CN102727503A

CN102727503A - 一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102727503A
Application number: CN201110091632XA
Authority: CN
Inventors: 付玉杰; 祖元刚; 彭霄; 王薇; 赵春健
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及了一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用。老鹳草素对于疱疹病毒属的单纯疱疹病毒工型(HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(HSV-2)具有明显的抑制能力。老鹳草素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。由于老鹳草素具有毒副作用小，疗效确切，安全可靠等特点，而且老鹳草资源丰富，因此该发明将为低毒、高效抗病毒天然产物类药物的开发提供了广阔的市场前景。

Description

一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用，属于植物药开发领域。

背景技术

老鹳草[Geranium sibiricum Linne]别名老鹳嘴、老鸦嘴、贯筋、老贯筋、老牛筋，属于牻牛儿苗科老鹳草属多年生草本植物，生于山坡、草地及路旁，分布于我国辽宁、吉林、黑龙江、河北、江苏、安徽、浙江、湖南、四川、贵州和云南等地。老鹳草能够祛诸风皮肤发痒，治筋骨疼痛，痰火痿软，手足筋挛，麻木，利小便，泻膀胱积热，攻散诸疮肿毒，退痨热发烧，治风火虫牙痘疹疥癞等症(《滇南本草》)。去风，疏经活血，健筋骨，通络脉。治损伤，痹症，麻木，皮风，浸酒常饮(《纲目拾遗》)。止久痢，厚肠胃，调中健脾(《现代实用中药》)。治跌打损伤，止刀伤出血，又可止咳，益肺气(《贵州民间方药集》)。清热解毒。治热病消渴，痈疽疮肿(《药材学》)。

国内已有众多文献介绍了老鹳草中组成成分的药理活性：老鹳草主要化学成分为鞣质、黄酮、有机酸和挥发油等成分，具有抗菌、抗病毒、止泻、抗氧化、降血糖等药理作用(雷志勇，2002)。老鹳草为临床常用药，具有多种药理作用，其中黄酮类化合物作为主要成分，是一大类从高等植物中提取的可食用的多酚类物质，具有抗氧化和自由基清除活性，对人体具有营养及医疗价值，如抗病毒、抗癌、保护神经系统和心血管系统等(刑涛，2009)。老鹳草素作为老鹳草中的主要活性成分，其抗肿瘤活性已被深入研究(李长龙，2008)，但是其抗疱疹病毒活性尚未见报道。

病毒是最小的病原微生物，但病毒的传播最广，是目前世界上发病率最高的传染性疾病之一。在临床上较多的疾病与病毒感染有关。近3/4的传染病是由病毒引起的，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要不同的针对该病毒的抗病毒药物治疗，但目前世界上有效的抗病毒药物只有20多种。HSV(Herpes simplex virus)是一种单纯疱疹病毒，是疱疹病毒科的典型代表。HSV分为两种类型：HSV-1和HSV-2，HSV-1感染可引起婴幼儿、儿童及成人的唇疱疹、角膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎等；HSV-2主要通过直接接触病灶(性接触)而传播，并导致皮肤病变，可引起早产、流产、死胎、胎儿畸形以及智力低下等，并与子宫颈癌的发生密切相关，特别在艾滋病、器官移植和恶性肿瘤等免疫抑制病人常并发严重的HSV感染(尚小红，2005；伍伟祯，2004)。HSV在人群中感染较为普遍，一旦感染，治愈性较差且具有复发性。

近年来新的抗病毒药不断出现，但是病毒性感染的发病率仍持续不衰，特别是20世纪80年代艾滋病及其病原病毒的出现，对抗病毒药的研究开发提出了紧迫的要求，随着临床应用的日益广泛，医生和患者对抗病毒药的要求越来越高，因此抗病毒药的研究成为当前国际研究的热点之一。从1975年发现阿糖腺苷，特别是1977年阿昔洛韦(ACV，无环鸟苷)问世后，抗病毒药物才真正起步。目前市场上已有一些抗HSV中成药和西药，中成药普遍存在服用周期长、疗效不突出的问题，患者需要长时间忍受病毒的折磨，西药存在价格高、副作用大等问题。目前阿昔洛韦(ACV)和泛昔洛韦(FCV)是目前世界上用量较大的第二代广谱抗病毒药物，但是对新生儿或老年人的中枢神经系统的疱疹病毒感染，其结果仍不理想，而且对疱疹病毒潜伏期和复发次数没有多大影响，同时具有神经毒性样的副作用，因而，低毒、高效抗病毒天然产物类药物的开发将会具有广阔的市场前景。

发明内容

发明目的与意义：

本发明的目的与意义在于提供了一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用途径，并为低毒、高效抗病毒天然产物类药物的开发提供了广阔的市场前景。发明技术解决方案：

本发明以单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)毒株和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)为实验对象，观察从老鹳草中提取的老鹳草素抗单纯疱疹病毒I型和II型的活性。结果证明：

(1)老鹳草素对HSV-1及HSV-2感染的细胞具有预防作用；

(2)老鹳草素对HSV-1及HSV-2感染的细胞具有治疗作用；

(3)老鹳草素可降低HSV-1及HSV-2的感染性；

(4)老鹳草素对HSV-1及HSV-2有直接杀伤作用，使HSV-1及HSV-2感染的Vero细胞的活性下降。

(5)老鹳草素在体内对HSV-1及HSV-2感染具有治疗作用。

基于上述研究结果，本发明证实了从老鹳草中提取的老鹳草素具有预防及治疗疱疹病毒感染引起的疾病的新用途，可用于制备抗疱疹病毒的药物。

本发明可以纯化的形式与药学上适当的载体一起被使用。可制成的药物剂型包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液、或针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。

根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种。可以通过任何适当的方式给药，包括非肠道、静脉内、肌内、腹腔内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态，同时服用其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。

本发明的优点：

(1)老鹳草素具有低毒不易产生耐药性的特点；

(2)老鹳草素在体外具有很好的抗疱疹病毒活性；

(3)老鹳草素在体内对疱疹病毒具有治疗作用。

具体实施方式

实施例1：

1、从老鹳草中提取的老鹳草素的细胞毒分析

(1)细胞培养

Vero细胞在含有5％胎牛血清和均为100mg/mL青霉素与链霉素的DMEM单层培养基中生长。细胞融合时传代。细胞置24孔和6孔板上分别进行细胞毒和抗病毒分析。

(2)病毒孵育

HSV-1，HSV-2病毒株购自武汉大学病毒研究所。当Vero细胞长成单层后接种病毒，放入CO₂培养箱中培养，当细胞病变达到90％以上时，放入-80℃冰箱内。反复冻融3次后合并。

(3)细胞毒分析

A.将细胞置96孔板上，37℃培养24h。

B.移去培养基，加入含有适当稀释度的老鹳草素，每浓度8个重复。含2‰DMSO而无药物的200μL培养基作为对照。

C.培养3d后，移去培养基，各孔加入200μL MTT，37℃培养4h，弃去，各孔加入200μLDMSO，37℃培养0.5h，在混合器中混匀5min，540nm处测OD值，计算药物最大无毒浓度(TD₀)。

(4)实验结果

老鹳草素对Vero细胞的最大无毒浓度(TD₀)为12.8μg/mL，等同为0.013μM。

2、从老鹳草中提取的老鹳草素体外抗疱疹病毒活性分析

(1)老鹳草素抗HSV半数抑制浓度(IC₅₀)测定

A.采用96孔细胞培养板培养Vero细胞，制成1×10⁵mL细胞悬液，每孔加入200μL细胞液，于5％CO₂培养箱37℃培养24h。

B.弃生长液，加100TCID₅₀HSV-1，HSV-2病毒液200μL，37℃吸附1h，吸出病毒液，加用维持液稀释的不同稀释度的化合物200μL，每组8个复孔，置5％CO₂培养箱中37℃继续培养72h。实验同时设细胞对照、病毒对照。

C.当病毒对照细胞病变达75％以上，MTT法测吸光值，计算不同老鹳草素浓度的抑制率。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。

(2)抗病毒模式

为了确定老鹳草素抗病毒的模式，分为以下四组：

A.预处理病毒：用老鹳草素预处理病毒，二者室温下孵育1h，加入到96孔板上，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。

B.病毒吸附：将老鹳草素与病毒共同加入到96孔板上，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。

C.病毒复制：将病毒直接加到96孔板上，37℃培养1h后，同时加入覆盖培养基和老鹳草素，在培养箱中培养72h。

D.预处理细胞：在病毒感染前用老鹳草素预处理细胞，37℃培养1h后，加入病毒，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。

(3)实验结果

不同浓度老鹳草素IC₅₀见表1，老鹳草中老鹳草素抗HSV效果及模式分析见表2，表3。

表1老鹳草素对HSV-1和HSV-2的IC₅₀

表2老鹳草素抗HSV-1效果及模式分析

病毒抑制率(％)	老鹳草素	阿昔洛韦
			预处理病毒模式	90.61±2.97％	44.10±0.86％
预处理细胞模式	83.23±1.21％	39.35±3.22％
			吸附模式	80.29±3.52％	31.24±2.98％
复制模式	81.17±2.33％	94.44±3.51％

[0050] 表3老鹳草中老鹳草素抗HSV-2效果及模式分析

病毒抑制率(％)	老鹳草素	阿昔洛韦
			预处理病毒模式	87.20±1.07％	24.11±2.48％
预处理细胞模式	79.41±2.24％	33.23±4.01％
			吸附模式	82.04±2.61％	28.05±1.14％
复制模式	81.73±1.89％	92.67±3.09％

实施例2：从老鹳草中提取的老鹳草素动物体内抗疱疹病毒活性分析

检验老鹳草素抗HSV效果体内实验需小白鼠60只(由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，每只重18～22克，分为五组，每组12只，公母各半，分别为给药高剂量组(I)，中剂量组(II)，低剂量组(III)，阳性对照组(IV)和空白对照组(V)，I、II、III、IV组小鼠分别尾静脉注射滴度为0.3mL×10^-8HSV-1，禁食过夜(24小时)后灌胃给药，I组给药100mg/kg，II组给药75mg/kg，III组给药50mg/kg，IV组每日给生理盐水，连续给药七天，每日观察老鼠状态，称取体重，定量给食。十四天后脱颈处死并解剖所有小鼠，并观察脏器变化。

实验结果：

老鹳草素体内抗HSV半数有效浓度见表4。

表4老鹳草素体内抗HSV半数有效浓度(ED₅₀)

由上述实例结果可以作如下总结：

(1)老鹳草素细胞毒分析

老鹳草中老鹳草素对Vero细胞的最大无毒浓度(TD₀)为12.8μg/mL，等同为0.013μM。

(2)老鹳草素抗HSV半数抑制浓度(IC₅₀)测定

老鹳草素抗HSV-1和HSV-2的IC₅₀分别为1.81±0.05μg/mL和3.42±0.09μg/mL，阳性对照阿昔洛韦抗HSV-1和HSV-2的IC₅₀分别为0.12±0.11μg/mL和0.18±0.04μg/mL。有上述结果可知，老鹳草素的抗HSV-1和HSV-2能力与阳性对照阿昔洛韦近似。

(3)老鹳草素体外抗疱疹病毒活性四种模式分析

由实验结果可知，老鹳草素抗HSV-1能力略高于抗HSV-2能力，而且老鹳草素在预处理病毒模式，预处理细胞模式和吸附模式下抗HSV-1和HSV-2能力远远强于阳性对照阿昔洛韦在这三种模式下的抗HSV-1和HSV-2能力。在复制模式下，老鹳草素的抗HSV-1和HSV-2能力略弱于阳性对照阿昔洛韦。由此可以推断出，老鹳草素的抗HSV-1和HSV-2整体能力要高于阳性对照阿昔洛韦，抗疱疹病毒能力更加全面。

(4)老鹳草素体内抗疱疹病毒活性分析

老鹳草素体内抗HSV-1和HSV-2半数有效浓度(ED₅₀)分别为58.31±2.03mg/kg和60.47±1.53mg/kg，而阳性对照阿昔洛韦体内抗HSV-1和HSV-2半数有效浓度(ED₅₀)分别为70.15±0.95mg/kg和65.29±1.38mg/kg，老鹳草素的体内抗HSV-1和HSV-2半数有效浓度(ED₅₀)都要小于阿昔洛韦。由此可知，老鹳草素的体内抗疱疹病毒活性要好于阳性对照阿昔洛韦。

阿昔洛韦(ACV)和泛昔洛韦(FCV)等世界上用量较大的第二代广谱抗病毒药物具有对于疱疹病毒潜伏期疗效差，且具有神经毒性样的副作用，而本发明中的从老鹳草中提取的老鹳草素具有低毒、高效、不易产生耐药性的特点，由上述实施例可知，老鹳草素对HSV-1，HSV-2有明显的抑制作用，有望成为一种治疗疱疹病毒的新药。本发明中所提到的老鹳草素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型，包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液、针剂或粉针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。

附图说明

图一老鹳草素分子结构式。

Claims

1.本发明涉及了一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用，老鹳草素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。

2.权利要求1所述的一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用，其特征在于所述的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(HSV-1)。

3.权利要求1所述的一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用，其特征在于所述的剂型包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液或针剂，以及现代制药界所公认的控释或缓释剂型。