu
Ser 80 Cys
Arg <210> 438 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 438
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser
Gly
Tyr
- 255 043015
Leu Asn Trp Tyr 35
Tyr Ala Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Gln Gln Lys
Ser Leu Gln 55
Thr Asp Phe 70
Thr Tyr Tyr 85
Gly Thr Lys
Pro Gly Lys Ala Pro 40
Ser Gly Val Pro Ser 60
Thr Leu Thr Ile Ser
Cys Gln Gln Leu Asp 90
Val Glu Ile Lys
105
Lys Leu Leu 45
Arg Phe Ser
Ser Leu Gln
Ser Thr Pro 95
Ile
Gly
Pro 80
Ile <210> 439 <211> 112 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 439
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 9095
Arg Asp Gly Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ala
Lys <210> 440 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 440
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser 20 2530
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 7075
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095
Ala Arg Glu Gly Gln Leu Pro Thr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Glu
Gly
Trp
Leu
Ser 80 Cys
Gln
- 256 043015 <210> 441 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 441
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Ala Asn Ser Leu Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Gly
Trp
Ile
Gly
Pro 80
Pro <210> 442 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 442
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Asp Val Gly Arg Thr Gly Pro His Tyr Tyr Gly Met 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Asp <210> 443 <211> 112 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 443
- 257 043015
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp 3540
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly 5055
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 6570
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 85
Leu Glu Ala Pro Leu Thr Phe Gly 100
Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 10 15
Ser Ser Gln Ser Leu Leu His
30
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 45
Ser His Arg Ala Ser Gly Val 60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 75
Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 90 95
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 105 110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80 Arg
Lys <210> 444 <211> 124 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 444
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Leu His Ser Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Tyr Gly Met 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Asp <210> 445 <400> 445 000 <210> 446 <400> 446 000 <210> 447 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 447
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro
Gly
- 258 043015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 2025
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 3540
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly 5055
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 6570
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100105
15
Ser Gln Ser Val Ser Ser 30
Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45
Ile Pro Ala Arg Phe Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Gln 75
Gln Ala Ala Asp Trp Pro 90 95
Ile Lys
Ser
Ile
Gly
Ser 80
Ile <210> 448 <211> 128 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 448
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Thr His Phe Gly Ala Asp His Tyr 100 105110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120125
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Tyr
Ser <210> 449 <400> 449 000 <210> 450 <400> 450 000 <210> 451 <211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 451
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15
Gly
- 259 043015
Glu Arg Ala Thr Leu 20
Tyr Leu Ala Trp Tyr 35
Ile Tyr Gly Ala Ser 50
Gly Ser Gly Ser Gly 65
Pro Glu Asp Phe Ala 85
Ile Thr Phe Gly Gly 100
Ser Cys Arg Ala Ser 25
Gln Gln Lys Pro Gly 40
Ser Arg Ala Thr Gly 55
Thr Asp Phe Thr Leu 70
Val Tyr Tyr Cys Gln 90
Gly Thr Lys Val Glu 105
Gln Ser Val Ser Ser 30
Gln Ala Pro Arg Leu 45
Ile Pro Asp Arg Phe 60
Thr Ile Ser Arg Leu 75
Gln Ala Ala Ser Ser 95
Ile Lys
Ser
Leu
Ser
Glu 80 Pro <210> 452 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 452
Gln Val Gln Leu Gln 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr 20
Gly Tyr Tyr Trp Ser 35
Trp Ile Gly Tyr Ile 50
Leu Lys Ser Arg Val 65
Ser Leu Lys Leu Ser 85
Cys Ala Arg Leu Pro 100
Gln Gly Thr Leu Val 115 последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1015
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 2530
Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 4045
Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro 5560
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 7075
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 9095
Gly Tyr Pro Leu Gly Leu Phe Asp Ile Trp 105110
Thr Val Ser Ser
120
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Gly <210> 453 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 453
Asp Ile Gln Met Thr 1 5
Asp Arg Val Thr Ile 20
Leu Ala Trp Tyr Gln 35
Tyr Ala Ala Ser Asn 50
Ser Gly Ser Gly Thr 65
Glu Asp Phe Ala Thr 85
Ile Thr Phe Gly Gly последовательность конструкция
Gln Ser Pro Ser Ser Val 10
Thr Cys Arg Ala Ser Gln 25
Gln Lys Pro Gly Lys Ala 40
Leu Gln Ser Gly Val Pro 55
Asp Phe Thr Leu Thr Ile 70 75
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala 90
Gly Thr Lys Val Glu Ile
Ser Ala Ser Val 15
Gly Ile Ser Ser 30
Pro Lys Leu Leu 45
Ser Arg Phe Ser 60
Ser Ser Leu Gln
Pro Ser Val Pro 95
Lys
Gly
Trp
Ile
Gly
Pro 80
Pro
- 260 043015
100
105 <210> 454 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 454
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Arg Thr Glu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Asp <210> 455 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 455
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Val Tyr Pro 85 9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Pro <210> 456 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 261 043015 <400> 456
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Gly Val Gly Arg Tyr Arg Val Ala Asp Tyr Trp Gly 100 105110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Gln
Gly
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Gln <210> 457 <211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 457
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Thr Asn Met Pro 85 9095
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Tyr
Ile
Gly
Pro 80
Pro <210> 458 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 458
Glu Ile Val Met Thr
5
Glu Arg Ala Thr Leu 20
Leu Ala Trp Tyr Gln 35
Tyr Ser Ala Ser Thr 50
Ser Gly Ser Gly Thr 65 последовательность конструкция
Gln Ser Pro Ala Thr 10
Ser Cys Arg Ala Ser 25
Gln Lys Pro Gly Gln 40
Arg Ala Thr Gly Ile 55
Glu Phe Thr Leu Thr 70
Leu Ser Val Ser Pro 15
Gln Ser Val Ser Ser 30
Ala Pro Arg Leu Leu 45
Pro Ala Arg Phe Ser 60
Ile Ser Ser Leu Gln 75
Gly
Asn
Ile
Gly
Ser 80
- 262 043015
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly
100
Val Tyr Tyr Cys 85
Gly Thr Lys Val
Gln Gln Tyr Asn 90
Glu Ile Lys 105
Ala Leu Pro Arg 95 <210> 459 <211> 126 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 459
Gln 1 Val Gln Leu Gln 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Gln
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Gly
Gly Tyr Tyr 35 Trp Ser Trp Ile Arg 40 Gln His Pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu
Trp Ile 50 Gly Asn Ile Tyr Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser
Leu 65 Lys Ser Arg Val Thr 70 Ile Ser Val Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gln Phe 80
Ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr
Cys Met Ala Asp Arg Val 115 Asp 100 Trp Arg Gly Gly Gln Met Gly Gly Thr 120 Pro 105 Thr Lys Val Leu Thr Tyr Val Tyr Ser 125 Tyr 110 Ser Tyr Gly
<210> 460 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 Asp Arg Val Thr 5 Ile Thr Cys Arg Ala 10 Ser Gln Ser Ile Ser 15 Ser Phe
Leu Asn Trp 20 Tyr Gln Gln Lys Pro 25 Gly Lys Ala Pro Lys 30 Leu Leu Ile
Ser Ala 35 Ala Ser Ser Leu Gln 40 Ser Gly Val Pro Ser 45 Arg Phe Ser Gly
Ser 50 Gly Ser Gly Thr Asp 55 Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Gln Pro
65 Glu Asp Phe Ala Thr 70 Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 Ser Tyr Arg Glu Pro 80 Ile
Thr Phe Gly Gly 100 85 Gly Thr Lys Val Glu 105 90 Ile Lys 95
<210> 461 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 263 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 461
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 2530
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn GlnPhe
70 7580
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val TyrTyr
9095
Cys Ala Arg Gly Val Gly Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Gly Phe Asp 100 105110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120 <210> 462 <400> 462 000 <210> 463 <400> 463 000 <210> 464 <211> 113 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 464
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Ile Asn Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Val Leu 30 Tyr Ser
Ser Asn Asn 35 Lys Asn Tyr Leu Ala 40 Trp Tyr Gln Gln Lys 45 Pro Gly Gln
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Ser Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Ile Ser Ser Leu Gln 85 Ala Glu Asp Val Ala 90 Val Tyr Tyr Cys Gln 95 Gln
Tyr Ala Asn Ala 100 Pro Ile Thr Phe Gly 105 Gly Gly Thr Lys Val 110 Glu Ile
Lys <210> 465 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 264 043015 <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 465
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Asp Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Ser Leu Ala Met Ser Gly Ala Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Gly <210> 466 <400> 466 000 <210> 467 <400> 467 000 <210> 468 <400> 468 000 <210> 469 <400> 469 000 <210> 470 <211> 112 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 470
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ala
- 265 043015
90 95
Leu Asp Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys <210> 471 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 471
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Glu Arg Trp Asp Leu Gly His Gly Met Asp Val Trp 100 105110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Gly <210> 472 <211> 108 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 472
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 2530
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 65 7075
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Val Ser 85 9095
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu 80 Pro <210> 473 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 266 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 473
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 2530
Asp Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn GlnPhe
70 7580
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val TyrTyr
9095
Cys Ala Arg Gly Val Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe
100 105110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
120
125 <210> 474 <211> 107 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 474
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 2530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 4045
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnSer
70 7580
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ala Phe ProPro
9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
105 < 210> 475 < 211> 123 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 475
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 2530
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560
- 267 043015
Leu Lys Ser Arg Val 65
Ser Leu Lys Leu Ser 85
Cys Ala Arg Gly Ser
100
Trp Gly Lys Gly Thr 115
Thr Ile Ser Val Asp 70
Ser Val Thr Ala Ala
Pro Thr Trp Leu Arg 105
Thr Val Thr Val Ser 120
Thr Ser Lys Asn Gln 75
Asp Thr Ala Val Tyr 95
Asp Tyr Tyr Met Asp
110
Ser
Phe 80 Tyr
Val <210> 476 <211> 112 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 476
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 9095
Ile Asp Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105110 <210> 477 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 477
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Trp Leu Val Ala Asp Val Trp Gly 100 105110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115120
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80
Ala
Lys
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80 Tyr
Gln <210> 478
- 268 043015 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 478
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 2530
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg LeuGlu
70 7580
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Ala Ser SerPro
9095
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210> 479 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 479
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
5 1015
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 5560
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Arg Gly Arg Tyr Ser Tyr Gly Tyr His Lys Ala Ala Phe 100 105110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210> 480 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = T, G, V, P, L, F, A или R
- 269 043015 <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = G, A или S <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 < 223> Xaa = Y, M или L <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 < 223> Xaa = H или W < 400> 480
Tyr Thr Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa
5 <210> 481 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = W, I или G <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 2 < 223> Xaa = I, V или T <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 3 < 223> Xaa = N, G или L <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = N, S, V или M <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = S, G, W или Q <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = G, F, A, Y, S, N или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 10 < 223> Xaa = N, R, S или M
- 270 043015 <400> 481
Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 482 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 482
Tyr Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr Met His <210> 483 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 483
Tyr Thr Phe Val Ala Tyr Tyr Met His <210> 484 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 484
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Met Met His <210> 485 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 485
Tyr Thr Phe Pro Gly Tyr Leu Met His <210> 486 <211> 9 <212> ПРТ
- 271 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 486
Tyr Thr Phe Leu Ala Tyr Tyr Met His <210> 487 <211> 9 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 487
Tyr Thr Phe Phe Ser Tyr Tyr Met His <210> 488 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 488
Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Leu Met His <210> 489 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 489
Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Tyr Met Trp <210> 490 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 490
Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Tyr Met His <210> 491
- 272 043015 <211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 491
Tyr Thr Phe Gly Gly Tyr Leu Met His <210> 492 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 492
Tyr Thr Phe Arg Ala Tyr Tyr Met His <210> 493 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 493
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Phe Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 494 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 494
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 495 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 273 043015 <400> 495
Trp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
5 10 15
Gly <210> 496 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 496
Ile Ile Gly Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 497 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 497
Trp Ile Asn Pro Val Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 498 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 498
Trp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 499 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 499
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gln
Gln
Gln
Gln
Gln
- 274 043015
Gly <210> 500 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 500
Trp Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 501 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 501
Trp Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 502 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 502
Gly Ile Leu Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 503 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 503
Trp Ile Asn Pro Ser Trp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
Gln
- 275 043015 <210> 504 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 504
Trp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Met Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 505 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 505
Trp Thr Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 506 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 506
Trp Ile Asn Pro Met Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 507 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 507
Trp Ile Asn Pro Ser Gln Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
Gln <210> 508 <211> 11
- 276 043015 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = V или I <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 < 223> Xaa = S или G < 400> 508
Arg Ala Ser Gln Ser Xaa Xaa Ser Asn Leu Ala
5 10 < 210> 509 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 3 < 223> Xaa = F или L <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = T или A <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S или K <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = Y, T, R, L, T, G, Q или H <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 < 223> Xaa = Y, T или L <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = M или I < 400> 509
Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
5
- 277 043015 <210> 510 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = I или V <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S, W, Y, V, F, L или I <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = S или T <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 < 223> Xaa = T или A <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 13 < 223> Xaa = Q или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 14 < 223> Xaa = K или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 16 <223> Xaa = Q или R <400> 510
Xaa Ile Asn Pro Xaa Gly Gly Xaa Xaa Ser Tyr Ala Xaa Xaa Phe Xaa
5 10 15
Gly <210> 511 <211> 22 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = A, V или T
- 278 043015 <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S, F или G <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 < 223> Xaa = I или A <220>
< 221> ВАРИАНТ <222> 8 < 223> Xaa = A или G <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 < 223> Xaa = A, L или V <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 10 < 223> Xaa = A, L или P <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 11 < 223> Xaa = G, F или Y <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 13 < 223> Xaa = A, G или F <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 14 < 223> Xaa = S, G, A <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 16 < 223> Xaa = Y, G, P, H или S <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 17 < 223> Xaa = Y или N <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 18 < 223> Xaa = Y, L, Q или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 20 < 223> Xaa = M или L <400> 511
Xaa Arg Asp Pro Xaa
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Arg Xaa
- 279 043015
Xaa Xaa Gly Xaa Asp Val 20 <210> 512 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 512
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala
5 10 <210> 513 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 513
Tyr Thr Phe Thr Ser Thr Tyr Met Ser <210> 514 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 514
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met Ser <210> 515 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 515
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Leu Met Ser <210> 516 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 280 043015 <400> 516
Tyr Thr Phe Thr Ser Arg Tyr Met Ser <210> 517 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 517
Tyr Thr Phe Ala Ser Arg Tyr Met Ser <210> 518 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 518
Tyr Thr Leu Thr Ser Arg Tyr Met Ser <210> 519 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 519
Tyr Thr Phe Thr Ser Leu Tyr Ile Ser <210> 520 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 520
Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Tyr Met Ser <210> 521 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 281 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 521
Tyr Thr Phe Thr Ser Leu Tyr Met Ser < 210> 522 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 522
Tyr Thr Phe Thr Ser Gly Tyr Met Ser
5 < 210> 523 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 523
Tyr Thr Phe Thr Ser Gln Tyr Met Ser
5 < 210> 524 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 524
Tyr Thr Phe Thr Ser His Tyr Met Ser
5 < 210> 525 < 211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность < 220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 525
Ile Ile Asn Pro Trp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly <210> 526
- 282 043015 < 211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 526
Ile Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 527 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 527
Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 528 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 528
Val Ile Asn Pro Phe Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 529 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 529
Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Arg
5 10 15
Gly <210> 530 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность
- 283 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 530
Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Arg Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 531 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 531
Ile Ile Asn Pro Leu Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 532 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 532
Val Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 533 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 533
Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
Gln <210> 534 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
- 284 043015 <400> 534
Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Arg
Gly <210> 535 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 535
Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 536 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 536
Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 537 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 537
Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 10 15
Gly <210> 538 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 538
Ile Val Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
- 285 043015
Gly
10 <210> 539 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 539
Ile Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly <210> 540 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 540
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Leu Asp Val <210> 541 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 541
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Arg Tyr
5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 542 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 542
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala 1 5
Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20
Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg His
15
- 286 043015 <210> 543 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 543
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Ala Ser Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 544 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 544
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Gly Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 545 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 545 Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Gly
Ala Arg Asp Pro Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 546 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 546
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Pro 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 547
- 287 043015 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 547
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
5 10 15
Tyr Leu Gly Met Asp Val <210> 548 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 548
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Gly Ser Arg Tyr
5 10 15
Tyr Arg Gly Met Asp Val <210> 549 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 549
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Val Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 550 <211> 22 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 550
Val Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 551 <211> 22 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность
- 288 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 551
Thr Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 552 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 552
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val <210> 553 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 553
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Gly 1 5 10 15
Tyr Gln Gly Met Asp Val <210> 554 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 554
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Phe Pro Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 555 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 289 043015 <400> 555
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ala Arg His
5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 556 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 556
Ala Arg Asp Pro Phe Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 557 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 557
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ala Gly Arg Tyr
5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 558 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 558
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Tyr Pro Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Asn Tyr Gly Met Asp Val <210> 559 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 559
Ala Arg Asp Pro Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
- 290 043015
5 10
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 560 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 560 Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Tyr Pro Ala Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Tyr Arg Gly Met Asp Val
20
<210> 561 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 561
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Gly Leu Ala Gly Pro Phe Ser Arg Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val <210> 562 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 562
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Ser
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 563 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 563
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ala Ser Arg Ser 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
- 291 043015 <210> 564 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 564
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Leu Gly Pro Ala Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 565 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = G или Y <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = S, R, G или T <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S, G или N <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = I или M <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 < 223> Xaa = S или A < 400> 565
Xaa Thr Phe Xaa Xaa Tyr Ala Xaa Xaa
5 <210> 566 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 292 043015 <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 3 < 223> Xaa = I или V < 220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = I, R, G, A, S, T или Q < 220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = F или G < 220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = T, R или W < 220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 10 < 223> Xaa = S, N, Q или W < 400> 566
Gly Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Ala Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly < 210> 567 < 211> 9 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 567
Gly Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Ile Ser
5 <210> 568 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 568
Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Ala Ile Ser <210> 569 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 293 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 569
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Ala Met Ala
5 <210> 570 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 570
Gly Thr Phe Arg Asn Tyr Ala Ile Ser <210> 571 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 571
Gly Ile Val Pro Arg Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 572 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 572
Gly Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Gln Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly <210> 573 <211> 17 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 573
Gly Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Trp Tyr Ala Gln Lys Phe 1 5 10 15
Gly
Gln
Gln
Gln
- 294 043015 <210> 574 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая <400> 574 Gly Ile Ile Pro Ala конструкция Trp 10 Tyr Ala Gln Lys Phe 15
Phe Gly Thr Ala
1 Gly 5
<210> <211> <212> <213> 575 17 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 575 Gly Ile Ile Pro Ser 1 5 Gly Phe Gly Thr Ala Ser 10 Tyr Ala Gln Lys Phe 15
<210> <211> <212> <213> 576 17 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 576 Gly Ile Ile Pro Thr 1 5 Gly Phe Gly Thr Ala Trp 10 Tyr Ala Gln Lys Phe 15
<210> <211> <212> <213> 577 17 ПРТ Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 577 Gly Ile Ile Pro Gly 1 5 Gly Phe Gly Arg Ala Asn 10 Tyr Ala Gln Lys Phe 15
Gln
Gln
Gln
Gln <210> 578
- 295 043015 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 578
Gly Ile Ile Pro Gln Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
5 10 15
Gly <210> 579 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 579
Gly Ile Ile Pro Ile Gly Gly Trp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
5 10 15
Gly <210> 580 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S или G <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 8 < 223> Xaa = H или R <400> 580
Arg Ser Ser Gln Xaa Leu Leu Xaa Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu
5 10 15
Gln
Gln
Asp < 210> 581 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6
- 296 043015 <223> Xaa = A или V <400> 581
Leu Gly Ser Asn Arg Xaa Ser < 210> 582 < 211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = G или V <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 < 223> Xaa = Y или R < 400> 582
Tyr Ser Ile Ser Ser Xaa Xaa Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 583 < 211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = T, S или A <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = H или P < 400> 583
Xaa Ile Tyr Xaa Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 < 210> 584 < 211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность < 220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 584
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
- 297 043015 <210> 585 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 585
Arg Ser Ser Gln Gly Leu Leu Arg Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
5 10 15 <210> 586 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 586
Leu Gly Ser Asn Arg Val Ser <210> 587 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 587
Tyr Ser Ile Ser Ser Val Arg Tyr Trp Gly
5 10 <210> 588 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 588
Ala Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 589 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
- 298 043015 <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = G или Y <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = S, V, Y, K или P <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 6 < 223> Xaa = S или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 7 <223> Xaa = D или E <400> 589
Xaa Ser Ile Xaa Ser Xaa Xaa Tyr Tyr Trp Gly
5 10 <210> 590 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 1 < 223> Xaa = S, G, Q или L <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 4 < 223> Xaa = Y, W или R <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 5 < 223> Xaa = S, R, K или A <220>
< 221> ВАРИАНТ < 222> 9 <223> Xaa = Y или V <400> 590
Xaa Ile Tyr Xaa Xaa Gly Ser Thr Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 591 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 299 043015 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 591
Gly Ser Ile Val Ser Ser Asp Tyr Tyr Trp Gly
5 10 <210> 592 <211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 592
Gly Ser Ile Tyr Ser Ser Asp Tyr Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 593 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 593
Gly Ser Ile Lys Ser Ser Glu Tyr Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 594 < 211> 10 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 594
Tyr Ser Ile Pro Ser Asp Tyr Tyr Trp Gly
5 10 < 210> 595 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 595
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Glu Tyr Tyr Trp Gly
5 10 <210> 596 <211> 11 <212> ПРТ
- 300 043015
<213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 596 Gly Ser Ile Ser Ser последовательность
Gly
конструкция
Arg Glu Tyr Tyr Trp
1 5 10
<210> 597 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 597 Gly Ile Tyr Tyr Arg последовательность конструкция Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 <210> 598 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 598 Gln Ile Tyr Tyr Lys 10 последовательность конструкция Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 15 Lys Ser
1 5 <210> 599 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 599 Ser Ile Tyr Trp Arg 10 последовательность конструкция Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 15 Lys Ser
1 5 <210> 600 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая <400> 600 Ser Ile Tyr Arg Ala 10 последовательность конструкция Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 15 Lys Ser
1 5 10 15
<210> 601
- 301 043015 < 211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 601
Ser Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 602 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 602
Leu Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 603 <211> 16 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 603
Ser Ile Tyr Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
5 10 15 <210> 604 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 604
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Phe Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
- 302 043015 <210> 605 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 605
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 606 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 606
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120 <210> 607 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <223> Синтетическая конструкция <220>
- 303 043015 <400> 607
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Met Met His Trp 35
Gly Ile Ile Gly 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ser Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Tyr Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
608
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 608
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Leu Met His Trp 35
Gly Trp Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Ser Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Asn Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Pro Gly Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
609
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 609
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Val Asn
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Asn Ser Gly
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Asn Tyr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Gly Ala Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
- 304 043015
5055
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 8590
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu 100105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115120
Ile Ser Thr Ala Tyr 80
Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Tyr Gly Met Asp 110
Ser
610
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 610
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Asn Ser Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Arg Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Leu Ala Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110 <210> 611 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 611
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Phe Ser Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asn Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
- 305 043015 <210> 612 <211> 124 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 612
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Leu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 613 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 613
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr 20 2530
Tyr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Gly Ile Leu Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120 <210> 614 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <223> Синтетическая конструкция <220>
- 306 043015 <400> 614
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ser Trp Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Leu Ala Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
615
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 615
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Val Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Asn Ser Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Met Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ala Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
616
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 616
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met His Trp 35
Gly Trp Thr Asn
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Asn Ser Gly
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Arg Tyr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Gly Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
- 307 043015
5055
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 8590
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu 100105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115120
Ile Ser Thr Ala Tyr 80
Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Tyr Gly Met Asp 110
Ser
617
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 617
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Leu Met His Trp 35
Gly Trp Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gly Lys 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Met Ser Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Arg Leu Arg Ser 85
Arg Ser Ser Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Gly Thr Arg Tyr 60
Asp Thr Ser Ile 75
Asp Asp Thr Ala 90
Trp Tyr Glu Gly 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Gly Gly Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110 <210> 618 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 618
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ala Tyr 20 2530
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Gln Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Lys Arg Ser Ser Gly Trp Tyr Glu Gly Tyr Gly Met Asp 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120
- 308 043015 <210> 619 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 619
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Thr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Trp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120125
Ser <210> 620 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 620
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 621 <211> 129 <212> ПРТ
- 309 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 621
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Thr
Tyr Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Met
Gly Ile 50 Ile Asn Pro Tyr Gly 55 Gly Ser Thr Ser Tyr 60 Ala Gln Lys Phe
Gln 65 Gly Arg Val Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Val Tyr 80
Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Asp Pro 100 Ser Gly Ile Ala Ala 105 Ala Gly Pro Ala Ser 110 Arg Tyr
Tyr Tyr Gly 115 Met Asp Val Trp Gly 120 Gln Gly Thr Thr Val 125 Thr Val Ser
Ser <210> 622 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 622
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 623 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая последовательность конструкция
- 310 043015 <400> 623
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Leu Met Ser Trp 35
Gly Val Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Phe Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125
624
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 624
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 625 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 625
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Ala Ser Arg 30
- 311 043015
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Glu Trp Met
Gln Lys Phe
Thr Val Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Gly Arg Tyr 110
Thr Val Ser
626
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 626
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Ala
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Gly Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser
125
627
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 627
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr
- 312 043015
7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Tyr Tyr Cys 95
Ser Arg His 110
Thr Val Ser
628
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 628
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Arg Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Leu Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser
125 <210> 629 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 629
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Arg Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
- 313 043015
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
630
107
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 630
Glu Val Val Met
Glu Arg Ala Thr 20
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Gly Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65
Glu Asp Phe Ala
Thr Phe Gly Gly 100
Синтетическая последовательность конструкция
Thr Gln Ser Pro 5
Leu Ser Cys Arg
Gln Gln Lys Pro 40
Thr Arg Ala Thr 55
Thr Glu Phe Thr 70
Val Tyr Tyr Cys 85
Gly Thr Lys Val
Ala Thr Leu Ser 10
Ala Ser Gln Ser 25
Gly Gln Ala Pro
Gly Ile Pro Ala 60
Leu Thr Ile Ser 75
Gln Gln Ala Arg 90
Glu Ile Lys 105
Val Ser Pro Gly 15
Val Gly Ser Asn 30
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Gln Ser 80
Leu Gly Pro Trp 95 <210> 631 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 631
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Ala Ser Arg Gly 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 632 <211> 129 <212> ПРТ
- 314 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 632
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Arg
Tyr Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Met
Gly Ile 50 Ile Asn Pro Val Gly 55 Gly Ser Thr Ser Tyr 60 Ala Gln Lys Phe
Gln 65 Gly Arg Val Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Val Tyr 80
Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Asp Pro 100 Ser Gly Ile Ala Leu 105 Ala Gly Pro Ala Gly 110 Arg Tyr
Tyr Tyr Gly 115 Met Asp Val Trp Gly 120 Gln Gly Thr Thr Val 125 Thr Val Ser
Ser <210> 633 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 633
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ser Arg Gly 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 634 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая последовательность конструкция
- 315 043015 <400> 634
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Pro 110
Val Thr Val Ser 125
635
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 635
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Leu Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 636 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 636
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
- 316 043015
Tyr Met Ser Trp Val 35
Gly Ile Ile Asn Pro 50
Gln Gly Arg Val Thr 65
Met Glu Leu Ser Ser 85
Ala Arg Asp Pro Ser 100
Tyr Arg Gly Met Asp 115
Ser
Arg Gln Ala Pro Gly 40
Val Gly Gly Ser Thr 55
Met Thr Arg Asp Thr 70
Leu Arg Ser Glu Asp 90
Gly Ile Ala Leu Ala 105
Val Trp Gly Gln Gly 120
Gln Gly Leu Glu Trp Met 45
Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 60
Ser Thr Ser Thr Val Tyr
80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Pro Gly Ser Arg Tyr 110
Thr Thr Val Thr Val Ser 125
637
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 637
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Val Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Arg 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser
125
638
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 638
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Leu Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Leu Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr
- 317 043015
7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Tyr Tyr Cys 95
Ser Arg Tyr 110
Thr Val Ser
639
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 639
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Ile Ser Trp 35
Gly Val Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Leu 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser
125 <210> 640 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 640
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Arg 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Leu Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
- 318 043015
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser <210> 641 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 641
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 Ser Val Lys Val 5 Ser Cys Lys Ala Ser 10 Gly Tyr Thr Phe Thr 15 Lys Tyr
Tyr Met Ser 20 Trp Val Arg Gln Ala 25 Pro Gly Gln Gly Leu 30 Glu Trp Met
Gly Ile 35 Ile Asn Pro Ile Gly 40 Gly Ser Thr Ser Tyr 45 Ala Gln Lys Phe
Gln 50 Gly Arg Val Thr Met 55 Thr Arg Asp Thr Ser 60 Thr Ser Thr Val Tyr
65 Met Glu Leu Ser Ser 70 Leu Arg Ser Glu Asp 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 80 Cys
Ala Arg Asp Pro 85 Ser Gly Ile Ala Ala 90 Ala Gly Pro Ala Ser 95 Arg Tyr
Tyr Tyr Gly 100 Met Asp Val Trp Gly 105 Gln Gly Thr Thr Val 110 Thr Val Ser
Ser 115 120 125
<210> 642 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 642
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Val Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser
- 319 043015 <210> 643 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 643
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 644 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 644
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <213> Искусственная последовательность <210> 645 <211> 129 <212> ПРТ
- 320 043015 <220>
<223>
<400> 645
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Arg Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Thr Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly 120
Ala Glu Val Lys
Ser Gly Tyr Thr
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala
Phe Thr Lys Tyr
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 646 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 646
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 647 <211> 128 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 647 последовательность конструкция
- 321 043015
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Gly Met Asp 115
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 510
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 25
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 4045
Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala 5560
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 7075
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ser Gly Ile Ala Leu Ala Gly Pro Ala 105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
120125
Pro Gly Ala 15
Thr Lys Tyr 30
Glu Trp Met
Gln Lys Phe
Thr Val Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Ser Arg Tyr 110
Val Ser Ser
648
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 648
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Gln Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Gly 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 649 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 649
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
- 322 043015
5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Leu Ala Phe Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Thr Val Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Ser Arg Tyr 110
Thr Val Ser
650
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 650
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Gly 110
Val Thr Val Ser
125 <210> 651 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 651
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Glu Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
- 323 043015
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ala Arg His 100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser
652
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 652
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Phe Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 653 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 653
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ala Gly Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120125
Ser
- 324 043015 <210> 654 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 654
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 3540
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly 5055
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg 6570
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala 100
Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
115120
Ser
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1015
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 2530
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45
Ser Thr Ser Tyr Ala Arg Lys Phe 60
Asp Thr Ser Thr Gly Thr Val Tyr 7580
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Ala Ala Tyr Pro Ala Ser Arg Tyr 105110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 125 <210> 655 <211> 129 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 655
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120125
Ser <210> 656 <211> 129
- 325 043015 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 656
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser <210> 657 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 657
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Tyr Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Arg Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120125
Ser <210> 658 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая последовательность конструкция
- 326 043015 <400> 658
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Val Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Gly
Asp Val Trp Gly 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Arg Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Phe Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125
659
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 659
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Ser 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 660 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 660
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
- 327 043015
2025
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Ile Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Glu Trp Met
Gln Lys Phe
Thr Val Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Ser Arg Ser 110
Thr Val Ser
661
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 661
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Leu Leu Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 662 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 662
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Lys Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
- 328 043015
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 65 7075
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 8590
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala 100105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120125
Ser
Thr Ala Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Gly Arg Tyr 110
Thr Val Ser
663
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 663
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Thr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser
125
664
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 664
Gln Val Gln Leu
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Val Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Leu 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr
- 329 043015
100 105
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120
Ser
110
Thr Val Thr Val Ser
125
65
129
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 665
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro
100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Tyr Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser Gly 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125 <210> 666 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 666
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Gln 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120125
Ser
- 330 043015 <210> 667 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 667
Glu 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Ala Thr 10 Leu Ser Val Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Ser 30 Ser Trp
Leu Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Gln Ala Pro Arg 45 Leu Leu Ile
Tyr Gly 50 Ala Ser Thr Arg Ala 55 Thr Gly Ile Pro Ala 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Ser 80
Glu Thr Asp Phe Phe Gly Ala Gly 100 Val 85 Gly Tyr Thr Tyr Lys Cys Val Gln Glu 105 Gln 90 Ile Ala Lys Arg Leu Gly Pro 95 Trp
<210> 668 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 668
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Gln 20 2530
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Ile Ile Asn Pro Val Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr ValTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Asp Pro Ser Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ser Arg Tyr 100 105110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120125
Ser <210> 669 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <223> Синтетическая конструкция <220>
- 331 043015 <400> 669
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Tyr Met Ser Trp 35
Gly Ile Ile Asn 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Asp Pro 100
Tyr Tyr Gly Met 115
Ser
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ile Gly Gly 55
Thr Met Thr Arg 70
Ser Leu Arg Ser 85
Ser Gly Ile Ala
Asp Val Trp Gly 120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Tyr Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Ser Thr Ser Tyr 60
Asp Thr Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Ala Ala Gly Pro 105
Gln Gly Thr Thr
Lys Pro Gly Ala 15
Phe Thr Ser His 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Val Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Ser Arg Tyr 110
Val Thr Val Ser 125
670
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 670
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Val 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly
100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Arg Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Asn Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
671
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 671
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met
- 332 043015
3540
Gly Gly Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala 5055
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu 6570
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 8590
Ala Arg Gln Gly Arg Lys Thr Gly Tyr Tyr 100105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115120
Gln Tyr Ala Gln Lys Phe 60
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
110
Ser Ser
672
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 672
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Gly Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Trp Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Arg Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110 <210> 673 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 673
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr 20 2530
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Ala Trp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gln Gly Arg Lys Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105110
- 333 043015
Val Trp Gly Gln Gly
Thr Thr Val Thr Val
Ser
Ser
115
120
674
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 674
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly
100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Ser Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val
120
Gly
Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Ser Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110 <210> 675 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 675
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 2530
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045
Gly Gly Ile Ile Pro Thr Phe Gly Thr Ala Trp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gln Gly Arg Lys Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120 <210> 676 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 334 043015 <220>
<223>
<400> 676
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly 100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala 40
Pro Gly Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val 120
Ala Glu Val Lys
Ser Gly Gly Thr
Pro Gly Gln Gly
Arg Ala Asn Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser
Phe Ser Ser Tyr
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
677
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 677
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp 35
Gly Gly Ile Ile 50
Gln Gly Arg Val 65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg Gln Gly
100
Val Trp Gly Gln 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gly
Ala
Val Gln Ser 5
Ser Cys Lys
Val Arg Gln Ala 40
Pro Gln Phe Gly 55
Thr Ile Thr Ala 70
Ser Leu Arg Ser 85
Arg Lys Thr Gly
Gly Thr Thr Val
120
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Thr Ala Asn Tyr 60
Asp Glu Ser Thr 75
Glu Asp Thr Ala 90
Tyr Tyr Tyr Tyr 105
Thr Val Ser Ser
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Gly Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Met 45
Ala Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr Gly Met Asp 110
678
124
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 678
Gln Val Gln Leu 1
Ser Val Lys Val 20
Ala Ile Ser Trp
Синтетическая последовательность конструкция
Val Gln Ser Gly 5
Ser Cys Lys Ala
Val Arg Gln Ala
Ala Glu Val Lys 10
Ser Gly Gly Thr 25
Pro Gly Gln Gly
Lys Pro Gly Ser 15
Phe Arg Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Met
- 335 043015
Gly Gly Ile Ile Pro 50
Gln Gly Arg Val Thr 65
Met Glu Leu Ser Ser 85
Ala Arg Gln Gly Arg 100
Val Trp Gly Gln Gly 115 <210> 679 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 679
Gln Val Gln Leu Gln
5
Thr Leu Ser Leu Thr
Arg Tyr Trp Gly Trp 35
Ile Gly Ser Ile Tyr 50
Lys Ser Arg Val Thr 65
Leu Lys Leu Ser Ser 85
Ala Arg Gln Gly Ser 100
Gly Gln Gly Thr Thr 115 <210> 680 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 680
Gln Val Gln Leu Gln
5
Thr Leu Ser Leu Thr 20
Arg Tyr Trp Gly Trp 35
Ile Gly Ala Ile Tyr 50
Lys Ser Arg Val Thr 65
Leu Lys Leu Ser Ser 85
Ala Arg Gln Gly Ser 100
4045
Ile Gly Gly Trp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 5560
Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 7580
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Lys Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 105110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
120 последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1015
Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Val 2530
Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 4045
His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 5560
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 70 7580
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Ile Lys Gln Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 105110
Val Thr Val Ser Ser
120 последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1015
Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Val 2530
Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 4045
Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 5560
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 70 7580
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095
Ile Lys Gln Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 105110
- 336 043015
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 681 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 681
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gln
85 90 95
Gln Glu Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 682 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 682
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Gly Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gln
85 90 95
Gln Glu Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 683 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 683 последовательность конструкция
- 337 043015
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp 3540
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly 5055
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 6570
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 85
Gln Glu Thr Pro Leu Thr Phe Gly 100
Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 10 15
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg
30
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 45
Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 75
Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 90 95
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 105 110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80 Gln
Lys <210> 684 <211> 112 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 684
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 1015
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg 20 2530
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 4045
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 7075
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 9095
Gln Glu Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile 80 Gln
Lys <210> 685 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 685
Gln Leu Gln Leu Gln
5
Thr Leu Ser Leu Thr
Asp Tyr Tyr Trp Gly 35
Trp Ile Gly Gly Ile 50
Leu Lys Ser Arg Val 65
Ser Leu Lys Leu Ser 85
Cys Ala Arg Gly Val последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly 10
Cys Thr Val Ser Gly 25
Trp Ile Arg Gln Pro 40
Tyr Tyr Arg Gly Ser 55
Thr Ile Ser Val Asp 70
Ser Val Thr Ala Ala 90
Gly Ser Gly Tyr Ser
Leu Val Lys Pro Ser 15
Gly Ser Ile Val Ser 30
Pro Gly Lys Gly Leu 45
Thr Tyr Tyr Asn Pro 60
Thr Ser Lys Asn Gln 75
Asp Thr Ala Val Tyr 95
Tyr Gly Tyr Arg Tyr
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80 Tyr
Phe
- 338 043015
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125 <210> 686 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 686
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Asp Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Gly Val Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Arg Tyr 100 105110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120125
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80 Tyr
Phe <210> 687 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 687
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 1015
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 2530
Asp Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 4045
Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Tyr Lys Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 5560
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 7075
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 9095
Cys Ala Arg Gly Val Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Arg Tyr 100 105110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210>
<211>
<212>
<213>
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80 Tyr
Phe
688
125
ПРТ
Искусственная последовательность
- 339 043015 <220>
<223>
<400> 688
Gln Leu Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu 20
Asp Tyr Tyr Trp 35
Trp Ile Gly Ser 50
Leu Lys Ser Arg 65
Ser Leu Lys Leu
Cys Ala Arg Gly
100
Asp Tyr Trp Gly 115
Синтетическая конструкция
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Thr Val
Gly Trp Ile Arg 40
Ile Tyr Trp Arg 55
Val Thr Ile Ser 70
Ser Ser Val Thr 85
Val Gly Ser Gly
Gln Gly Thr Leu 120
Pro Gly Leu Val
Ser Gly Gly Ser
Gln Pro Pro Gly
Gly Ser Thr Tyr 60
Val Asp Thr Ser 75
Ala Ala Asp Thr 90
Tyr Ser Tyr Gly 105
Val Thr Val Ser
Lys Pro Ser Glu
Ile Tyr Ser Ser
Lys Gly Leu Glu 45
Tyr Asn Pro Ser
Lys Asn Gln Phe 80
Ala Val Tyr Tyr 95
Tyr Arg Tyr Phe 110
Ser
125
689
125
ПРТ
Искусственная <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 689
Gln Leu Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu 20
Glu Tyr Tyr Trp 35
Trp Ile Gly Ser 50
Leu Lys Ser Arg 65
Ser Leu Lys Leu
Cys Ala Arg Gly
100
Asp Tyr Trp Gly 115
Синтетическая последовательность конструкция
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Thr Val
Gly Trp Ile Arg 40
Ile Tyr Arg Ala 55
Val Thr Ile Ser 70
Ser Ser Val Thr 85
Val Gly Ser Gly
Gln Gly Thr Leu 120
Pro Gly Leu Val 10
Ser Gly Gly Ser 25
Gln Pro Pro Gly
Gly Ser Thr Tyr 60
Val Asp Thr Ser 75
Ala Ala Asp Thr 90
Tyr Ser Tyr Gly 105
Val Thr Val Ser
Lys Pro Ser Glu 15
Ile Lys Ser Ser 30
Lys Gly Leu Glu 45
Tyr Asn Pro Ser
Lys Asn Gln Phe 80
Ala Val Tyr Tyr 95
Tyr Arg Tyr Phe 110
Ser
125 <210> 690 <211> 124 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 690
Gln Val Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu
Синтетическая конструкция
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Ala Val
Pro Gly Leu Val 10
Ser Gly Tyr Ser 25
Lys Pro Ser Glu 15
Ile Pro Ser Asp 30
- 340 043015
Tyr Tyr Trp Gly Trp 35
Ile Gly Ser Ile Tyr 50
Lys Ser Arg Val Thr 65
Leu Lys Leu Ser Ser 85
Ala Arg Gly Val Gly 100
Tyr Trp Gly Gln Gly 115
Ile Arg Gln Pro Pro 40
Tyr Arg Gly Ser Thr 55
Ile Ser Val Asp Thr 70
Val Thr Ala Ala Asp 90
Ser Gly Tyr Ser Tyr 105
Thr Leu Val Thr Val 120
Gly Lys Gly Leu Glu 45
Val Tyr Asn Pro Ser 60
Ser Lys Asn Gln Phe 75
Thr Ala Val Tyr Tyr 95
Gly Tyr Arg Tyr Phe
110
Ser Ser
Trp
Leu
Ser 80
Cys
Asp <210> 691 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 691
Gln Leu Gln Leu Gln
5
Thr Leu Ser Leu Thr
Glu Tyr Tyr Trp Gly 35
Trp Ile Gly Leu Ile 50
Leu Lys Ser Arg Val 65
Ser Leu Lys Leu Ser 85
Cys Ala Arg Gly Val 100
Asp Tyr Trp Gly Gln 115 последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1015
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 2530
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 4045
Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 5560
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 7075
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 9095
Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Arg Tyr 105110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120125
Glu
Ser
Glu
Ser
Phe 80 Tyr
Phe <210> 692 <211> 125 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая <400> 692
Gln Leu Gln Leu Gln 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr 20
Glu Tyr Tyr Trp Gly 35
Trp Ile Gly Ser Ile 50
Leu Lys Ser Arg Val 65
Ser Leu Lys Leu Ser 85
Cys Ala Arg Gly Val последовательность конструкция
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 10
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 25
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 4045
Tyr Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 5560
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 7075
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 90
Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr
Pro Ser 15
Ser Ser 30
Gly Leu
Asn Pro
Asn Gln
Val Tyr 95
Arg Tyr
Glu
Arg
Glu
Ser
Phe 80
Tyr
Phe
- 341 043015
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125 <210> 693 <211> 24 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 693
Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg 1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu <210> 694 <211> 8 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 694
Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe <210> 695 <211> 41 < 212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 695
Gly Gly Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Gly Gly 1 510
Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala 2025
Cys Ala Ala Thr Gly Thr Cys Cys Cys 3540
Thr Cys
Gly Ala
Gly
Gly 30
Cys 15 Ala
Gly
Gly <210> 696 <211> 52 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 696
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Cys Gly Cys Cys
20 25 30
- 342 043015
Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly 35 40 45
Gly Ala Gly Ala <210> 697 <211> 44 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 697
Gly Gly Thr Ala 1
Cys Cys Cys Cys 20
Ala Ala Ala Cys 35
Синтетическая конструкция
Thr Thr Gly Ala 5
Cys Ala Thr Gly
Ala Thr Cys Cys 40
Gly Gly Gly Thr 10
Ala Ala Ala Gly 25
Gly Ala Gly Gly
Cys Gly Cys Gly 15
Ala Ala Gly Cys 30
<210> 698 последовательность
<211> 49
<212> ПРТ
<213> Искусственная
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 698
Cys Ala Cys Gly Thr 1 5 Thr Thr Gly Thr Ala 10 Cys Ala Gly Gly Thr 15 Ala
Cys Thr Cys Cys Cys 20 Ala Gly Gly Cys 25 Cys Gly Cys Gly Ala 30 Cys Thr
Cys Cys Gly Ala Gly 35 Ala <210> 699 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная <220> <223> Синтетическая Ala Thr Thr Gly Ala 40 последовательность конструкция Gly Ala Gly 45 Gly Ala Gly
<400> 699
Lys Thr Ile Gly Val 1 5 Lys Ile Tyr Ser Phe 10 Gly Leu Gly Gly Arg 15 Phe
Leu Phe Ala Ser Val <210> 700 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 343 043015 <223> Синтетическая конструкция <400> 700
Asn Gly Leu Trp Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly
5 10 <210> 701 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 701
Phe Ala Ser Val Met Ala Asp Lys Asp Thr Thr Arg Arg Ile His 1 5 10 15
Ser Thr Asp Gln Gly Asp Thr Trp Ser
25 <210> 702 <211> 21 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 702
Phe Val Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met 1 5 10 15
Ser Pro Gln Asn Ser <210> 703 < 211> 24 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 703
Asn Gly Leu Trp Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu 1 5 10 15
His Lys Ala Val Cys Leu Ala Lys <210> 704 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 704
Phe Val Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met
5 10 15
Val
Tyr
Ile
Tyr
- 344 043015
Ser Pro Gln Asn Ser Asp Tyr Leu Leu 20 25 <210> 705 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 705
Glu Pro Gly Asp Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp
1 5 10 15
Gly Ile Val Tyr Ser Lys Ser Leu Asp
20 25
Arg <210> 706 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 706
His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Gln Val Pro Leu Val Ile Val
5 10 15
Ser <210> 707 <211> 21 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 707
Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His
1 5 10 15
Tyr Arg Asn Gly Lys
20
<210> 708 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция
Leu <400> 708
His Ser Thr Asp Pro
Glu Asp Tyr Glu Asp
5 10 <210> 709 <211> 15 <212> ПРТ
- 345 043015 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 709
Ile Thr Phe Asp Gln Gly Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro 1 5 10 15 <210> 710 <211> 10 <212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция <400> 710
Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys
5 10 < 210> 711 < 211> 11 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 711
Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu Trp Val Ser Lys
5 10 < 210> 712 < 211> 7 < 212> ПРТ < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Синтетическая конструкция < 400> 712
Gly Pro Glu Asn Ser Gly Lys
5 <210> 713 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 713
Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met
5 10 <210> 714
- 346 043015 <211> 678 <212> ПРТ <213> Homo sapien <400> 714
Ser Ala Pro Gly Glu
Ala Lys Leu Ala 20
Gly Ser Val Ser 35
Val Leu Thr Thr 50
Ser Lys Leu Tyr 65
Thr Asp Leu Ile
Ile Gly Pro Glu 100
Gly Gly Ser Arg 115
Asn Phe Val Gln 130
Tyr Ser Pro Gln 145
Gly Leu Trp Val
Lys Ala Val Cys 180
Thr Thr Tyr Ala 195
Leu Trp Arg Thr 210
Lys Ile Tyr Ser
225
Met Ala Asp Lys
Gly Asp Thr Trp 260
Phe Tyr Ser Ile 275
Asp Glu Pro Gly 290
Arg Gly Ile Val 305
Thr Gly Gly Glu
Tyr Ile Thr Ser 340
Thr Phe Asp Gln 355
Ser Glu Cys Asp 370
Ile His Ala Ser 385
Pro Leu Ser Glu
Val Gly Asp Ala 420
Asp Gly Gly Tyr 435
Thr Ile Leu Asp 450
Asn
Leu
Phe
Arg
Asn 85
Asn
Gly
Thr
Asn
Ser 165 Leu
Asn
Ser
Phe
Asp Glu Glu
Asn Thr His
Ser Trp Val 40
His Val Pro 55
Ser Glu Asp 70
Asn Thr Phe
Ser Gly Lys
Gly Arg Ile 120
Asp Leu Pro 135
Ser Asp Tyr 150
Lys Asn Phe
Ala Lys Trp
Gly Ser Cys 200
Asp Leu Gly 215
Gly Leu Gly 230
Asp Thr Thr Arg 245
Ser Met Ala Gln
Leu Ala Ala Asn
280
Asp Thr Gly Phe 295
Tyr Ser Lys Ser 310
Thr Asp Phe Thr 325
Val Leu Ser Glu
Gly Gly Arg Trp 360
Ala Thr Ala Lys 375
Tyr Ser Ile Ser 390
Pro Asn Ala Val 405
Ile Ser Val Met
Ser Trp Thr Lys 440
Ser Gly Gly Ile 455
Cys Gly Arg Val
Gln His Val Phe
Gly Asp Ser Thr
Leu Val Ile Met 60
Tyr Gly Lys Asn 75
Ile Arg Thr Glu 90
Val Val Leu Thr 105
Phe Arg Ser Ser
Phe His Pro Leu
140
Leu Leu Ala Leu 155
Gly Gly Lys Trp 170
Gly Ser Asp Asn 185
Lys Ala Asp Leu
Lys Ser Phe Lys 220
Gly Arg Phe Leu 235
Arg Ile His Val 250
Leu Pro Ser Val 265
Asp Asp Met Val
Gly Thr Ile Phe 300
Leu Asp Arg His 315
Asn Val Thr Ser 330
Asp Asn Ser Ile 345
Thr His Leu Arg
Asn Lys Asn Glu 380
Gln Lys Leu Asn 395
Gly Ile Val Ile 410
Val Pro Asp Val 425
Met Leu Glu Gly
Ile Val Ala Ile
460
Arg Asp Phe Val
Asp Asp Leu Arg
Gly Val Ile Leu 45
Thr Phe Gly Gln
Phe Lys Asp Ile 80
Phe Gly Met Ala 95
Ala Glu Val Ser 110
Asp Phe Ala Lys 125
Thr Gln Met Met
Ser Thr Glu Asn
160
Glu Glu Ile His 175
Thr Ile Phe Phe
190
Gly Ala Leu Glu 205
Thr Ile Gly Val
Phe Ala Ser Val 240
Ser Thr Asp Gln 255
Gly Gln Glu Gln 270
Phe Met His Val 285
Thr Ser Asp Asp
Leu Tyr Thr Thr 320
Leu Arg Gly Val 335
Gln Thr Met Ile
350
Lys Pro Glu Asn 365
Cys Ser Leu His
Val Pro Met Ala
400
Ala His Gly Ser 415
Tyr Ile Ser Asp 430
Pro His Tyr Tyr 445
Glu His Ser Ser
- 347 043015
Arg Pro Ile Asn 465
Gln Thr Tyr Thr
Ser Glu Pro Gly 500
Glu Ser Phe Leu 515
Asp Ile Leu Glu 530
Ala His Ser Thr 545
Tyr Lys Glu Gln
Gly Arg Asp Tyr 580
Leu Glu Asp Phe 595
Ser Lys Cys Val 610
Cys Leu Tyr Gly 625
Ile Pro Gly Asp
Lys Asp Leu Lys 660
Gln Asn Ser Lys 675
Val Ile Lys Phe 470
Phe Thr Arg Asp 485
Ala Arg Ser Met
Thr Ser Gln Trp 520
Arg Asn Cys Glu 535
Asp Pro Glu Asp 550
Phe Leu Arg Leu 565
Val Val Thr Lys
Leu Cys Asp Phe 600
Glu Gln Pro Glu 615
Arg Glu Glu His 630
Lys Cys Gln Gly 645
Lys Lys Cys Thr
Ser Asn
Ser Thr Asp Glu 475
Pro Ile Tyr Phe 490
Asn Ile Ser Ile 505
Val Ser Tyr Thr
Glu Lys Asp Tyr 540
Tyr Glu Asp Gly 555
Arg Lys Ser Ser 570
Gln Pro Ser Ile 585
Gly Tyr Tyr Arg
Leu Lys Gly His 620
Leu Thr Thr Asn 635
Gly Val Asn Pro 650
Ser Asn Phe Leu 665
Gly Gln Cys Trp 480
Thr Gly Leu Ala 495
Trp Gly Phe Thr 510
Ile Asp Phe Lys 525
Thr Ile Trp Leu
Cys Ile Leu Gly 560
Val Cys Gln Asn 575
Cys Leu Cys Ser 590
Pro Glu Asn Asp 605
Asp Leu Glu Phe
Gly Tyr Arg Lys 640
Val Arg Glu Val 655
Ser Pro Glu Lys 670

Claims (45)

1. Выделенное антитело против сортилина, которое связывается с сортилином человека, где антитело против сортилина получено с использованием эпитопа, содержащего:
(i) аминокислотные остатки 237-247 последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотные остатки белка сортилина млекопитающего, соответствующие аминокислотным остаткам 237-247 последовательности SEQ ID NO: 1; или (ii) аминокислотные остатки 314-338 последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотные остатки белка сортилина млекопитающего, соответствующие аминокислотным остаткам 314-338 последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Антитело против сортилина по п.1, где антитело против сортилина повышает внеклеточные уровни програнулина и снижает клеточные уровни сортилина, где снижение клеточных уровней сортилина представляет собой снижение уровней сортилина на клеточной поверхности, снижение внутриклеточных уровней сортилина, снижение общих уровней сортилина или любую их комбинацию.
3. Антитело против сортилина по п.1 или 2, где антитело против сортилина индуцирует деградацию сортилина, расщепление сортилина, интернализацию сортилина, снижение регуляции сортилина или любую их комбинацию.
4. Антитело против сортилина по любому из пп.1-3, где антитело против сортилина ингибирует взаимодействие между сортилином и одним или несколькими белками благодаря a) снижению эффективных уровней сортилина, доступных для взаимодействия с одним или несколькими белками; b) индукции деградации сортилина; или обоим этим эффектам.
5. Антитело против сортилина по п.4, где антитело против сортилина дополнительно ингибирует взаимодействие между сортилином и предшественником фактора роста нервов (pro-NGF).
6. Антитело против сортилина по любому из пп.1-5, где антитело против сортилина связывается с сортилином человека с константой диссоциации (KD), значение которой находится в диапазоне от около 0,005 до около 100 нМ.
7. Антитело против сортилина по любому из пп.1-6, где антитело против сортилина также связывается с сортилином мыши.
8. Антитело против сортилина по п.7, где антитело против сортилина связывается с сортилином мыши с константой диссоциации (KD) в диапазоне от около 0,005 до около 100 нМ.
9. Антитело против сортилина по любому из пп.1-8, где антитело против сортилина представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, моноклональное антитело или химерное антитело.
10. Конъюгат антитела против сортилина по любому из пп.1-9, где антитело против сортилина конъюгировано с цитотоксичным агентом.
- 348 043015
11. Биспецифическое антитело, содержащее антитело против сортилина по любому из пп.1-9, где биспецифическое антитело связывается с сортилином человека и вторым антигеном, где второй антиген является антигеном, облегчающим транспорт через гематоэнцефалический барьер.
12. Поливалентное антитело, содержащее антитело против сортилина по любому из пп.1-9, где поливалентное антитело связывается с сортилином человека и вторым антигеном, где второй антиген является антигеном, облегчающим транспорт через гематоэнцефалический барьер.
13. Биспецифическое антитело по п.11 или поливалентное антитело по п.12, где второй антиген выбирают из группы, состоящей из рецептора трансферрина (TR), инсулинового рецептора (HIR), рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGFR), белков 1 и 2 подобных рецептору липопротеинов низкой плотности (LPR-1 и 2), рецептора дифтерийного токсина, CRM197, TMEM 30(A), белкового домена трансдукции, TAT, Syn-B, пенетратина, полиаргининового пептида, пептида ангиопеп и ANG1005.
14. Фрагмент антитела, который связывается с сортилином человека, где фрагмент антитела представляет собой фрагмент против сортилина по любому из пп.1-9, конъюгата по п.10, биспецифического антитела по п.11 или 13 или поливалентного антитела по п.12 или 13.
15. Фрагмент антитела по п.14, где фрагмент представляет собой Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv или scFv-фрагмент.
16. Антитело против сортилина по любому из пп.1-9, конъюгат по п.10, биспецифическое антитело по п.11 или 13, поливалентное антитело по п.12 или 13 или фрагмент антитела по п.14 или 15, где антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела:
(a) индуцирует одну или более активностей програнулина;
(b) снижает эндосомальную интернализацию програнулина или его фрагментов; и (c) увеличивает эффективную концентрацию програнулина.
17. Антитело против сортилина по любому из пп.1-9 и 16, конъюгат по п.10 или 16, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13 и 16, поливалентное антитело по любому из пп.12-13 и 16 или фрагмент антитела по любому из пп.14-16, где антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела ингибирует взаимодействие между сортилином, экспрессируемым на клетке, и програнулином.
18. Антитело против сортилина или фрагмент антитела, которое специфически связывается с сортилином человека и сортилином мыши, где антитело против сортилина или фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где:
(a) вариабельная область легкой цепи содержит:
HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,
HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и
HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит:
HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 520,
HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 533, и
HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 553; или (b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343 и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 648.
19. Антитело против сортилина или фрагмент антитела, которое связывается с сортилином человека и сортилином мыши, где антитело против сортилина или фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где:
(a) вариабельная область легкой цепи содержит:
HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,
HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и
HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи содержит:
HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129,
HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155, и
HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 190; или (b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343, и вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342.
20. Антитело против сортилина по любому из пп.1-9 и 16, 17, конъюгат по любому из пп.10 и 16, 17, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13 и 16, 17, поливалентное антитело по любому из пп.12-13 и 16, 17 или фрагмент антитела по любому из пп.14-17, где антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела конкурирует с рефе-
- 349 043015 ренсным антителом против сортилина за связывание с сортилином человека и/или сортилином мыши, где референсное антитело против сортилина содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где:
(a) вариабельная область легкой цепи референсного антитела против сортилина содержит:
HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,
HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и
HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела против сортилина содержит:
HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129,
HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155, и
HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 190; или (b) вариабельная область легкой цепи референсного антитела против сортилина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343 и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела против сортилина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342.
21. Антитело против сортилина по любому из пп.1-9, 16-17 и 20, конъюгат по любому из пп.10, 1617 и 20, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13, 16-17 и 20, поливалентный антитело по любому из пп.12-13, 16-17 и 20 или фрагмент антитела по любому из пп.14-17 и 20, где антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела связывается с тем же эпитоп сортилина человека или мыши, что и референсное антитело против сортилина, где референсное антитело против сортилина содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где:
(a) вариабельная область легкой цепи референсного антитела против сортилина содержит:
HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,
HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и
HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела против сортилина содержит:
HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 129,
HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155, и
HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 190; или (b) вариабельная область легкой цепи референсного антитела против сортилина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343 и вариабельная область тяжелой цепи референсного антитела против сортилина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342.
22. Антитело против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-21, конъюгат по любому из пп.10, 16-17, 20 и 21, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13, 16-17, 20 и 21, поливалентное антитело по любому из пп.12-13, 16-17, 20 и 21 или фрагмент антитела по любому из пп.14-21, где антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела имеет изотип IgG1 или IgG4.
23. Антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела по п.22, включающее:
(a) изотип IgG1 человека и одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, и их любой комбинации, где нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU;
(b) изотип IgG4 человека и содержит одну или более аминокислотных замен в Fc-участке в положении остатков, выбранных из группы, состоящей из: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, и их любой комбинации, где нумерация остатков представлена в соответствии с нумерацией EU.
24. Антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела по п.23, где:
(a) Fc-область IgG1 дополнительно содержит одну или несколько дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из A330L, L234F, L235E, P331S и любой их комбинации, где нумерация остатков соответствует нумерации EU;
(b) Fc-область IgG1 или IgG4 дополнительно содержит одну или несколько дополнительных аминокислотных замен в положении, выбранном из группы, состоящей из M252Y, S254T, T256E и любой их комбинации, где нумерация остатков соответствует нумерации EU; или (c) Fc-область IgG4 дополнительно содержит аминокислотную замену S228P в соответствии с нумерацией EU.
25. Антитело против сортилина, конъюгат, биспецифическое антитело, поливалентное антитело или фрагмент антитела по п.24, содержащее изотип IgG1 человека и аминокислотную замену в положениях
- 350 043015 остатков L234A, L235A и P331S, где нумерация положение остатка соответствует нумерации EU.
26. Антитело против сортилина или фрагмент антитела по п.18, где антитело против сортилина или фрагмент антитела:
(i) содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 343, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 648; и (ii) имеет изотип IgG1 человека.
27. Антитело против сортилина или фрагмент антитела по п.26, где антитело против сортилина или фрагмент антитела содержит аминокислотную замену в положениях остатков L234A, L235A и P331S, где нумерация положения остатка соответствует нумерации EU.
28. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует связывающийся с сортилином агент, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгат по любому из пп.10, 16-17 и 20-25, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13, 16-17 и 20-25, поливалентное антитело по любому из пп.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмент антитела по любому из пп. 14-27.
29. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.28.
30. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.29.
31. Способ получения антитела против сортилина или фрагмента антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.30, сопровождающееся продукцией антитела против сортилина или фрагмента антитела.
32. Способ по п.31, где способ дополнительно включает выделение антитела против сортилина или фрагмента антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.
33. Выделенное антитело против сортилина или фрагмент антитела, продуцируемое способом по п.31 или 32.
34. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгат по любому из пп.10, 16-17 и 20-25, биспецифическое антитело по любому из пп.11, 13, 16-17и 20-25, поливалентное антитело по любому из пп.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмент антитела по любому из пп.14-27 и фармацевтически приемлемый носитель, для предотвращения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или поражение, связанное с активностью сортилина или дефицитом програнулина.
35. Фармацевтическая композиция по п.34, где заболевание, нарушение или поражение, связанное с активностью сортилина или дефицитом програнулина, выбраны из группы, состоящей из лобновисочной деменции, прогрессирующего супрануклеарного паралича, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, деменции, инсульта, болезни Паркинсона, острого рассеянного энцефаломиелита, дегенерации сетчатки, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, рассеянного склероза, септического шока, бактериальной инфекции, артрита и остеоартрита.
36. Способ увеличения внеклеточных уровней програнулина, уменьшающее клеточные уровни сортилина в одной или более клеток и/или уменьшающее экспрессию одного или более провоспалительных медиаторов в одной или нескольких клетках, включающий приведение в контакт одной или более клеток с антителом против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгатом по любому из пп.10, 16-17 и 2025, биспецифическим антителом по любому из пп.11, 13, 16-17 и 20-25, поливалентным антителом по любому из пп.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагментом антитела по любому из пп.14-27.
37. Способ по п.36, где один или более провоспалительных медиаторов выбраны из группы, состоящей из IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1p, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 и CCL5.
38. Способ предотвращения, снижения риска или лечения индивида, имеющего заболевание, нарушение или поражение, связанное с активностью сортилина или дефицитом програнулина, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгата по любому из пп.10, 16-17 и 20-25, биспецифического антитела по любому из пп.11, 13, 16-17 и 20-25, поливалентного антитела по любому из пп.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмента антитела по любому из пп.14-27.
39. Способ по п.38, где заболевание, нарушение или повреждение, связанные с активностью сортилина или дефицитом програнулина выбраны из группы, состоящей из лобно-височной деменции, прогрессирующего супрануклеарного паралича, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, эпилептических припадков, дистрофии сетчатки, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, деменции, инсульта, болезни Паркинсона, острого рассеянного энцефаломиелита, дегенерации сетчатки, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, рассеянного склероза, септического шока, бактериальной инфекции, артрита и остеоартрита.
40. Способ предотвращения, снижения риска или лечения лобно-височной деменции у индивида, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина
- 351 043015 по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгата по любому из пи. 10, 16-17 и 20-25, биспецифического антитела по любому из пп.И, 13, 16-17 и 20-25, поливалентного антитела по любому из пи.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмента антитела по любому из пи. 14-27.
41. Способ предотвращения, снижения риска или лечения болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона или бокового амиотрофического склероза у нуждающегося в этом индивида, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгата по любому из пи. 10, 16-17 и 20-25, биспецифического антитела по любому из пп.И, 13, 16-17 и 20-25, поливалентного антитела по любому из пи. 12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмента антитела по любому из пи. 14-27.
42. Способ ингибирования одного или более из состояний, связанных с взаимодействием между сортилином и одним или несколькими лигандами сортилина у индивида, нуждающегося в этом, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгата по любому из пп.10, 16-17 и 20-25, биспецифического антитела по любому из пп.И, 13, 16-17 и 20-25, поливалентного антитела по любому из пп.12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмента антитела по любому из пп. 14-27.
43. Способ по п.42, где одно или несколько состояний, связанных с взаимодействием между сортилином и одним или несколькими лигандами сортилина, представляют собой нейровоспаления, аксонопатии, характеризующейся коротким аксональным отростком и аномальным разветвлением, патологической микроглиальной активации и воспалительного ответа.
44. Способ стимулирования одной или более активностей, связанных с активностью програнулина или сортилина, или связанных с взаимодействием между сортилином и одним или несколькими лигандами сортилина у индивида, нуждающегося в этом, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела против сортилина по любому из пп.1-9 и 16-27, конъюгата по любому из пп.10, 16-17 и 20-25, биспецифического антитела по любому из пп.И, 13, 16-17 и 20-25, поливалентного антитела по любому из пп. 12-13, 16-17 и 20-25 или фрагмента антитела по любому из пп. 14-27.
45. Способ по п.44, где одна или более активностей, связанных с активностью програнулина или сортилина, или связанных с взаимодействием между сортилином и одним или несколькими лигандами сортилина, представляет собой заживление ран, аутофагию и выведение агрегатов белков.
EA201792221 2015-04-07 2016-04-07 Антитела против сортилина и способы их применения EA043015B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/144,270 2015-04-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043015B1 true EA043015B1 (ru) 2023-04-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220185899A1 (en) Methods of increasing progranulin levels using anti-sortilin antibodies
US20230295297A1 (en) Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
JP6669749B2 (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP2024009818A (ja) 抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体及びその使用方法
ES2940311T3 (es) Anticuerpos anti-sortilina y métodos de uso de los mismos
EP3019523A1 (en) Methods of treatment for alzheimer&#39;s disease and huntington&#39;s disease
EA039554B1 (ru) Способ снижения уровней a40 и/или a42 в нервной клетке и/или во внеклеточной жидкости
JP2011523359A (ja) 抗ＰｉｒＢ抗体
EA043015B1 (ru) Антитела против сортилина и способы их применения