CN1135979C - 槐果碱作为制备柯萨奇b病毒性心肌炎病因治疗药物的用途及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种对柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物-槐果碱的用途及其制法，它具有低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用的特点，其制造工艺亦具有成本低，药源丰富，制备方法操作简便，适用于大规模生产等特点。

Description

槐果碱作为制备柯萨奇B病毒性心肌炎 病因治疗药物的用途及其制法

本发明揭示一种治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的药物——槐果碱的用途及其制法，属于药物制造领域。

国内病毒性心肌炎有日益增多趋势，据估计在一次急性病毒性感染中，约有5％的病人的心肌受染，在普通感冒中，有1/3患者可出现心电图异常。国外在常规尸检中约有3.4-9.3％的患者有局灶性或弥漫性心肌炎。若加用免疫荧光技术进行调查，则30％的心脏标本有柯萨奇B病毒抗原。本病的发病率仅次于冠心病，其病原病毒以柯萨奇B(CVB)病毒占首位(占60％以上)，其所致心肌炎临床表现轻重不一，重者可出现泵衰竭、严重心律失常，甚至猝死，有的突然出现心前区疼痛加剧，急性心肌梗死而危在旦夕，有的呈顽固性反复发作或临床表现呈不明显，但其潜在发展所致扩张型心肌病3/4于起病5年内死亡，后果十分严重。但近年来由于分子生物学引入本病的研究，认为本病的病因是由于“柯萨奇B病毒”持续感染所致。以上现状皆因迄今为止尚未发现对抗柯萨奇B病毒的有效药物所致，所以当务之急是寻找对抗柯萨奇B病毒的有效药物。

对于病毒性心肌炎，目前所采用的治疗全为对症治疗，如：葡萄糖、氯化钾、胰岛素、辅酶Q₁₀、维生素、抗心律失常药物等。晚近曾有学者报导干扰素在实验小鼠感染CVB3的同时或感染后24小时内使用能有效地减轻心肌炎症状，而在病毒感染24小时后使用则未能阻止心肌炎病毒的增殖。三氮唑核苷虽能抑制病毒RNA的合成，但该药的有效治疗浓度对人体已有毒性。免疫抑制剂和环孢霉素等治疗小鼠急性病毒性心肌炎无有效报导，却有报导用此药物仅可使病情恶化。故以上述及的干扰素、三氮唑核苷、免疫抑制剂和环孢霉素等都不是有效的抗柯萨奇B病毒有效药物。

为寻找对抗柯萨奇B病毒有效药物，我们通过实验从众多的中药中仅筛选出一味苦参，它低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的作用。已有技术中苦参是我国历史悠久的传统中药之一，无论是古代还是现代，对它的研究和应用一直是十分活跃的。苦参始载于我国最早的医学文献《神农本草经》，列为中品，具有清热燥湿、祛风杀虫的功能、主治心腹痞满胀气、症瘕积聚、黄疸，溺有余沥，逐水除痈肿，补中明目止泪，养肝胆气，安五脏，平胃气，令人嗜食、轻身、定志，益精利九窍，除伏热肠癖，止渴醒酒，小便赤黄，疗恶疮下部。我国药典一九七七年版及部分地方药品标本已将《苦豆草流浸膏片》收载主治菌痢及肠炎[中草药学(中册)，一九七六年八月第一版，P494-495，江苏人民出版社]。晚近的动物实验证明，苦参生物碱对中枢神经有抑制、镇痛及降温作用，能提高机体免疫能力，并有抗癌作用。苦参提取物苦参生物碱能治疗乙肝，有改善临床症状及肝功能，使部分患者HbeAg转阴。有文献报导苦参生物碱具有平喘及抗心律失常的作用。江西南昌妇幼保健院曾用苦参生物碱治疗恶性葡萄胎112例[中医杂志，1980年第10期(总767期)，P47]。第三军医大学曾用苦参生物碱对254例喘息型慢性气管炎及支气管哮喘病人进行治疗，证明是一种有效的平喘药物，安全而副作用小[中草药，1980年第12期，P555]。但至今未见苦参生物碱能对抗柯萨奇B病毒的作用及用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的报导。

已有技术中，从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescensAit)及豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥根及其地面部分中所提取的物质，已可分离出20余种生物碱，其中有一种主要的生物碱是槐果碱(Sophocarpine)，分子式为C₁₅H₂₂ON₂，熔点为53-54℃，[α]_D-32.9°，(t＝15，乙醇)，结构式为：

参见南京药学院《中草药学》编写组编《中草药学》(中册)，江苏人民出版社8月第一版，P494-495。

本发明目的在于提出一种能用于治疗柯萨奇B病毒所引起的病毒性心肌炎对抗病因的有效药物的用途和制备方法。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：

我们通过体外以及Balb/c小鼠的柯萨奇B病毒性心肌炎的动物模型体内，从众多的中药中筛选出一味能对抗柯萨奇B病毒的苦参，在苦参的众多生物碱中再筛选出其有效成分一槐果碱，实验证明当其浓度在312ug/ml以下时对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有效果。当细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/ml至200ug/ml浓度间仍能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，对病毒血症期的小鼠能从血中清除柯萨奇B病毒95.63％-99％。通过³HdR掺入法、MTT比色法、结晶体染色法，证明槐柯碱在200-3.125ug/ml时对Hela细胞的DNA合成代谢、细胞能量合成代谢、细胞存活率都有不同程度的保护，与剂量呈正相关。对患CoxB病毒性心肌炎的小鼠如用槐果碱治疗，大于60％的小鼠均能存活50天以上，且心肌无病理变化，而不用药的对照组100％死于8天内，心肌细胞明显坏死伴淋巴细胞浸润，证实槐果碱是一种低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用，具有用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的用途，从而可以用来制备作为治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的药物。

槐果碱作为柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的制备方法，其技术特征在于：

a.将苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；

b.对总生物碱经甲苯萃取，并通过5-10％盐酸提取槐果碱；

c.调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；

d.溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；

e.通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。

本发明的技术方案通过实验研究结果如下：

(一)体外实验

(1)建立微量细胞培养法：显示槐果碱注射液浓度低于312ug/ml对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有保护作用。

(2)建立病毒增殖减少试验：表明细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/ml至200ug/ml浓度间均能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，说明槐果碱在体外试验中能抑制CVB的增殖，并呈一定的剂量依赖性。

(3)建立SDS-PAGE电泳分离和Westernllot免疫印迹试验，通过微量细胞培养法，病毒蛋白质Westernllot，分析了槐果碱的不同浓度(0，6.25，12.5，25，50，100及200ug/ml)对病毒增殖和衣壳蛋白质含量的影响，表明槐果碱在体外试验中能抑制CVB3m的增殖，并呈一定的剂量依赖性。通过病毒吸附和穿入细胞前后槐果碱的比较，显示其能进入细胞内发挥抗病毒作用。它可能不影响CVB3m吸附、穿入等环节，而是影响CVB3m侵入细胞后某环节，特别是病毒的生物合成(包括蛋白的合成)。

(4)³H-TdR(掺入法测定)：(氚标记胸腺嘧啶核甘)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的DNA合成代谢的保护作用(见下表1)。

(5)MTT微量检测法：(甲基偶氮唑盐)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的能量代谢的保护作用(见下表1)

(6)结晶紫染色法(crystol violet)：测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞存活率的保护作用(见下表1)。

                          表1槐果碱对Hela细胞保护作用的测定MO 1：5

                                         槐果碱ug/ml方法      正常        200        100         50         25         12.5       6.25      3.125      病毒

      细胞                                                                                     对照³H-TdR   21998.65    21644.3    21537       19604      19377      16603      16554     14091.5    13201掺入法(CPM)     ±71887     ±392.42   ±1192.085  ±1518.60  ±1452.64  ±709.1    ±1392.42 ±1473.24  ±803.6MTT       0.2172      0.2113     0.203       0.2625     0.199      0.119      0.166     0.163      0.1535比色法OD        ±0.01787   ±0.00864  ±0.00463   ±0.02288  ±0.01158  ±0.02179  ±0.02025 ±0.002828 ±0.019570nm结晶紫    1.653       1.643      1.588       1.5192     1.4955     1.474      0.943     0.9027     0.8573染色OD        ±0.11456   ±0.06852  ±0.0324    ±0.03307  ±0.06344  ±0.0785   ±0.056   ±0585     ±0.020600nm

上表(表1)所示：当MO 1：5时，槐果碱在200ug/ml至3.125ug/ml时，均对Hela细胞有不同程度的保护作用。在DNA合成代谢、细胞能量合成代谢及细胞存活数的测定值随浓度而增加，呈正相关关系。R分别为0.9818，0.9727，0.9219。

(7)体外病毒增殖抑制试验(即空斑形成减少试验)

表2不同浓度槐果碱体外抗病毒试验(在MO 1：5时)SFA浓度    200     100      50     25    病毒对    细胞对(ug/ml)                                  照        照空斑数(平  38      82       100    115   358       0均)注：病毒增殖抑制试验，即病毒感染后，在细胞内繁殖，由于细胞用琼脂糖覆盖，病毒只能经细胞-细胞途径进行传播，杜绝了细胞-液体-远处细胞的传播途径。由于一个局部地区细胞的破坏，不能摄取活性饮料中性红，在红色的背景下出现一个空斑，每个空斑由一个病毒感染单位所形成，空斑计数可以准确地表示病毒地滴度。同样，空斑形成减少试验也能准确反映槐果碱抑制CVB3m增殖地程度。表2结果表明：随着槐果碱浓度的增高，病毒空斑数逐渐减少，药物浓度与病毒空斑呈直线负相关(r＝0.9518)，即槐果碱对CVB3m增殖的抑制作用呈剂量依赖关系，经计算，当槐果碱浓度为200ug/ml时，对CVB3m的抑制率为92％，而低浓度25ug/ml时，其对CVB3m的抑制率仍有67.9％。

(二)体内试验

1.槐果碱对CVB3m心肌炎模型病毒血症期增殖抑制作用的微量法测定。

(1)制作病毒性心肌炎的槐果碱治疗模型：取小鼠18只，分A、B、C三组。

A.治疗组：每鼠接种0.8ml CVB3m悬液，2小时后用槐果碱注射液治疗，50mg/kg分2次/日腹腔内注射。

B.对照组：每鼠接种0.8ml CVB3m悬液，2小时后用无菌生理盐水0.2ml二次/日腹腔内注射。

C.空白组：每鼠0.2ml生理盐水0.2ml二次/日腹腔注射。

(2)小鼠血清标本的收集：至第3天，用75％酒精消毒每小鼠颈部皮肤，置于超净工作台内以无菌手术刀断其一侧颈总动脉，以无菌试管收集血液，静置于室温，待血清析出，将各组内6只小鼠的血清等量混合，每个小鼠0.1ml，三组各0.6ml，分别加入青链霉素，浓度为2000u/ml，置4℃冰箱2小时灭活。

(3)微量法测定各组标本的TCID₅₀(Tissue cultureinfections dose)：将上述三组标本10倍递减稀释，从10^-1至10^-8，在40孔板上，每个梯度做3个复孔，每孔滴25ul样本，另补25ul培养基，最后加50ul浓度为3×10⁵/ml的Hela细胞悬液(含小牛血清浓度为4％)，37℃，5％CO₂孵育至第四天观察结果。

(4)空斑减少法测定槐果碱对CVB3m病毒血症的抑制作用：将3种标本以各稀释度0.3ml接种于第4天的单层Hela细胞上，每个稀释度做2个复瓶，37℃吸附1小时后，弃标本液，用无牛血清培养基洗2次，用微量法观察三组小鼠血清标本不同稀释度下对Hela细胞的致病变作用。见表3。表3微量法测定槐果碱体内(小鼠病毒血症)抗CVB3m的作用病变孔数                      标本稀释度/总细胞  10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8数治疗组   4/4   4/4   4/4   3/4   1/4   0/4   0/4   0/4对照组   4/4   4/4   4/4   4/4   4/4   3/4   1/4   0/4上表3表明：经计算治疗组血清病毒滴度为

TCID₅₀，对照组为

TCID₅₀，槐果碱在体内对CVB3m的抑制率为99％。

2.体内：槐果碱注射液在体内对CVB3m增殖抑制作用的空斑法测定，二组小鼠血清标本不同稀释下，空斑数测得如下：

  表4空斑法测定槐果碱注射液体内抗CVB3m的作用空斑数  10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8治疗数  融合  融合  255   26    6     0     0     0对照组  融合  融合  融合  355   57    15    5     0表4表明：经空斑法测定，治疗组小鼠血清病毒滴度为26×10⁴÷0.3=8.3×10⁵pFu/ml，对照组为57×10⁵÷O.3=1.9×10⁷pFu/ml，槐果碱对CVB3m的抑制率为1-(8.3×10⁵)÷(1.9×10⁷)＝95.63％。结果表明：槐果碱对小鼠急性期CVB3m病毒血症的抑制率为95.63％。

3.槐果碱对柯萨奇B3m病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型心肌病理变化的保护：

通过槐果碱注射液对造型小鼠体内对抗病毒的研究，均显示出其低毒和明显的抗CVB3m的作用，对用药治疗组的小鼠都能存活50天以上，且心肌无病理变化，而不用药的对照组100％死于8天内，心肌细胞明显坏死伴淋巴细胞浸润。故槐果碱对抗CVB3m的作用，从而对病毒性心肌炎有明显治疗效果。

4.槐果碱在体内诱生干扰素

槐果碱能在小鼠脾细胞上诱生干扰素，在L₉₂₉细胞上以VSL测定干扰素效价，与对照组相比明显增加。

5.槐果碱对培养心肌细胞搏动次数及变化的影响：

用槐果碱后对已感染CVB病毒的心肌细胞搏动不减，有明显保护作用，对已感染病毒而未用槐果碱处理的对照者，其心肌细胞搏动甚微，甚至消失。前者上清液中心肌酶活性和LDH释放甚少；后者则明显增加。

6.用定性定量PCRCVBRNA的方法(激光扫描)检测CVB3m造型Balb/c小鼠心肌匀浆中CVBRNA，用槐果碱注射液治疗后与不用槐果碱治疗者二者相比，心肌匀浆中CVBRNA的清除率为99.38％。

(三)槐果碱的临床研究：

我院已总结70例用槐果碱注射液[沪卫药剂(95)-005(仁剂)]静脉滴注治疗的病毒性心肌炎(CVBRNA持续感染者)，并与50例用GIK-葡萄糖、胰岛素、氯化钾静脉滴注者作对照，静脉点滴槐果碱后临床症状疗效达87-95％，抗心律失常疗效达75-87.5％，ST段回升，EF％、SV、C0、CI均上升，细胞免疫提高，与GIK相比P＜0.01，对血中CVBRNA持续阳性者用槐果碱5-6mg/kg时，CVBRNA清除率为45.8％，7mg/kg时为55.5％，8-9mg/kg时为81.25％。采用高效液相色谱法(HPLC)测定槐果碱的血浓度，证明CVBRNA的清除率与所用槐果碱的用药剂量与血中所测血药峰浓度呈正相关，无明显副反应。

本发明的明显特点是：

1.槐果碱可以作为一种治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的有效药物。

2.治疗病毒性心肌炎重在治本，即重在病因治疗。槐果碱将病毒清除后，心律失常得以控制，胸闷气促得以解除，本药源于清热化湿药，故低热、全身乏力、酸痛等解除。

3.心肌内病毒清除后，心排量得以增加，心功能得以恢复，免疫力得以提高。

4.药源丰富，制备方法操作简便，成本低，适用于工业化生产。

下面结合实施例，对本发明作进一步描述：

实施例：将10千克苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，8％硫酸萃取，获得总生物碱，再经甲苯萃取，并通过足量7％盐酸提取槐果碱，调节pH值为8，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品，得率为0.12％。取一定量的槐果碱精品溶解于注射用水中，经过滤，含量测定，调节pH值为4，再通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，最后经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。

Claims (2)

1.槐果碱作为制备柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的用途，其中槐果碱的结构式为：

2.如权利要求1所述的槐果碱作为柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的制备方法，其特征在于：a.将含叶、花、茎干的苦豆子粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；b.对总生物碱经甲苯萃取，并通过5-10％盐酸提取槐果碱；c.调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；d.溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；e.通过0.65μm微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。