CN101084991B

CN101084991B - 一种藏药唐古特青兰提取物及其在制备抗病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN101084991B
Application number: CN2007102010826A
Authority: CN
Inventors: 李红玉; 张春江; 允田; 傅永红; 支德娟
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2007-07-16
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2027-07-16
Also published as: CN101084991A

Abstract

本发明涉及一种抗病毒药物。具体地讲，涉及了一种唐古特青兰提取物及其在制备抗病毒药物中的应用。本发明所提供的唐古特青兰提取物可以在抑制病毒吸附、预防病毒侵染、抑制病毒基因复制、直接灭活病毒等多环节发挥明显的抗病毒作用，故而该提取物可以在制备抗病毒药物中应用。本发明提供的唐古特青兰提取物可以在制备抗病毒药物中以单味或者复方方式制备成药物组合物，尤其是单味或者复方方式在制备治疗生殖器疱疹的药物组合物中应用，同时，其原料丰富、价廉、萃取工艺简单，成本低，并可很方便地做成各种剂型。具有重要的开发与应用前景。

Description

一种藏药唐古特青兰提取物及其在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种抗病毒药物。具体地讲，涉及了一种唐古特青兰提取物及其在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

藏药唐古特青兰为唇形科植物唐古特青兰(Dracocephalum tanguticum Maxim)的干燥地上部分，多年生草本。产于西藏、青海、四川西部和甘肃西南部，是青藏高原特有植物，又称“甘青青兰”，藏语称“知羊格”，具有清肝热、胃热、干黄水、愈疮、止血的功效，主治肝热病、胃热病、黄水病、使血、疮疡不愈。地上部分含黄酮类、氨基酸、甾醇、酸性成分，并呈挥发油类反应。药理研究表明青兰苷为唐古特青兰全草中的有效成分。经青海省高原医学研究所研究表明，唐古特青兰具有抗缺氧及抗氧化作用，[中草药，1995，26(12)：641-644]，[中草药，1994，25(3)：134-137]。张晓峰，王生新等从唐古特青兰分离到8种化合物，经化学和光谱分析鉴定为：齐墩果酸(1)、熊果酸(II)、胡萝卜甙(II)、茵芋甙(IV)、大波斯菊甙(V)、胡麻素(VI)、胡麻甙(VII)、胡麻甙-6-乙酸酯(VII)[植物学报，1994，36(8)：645-648]。虽然唐古特青兰在藏药中用途广泛，历史悠久，其药理活性有关抗缺氧作用报道甚多，但其抗病毒作用国内外未见报道。

病毒性疾病治疗药物发展较迟缓，主要由于病毒有严格寄生性，与细胞关系密切，病毒感染细胞后，进入细胞内，在宿主细胞内利用细胞酶系统复制；有些病毒核酸整合于细胞染色体，难于清除。病毒严格寄生在细胞内，使得药物杀伤病毒的同时对机体细胞也有损害。现有的抗病毒化学药物即因为毒性太大或耐药性的产生，其临床难以取得令人满意的效果。本发明以单纯疱疹病毒为例，阐明唐古特青兰提取物在制备抗病毒药物中的应用。单纯疱疹病毒引起的性传播性疾病，与宫颈癌关系密切。目前国内外研究的抗病毒药物已接近50种，但真正应用于临床的只有阿昔洛韦、拉米夫定等少数几类核苷类药物，这类药物作用靶点为病毒DNA聚合酶。它们以酶反应底物类似物的形式与正常底物竞争，直接降低或阻断病毒DNA聚合酶活性，其共同缺点是易产生耐药毒株，抗病毒谱窄，毒副作用大，价格高昂或药理特性不理想。因此，寻求更新更好的抗病毒药物已势在必行。

本发明提供了一种唐古特青兰提取物，该提取物可以在制备抗病毒药物中应用，与现有抗病毒合成药相比，其毒性低，安全可靠，药效作用强，而且唐古特青兰原料丰富、价廉、萃取工艺简单、制备成本低，可以制成各种剂型。

发明内容

唐古特青兰提取物的制备

将称取干燥唐古特青兰生药，粉碎，用适量浓酒精浸泡过夜，热水浴回流1～5h，提取1～4次，合并提取液，抽滤，旋转蒸发仪蒸发浓缩，冷冻冻干，紫外线照射灭菌获得总浸膏。

本发明所提供的唐古特青兰提取物可以在抑制病毒吸附、预防病毒侵染、抑制病毒基因复制、直接灭活病毒等多环节发挥明显的抗病毒作用，故而该提取物可以在制备抗病毒药物中应用。本发明提供的唐古特青兰提取物可以在制备抗病毒药物中以单味或者复方方式制备成药物组合物，尤其是单味或者复方方式在制备治疗生殖器疱疹的药物组合物中应用。由于软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂等药物剂型的制备是本领域的研究人员所能理解的，可以方便地实现唐古特青兰提取物与相应载体组合而制备成各种药物剂型：软胶囊、或硬胶囊、或滴丸、或片剂、或分散片、或颗粒剂、或注射液、或口服液、或栓剂。

本发明的优点在于：

1、唐古特青兰为纯藏药，毒性低，安全性高。

2、唐古特青提取物可通过抑制病毒吸附、预防病毒侵染、抑制病毒基因复制、直接灭活病毒等多环节发挥明显的抗病毒作用，唐古特青兰提取物可以在制备抗病毒药物中应用。

3、原料丰富、价廉、萃取工艺简单、制备成本低，可以方便地制备成各种剂型。

具体实施方式：

实施例一

唐古特青兰提取物的制备

实施例二唐古特青兰提取物的体外抗病毒作用

(一)唐古特青兰提取物对细胞的毒性

1病毒和细胞株

单纯疱疹病毒II型毒株是来源于武汉大学病毒研究所的HSV-II333株。Vero细胞购于美国ATCC公司。

2动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，兰州生物制品研究所实验动物中心提供。

3药物

以1％DMSO为溶剂配制唐古特青兰总浸膏药液，阿昔洛韦(武汉普生制药有限公司)作为阳性对照。

培养细胞，待96孔板细胞长成单层后倾去培养基，加入倍半稀释的5个稀释度的药液16、8、4、2、1mg/ml，每孔加药液150微升，37℃、5％CO₂培养箱培养，于24h和48h观察药物对细胞的毒性，设无药物细胞对照。由于药液颜色深，不能用MTT染色法观察药物对细胞的毒性，采用显微镜观察细胞病变(CPE)为指标。唐古特青兰提取物对Vero细胞的毒性表现为细胞颗粒较多，折光性强，细胞形态由棱形收缩成圆形，部分细胞脱落破碎，根据细胞病变的级别来判定细胞病变程度。我们将病变程度分为5级：完全圆化变形病变＞75％为4，病变＞50％＜75％为3，病变＞25％＜50％为2，病变＞15％＜25％为1，无病变为0。并按Reed-Meuench法计算半数有毒浓度(CC50)结果。结果显示唐古特总提取物的CC50为4.5±0.1mg/ml。

(二)唐古特青兰提取物半数有效浓度

将倍半稀释的5个稀释度药液4、2、1、0.5、0.25mg/ml与等量TCID50(组织半数感染量)的病毒混合，加入到96孔板上长成单层的Vero细胞上，每孔加样量为200微升，37℃，5％CO₂培养箱培养，于24h和48h观察药物对病毒的抑制性，设无药物细胞对照。采用显微镜观察细胞病变(CPE)为指标。病变程度分同前，以Reed-Muench法计算药物对病毒生长抑制率及半数有效浓度(EC50)。结果表明唐古特青兰提取物EC50分别为0.96±0.07mg/ml。

(三)唐古特青兰提取物对病毒的直接灭活作用

将浓度为4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml的唐古特青兰总浸膏药液分别与100PFU 0.1ml的HSV2-II等体积混合，37℃作用90min后，以此病毒药物混合液感染Vero细胞。37℃，5％CO₂吸附90min，加甲基纤维素覆盖液，37℃，5％CO₂培养。72h后，结晶紫染色，计数蚀斑，计算抑制率。每一药物浓度重复4孔，同时设置正常细胞对照、溶剂对照、阳性药物对照及病毒对照。

病毒抑制率(％)＝(病毒对照组平均出斑数-给药试验组平均出斑数)/病毒对照组平均出斑数

结果显示，在唐古特青兰总浸膏具有很强的对HSV-II的直接灭活作用，在浓度为4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，抑制率分别为99.0％，81.5％，50.0％，15.2％，0％。阳性对照阿昔洛韦在浓度为0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，抑制率分别为79.5％，45.5％，30.8％，3.2％，0％。

(四)唐古特青兰提取物对病毒侵入细胞的阻断作用

将浓度为4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml的唐古特青兰总浸膏药液用药物预先处理细胞90min，洗涤后以100PFU 0.1ml的HSV2-II攻击，37℃，5％CO₂吸附90min后洗涤，同上法培养与检查。

结果显示，在唐古特青兰总浸膏能够阻断HSV-II对细胞的侵入，在浓度为4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，抑制率分别为100％，56.6％，23.2％，15.4％，9.8％。阳性对照阿昔洛韦在浓度为0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，抑制率分别为87.5％，43.3％，26.2％，23.0％，14.8％。

(五)唐古特青兰提取物阻止HSV-2病毒颗粒对靶细胞的吸附

将供试药物与TCID₅₀ 0.1ml的HSV-2等体积混合，以此病毒混合物感染Vero细胞。37℃，5％CO₂吸附90min后洗涤，同上法培养与检查。

4、2、1、0.5、0.25mg/ml的唐古特青兰总浸膏对HSV-2病毒的抑制率分别为100.0％、100.0％、99.0％、62.3％、34.3％，阿昔洛韦在浓度为0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml时，对病毒的抑制率为90.1％、29.2％、27.9％、9.9％、0.0％。

(六)唐古特青兰提取物对病毒DNA合成的抑制作用

以荧光PCR方法测定病毒DNA，将浓度为4mg/ml，2mg/ml的唐古特青兰总浸膏药液和病毒等量混合感染细胞，设立病毒对照及细胞对照，37℃，5％CO₂培养24小时，消化，收获细胞，按标准方法从细胞中提取病毒DNA，作为荧光定量PCR的模板，按照荧光定量PCR HSV试剂盒程序操作，同时设立一系列浓度的HSV-DNA定量阳性标准品。以起始拷贝数的自然对数为横坐标，循环阈值为纵坐标，得到的回归直线为标准曲线据此对样品的拷贝数进行定量。

荧光PCR结果表明，唐古特青兰总浸膏能够显著抑制HSV-IIDNA的复制，浓度为4mg/ml，2mg/ml时，DNA拷贝数分别为(3.87±0.2)×10²，(2.12±0.52)×10³，而不加药液的病毒对照DNA拷贝数为(7.93±0.84)×10⁸。

实施例三唐古特青兰提取物的体内抗病毒作用

(一)唐古特青兰提取物对小鼠的急性毒性(LD50)

根据孙氏综合法，首先进行预试实验，算出D₀和D₁₀₀。在D₀和D₁₀₀的剂量范围内设5个剂量组，组间剂量比值为1∶0.8，观察一次给药后15d内动物死亡情况，计算LD₅₀。小鼠中毒症状：软弱无力，葡伏不动，四肢下垂于铁丝笼铁丝的间隙中，呼吸缓慢，最后抽搐死亡。尸体解剖，观察心、肺、肝、脾、肾、消化管道，肉眼未见明显病变。经统计学计算，结果LD50为5.12g/kg。

(二)唐古特青兰提取物对病毒感染小鼠的保护作用

选取18～22g清洁级昆明小鼠，雌雄各半，随机分组每组10只。感染部位常规消毒后，经右侧脑腔注射病毒悬液，感染剂量为0.05ml/只，感染24h后灌胃给药治疗。在药物LD50的1/2～1/10范围内确定高、中和低三个剂量组，另设阳性药物对照组(阿昔洛韦0.1g/kg)、安慰剂量组(生理盐水)、病毒对照组和正常组。连续治疗7d，每天观察小鼠的死亡情况、是否毛发蓬松、步态不稳及抽搐等存活状态。所得试验结果进行统计学(t检验)处理，试验结果重复三次，生命延长率计算公式如下：

生命延长率＝(给药组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数)/病毒对照组平均存活天数×100％

表1唐古特青兰总浸膏对HSV-2脑炎小鼠的治疗效果(n＝10)

药物	剂量(g/kg)	平均存活天数	存活率(％)	生命延长率(％)
					唐古特浸膏	2.0	4.0±0.6	0	29.0
	1.0	12.8±0.5	37.5	312.9
						0.5	6.6±0.7	10.0	112.9
阿昔洛韦	0.1	11.5±0.1	25.0	271.0
					生理盐水组	0.5	3.5±0.4	0	12.9
病毒对照组	-	3.1±0.3	0	-
					正常对照组	-	30.0	100	-

表1中，脑炎模型小鼠经过供试药物治疗以后，平均存活天数有所延长，唐古特青兰总浸膏高、中和低三个剂量组与生理盐水组、病毒对照组差别有统计学意义(P＜0.05)，且与阳性药物阿昔洛韦组疗效相同(P＞0.05)。其中1g/kg剂量组对小鼠的生命延长作用最强，其生命延长率达到312.9％；其次为0.5g/kg剂量组，其生命延长率为112.9％，2g/kg剂量组的最弱，其生命延长率为29％。

通过以上具体实施方案，唐古特青兰总浸膏体外抗病毒疗效的治疗指数(TI)为4.56(病毒等量作用于细胞)。体内试验表明能够显著延长平均存活时间，提高病毒感染脑炎小鼠存活率，说明唐古特青兰提取物具有很强的抗病毒作用，适宜在制备各种抗病毒药物包括在制备治疗生殖器疱疹药物中应用。

Claims

1.唐古特青兰提取物在制备抗HSV- II疱疹病毒药物中的应用，其特征是：其中唐古特青兰提取物按以下方法制备：称取干燥唐古特青兰生药，粉碎，用适量的浓酒精浸泡过夜，热水浴回流1~5h，提取1~4次，合并提取液，抽滤，旋转蒸发仪蒸发浓缩，冷冻冻干，紫外线照射灭菌获得总浸膏。