CN101461805B

CN101461805B - 一种抗汉坦病毒药物阿比朵尔的用途

Info

Publication number: CN101461805B
Application number: CN2009100605376A
Authority: CN
Inventors: 杨占秋; 邓海英; 罗凡; 石丽桥; 钟琼; 刘颖娟; 王又又; 肖红
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN101461805A

Abstract

本发明公开了一种抗汉坦病毒药物阿比朵尔的用途，阿比朵尔在体外具有明显抑制汉坦病毒的作用，病毒进入细胞前给药抗病毒作用强于病毒进入细胞后给药。具体体现在：感染前给药及感染后给药，病毒感染细胞阳性率、荧光强度随浓度增加下降，具有剂量效应；可明显降低病毒感染阳性率，病毒mRNA表达下降。阿比朵尔对乳鼠感染汉坦病毒具有保护和治疗作用，保护作用强于治疗作用。感染前24h给药，随着药物剂量的增加，小鼠死亡率降低，平均生存天数延长。感染后24h给药组，不能提高动物的生存率，但可延长动物的平均生存天数。阿比朵尔在动物体内对汉坦病毒具有抑制作用。感染前24h给药，可减轻组织(肺、肾、脑)病理改变，对HFRS有治疗作用。该药物对汉坦病毒引起的肾综合征出血热(HFRS)病人既有预防作用，也有治疗作用，未发现毒副作用。

Description

一种抗汉坦病毒药物阿比朵尔的用途

技术领域

本发明涉及一种抗病毒药物，更具体涉及一种阿比朵尔抗汉坦病毒的药物，具体地说，本发明是一种具有良好抗病毒活性的新化合物，其能在细胞和动物体内及人体内发挥抗汉坦病毒的作用，该药物对汉坦病毒引起的肾综合征出血热(HFRS)既有预防作用，也有治疗作用，未发现毒副作用。

背景技术

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(Hantaviruses，HV)引起的经啮齿类动物传播的自然疫源性疾病，人通过气溶胶吸入、伤口、消化道等途径感染，该病死亡率高，危害性大，曾被世界卫生组织(WHO)列为可通过气溶胶传播的潜在生物武器。中国的发病人数占世界总发病人数的90.94％，是HFRS的重疫区。文献报道，在HFRS早期使用利巴韦林，可减轻病毒血症，降低死亡率，因此利巴韦林是目前公认的治疗HFRS有效的药物。但在临床应用中，发现其可引起溶血、降低血红蛋白，患者不能耐受治疗等毒副作用，故研发新的抗汉坦病毒药物具有现实意义。

阿比朵尔是非核苷类免疫刺激剂，在体内可诱导产生干扰素，对巨噬细胞的吞噬功能有显著的活化作用，具有免疫调节作用。我们采用新的合成方法及原料，合成了具有我国知识产权的新药(CN200510018613.9)，并证明了该药动物体内具有抗柯萨奇病毒B3、柯萨奇病毒B5、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等呼吸道病毒的作用，但其对汉坦病毒的作用还未见报道和发现。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种阿比朵尔抗汉坦病毒的药物，阿比朵尔在制备治疗或预防汉坦病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用，阿比朵尔是非核苷类抗病毒药物，具有诱生干扰素、增强吞噬细胞的吞噬功能及免疫调节作用，在体外能保护细胞免受汉坦病毒的感染，在体内可提高汉坦病毒致死感染动物的生存率及平均生存天数；阿比朵尔在体内和体外均有抑制汉坦病毒的作用，临床上可用于汉坦病毒引起的肾综合征出血热(HFRS)病人的治疗，人群能较好耐受，未发现毒副作用，该药物无毒。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种抗病毒新药——阿比朵尔(Arbidol Hydrochloride)，化学名为6-溴-4-(二甲氨甲基)-5-羟基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-1H-吲哚-3-羟酸乙酯盐酸盐-水合物，其化学结构式如下：

其中：HO-表示羟基，Br-表示溴，CH₃-表示甲基，CH₂N(CH₃)₂-表示二甲氨甲基，COOC₂H₅-羧酸乙酯，CH₂S-表示硫甲基，HCL表示盐酸，H₂O表示水。阿比朵尔为白色晶状粉末，分子量为531.89，不含影响生物活性的额外化合物和其他杂质。

阿比朵尔是申请人合成的，其具体合成工艺见文献(一种抗呼吸道病毒的药物及用途，专利号：CN200510018613.9)

阿比朵尔为水溶性药物，但溶解度一般，DMSO(二甲基亚砜)可促进其溶解。药物对小鼠毒性作用表现为食欲减退、耸毛、消瘦、死亡。药物对细胞的毒性表现一定浓度范围内细胞变圆、细胞壁增厚，脱落且吸收度A值下降。

阿比朵尔在体外具有明显抑制汉坦病毒的作用。具体体现在：感染前给药及感染后给药，病毒感染细胞阳性率、荧光强度随浓度增加下降，具有剂量效应；5μg/ml阿比朵尔在-24h、-12h、0h、2h四个时间点作用后，可明显降低病毒感染阳性率，具有时间效应；-24h、-12h作用后，病毒mRNA表达水平下降。

阿比朵尔对乳鼠感染坦病毒具有保护和治疗作用。感染前24h给药，随着药物剂量的增加，小鼠死亡率降低，平均生存时间延长。感染后24h给药组，不能提高动物的生存率，但可延长动物的平均生存天数。

阿比朵尔在动物体内对汉坦病毒具有抑制作用。感染前24h给药，可减轻组织(肺、肾、脑)病理改变，降低病毒抗原与mRNA表达水平，调节血清中α肿瘤坏死因子水平。

本发明与现有技术比较，具有以下优点和效果：

1、对汉坦病毒感染既有预防作用，也有治疗作用；

2、既有抑制病毒复制作用，亦有诱导细胞抗病毒状态作用；

3、可口服给药，使用方便；

4、为非核苷类药物，毒性不明显，肾综合征出血热(HFRS)病人耐受性好。

附图说明

图1为5微克/毫升阿比朵尔不同时间作用对汉坦病毒感染细胞阳性率作用示意图，图中结果显示于-24h、-12h、0h、+2h以5微克/毫升阿比朵尔作用VeroE6细胞，均可以降低病毒抗原的表达，与病毒对照组比较，p＜0.05，并具有时间效应。其中：

*与病毒对照组比较，p＜0.05

1.VC；2.+2h；3.0h；4.-12h；5.-24h；

图2为5微克/毫升阿比朵尔不同时间作用对汉坦病毒核酸影响示意图，A为PCR图片，B为半定量结果。结果显示感染前24h、12h给药，可降低病毒mRNA的表达，与病毒对照组比较，p＜0.05，而0h、+2h给药组与对照组比较，病毒mRNA表达量无统计学意义，p＞0.05.其中：

BC.空白对照；M.分子量对照；VC.病毒对照

1.VC；2.+2h；3.0h；4.-12h；5.-24h；*与病毒对照组比较，p＜0.05

图3为阿比朵尔对汉坦病毒致死性乳鼠感染的保护作用，图中A结果提示感染前24h起始灌胃，可明显提高乳鼠的生存率及平均天数，感染乳鼠的体重于感染后28d恢复；B结果提示感染后24h起始灌胃，虽不能提高乳鼠生存率，但可以延长平均生存天数。A.感染前24h用药组；B.感染后24h用药组；^*p＜0.05vs.安慰剂对照组#p＜0.05vs.5mg/kg/d.

图4为半定量RT-PCR检测不同时间组织中病毒mRNA表达水平，结果提示感染前24h给乳鼠灌药，可明显降低肝肾脑组织中病毒mRNA的表达水平，并具有时间效应。其中：

HD：20mg/kg/d；MD：10mg/kg/d：LD：5mg/kg/d；VC：安慰剂对照组；A1.感染后8d检测结果；A2.感染后12d检测结果；A3.感染后16天检测结果；.^*p＜0.05vs.安慰剂对照组#p＜0.05vs.HD.§p＜0.05vs.MD.

具体实施方式

实施例1：阿比朵尔对Vero E6细胞的毒性作用

按照之前的合成工艺(一种抗呼吸道病毒的药物及用途，专利号：CN200510018613.9)，我们合成了阿比朵尔，并经高效液相检测其中无杂质及其他成分。将阿比朵尔溶于二甲基亚砜(DMSO)，再溶于双蒸水中，制成200μg/ml的储备液，滤过除菌，保存于4℃。用含2％小牛血清的MEM细胞维持液将阿比朵尔稀释成不同的浓度，200μl加入96孔培养板的单层Vero E6细胞中，同时设细胞对照，10天后，观察细胞形态学变化并用MTT法进行活细胞染色，读取OD570值，根据OD值计算细胞存活率判断不同浓度药物对细胞毒性的大小，同时设溶剂对照(DMSO∶ddH2O为1∶9混合后过滤除菌，与实验组相同稀释比例加入细胞)。

实验结果显示：阿比朵尔对Vero E6细胞的毒性表现为细胞变圆、细胞壁增厚，脱落且吸光度A值下降。其最大无毒浓度为8μg/ml，以SPSS11.5的Probit回归法处理数据，其半数无毒浓度(CC50)为15.64μg/ml。

实施例2：阿比朵尔体外抗汉坦病毒作用

将Vero-E6细胞接种至6孔板，待长成单层。以0.5-8μg/ml对倍稀释的阿比朵尔，按不同方式给药。具体如下，I(药物对细胞的保护作用)：药物与细胞37℃作用2h后，弃去含药维持液，PBS洗涤两次，吸附病毒37℃2h，洗涤两次后更换细胞维持液；II(直接杀伤)：病毒液与不同浓度药物37℃作用2h，后将混合液与细胞孵育37℃2h，弃混合液，PBS洗涤两次，更换细胞维持液；III(抑制病毒复制)：病毒液吸附细胞37℃2h，洗涤两次，加含药维持液；同时设立未感染细胞对照、病毒对照组，每组设3个复孔。37℃、5％CO₂培养，根据细胞状况适时换维持液或含药维持液，第10天消化细胞，点片以间接免疫荧光法(IFA)检测病毒抗原；剩下细胞取1/2体积细胞悬液，以含1％BSA的PBS(PH7.2)洗两次，弃上清，1毫升90％甲醇4℃固定15min，PBS洗涤两次，弃上清，计数，调整细胞浓度，加入50μl不同浓度A₃₅单克隆抗体37℃孵育1h，同上洗涤2次，加50μl不同浓度的FITC标记羊抗鼠抗体避光孵育45min，同上洗涤2次，重悬于500μlPBS中，过膜，以至少10⁴个细胞在Beckman流式细胞仪上进行分析；剩余细胞以TRAZOL按照试剂说明提取细胞总RNA，取1μl RNA样品100倍稀释后在荧光酶标仪上分别测OD260和OD280值，确定其浓度和纯度定量。各样本取1.0μg总RNA逆转录，体系中包括10×Buffer RT 2μl、10mM dNTP Mix 1μl、10U Rnasin、20pmol随机引物和转录酶M-MLV1μl(200U/μl)，无RNase水补足体积至20μl，充分混匀，短暂离心收集反应液至管底，将反应管放入PCR(Eppendorf公司)仪进行逆转录：42℃60min，95℃5min得到cDNA模板。在50μl的PCR反应体系中加入10×Buffer5μl，SMF、SMR引物各10pmol，10mM dNTP1μl，10μl cDNA模板，Taq酶(200u/μl)1μl，以DEPC处理的去离子水，补足终体积50μl。以β-actin为内参，同时设阴性对照和空白对照。将反应管放入PCR(Eppendorf公司)仪进行扩增：94℃预变性180s，94℃45s，55℃45s，72℃45s共30个循环，72℃延伸420s。取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并设分子量对照，EB染色后在紫外透射仪下观察结果，以Bandscan 5.0(Glyko，Japan)软件对结果进行分析。另取5μg/ml的阿比朵尔，分别于-24h、-12h、0h及2h(感染时为0h)给药，病毒核酸抗原检测同前。

实验结果提示，分别以0.5、1、2、4、8μg/ml浓度阿比朵尔按三种方式作用至病毒感染细胞，经流式细胞检测结果显示，药物抗吸附组，病毒感染细胞阳性率有明显降低；药物抑制病毒复制组次之；药物对病毒直接作用组，各浓度对病毒感染后抗原的表达无明显影响，见表1。在荧光显微镜下观察，阴性对照细胞未见荧光，病毒对照细胞可见胞浆中有翠绿色荧光，强度为++-+++，药物抗吸附组与药物抑制病毒复制组，随着药物浓度的增加，可见有荧光的细胞数目减少及荧光强度减弱，与流式细胞计数结果一致。

5μg/ml阿比朵尔在感染的不同时间作用后，流式细胞仪计数检测各组病毒感染细胞的阳性率，-24h、-12h组阳性率明显降低，3次不同实验阳性率的均数分别为19.73％、25.16％，0h、2h组的阳性率均数为28.63％，34.70％，各组阳性率与病毒对照组(40.97％)比较，p＜0.05，结果见图1。RT-PCR扩增，进行半定量分析(n＝3)，结果显示-24h、-12h给药，病毒mRNA表达量与病毒对照比较，有统计学差异(p＜0.05)；0h、2h组病毒mRNA表达量与病毒对照比较，无统计学差异(p＞0.05)；见图2。

表1阿比朵尔对汉坦病毒感染Vero E6细胞的抑制作用

a X±SD

*与VC组比较，p＜0.05

注：a X±SD

*与病毒对照组比较，p＜0.05

实施例3：阿比朵尔对乳鼠的毒性作用

首先做最大耐受量试验。最大耐受量(MTD)试验：即以最大允许浓度和动物能耐受的最大容积给药一次，观察14天，记录动物反应情况。观察期内如动物不出现死亡或中毒症状，则认为该药对某种动物某种给药途径的MTD为某一数值(mg·kg^-1或g·kg^-1)。

阿比朵尔灌胃给药，1mg·kg^-1，0.5ml·10g^-1鼠观察14天，观察动物有无中毒和死亡的情况，根据最大耐受量试验结果决定是否进行急性毒性和亚急性试验。

Balb/C 1日龄乳鼠灌胃给药1mg·kg^-1，14d内动物无中毒和死亡情况，说明阿比朵尔对Balb/c1日龄乳鼠灌胃给药途径MTD为1mg·kg-1，为实际无毒物质。

结果提示，阿比朵尔对1日龄乳鼠的LD50为78.42mg.kg^-1.d^-1，在40mg.kg^-1.d^-1之下各剂量组，动物无死亡，且体重与正常组间比较，无明显差异。

实施例4：阿比朵尔在乳鼠体内的抗汉坦病毒作用：

随机将乳鼠分组(n＝30/组)，即正常对照组、安慰剂对照组、5mg/kg/d组、10mg/kg/d组、20mg/kg/d组。将正常对照组颅内注射20μl 2％MEM培养基，其余组颅内接种20μl 100LD₅₀的汉坦病毒。灌药起始时间为-24h、+24h(以接种病毒时间为0h)，按体重分别灌胃以0.5％羧甲基纤维素混悬的不同浓度药物20μlqd，正常对照组与安慰剂对照组灌20μl 0.5％羧甲基纤维素，各组动物每日称重，根据体重变化调整灌胃药物浓度，连续灌药10天。于28天内观察动物症状体征的变化及死亡率。分别于感染后4、8、12、16天处死4只动物，取肺、脑、肾及血清。各组织样本1/3经4％多聚甲醛固定，病理切片；1/3用于冰冻切片，间接免疫荧光(IFA)检测病毒抗原；余下部分，提取组织总RNA，半定量RT-PCR检测病毒mRNA表达水平。存活动物28d处死，处理同前。血清中TNF-α含量以双抗体夹心法ELISA检测。

实验结果为：感染后11-13d内动物出现体重减轻，耸毛，弓背，尾强直，反应性增高，后肢瘫痪，发病后三天内死亡。在肺、肾、脑组织中可检测到病毒的特异性抗原。器官组织匀浆液接种至Vero-E6细胞15d，IFA法可在胞浆中检测到翠绿色的颗粒状或片状荧光。提前给药组中，10mg/kg/d、20mg/kg/d组动物出现症状的时间较安慰剂对照组晚，且症状轻微，初始死亡时间延后，存活鼠发病后7-10d症状逐渐消失，体重恢复正常。5mg/kg/d组与安慰剂对照组间在出现症状的时间及病情轻重上均无差异；感染后给药组中，10mg/kg/d组、20mg/kg/d组出现症状时间较对照组延后。经阿比朵尔感染前给药，10mg/kg/d、20mg/kg/d组存活率为33.3％，60％，平均生存天数为21.50、23.80d，与安慰剂对照组比较，显示统计学差异，P＜0.05，5mg/kg/d组的存活率及平均生存天数与安慰剂对照组比较，无统计学差异，P＞0.05；感染后给药，各组动物存活率均为0，10mg/kg/d、20mg/kg/d组的平均生存天数分别为16.44、16.40d，与安慰剂对照组比较，有统计学差异(P＜0.05)。结果见图3

实验结果提示，感染后12天，可明显降低用药组动物肺组织中病毒抗原的表达，感染后28天的存活动物脑组织中病毒抗原消失，除1只动物外，肺组织与肾组织中亦无病毒抗原表达。见表3。

表3阿比朵尔对汉坦病毒感染乳鼠组织中病毒抗原表达的作用

a.荧光以“+”判断.-0％；+0％～25％；++25％～50％；+++50％～75％；++++75％～100％；

b.感染28天无存活动物

ND：未检测

实验结果提示，感染后12天，可明显减轻用药组动物肺组织中病理改变，感染后28天的存活动物肺组织中病变消失，脑组织与肾组织中出血灶减少。

半定量RT-PCR结果显示，感染后4天，组织中检测不到病毒mRNA；感染后8天，用药组动物肺组织中病毒mRNA水平表达下降，呈剂量效应；感染后16天，用药组动物肺、脑组织中病毒mRNA水平表达下降，呈剂量效应，肾组织大剂量组(20mg/kg/d)mRNA水平表达下降。结果见图4.

血清中TNF-α检测结果表明，感染后第4天，病毒对照组可诱生高水平的TNF-α(183.58pg/ml)，各用药组TNF-α血清水平降低，呈剂量效应。见表4。

实施例5：阿比朵尔治疗流行性出血热(HFRS)的临床研究

采用随机、双盲和安慰剂对照的临床实验设计。受试对象为年龄≥18岁，≤65岁；发热≥37.8℃，HFRS IgM抗体阳性，符合HFRS病例诊断标准；出现症状后不超过36h，共入组32例。合格的受试者随机接受阿比朵尔胶囊治疗或安慰剂治疗，300mg/次，2次/d，历时5d。实验结果显示按照规定服用药物并完成所有随访且实验室检查证明为汉坦病毒感染的病例，实验组为16例，对照组为16例。两组疾病缓解率经生存分析Logrank检验，试验组缓解率高于对照组。试验组疾病持续时间中位数为76h，对照组疾病持续时间中位数为98h，两组比较差异有显著性(P＜0.01)。试验组症状总分下降值的曲线下面积中位数为758，对照组中位数为632，两组经Wilcoxon检验差异有显著性(P＜0.01)。所有受试对象未出现明显的可能与研究药物有关的不良反应。实验结果表明阿比朵尔在HFRS发病后早期使用可以缩短疾病的持续时间，减轻症状的严重程度和死亡率，对HFRS有很好的治疗作用，而且安全性和耐受性好，适合在临床使用。

表4阿比朵尔对汉坦病毒感染乳鼠血清中TNF-α的作用

a.感染前24h起始灌胃10d

b.最低检测限为15.63pg/ml

c.病毒对照组灌胃0.5％羧甲基纤维素

ND：未检测

^**与病毒对照组比较，p＜0.01

Claims

1.一种阿比朵尔在制备治疗或预防汉坦病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用。