CN103130898B - Tat-lbd-pep融合蛋白及其在治疗中枢神经系统损伤疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TAT-LBD-PEP融合蛋白以及其在治疗中枢神经系统缺氧缺血损伤疾病的应用。本发明融合蛋白TAT-LBD-PEP与髓磷脂抑制因子MAG、Nogo-66、OMgp结合，从而拮抗PirB的作用发挥促进轴突再生的能力，并且具有转导效率高、易透过血脊屏障、血脑屏障的优点，能够靶向性转导到损伤区域，在缺血区产生富集作用。不仅可以避免显微注射等方式注射该蛋白而引起神经组织额外伤害以及大分子难以通过血脊屏障、血脑屏障的问题，同时克服了其不能达到相应的生物学浓度的不足，通过LBD靶向转导到缺血区域。本发明可大量制备、成本低、活性高，用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤以及脊髓损伤等多种脑和脊髓损伤的治疗，促进神经组织的再生和神经功能恢复。

Description

TAT-LBD-PEP融合蛋白及其在治疗中枢神经系统损伤疾病中的应用

技术领域

本发明属于蛋白转导领域，具体涉及一种将TAT、LBD和PEP融合制备为TAT-LBD-PEP融合蛋白，同时本发明涉及的TAT-LBD-PEP融合蛋白穿透血脑屏障并富集损伤区，可用于中枢神经系统损伤的治疗。

背景技术

据WHO近期调查结果显示：第一、我国脑血管疾病如脑梗塞、脑出血等年新发患者在200万～250万之间，年死亡人数高达150万人，仍以8.7%的速度在递增，其发病率和死亡率均排名世界第一；第二、我国每年因交通事故死亡超过10万人，伤残人数＞50万，远远超过抗美援朝死伤人数，也是排名世界第一。我国卫生部经济研究所调查结果表明，每年用于治疗脑损伤的经费达1000多亿，给社会和家庭均带来了巨大的经济负担。急性脑血管病除了高致死率外，还具有高致残率和高复发率的特点，严重威胁国民生命健康和生活质量。据调查，全国脑损伤恢复期的幸存者约3/4，超过500万患者伴有不同程度智力障碍、感觉障碍、运动障碍和生活不能自理等严重残疾，随着恢复期幸存者数量逐年增加，已逐渐衍变成为严重的社会问题。因此，充分认识脑损害的严重性和危害性，加大力度研究如何促进缺血后神经功能的恢复，降低病残率，提高恢复期患者的生活质量，目前仍是一个亟待解决的世界性难题。

人体的大多数组织在损伤后具有再生和修复能力，但成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后却存在再生与修复困难，在脑缺血性损伤相关疾病、脊髓损伤、以及许多神经病变的情况下，CNS功能恢复非常有限，并且容易发生肢体运动和感觉障碍等严重影响个人生活质量的病症。因此，CNS再生问题一直是医学界和神经科学界在理论研究和临床实践中亟待解决的重大难题。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促进再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，多项研究表明：Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)等髓磷脂轴突生长抑制因子，在脑缺氧缺血损伤、脊髓损伤、癫痫疾病、阿尔海默氏病、自身免疫性脱髓鞘疾病、以及CNS神经发生过程中扮演着重要的角色。

Nogo-66受体(Nogo-66receptor,NgR1)是CNS髓磷脂中3种主要轴突生长抑制因子Nogo-A、MAG、OMgp的共受体，干预NgR1可以同时逆转Nogo-A、MAG、OMgp对轴突生长的抑制作用。然而，近年的研究发现：基因敲出NgR1(-/-)或RNAi下调NgR1表达，Nogo-66、MAG、OMgp仍具有较强的抑制轴突生长作用，而且证实NgR1仅对Nogo-66、MAG、OMgp导致的急性生长锥崩溃发挥关键作用，而对轴突生长的慢性抑制效应并不是必须的，因此强烈提示可能存在其它受体在此过程中发挥更为重要的作用。

目前在治疗中枢神经系统疾病的大分子蛋白药物研究中，由于血脑屏障、血脊屏障等的存在，大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过这些屏障，难以达到有效的药物治疗浓度。蛋白转导技术是近年来运用较广泛的一种新兴技术，可以将分子量超过100kD的蛋白质或其他物质穿过细胞膜，甚至穿过血脑屏障。转导效率很高而且对细胞没有损伤。已经有研究证明HIV-I的反式激活转导蛋白TAT(Transactivating transduction protein)的蛋白转导域，能够将分子量在15～120kD的不同生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)导入细胞，转导的蛋白质在细胞中均具有生物活性，并能够直接通过血脑屏障直接进入脑组织和神经元，不破坏细胞膜和血脑屏障，而且对宿主细胞几乎没有毒性。TAT融合蛋白系统被认为是一种有效的运载工具，在基础医学研究和临床治疗方面有着广泛的应用前景，其为蛋白质治疗带来了新的曙光，显示出巨大的应用价值。目前，TAT蛋白转导技术已经成功将BDNF、XIAP，Neuroglobin等功能蛋白转导进入脑组织和神经元。

与此同时，为了提高有效的药物浓度，同时降低药物对其他组织的副作用，因此治疗蛋白如何靶向聚集于损伤区域是需要解决一个关键问题。层粘连蛋白Laminin是CNS重要的胞外基质。在缺血性脑损伤时，laminin在缺血区域内高表达，因此，其可成为治疗蛋白聚集于缺血损伤区域的一个潜结合靶向区域，使治疗蛋白更有效的发挥靶向治疗损伤神经元的作用。集聚蛋白（Agrin）是神经肌肉接头突触后分化的一个关键分子，层粘连蛋白和集聚蛋白的氨基端（N-terminal domain ofagrin，NtA)有很强的亲和能力，这种可与LN特性结合的序列被命名为laminin-binding domain（LBD），有研究显示：通过构建含有神经营养因子BDNF和层粘连蛋白结合区域NtA的融合蛋白，可以靶向聚集于脑缺血损伤区域，并且高效、持续的发挥BDNF的治疗作用，而对正常组织和细胞没有任何副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于CNS损伤治疗的TAT-LBD-PEP融合蛋白，它由TAT蛋白转导域，LBD靶向转导域，和PEP功能多肽融合制成。

本发明的再一个目的是TAT-LBD-PEP融合蛋白用于制备哺乳动物脑中枢神经系统损伤的药物以及中枢神经系统损伤保护剂的应用。该药物能够用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤，在哺乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具

为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种TAT-LBD-PEP融合蛋白，该融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下：TAT-LBD-PEP的cDNA序列：

ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGGGATCCAAGCTTGGCTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCGCCGCGGTGGATCCACCATGGCCCTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTCTGACGGGTAGCCTGCCGAAACCGATTCTGCGTGTTCAACCGGATAGCGTTGTGAGCCGCCGCACCAAAGTGACCTTCCTGTGTGAAGAAACCATTGGCGCCAACGAATATCGTCTGTACAAAGATGGTAAACTGTATAAAACCGTGACGAAAAACAAACAGAAACCGGAAAATAAAGCTGAATTTAGCTTCTCTAACGTTGATCTGAGCAATGCGGGCCAGTATCGCTGCAGTTACTCCACCCAATATAAAAGCTCTGGCTACTCGGACCTGCTGGAACTGGTGGTTACCGGTCATTATTGGACGCCGAGCCTGCTGGCACAGGCATCACCGGTCGTGACCTCGGGCGGTTATGTTACGCTGCAATGTGAAAGCTGGCATAACGATCACAAATTTATTCTGACCGTCGAAGGCCCGCAGAAACTGAGCTGGACCCAGGACTCTCAATATAATTACAGTACGCGTAAATACCACGCACTGTTCAGCGTCGGTCCGGTGACCCCGAACCAGCGTTGGATCTGCCGCTGTTATTCCTACGATCGTAATCGCCCGTATGTGTGGTCACCGCCGTCAGAATCGGTTGAACTGCTGGTCAGCGGCAACCTGCAGAAACCGACCATTAAAGCAGAACCGGGTTCAGTCATCACCTCGAAACGCGCTATGACGATTTGGTGCCAGGGTAACCTGGACGCGGAAGTGTATTTTCTGCATAACGAAAAATCCCAGAAAACCCAATCAACCCAGACGCTGCAAGAACCGGGCAACAAGGGTAAATTTTTCATCCCGTCTGTTACCCTGCAGCACGCCGGCCAATACCGTTGCTATTGTTACGGCAGTGCAGGTTGGAGCCAGCCGTCTGATACCCTGGAACTGGTTGTCACGGGTATCTATGAATATTACGAACCGCGTCTGAGCGTGCTGCCGTCTCCGGTGGTTACCGCGGGCGGTAACATGACGCTGCATTGTGCCTCCGATTTTCCGTATGACAAATTCATCCTGACCAAAGAAGATAAAAAATTCGGCAATTCACTGGACACGGAACATATCAGTTCCTCAGGCCAGTACCGTGCCCTGTTTATTATCGGTCCGACCACGCCGACCCACACGGGTGCATTCCGCTGCTATGGTTATTACAAAAACGCACCGCAGCTGTGGAGTGTTCCGTCCGCTCTGCAGCAAATTCTGATCTCAGGTCTGTCGAAAAAACCGTCTCTGCTGACCCATCAGGGCCACATCCTGGACCCGGGTATGACCCTGACGCTGCAATGTTTCAGTGATATCAACTACGACCGTTTCGCACTGCATAAAGTGGGCGGTGCTGATATCATGCAGCACTCGAGCCAGCAAACCGACACGGGCTTTTCTGTCGCCAACTTCACCCTGGGTTATGTGTCTAGTTCCACGGGCGGTCAATATCGTTGCTACGGTGCACATAATCTGTCATCGGAATGGAGCGCCAGCTCTGAACCGCTGGATATTCTGATCACCGGTCAGCTGCCGCTGACGCCGAGCCTGTCTGTCCAACCGAATCATACCGTGCACTCGGGTGAAACGGTTAGCCTGCTGTGTTGGAGCATGGATTCTGTTGACACCTTTATTCTGAGTAAAGAAGGCTCCGCTCAGCAACCGCTGCGTCTGAAAAGTAAATCCCATGATCAGCAAAGCCAGGCGGAATTTTCAATGTCGGCCGTGACCAGTCACCTGTCCGGCACGTATCGCTGCTACGGTGCGCAAGACAGTTCCTTCTATCTGCTGTCATCGGCATCTGCTCCGGTGGAACTGACCGTTAGTGGTCCGATTGAAACGAGCACGCCGCCGCCGACGATGTCCATGCCGCTGGGTGGTCTGCATATGTAT；

TAT-LBD-PEP蛋白质序列：

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRRQRRRGGSLPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSCKVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTGDTRIFFVNPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSGSLPKPILRVQPDSVVSRRTKVTFLCEETIGANEYRLYKDGKLYKTVTKNKQKPENKAEFSFSNVDLSNAGQYRCSYSTQYKSSGYSDLLELVVTGHYWTPSLLAQASPVVTSGGYVTLQCESWHNDHKFILTVEGPQKLSWTQDSQYNYSTRKYHALFSVGPVTPNQRWICRCYSYDRNRPYVWSPPSESVELLVSGNLQKPTIKAEPGSVITSKRAMTIWCQGNLDAEVYFLHNEKSQKTQSTQTLQEPGNKGKFFIPSVTLQHAGQYRCYCYGSAGWSQPSDTLELVVTGIYEYYEPRLSVLPSPVVTAGGNMTLHCASDFPYDKFILTKEDKKFGNSLDTEHISSSGQYRALFIIGPTTPTHTGAFRCYGYYKNAPQLWSVPSALQQILISGLSKKPSLLTHQGHILDPGMTLTLQCFSDINYDRFALHKVGGADIMQHSSQQTDTGFSVANFTLGYVSSSTGGQYRCYGAHNLSSEWSASSEPLDILITGQLPLTPSLSVQPNHTVHSGETVSLLCWSMDSVDTFILSKEGSAQQPLRLKSKSHDQQSQAEFSMSAVTSHLSGTYRCYGAQDSSFYLLSSASAPVELTVSGPIETSTPPPTMSMPLGGLHMYLK。

与现有技术相比，本发明具有以下其他技术优势：

（1）通过离体细胞培养证实TAT-LBD-PEP融合蛋白对细胞正常功能不产生影响。

（2）通过在体的方式证实TAT-LBD-PEP融合蛋白能够转导入血脑屏障并能够富集于缺血区域。

（3）通过离体细胞培养证实TAT-LBD-PEP融合蛋白对原代神经元缺氧缺血损伤能够产生保护作用，抑制神经元凋亡。

（4）通过在体的脑缺血损伤，证实TAT-LBD-PEP融合蛋白抑制神经元凋亡，促进轴突生长，从而改善神经功能的恢复。

另外，本发明来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)TAT的蛋白转导域，与LBD-PEP融合，构建TAT-LBD-PEP重组质粒，经表达、纯化得到具有生物活性的TAT-LBD-PEP融合蛋白。它能够用于CNS损伤治疗的TAT-LBD-PEP融合蛋白，并且在哺乳动物细胞水平上可以作为蛋白药物治疗工具。

TAT融合蛋白系统是一种很好的蛋白传送工具，打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将所携带的生物信息传递到细胞内的规律，能有效解决大分子蛋白质不能穿透血脑屏障的问题，在临床应用大分子药物治疗脑血管疾病中具有广阔的应用前景。携带LBD的融合蛋白可以发挥靶向治疗脑缺血损伤的作用，将目标转导蛋白与损伤区的laminin结合，不仅能够有效提高药物浓度，还可以增强药物对目标组织的靶向性，从而减少全身其他组织器官的副作用。通过TAT及LBD的双重作用，能够有效的将目标蛋白转导入损伤区域，从而发挥最大功效。

本发明在体外培养的原代海马神经元细胞，应用MTT法和LDH释放评估TAT-LBD-PEP对氧糖剥夺(OGD)海马神经元细胞的保护作用，结果显示TAT-LBD-PEP融合蛋白可提高OGD诱导的细胞活性和存活率，表明TAT-LBD-PEP融合蛋白具有细胞膜转导作用，对海马神经元细胞具有明确的保护作用。同时，通过TUNEL等检测可观察到其对OGD所引起的神经细胞凋亡产生抑制作用。其次，通过本发明将纯化后的TAT-LBD-PEP通过腹腔注射的方式给药，检测TAT-LBD-PEP融合蛋白能否转导入脑组织并对小鼠全脑缺血是否具有保护作用，免疫荧光组织化学结果显示，融合蛋白TAT-LBD-PEP在小鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而对照组的小鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障转导入脑组织，而且TAT-LBD-PEP可显著改善脑缺血引起的学习记忆损伤和抑制神经元凋亡，表明TAT-LBD-PEP具有蛋白转导作用可进入脑组织，对全脑缺血损伤具有保护作用。

本发明所述TAT-LBD-PEP融合蛋白保留了PEP对PirB的选择性拮抗活性，具有转导效率高、透过BBB的优点，同时具有转导靶向性。其用于脑损伤治疗，可以避免显微注射或植入微型泵的方式注射PEP引起神经组织额外伤害以及PEP难以通过血脊屏障的问题，克服了其不能以相应的生物学浓度达到靶向位点的不足，可用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗。

附图说明

图1A.为本发明的pTAT-LBD-PEP质粒和pTAT-PEP质粒结构示意图，图1B为本发明的TAT-LBD-PEP表达、纯化和鉴定图。

图2.为本发明不同剂量TAT-LBD-PEP对正常海马神经元细胞的活力的影响。结果显示不同剂量TAT-LBD-PEP对正常海马神经元细胞活力没有明显影响，表明TAT-LBD-PEP无神经毒性作用。

图3.TAT-LBD-PEP可以通过血脑屏障，富集于缺血区。其中图3A为脑缺血后，anti-(His)6检测缺血区内TAT-PEP和TAT-LBD-PEP水平(红色)，表明TAT-PEP和TAT-LBD-PEP均通过血脑屏障；图3B、图3C为Western blot检测缺血区内TAT-LBD-PEP水平显著高于TAT-PEP(P<0.01)，表明TAT-LBD-PEP富集于缺血区，具有靶向性。

图4.TAT-LBD-PEP对氧糖剥夺诱导的海马神经元细胞损伤的保护作用。其中细胞活力应用MTT比色法评估，细胞死亡应用LDH释放分析。图4A为MTT比色法测量的细胞活力，与Control组比较，*P<0.05，与OGD组比较，**P<0.01，***P<0.001；图4B为LDH释放分析测定的细胞死亡，与Control组比较，*P<0.05，与OGD组比较，**P<0.01，***P<0.001。

图5.TAT-LBD-PEP抑制氧糖剥夺诱导的海马神经元细胞凋亡的作用。绿色荧光表示TUNEL阳性细胞，可以看出OGD组较正常组荧光数目明显增多，而应用TAT-LBD-PEP处理（Treatment组）较OGD组荧光数目明显减少，表明TAT-LBD-PEP可抑制氧糖剥夺诱导的海马神经元细胞凋亡，Scalebars=100μm。

图6.TAT-LBD-PEP融合蛋白减少小鼠全脑缺血后海马、皮层受损神经元数量。小鼠全脑缺血(BCCAO)后，给予0.5mg/kg的TAT-LBD-PEP或者相应溶剂，连续治疗1周应用Flour Jade C染色法，观察受损神经元（退行性病变）数量变化，结果显示TAT-LBD-PEP融合蛋白减少小鼠全脑缺血后海马、皮层受损神经元数量。

图7.TAT-LBD-PEP融合蛋白改善小鼠全脑缺血损伤后的学习及记忆功能。小鼠全脑缺血(BCCAO)后，给予0.5mg/kg的TAT-LBD-PEP或者相应溶剂，连续治疗4周后应用行Morris Water Maze实验评估动物的认知功能，结果显示与BCCAO组相比，TAT-LBD-PEP治疗后在目标象限停留时间（A）和穿台次数（B）显著增加（P<0.05），表明TAT-LBD-PEP融合蛋白能够改善脑缺血损伤后的学习及记忆功能。C为三组典型的Morris Water Maze实验轨迹。

以下结合附图和具体实施方式对发明的具体内容作进一步详细说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例一：TAT-LBD-PEP融合蛋白的构建、表达与鉴定

TAT-LBD-PEP融合蛋白是将TAT与LBD-PEP融合制得，具体包括以下步骤：

1、从Genebank获取LBD基因和PEP序列，然后将LBD基因和PEP序列之间通过GGCGGTGGCGGTTCA序列连接，合成LBD-PEP基因序列，且使得LBD-PEP的基因序列两端分别含有Nco I和Xho I序列，整个LBD-PEP的基因序列为：

LBD-PEP cDNA序列：

ACCATGGCC–CTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCA

CTGACGGGTAGCCTGCCGAAACCGATTCTGCGTGTTCAACCGGATAGCGTTGTGAGCCGCCGCACCAAAGTGACCTTCCTGTGTGAAGAAACCATTGGCGCCAACGAATATCGTCTGTACAAAGATGGTAAACTGTATAAAACCGTGACGAAAAACAAACAGAAACCGGAAAATAAAGCTGAATTTAGCTTCTCTAACGTTGATCTGAGCAATGCGGGCCAGTATCGCTGCAGTTACTCCACCCAATATAAAAGCTCTGGCTACTCGGACCTGCTGGAACTGGTGGTTACCGGTCATTATTGGACGCCGAGCCTGCTGGCACAGGCATCACCGGTCGTGACCTCGGGCGGTTATGTTACGCTGCAATGTGAAAGCTGGCATAACGATCACAAATTTATTCTGACCGTCGAAGGCCCGCAGAAACTGAGCTGGACCCAGGACTCTCAATATAATTACAGTACGCGTAAATACCACGCACTGTTCAGCGTCGGTCCGGTGACCCCGAACCAGCGTTGGATCTGCCGCTGTTATTCCTACGATCGTAATCGCCCGTATGTGTGGTCACCGCCGTCAGAATCGGTTGAACTGCTGGTCAGCGGCAACCTGCAGAAACCGACCATTAAAGCAGAACCGGGTTCAGTCATCACCTCGAAACGCGCTATGACGATTTGGTGCCAGGGTAACCTGGACGCGGAAGTGTATTTTCTGCATAACGAAAAATCCCAGAAAACCCAATCAACCCAGACGCTGCAAGAACCGGGCAACAAGGGTAAATTTTTCATCCCGTCTGTTACCCTGCAGCACGCCGGCCAATACCGTTGCTATTGTTACGGCAGTGCAGGTTGGAGCCAGCCGTCTGATACCCTGGAACTGGTTGTCACGGGTATCTATGAATATTACGAACCGCGTCTGAGCGTGCTGCCGTCTCCGGTGGTTACCGCGGGCGGTAACATGACGCTGCATTGTGCCTCCGATTTTCCGTATGACAAATTCATCCTGACCAAAGAAGATAAAAAATTCGGCAATTCACTGGACACGGAACATATCAGTTCCTCAGGCCAGTACCGTGCCCTGTTTATTATCGGTCCGACCACGCCGACCCACACGGGTGCATTCCGCTGCTATGGTTATTACAAAAACGCACCGCAGCTGTGGAGTGTTCCGTCCGCTCTGCAGCAAATTCTGATCTCAGGTCTGTCGAAAAAACCGTCTCTGCTGACCCATCAGGGCCACATCCTGGACCCGGGTATGACCCTGACGCTGCAATGTTTCAGTGATATCAACTACGACCGTTTCGCACTGCATAAAGTGGGCGGTGCTGATATCATGCAGCACTCGAGCCAGCAAACCGACACGGGCTTTTCTGTCGCCAACTTCACCCTGGGTTATGTGTCTAGTTCCACGGGCGGTCAATATCGTTGCTACGGTGCACATAATCTGTCATCGGAATGGAGCGCCAGCTCTGAACCGCTGGATATTCTGATCACCGGTCAGCTGCCGCTGACGCCGAGCCTGTCTGTCCAACCGAATCATACCGTGCACTCGGGTGAAACGGTTAGCCTGCTGTGTTGGAGCATGGATTCTGTTGACACCTTTATTCTGAGTAAAGAAGGCTCCGCTCAGCAACCGCTGCGTCTGAAAAGTAAATCCCATGATCAGCAAAGCCAGGCGGAATTTTCAATGTCGGCCGTGACCAGTCACCTGTCCGGCACGTATCGCTGCTACGGTGCGCAAGACAGTTCCTTCTATCTGCTGTCATCGGCATCTGCTCCGGTGGAACTGACCGTTAGTGGTCCGATTGAAACGAGCACGCCGCCGCCGACGATGTCCATGCCGCTGGGTGGTCTGCATATGTAT-CTCGAG；其中基因下划线为Nco I和Xho I酶切位点。

其中：PEP，即PirB胞外多肽（PirB extracellular peptides,PEP）的cDNA序列为：

CTGACGGGTAGCCTGCCGAAACCGATTCTGCGTGTTCAACCGGATAGCGTTGTGAGCCGCCGCACCAAAGTGACCTTCCTGTGTGAAGAAACCATTGGCGCCAACGAATATCGTCTGTACAAAGATGGTAAACTGTATAAAACCGTGACGAAAAACAAACAGAAACCGGAAAATAAAGCTGAATTTAGCTTCTCTAACGTTGATCTGAGCAATGCGGGCCAGTATCGCTGCAGTTACTCCACCCAATATAAAAGCTCTGGCTACTCGGACCTGCTGGAACTGGTGGTTACCGGTCATTATTGGACGCCGAGCCTGCTGGCACAGGCATCACCGGTCGTGACCTCGGGCGGTTATGTTACGCTGCAATGTGAAAGCTGGCATAACGATCACAAATTTATTCTGACCGTCGAAGGCCCGCAGAAACTGAGCTGGACCCAGGACTCTCAATATAATTACAGTACGCGTAAATACCACGCACTGTTCAGCGTCGGTCCGGTGACCCCGAACCAGCGTTGGATCTGCCGCTGTTATTCCTACGATCGTAATCGCCCGTATGTGTGGTCACCGCCGTCAGAATCGGTTGAACTGCTGGTCAGCGGCAACCTGCAGAAACCGACCATTAAAGCAGAACCGGGTTCAGTCATCACCTCGAAACGCGCTATGACGATTTGGTGCCAGGGTAACCTGGACGCGGAAGTGTATTTTCTGCATAACGAAAAATCCCAGAAAACCCAATCAACCCAGACGCTGCAAGAACCGGGCAACAAGGGTAAATTTTTCATCCCGTCTGTTACCCTGCAGCACGCCGGCCAATACCGTTGCTATTGTTACGGCAGTGCAGGTTGGAGCCAGCCGTCTGATACCCTGGAACTGGTTGTCACGGGTATCTATGAATATTACGAACCGCGTCTGAGCGTGCTGCCGTCTCCGGTGGTTACCGCGGGCGGTAACATGACGCTGCATTGTGCCTCCGATTTTCCGTATGACAAATTCATCCTGACCAAAGAAGATAAAAAATTCGGCAATTCACTGGACACGGAACATATCAGTTCCTCAGGCCAGTACCGTGCCCTGTTTATTATCGGTCCGACCACGCCGACCCACACGGGTGCATTCCGCTGCTATGGTTATTACAAAAACGCACCGCAGCTGTGGAGTGTTCCGTCCGCTCTGCAGCAAATTCTGATCTCAGGTCTGTCGAAAAAACCGTCTCTGCTGACCCATCAGGGCCACATCCTGGACCCGGGTATGACCCTGACGCTGCAATGTTTCAGTGATATCAACTACGACCGTTTCGCACTGCATAAAGTGGGCGGTGCTGATATCATGCAGCACTCGAGCCAGCAAACCGACACGGGCTTTTCTGTCGCCAACTTCACCCTGGGTTATGTGTCTAGTTCCACGGGCGGTCAATATCGTTGCTACGGTGCACATAATCTGTCATCGGAATGGAGCGCCAGCTCTGAACCGCTGGATATTCTGATCACCGGTCAGCTGCCGCTGACGCCGAGCCTGTCTGTCCAACCGAATCATACCGTGCACTCGGGTGAAACGGTTAGCCTGCTGTGTTGGAGCATGGATTCTGTTGACACCTTTATTCTGAGTAAAGAAGGCTCCGCTCAGCAACCGCTGCGTCTGAAAAGTAAATCCCATGATCAGCAAAGCCAGGCGGAATTTTCAATGTCGGCCGTGACCAGTCACCTGTCCGGCACGTATCGCTGCTACGGTGCGCAAGACAGTTCCTTCTATCTGCTGTCATCGGCATCTGCTCCGGTGGAACTGACCGTTAGTGGTCCGATTGAAACGAGCACGCCGCCGCCGACGATGTCCATGCCGCTGGGTGGTCTGCATATGTAT；

LBD的基因序列为：

ACCATGGCCCTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAA

2、将合成得到的LBD-PEP基因序列装载在pUC57载体中，得到pUC57-LBD-PEP载体。

3、选用含限制性内切酶Nco I和Xho I的人类免疫缺陷病毒的TAT序列的pTAT-HA作为表达载体；其中TAT的核苷酸序列为：ATA GGC AGG AAGAAG CGT AGA CAG AGA CGT AGA。

4、用限制性内切酶Nco I和Xho I，双酶切pTAT-HA和pUC57-LBD-PEP载体，分别回收酶切产物，其中pTAT-HA的酶切切产物为线性pTAT载体，pUC57-LBD-PEP酶切产物为TAT-LBD-PEP基因片段；

5、将步骤4得到的酶切产物，即线性pTAT载体和TAT-LBD-PEP基因片段采用T4连接酶连接，通过克隆筛选得到重组质粒pTAT-LBD-PEP表达载体。

6、将重组质粒pTAT-LBD-PEP表达载体转化E.coli TOP10F感受态菌。挑选5～8个阳性的菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，提取表达载体pTAT-LBD-PEP质粒，参见图1A。

7、将表达载体pTAT-LBD-PEP质粒经酶切鉴定筛选阳性单克隆并测序，将表达载体pTAT-LBD-PEP质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。

8、收集大肠杆菌BL21(DE3)菌株，超声裂解，收集上清和沉淀，SDS-PAGE鉴定该蛋白的表达，参见图1B所示。

需要说明的是，本实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件；又如David等人，细胞实验指南(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)中所述的条件。

实施例二：TAT-LBD-PEP融合蛋白药效试验

(一)、TAT-LBD-PEP融合蛋白有无毒性及转导功能的鉴定

1、不同浓度的TAT-LBD-PEP对原代神经元有无毒性分析

(1)海马神经元原代培养至第5天，分别加入纯化后的融合蛋白TAT-LBD-PEP(62.5μg/l,125μg/l,250μg/l)和溶剂(PBS)；

(2)正常培养，于加入蛋白后的12h，24h，48h行细胞活力分析（MTT法）。

2、TAT-LBD-PEP融合蛋白转导和靶向作用的鉴定

(1)小鼠全脑缺血模型：BCCAO制备；

(2)动物分组：TAT-LBD-PEP、TAT-PEP注射组，PBS注射组；

(3)通过小鼠腹腔注射上述蛋白按1mg/kg及PBS；

(4)注射后不同时间(6h,12h，24h)，麻醉处死、固定、冰冻切片；提取组织蛋白，定量分析；

(5)切片用anti-(His)6单克隆抗体免疫荧光组织化学染色；

(6)蛋白组织用anti-(His)6单克隆抗体和anti-PirB兔多克隆抗体行Weaternblot分析。

3、结果

(1)不同的剂量TAT-LBD-PEP对正常原代海马神经元细胞的活力没有明显影响(图2)，表明TAT-LBD-PEP对正常原代海马神经元无毒性作用。

(2)免疫荧光组织化学结果显示：融合蛋白TAT-LBD-PEP和TAT-PEP在小鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而对照组的小鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障；而且缺血区TAT-LBD-PEP显著多于TAT-PEP，表明LBD能够靶向介导融合蛋白入缺血区域，从而使TAT-LBD-PEP富集于缺血区。图3A为BCCAO后，anti-(His)6检测缺血区内TAT-LBD-PEP水平(红色)；图3B/3C为Western blot检测缺血区内TAT-LBD-PEP水平(P<0.01)。

(二)、TAT-LBD-PEP对体外氧糖剥夺(OGD)海马神经元细胞的保护作用

1、海马原代神经元细胞的培养。

2、细胞OGD模型的建立：原代神经元在EBSS buffer、95%N₂和5%CO₂中培养，神经元暴露于OGD环境下2h后，换正常的培养液正常培养，24h后分组，进行不同处理，分别于处理后第1天、3天、5天观察。

3、神经元保护观察：细胞的活力应用MTT比色法评估，细胞损伤应用LDH释放分析，细胞凋亡应用TUNEL染色评估。

4、实验结果

(1)与正常细胞的活性相比，OGD明显降低海马神经元细胞的活性；与OGD组细胞的活性相比，TAT-LBD-PEP组细胞的活性显著增加，表明TAT-LBD-PEP对OGD诱导的海马神经元细胞损伤有保护作用。图4A为MTT比色法测量的细胞活力；图4B为LDH分析测定的细胞死亡。

(2)TUNEL结果显示：OGD显著增加海马神经元细胞的凋亡，TAT-LBD-PEP明显抑制OGD诱导的神经元细胞凋亡，表明TAT-LBD-PEP对OGD诱导海马神经元细胞损伤有保护作用（参见图5）。

(三)、TAT-LBD-PEP对小鼠全脑缺血损伤的保护作用

1、动物分组：

正常对照组；假手术（Sham）组；TAT-LBD-PEP治疗组；无关蛋白（TAT-LBD）组。

2、药物治疗：

每日腹腔注射一次，每次按照0.5mg/kg，连续注射1周或者4周，进行下列内容的观察和分析：

(1)治疗1周后应用Flour Jade C染色法，观察受损神经元（退行性病变）数量变化；

(2)治疗4周后Morris水迷宫检测空间学习和记忆功能情况。

3、实验结果

(1)受损神经元（退行性病变）数量变化：小鼠全脑缺血(BCCAO)后，给予0.5mg/kg的TAT-LBD-PEP或者相应溶剂，连续治疗1周应用Flour Jade C染色法，观察海马及皮层损伤区内受损神经元数量变化，结果显示TAT-LBD-PEP融合蛋白减少小鼠全脑缺血后海马（CA1）、皮层受损神经元数量，参见图6。

(2)Morris水迷宫检测空间学习和记忆功能：如图7所示，小鼠全脑缺血(BCCAO)后，给予0.5mg/kg的TAT-LBD-PEP或者相应溶剂，连续治疗4周后应用行Morris Water Maze实验评估动物的认知功能，结果显示与BCCAO组相比，TAT-LBD-PEP治疗后在目标象限停留时间（图7A）和穿台次数（图7B）显著增加（P<0.05），表明TAT-LBD-PEP融合蛋白能够改善脑缺血损伤后的学习及记忆功能。图7C为三组典型的Morris Water Maze实验轨迹。

需要说明的是，本发明提供的附图是在显微镜或荧光显微镜下采集的细胞图片，为医学研究最清晰的图片，也不能应用计算机修改为黑白对比图片，因为只有根据不同的显色，才能判断实验的结果。

以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备是行业惯例设备。

Claims (3)

1.一种TAT-LBD-PEP融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下：

cDNA序列：

ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCAT CATGGTATG GCTAGCATG

ACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAA

GGATCGATGGGGATCCAAGCTTGGCTACGGCCGCAAGAAACGCCGCC

AGCGCCGCCGCGGTGGATCCACCATGGCCCTGCCGGGCGCATCGGGCA

CCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTG

TCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGC

ATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGG

ATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTA

TTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGG

TGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCG

GCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACG

CTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGC

GGTCTGACGGGTAGCCTGCCGAAACCGATTCTGCGTGTTCAACCGGAT

AGCGTTGTGAGCCGCCGCACCAAAGTGACCTTCCTGTGTGAAGAAACC

ATTGGCGCCAACGAATATCGTCTGTACAAAGATGGTAAACTGTATAAA

ACCGTGACGAAAAACAAACAGAAACCGGAAAATAAAGCTGAATTTAG

CTTCTCTAACGTTGATCTGAGCAATGCGGGCCAGTATCGCTGCAGTTAC

TCCACCCAATATAAAAGCTCTGGCTACTCGGACCTGCTGGAACTGGTG

GTTACCGGTCATTATTGGACGCCGAGCCTGCTGGCACAGGCATCACCG

GTCGTGACCTCGGGCGGTTATGTTACGCTGCAATGTGAAAGCTGGCAT

AACGATCACAAATTTATTCTGACCGTCGAAGGCCCGCAGAAACTGAGC

TGGACCCAGGACTCTCAATATAATTACAGTACGCGTAAATACCACGCA

CTGTTCAGCGTCGGTCCGGTGACCCCGAACCAGCGTTGGATCTGCCGC

TGTTATTCCTACGATCGTAATCGCCCGTATGTGTGGTCACCGCCGTCAG

AATCGGTTGAACTGCTGGTCAGCGGCAACCTGCAGAAACCGACCATTA

AAGCAGAACCGGGTTCAGTCATCACCTCGAAACGCGCTATGACGATTT

GGTGCCAGGGTAACCTGGACGCGGAAGTGTATTTTCTGCATAACGAAA

AATCCCAGAAAACCCAATCAACCCAGACGCTGCAAGAACCGGGCAAC

AAGGGTAAATTTTTCATCCCGTCTGTTACCCTGCAGCACGCCGGCCAAT

ACCGTTGCTATTGTTACGGCAGTGCAGGTTGGAGCCAGCCGTCTGATA

CCCTGGAACTGGTTGTCACGGGTATCTATGAATATTACGAACCGCGTCT

GAGCGTGCTGCCGTCTCCGGTGGTTACCGCGGGCGGTAACATGACGCT

GCATTGTGCCTCCGATTTTCCGTATGACAAATTCATCCTGACCAAAGAA

GATAAAAAATTCGGCAATTCACTGGACACGGAACATATCAGTTCCTCA

GGCCAGTACCGTGCCCTGTTTATTATCGGTCCGACCACGCCGACCCAC

ACGGGTGCATTCCGCTGCTATGGTTATTACAAAAACGCACCGCAGCTG

TGGAGTGTTCCGTCCGCTCTGCAGCAAATTCTGATCTCAGGTCTGTCGA

AAAAACCGTCTCTGCTGACCCATCAGGGCCACATCCTGGACCCGGGTA

TGACCCTGACGCTGCAATGTTTCAGTGATATCAACTACGACCGTTTCGC

ACTGCATAAAGTGGGCGGTGCTGATATCATGCAGCACTCGAGCCAGCA

AACCGACACGGGCTTTTCTGTCGCCAACTTCACCCTGGGTTATGTGTCT

AGTTCCACGGGCGGTCAATATCGTTGCTACGGTGCACATAATCTGTCAT

CGGAATGGAGCGCCAGCTCTGAACCGCTGGATATTCTGATCACCGGTC

AGCTGCCGCTGACGCCGAGCCTGTCTGTCCAACCGAATCATACCGTGC

ACTCGGGTGAAACGGTTAGCCTGCTGTGTTGGAGCATGGATTCTGTTG

ACACCTTTATTCTGAGTAAAGAAGGCTCCGCTCAGCAACCGCTGCGTC

TGAAAAGTAAATCCCATGATCAGCAAAGCCAGGCGGAATTTTCAATGT

CGGCCGTGACCAGTCACCTGTCCGGCACGTATCGCTGCTACGGTGCGC

AAGACAGTTCCTTCTATCTGCTGTCATCGGCATCTGCTCCGGTGGAACT

GACCGTTAGTGGTCCGATTGAAACGAGCACGCCGCCGCCGACGATGTC

CATGCCGCTGGGTGGTCTGCATATGTAT；

蛋白质序列：

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRR

QRRRGGSLPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSC

KVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTGDTRIFFV

NPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSGSLPKP

ILRVQPDSVVSRRTKVTFLCEETIGANEYRLYKDGKLYKTVTKNKQKPENK

AEFSFSNVDLSNAGQYRCSYSTQYKSSGYSDLLELVVTGHYWTPSLLAQA

SPVVTSGGYVTLQCESWHNDHKFILTVEGPQKLSWTQDSQYNYSTRKYH

ALFSVGPVTPNQRWICRCYSYDRNRPYVWSPPSESVELLVSGNLQKPTIKA

EPGSVITSKRAMTIWCQGNLDAEVYFLHNEKSQKTQSTQTLQEPGNKGKF

FIPSVTLQHAGQYRCYCYGSAGWSQPSDTLELVVTGIYEYYEPRLSVLPSP

VVTAGGNMTLHCASDFPYDKFILTKEDKKFGNSLDTEHISSSGQYRALFIIG

PTTPTHTGAFRCYGYYKNAPQLWSVPSALQQILISGLSKKPSLLTHQGHILD

PGMTLTLQCFSDINYDRFALHKVGGADIMQHSSQQTDTGFSVANFTLGYV

SSSTGGQYRCYGAHNLSSEWSASSEPLDILITGQLPLTPSLSVQPNHTVHSG

ETVSLLCWSMDSVDTFILSKEGSAQQPLRLKSKSHDQQSQAEFSMSAVTS

HLSGTYRCYGAQDSSFYLLSSASAPVELTVSGPIETSTPPPTMSMPLGGLH

MYLK。

2.权利要求1所述的TAT-LBD-PEP融合蛋白用于制备治疗哺乳动物中枢神经系统损伤疾病药物的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤或脊髓损伤。

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