CN103816199B - 一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方，属于中兽药制备技术领域。采用乙醇回流法提取淫羊藿16份、野菊花4份、三七1份中的醇溶成分，采用水煎醇沉法提取醇提后的淫羊藿、野菊花及黄芪4份中的多糖成分，各醇提物与多糖成分以净含量按不同比例组合形成不同的提取物复方。采用细胞培养和临床试验筛选抗鸭病毒性肝炎(DVH)复方，发现以黄酮：多糖＝1∶4组成的复方2对DVH临床病例的治愈率比不治疗对照组提高35.48％～36.84％，且病程缩短1～2天。本发明所获中药提取物复方不仅对DVH预防和治疗效果良好，且组方和制备工艺简单，为水溶性棕色透明液体；易于质量监控；成本低廉；纯中药无污染，无残留，无毒副作用。

Description

一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方

一、技术领域

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方，属于中兽药制备技术领域。

二、背景技术

鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、DuckAstrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80％，甚至可高达100％，是严重危害养鸭业主要病原之一。

目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。本实验室也发现了黄芪、淫羊藿、野菊花等多种中药多糖和黄酮成分能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病、鸭病毒性肝炎等病毒的感染，提高机体免疫力的作用。前期的研究还发现，黄芪、淫羊藿、野菊花和三七四味药物组成的复方提取液不仅在体外对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒等感染鸡胚成纤维细胞的抑制作用显著较各单味药物增强，而且对雏鸡人工感染新城疫病毒、传染性法氏囊病毒的治疗效果也显著优于各单味药物。这也充分体现了中药配伍的作用和优势。

基于上述研究基础，为研究有效的鸭病毒性肝炎临床治疗用药物，并方便于质量监控，本发明首次将淫羊藿、野菊花、三七中的醇溶成分和淫羊藿、野菊花、黄芪的多糖等抗鸭病毒性肝炎有效的提取物按照不同比例组合形成复方，采用体外细胞培养法结合雏鸭体内攻毒法筛选出作用较好的复方，将所筛选出的提取物复方治疗鸭病毒性肝炎临床发病鸭，其治愈率较不治疗对照组提高35.48％～36.84％，存活率显著提高，且其病程明显缩短。

三、发明内容

技术问题 本发明针对世界范围内还没有有效的抗鸭病毒性肝炎临床用药，提供一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方制备方法，所获得的一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方中总黄酮与多糖含量比为1∶4，不仅质量监控方便，制备工艺简单，成本低廉，无污染，而且对鸭病毒性肝炎临床发病鸭治愈率较不治疗对照组提高35.48％～36.84％，存活率提高显著，且其病程缩短1～2天，可用于鸭病毒性肝炎的临床防治。

技术方案

采用乙醇减压回流法提取淫羊藿(16份)、野菊花(4份)、三七(1份)中的醇溶成分，并测定其有效成分总黄酮含量；采用水煎醇沉法，收集淫羊藿、野菊花醇提后药渣及黄芪(4份)中多糖提取物，并测定其多糖含量。将醇提取物(以黄酮计算)与多糖提取物以不同比例按其净含量组合后形成不同的提取物复方。采用体外细胞培养结合雏鸭体内DHV攻毒法筛选出抗DVH较好的复方，将所筛选出的复方治疗鸭病毒性肝炎临床发病鸭，观察其动态死亡情况，统计各组死亡率。按此方法制备的中药提取物复方2中总黄酮与多糖含量比为1∶4，为水溶性棕色透明液体，且无明显的可见沉淀物。

有益效果

病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40％以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。

而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80％，甚至可高达100％，造成的损失难以估量。虽然目前国家专利局已经受理或审批多项抗鸭病毒性肝炎的中药专利，但这些专利，大部分为散剂，其治疗效果有限，因为发病的动物采食减少，药物摄入往往难于达到需要的治疗量，甚至不能摄入；有点虽然为煎液，但由于组方复杂，剂型粗放，沉淀物多而易造成养殖舍饮水管道堵塞，而且成分复杂，产品无质量监控或监控困难；还有的则仅为预防用。

淫羊藿、黄芪、野菊花、三七等都是常用的中药之一，其主要成分为黄酮类成分和多糖成分等，具有良好的抗病毒、抗氧化等作用。我们的前期试验研究发现其组成的复方对鸡新城疫、传染性法氏囊病等病毒性疾病均有良好的治疗作用。本发明获得的抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方，不仅临床疗效显著提高，缩短病程，且制剂工艺简单，质量监控方便，使用方便，成本低廉，无污染，可用于鸭病毒性肝炎的临床防治。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.目前用于鸭病毒性肝炎的临床治疗用药尚缺乏。本发明提供的中药提取物复方对鸭病毒性肝炎的临床治疗效果显著，可以使治愈率较不治疗对照组提高35.48％～36.84％，且其病程缩短1～2天；预防效果显著。

2.剂型优于目前公布的专利。目前公布的专利大部分为散剂，其治疗效果有限，因为发病的动物采食减少，药物摄入往往难于达到需要的治疗量，甚至不能摄入。有点虽然为煎液，但由于组方复杂，剂型粗放，沉淀物多而易造成养殖舍饮水管道堵塞，而且成分复杂，产品无质量监控或监控困难；还有的则仅为预防用。而本提取物复方组方简单，制剂工艺简单，质量监控方便，成本低廉，为水溶性棕色透明液体，不会造成饮水管道堵塞。

四、具体实施方式

1.中药提取物复方的制备

各取淫羊藿160g、野菊花40g、三七10g，加8～10倍量80％乙醇减压回流提取，反复2次，收集合并提取液，减压浓缩至浸膏为醇提物；滛羊藿、野菊花的醇提后药渣和黄芪40g加10倍量水，武火煮沸后文火持续煎煮1小时，收集的煎煮液，浓缩至1g生药/mL，静置过夜后，高速离心，上清中缓慢加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％，静置过夜，收集沉淀为多糖提取物；冷冻干燥后分别芦丁法和苯酚-硫酸法测定醇提物中总黄酮和多糖提取物中多糖含量。将醇提物以少量无水乙醇溶解；多糖提取物以蒸馏水充分溶解后，将两种液体分别以糖、黄酮净含量不同比例(多糖：黄酮＝6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，分别命名为提物物复方1～7)混合，并加入适量吐温80助溶，充分摇匀后灌装消毒备用。

2.中药提取物不同配比复方对DHV-1感染体外培养鸭胚肝细胞的抑制作用观察筛选

取14-16日龄鸭胚，无菌条件下取出肝脏。将取出的鸭胚肝脏去胆囊，用D-Hank′s清洗2次，剪碎后用D-Hank′s清洗3次。加入0.25％胰蛋自酶，37℃消化8～15min，吸掉胰蛋白酶，用D-Hank′s清洗3次，加入含1％青霉素钾、1％硫酸链霉素、1％L-谷氨酰胺、10％小牛血清的DMEM培养基。计数使细胞浓度在0.8×10⁶-1.2×10⁶个/mL范围内，置37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞形成完整单层后，弃去细胞培养液，用D-Hank`s液洗2次待用。

将提取物复方1～7用细胞维持液分别从最大安全浓度连续倍比稀释5个浓度。在鸭胚肝细胞单层中每孔各加入病毒70μL，培养2h后弃去病毒液，用D-Hank’s反复清洗3遍，弃去清洗液，分别加入70μL稀释后受试药物，每药各浓度重复5孔。同时设细胞对照(CC)和病毒对照(VC)，置38℃5％CO₂培养箱内培养，当VC组出现明显病变时，用MTT法检测，读取A₅₇₀值。同时计算病毒抑制率＝(A_{570.药+病毒}-A_570.VC)/(A_570.CC-A_570.VC)×100％。以A₅₇₀值和病毒抑制率综合分析药物的抗病毒作用。

结果见表1和表2。从A₅₇₀值可以看出，复方1～7均有1～3个浓度显著高于病毒对照组，尤其是复方7和复方4，均有3个浓度显著高于病毒对照组；而复方1，2和4的部分浓度甚至高于细胞对照。从病毒抑制率而言，也是以复方1，2，4和7较高。说明复方1，2，4和7具有较好的体外抗DHV-1感染细胞作用。

表1中药提取物复方体外抗DHV-1作用的A₅₇₀值

注：同列数据标不同字母者差异显著(p＜0.05)。

表2中药提取物复方体外抗DHV-1作用的病毒抑制率

3.中药提取物不同配比组方对鸭病毒性肝炎自然感染病例的治疗作用观察筛选

购买临床发现的鸭病毒性肝炎自然感染发病的4日龄樱桃谷鸭，随机均分8组，每组31羽，分别为阳性对照组和7个复方组。除阳性对照组外，其余7组鸭分别于饮水中添加复方药物饮喂，5mg/羽.天，连续3天，连续7天每天观察记录各组鸭死亡情况，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。

结果发现，总体上看，药物治疗组发病较急，24h内大量死亡，尤其是复方1，2，4，5，6和7；48h内死亡减少，72h基本不死亡，复方1，2，3在72h，复方5，6在96h即停止死亡。而阳性对照组基本上没有死亡规律，直到96h仍然有大量死亡，直至全部死亡。治疗后病程缩短1～2天。复方组死亡快速，甚至先于病毒对照组，可能用药量依旧过大，因此拟降低用药量。

从存活率来看，复方2的存活率最高，为35.48％；其次是复方4和7，为25.81％；复方5和6的存活率最低，为16.13％。复方1，2，3，4和7的存活率均显著高于阳性对照组。

表3各复方对鸭病毒性肝炎临床自然发病鸭的治疗试验结果

注：同列数据标*表示与阳性对照组差异显著(p＜0.05)。

4.中药提取物不同配比组方对DHV-1攻毒感染鸭的治疗作用观察筛选

3日龄非免樱桃谷鸭随机均分9组.，每组38羽，分别为空白对照组(单独饲养)、攻毒对照组和7个复方组。除空白对照组外，其余8组鸭分别肌肉注射鸭肝炎病毒DHV-10.2mL/羽后，1h后各复方组分别于饮水中添加复方药物饮喂，3mg/羽.天，连续3天，连续7天每天观察记录各组鸭死亡情况，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。

如表4所示，空白对照组没有死亡，阳性对照组存活率0.00％，各复方组的存活率均显者高于阳性对照组。7个复方组中，以复方2存活率最高，为36.84％；其次是复方4，为31.58％；复方1和复方7的存活率为28.95％，复方3的存活率最低，为15.79％。从死亡时间看，各组死亡主要集中在攻毒后24h～36h，尤其是30h，阳性对照组在30h前死亡只数最多，到120h仍然出现死亡，直至全部死亡；复方1和3组在96h，复方2和6在120h即停止死亡，治疗后病程缩短1～2天。

表4各复方对DHV-1攻毒发病鸭的治疗试验结果

注：同列数据标*表示与阳性对照组差异显著(p＜0.05)。

提取物复方对鸭病毒性肝炎自然发病和DHV-1攻毒发病鸭的治疗试验结果说明提取物复方对鸭病毒性肝炎均有一定的治疗效果，尤其是复方2，治疗后存活率显著提高，较阳性对照组(0％)提高了35.48％～36.84％，且病程缩短1～2天。

5.复方2对DHV-1攻毒感染的预防作用研究

1日龄非免樱桃谷鸭随机分成空白对照组(单独饲养)、阳性对照组、药物预防组3组，每组50只。药物预防组从1日龄起每天饮喂复方2，1.5mg/只/天，连用4天，放入饮水中混匀给药，用药前控制饮水；自由采食。至5日龄时，除空白组外其余组分别腿部肌肉注射DHV-1病毒0.2ml/只。攻毒后仍继续给药，连续3天。观察记录各组鸭的临床症状和病理变化，每天定时记录各组鸭发病死亡情况，直至停止死亡后24小时。死亡鸭逐只剖检观察病变，以具有典型鸭病毒性肝炎病变记录为有效。

结果如表5所示，空白对照组没有死亡，阳性对照组的存活率为2％，药物预防组为40％，显著高于阳性对照组，提高了38个百分点，病程缩短2天。

表5复方2对DHV攻毒感染预防试验结果

注：同列数据标*表示与阳性对照组差异显著(p＜0.05)。

综合分析，提取物复方2对DHV-1临床发病鸭和攻毒发病均有良好的治疗和预防作用，其治愈率较阳性对照组提高35.48％～36.84％，且病程缩短1～2天；预防时也能提高38个百分点。而且复方组方和制剂工艺简单，便于质量监控，仅用简单的分光光度法即可实施；制剂为水溶性液体制剂，使用方便；成本低廉；纯中药制剂无污染，无残留，无毒副作用。

Claims (2)

1.一种抗鸭病毒性肝炎中药提取物复方，将乙醇回流法提取的淫羊藿、野菊花、三七中的醇溶成分与用水煎醇沉法提取的淫羊藿、野菊花、黄芪多糖成分按照不同比例组合后形成中药提取物复方。

(1)淫羊藿160g、野菊花40g、三七10g，加8～10倍量80％乙醇减压回流提取，反复2次，收集合并提取液，减压浓缩至浸膏为醇提物；淫羊藿、野菊花醇提后的药渣和黄芪40g加10倍量水，武火煮沸后文火持续煎煮1小时，收集的煎煮液，浓缩至1g生药/mL，静置过夜后，高速离心，上清中缓慢加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％，静置过夜，收集沉淀为多糖提取物；冷冻干燥后分别芦丁法和苯酚-硫酸法测定醇提物中总黄酮和多糖提取物中多糖含量。

(2)将醇提物以少量无水乙醇溶解；多糖提取物以蒸馏水充分溶解后，将两种液体分别以糖、总黄酮净含量不同比例(多糖：总黄酮＝6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，分别命名为提物物复方1～7)混合，并加入适量吐温80助溶，充分摇匀后灌装消毒即为提取物复方1～7。

(3)按上述方法制备的提取物复方1～7对DHV-1感染鸭胚肝细胞具有抑制作用，复方1，2，3和7效果较好。

(4)按上述方法制备的提取物复方1～7对鸭病毒性肝炎自然感染发病病例具有治疗作用，存活率提高35.48％～16.13％，复方2的存活率比不治疗组提高35.48％，病程缩短1～2天。

(5)按上述方法制备的提取物复方1～7对DHV-1攻毒发病鸭具有较好治疗作用，存活率提高36.84％～15.79％，复方2的存活率比不治疗组提高36.84％，病程缩短1～2天。

(6)按上述方法制备的提取物复方2对DHV-1攻毒具有较好预防作用，存活率提高38％，病程缩短2天。

(7)按上述方法制备的提取物复方最佳组合为复方2，其多糖：总黄酮＝4∶1。

(8)按上述方法制备的提取物复方制剂为水溶性棕色透明液体制剂，使用方便；质量监控方法简单，用分光光度法即可实施。

2.权利要求1所述方法获得的中药淫羊藿、野菊花、三七、黄芪中的提取物复方对鸭病毒性肝炎临床病例具有显著的防治效果，可以提高存活率35.48％～36.84％，缩短病程1～2天；制剂为水溶性棕色透明液体，使用方便；质量监控方法简单。