CN105726742B - 一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药及其制备方法 - Google Patents

一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药，由包括以下重量份数的组分制成：金银花10～50、鱼腥草10～50、大青叶6～20、连翘8～40、黄芩10～40。本发明还公开这种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药的制备方法。本发明组分配方合理，协同增效，对鸡新城疫病毒病和防治禽流感具有明显的防治效果；绿色安全，稳定性好，易于运输和保存；用于饮水给药，使用方便，具有较好的应用推广前景；制备方法简单；在复方制剂中使用资源丰富的药材，降低了成本；同时在鸡产品中不会产生药物残留，有利于保障食品安全。

Description

一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种禽用复方中兽药，更具体的，是涉及一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药及其制备方法。
背景技术
中兽药是近年新兴的产业，就是将中医药理论应用于动物身上。因中草药含有丰富的维生素、微量元素及其他活性成分，能够增强机体免疫功能，全面协调机体生理代谢，减轻病毒感染后对家禽产生的各种不良影响，且不会产生危害人体健康的药物残留，使得中兽药在抗病毒方面已经得到比较多的应用。
具有抗病毒作用的中药包括清热燥湿药，如黄芩；清热解毒药，如金银花、板蓝根、蒲公英、穿心莲、白花蛇舌草；补益药，如黄芪、三七、党参、淫羊藿。
鸡新城疫病毒病是对家禽养殖业危害严重的疾病之一，虽然目前市场上已经有不少抗鸡新城疫病毒病中兽药的产品研发，但是这些中兽药产品的制备方法往往比较复杂，不利于中兽药产品的推广和应用；而且家禽服药后，仍然时不时会出现鸡新城疫病毒的流行和感染现象，基本难以达到的治愈的作用。
历史上历次流感的发生给人类带来的灾难是巨大的，1997年香港发生禽流感病毒H5N1感染人的事件，这是禽流感病毒首次突破人与动物种属间的差异传播，截止到1998年2月11日先后有18人确诊为H5N1病毒感染并发病，导致其中6人死亡；2003年冬天在亚洲的东亚、东南亚发生禽流感，截止目前已有多人因感染禽流感病毒而丧生。这一系列事件引起了人们极大的恐慌，一时间使得人们谈“禽”色变，如何去面对禽流感，这给人类带来了一个巨大的挑战。对禽流感的防治目前主要采用疫苗预防和药物治疗相结合的方法。疫苗是预防流感的主要手段，由于禽流感病毒抗原性变异，可使疫苗的有效性显著降低，因此抗禽流感病毒的药物研究越来越受到重视。目前常用的抗病毒类治疗药物有金刚烷胺类、利巴韦林类和神经氨酸酶抑制剂类，由于禽流感病毒血清型较多，在临床应用效果不明显。为了保证人或动物的健康，目前市场上亟需有效的抗禽流感药物。
发明内容
本发明的第一目的是针对上述现有技术的不足，提供一种安全有效、无毒无残留的抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药。
本发明的第二目的是提供所述抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药的制备方法。
为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药，其由包括以下重量份数的组分制成：
组分 重量份数
金银花 10～50
鱼腥草 10～50
大青叶 6～20
连翘 8～40
黄芩 10～40。
优选的，所述抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药，其由包括以下重量份数的组分制成：
组分 重量份数
金银花 20～40
鱼腥草 20～40
大青叶 8～12
连翘 12～20
黄芩 15～25。
优选的，所述抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药，其由包括以下重量份数的组分制成：
组分 重量份数
金银花 30
鱼腥草 30
大青叶 10
连翘 18
黄芩 20
一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药的制备方法，包括的步骤如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡20～30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；优选的，水量为药材重量的3-5倍。
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20～25分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20～30分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08～0.12Mpa和20～30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
优选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为30分钟。
优选的，所述步骤(2)中两次煎煮的停止时间均为沸腾后20分钟。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：用于饮水给药，使用方便，具有较好的应用推广前景；绿色安全，稳定性好，易于运输和保存；制备方法简单；在复方制剂中使用资源丰富的药材，降低了成本；对鸡新城疫病毒病和禽流感具有明显的防治效果；同时在鸡产品中不会产生药物残留，有利于保障食品安全。
附图说明
图1是本发明验证实施例2第一至六组IFITM3表达量结果示意图(其中，a是第一组，b是第二组，c是第三组,d是第四组,e是第五组,f是第六组)；
图2是本发明验证实施例3同途径预防组24～72小时死亡鸡胚数的结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图3是本发明验证实施例3同途径治疗组24～72小时死亡鸡胚数的结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图4是本发明验证实施例3异途径预防组24～72小时死亡鸡胚数的结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图5是本发明验证实施例3异途径预防组24～72小时死亡鸡胚数的结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图6是本发明验证实施例3同途径预防HA效果评价结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图7是本发明验证实施例3同途径治疗HA效果评价结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图8是本发明验证实施例3异途径预防HA效果评价结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图9是本发明验证实施例3异途径治疗HA效果评价结果示意图(其中，g是鱼腥草，h是野菊花，i是大青叶,j是连翘，k是黄芩，l是复方1，m是复方2，n是复方3，o是抗病毒，p是双黄连，q是清开灵，r是黄芪多糖，s是板蓝根，t是西药对照组，u是感染对照组，v是空白对照组)；
图10是本发明验证实施例4各组鸡的成活数量结果示意图(其中，w是中药复方组，x是连翘组，y是攻毒对照组,z是空白对照组)。
具体实施例
为了更好地阐述本发明内容，下面用若干较佳的具体实施例进行说明。
原理说明
金银花是传统的中药材，其主要药物成份包括有木犀草素、肌醇、皂甙及鞣质等。具有抗菌，清热，解毒疮，止痢疾，去皮肤血热，养血止渴等功效。
鱼腥草又名蕺菜，味辛，性微寒，归肺经。具有镇痛止血，清热解毒，抗菌消炎，消痈排脓，利尿通淋，降低毛细血管脆性，增加机体免疫功能等功效。
大青叶味苦，性寒，归心、肺、胃经。常用于清热、解毒、利咽和止痛，有免疫调节、抑菌及活血化瘀、清除自由基、抗病毒、抗炎和利胆等药理作用。
连翘是我国临床常用的传统中药之一，其主要药物成份有连翘甙、连翘酯甙和芦丁。具有清热解毒，抗菌抗病毒，利尿，调节非特异性免疫等药理作用。
黄芩是我国的传统中药，历代本草均有记载。具有清热燥湿、泻火解毒和止血的功效，用于湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、臃肿疮毒等病症的治疗。
以上诸药在本发明提到的配比下合用，协同增效，对鸡新城疫病毒病或禽流感具有明显的防治效果，同时在鸡产品中不会产生药物残留，有利于保障食品安全。
其中，优选的金银花:鱼腥草:大青叶:连翘:黄芩按3:3:1:1.8:2配比合用，可达到最佳治愈的效果。
实施例1
一种禽用抗鸡新城疫病毒病的复方中兽药口服液，由以下配方表内的重量份数中药材组分制成：
组分 重量份数
金银花 30
鱼腥草 30
大青叶 10
连翘 18
黄芩 20
制备方法如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08Mpa和30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
实施例2
一种禽用抗鸡新城疫病毒病的复方中兽药口服液，由以下配方表内的重量份数中药材组分制成：
制备方法如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08Mpa和30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
实施例3
一种禽用抗鸡新城疫病毒病的复方中兽药口服液，由以下配方表内的重量份数中药材组分制成：
组分 重量(g)
金银花 50
鱼腥草 50
大青叶 20
连翘 40
黄芩 40
制备方法如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08Mpa和30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
实施例4
一种禽用抗鸡新城疫病毒病的复方中兽药口服液，由以下配方表内的重量份数中药材组分制成：
组分 重量(g)
金银花 10
鱼腥草 10
大青叶 6
连翘 8
黄芩 10
制备方法如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡20分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后25分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后30分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.12Mpa和20℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
实施例5
一种禽用抗鸡新城疫病毒病的复方中兽药口服液，由以下配方表内的重量份数中药材组分制成：
制备方法如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡20分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后25分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后30分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.12Mpa和20℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL，混匀，滤过，灌封，灭菌。
上述(3)步骤目的是避免药业蒸煮时间过久，可以最大程度保留有效成分，保证药效。
验证实施例1
将实施例1、2、3、4和5制得的复方中兽药口服液(以下分别相应地简称试验组1、2、3、4、5)和购得的利巴韦林(以下简称对照组)分别应用于受鸡新城疫病毒感染的鸡群，比较各组对抗鸡新城疫病毒病的综合防治效果。
利巴韦林：为抗病毒常用药物。
供试鸡：三黄鸡羽鸡苗140只，所喂饲料为自配的不含任何药物，饮用洁净自来水。
操作方法：
将新城疫病毒(NDV)接种于9日龄SPF鸡胚尿囊液，接种胚置37℃继续孵育。24h死亡鸡胚弃去，收获24～48小时死亡鸡胚，放入4℃冰箱，在第48h收获全部鸡胚尿囊液，用血凝法(HA)测病毒效价，并将病毒分装置于-80℃保存。
取NDV F48E9鸡胚尿囊液用PBS在2ml灭菌EP管内，作10倍连续稀释至10-11，取10-7～10-11 5个稀释梯度接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释梯度接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1ml。37℃孵化，24h后每隔6h照蛋1次，记录鸡胚死亡情况，连续观察120h。根据Reed-Muench法计算EID50。
供试药物：复方中兽药口服液、利巴韦林。
试验分组及处理：
将上述供试鸡随机分成7组，每组20只，具体如下所示：在7,10,13,15,17天，每天取5只鸡，心脏采血，分离血清，做HI实验，监测母源抗体含量。在17日龄时，母源抗体降到3log2以下。将实验动物挑出弱雏后随机分为6组，每组20只，分别为实施例1组、实施例2组、实施例3组，实施例4组、实施例5组、利巴韦林对照6组和攻毒对照7组。在第18日龄，各组鸡全部颈部皮下注射0.2ml浓度为106EID50的病毒稀释液。感染病毒的同时口服实施例1、2、3、4和5组的中药口服液，按每只鸡每天每千克体重1g中药口服液。实施例6组按人用推荐剂量换算为每只鸡每天每千克体重10mg。
评价指标：
(1)临床体征
试验2、4组在攻毒后第三天，鸡群开始呼吸道症状，有部分鸡只呼吸出现呼噜声；在攻毒第四天，2、4组，各有2只鸡出现两脚后伸神经症状；利巴韦林组有2只出现一腿后伸的神经症状，鸡群整体精神萎靡；攻毒第五天死亡率达到高峰；第六、七天死亡持续；第八天死亡开始减少；第九天以后未见死亡；但试验2、4组，利巴韦林组，攻毒对照组，出现的神经症状、呼吸道症状，没有恢复迹象。
(2)死亡情况，各组死亡率统计见下表：
实施例1、2、3是采用相同的制备方法，用于比较不同剂量复方中兽药口服液的死亡率；而实施例2与实施例4、实施例3与实施例5均用相同的中药配比，用于比较不同制备方法得到的复方中兽药口服液的死亡率。结果表明，实施例1的复方中兽药口服液对鸡新城疫病毒感染具有明显的治疗作用，而实施例2、3、4和5对抗鸡新城疫病效果不显著。即表明本发明的中药配比不是随意组合的，中药配比组合决定复方中兽药口服液治疗鸡新城疫病毒的效果。
验证实施例2
1实验目的
干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)具有明显的抗病毒作用。有研究表明敲除IFITM3基因后，细胞被病毒感染的速度会呈指数上升；如果该蛋白表达高，说明对病毒感染有显著抑制作用。为了探究中药复方与单方对三黄鸡IFITM3基因表达的区别。由于单味药在干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)表达中的作用不明显，因此没有进行单味药的抗鸡新城疫病的效果。
2材料方法
2.1实验仪器
珠海黑马1416r高速低温冷冻离心机，罗氏lightcycler 480，荧光定量pcr仪；上海标本匀浆机，旋转蒸发仪，纯水仪。
2.2实验试剂
Rnaiso plus；
PrimeScriptTM RT Master Mix；
Premix Ex TaqTM II；
以上试剂均购自takara宝生物工程有限公司。
2.3实验药物
连翘，黄芩，金银花，鱼腥草，大青叶。
2.4实验动物及分组
1日龄三黄鸡250只，饲养至9日龄，挑出弱雏，随机分为7组，编号为1～7每组30只。
2.5中药炮制及给药
连翘，黄芩，金银花，鱼腥草，大青叶各100g，单独煎煮，并减压浓缩到1g生药/ml。
连翘:黄芩:金银花:鱼腥草:大青叶按1.8:2:3:3:1混合煎煮，先煎连翘，鱼腥草，大青叶,金银花，至煮沸，再加入黄芩，文火煎煮至沸腾后20分钟，过滤得到药液A；药渣再加水煎煮，至沸腾后20分钟，过滤得到药液B；合并2次滤液并浓缩到0.5g生药/ml。
3.2动物实验：
10日龄雏鸡200只，挑除弱雏，剩余150只随机分成6组。第一组饲喂连翘，第二组饲喂金银花，第三组鱼腥草，第四组黄芩，第五组大青叶，第六组复方。按每千克体重1g生药的剂量，每天上午10：00灌服。
3.2取样：
第1,3,5,7日下午两点，从第一到7组中随机取5只，颈部放血处死。取心，胸腺，脾，肺，法氏囊，将脾脏切一半放入预先分装好的样本保存液中，并于-20℃保存；其余样品用纱布包裹，迅速投入液氮中冷却，并置于-80冰箱，保存备用。
3.3样品处理：
3.3.1Rna提取
Trizol法提取rna，并稀释至250ng/ul
3.3.2反转录
Takara PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒，10ul体系翻转，并稀释浓度至200ng/ul。
3.3.3荧光定量PCR
引物：
IFITM:上游引物TATGGGAGGACAGCGAAGAT；
下游引物：ACAACGGGAGGTAGAGAAACAC
β-actin上游引物：CCCCATGCCATCTCCGTCTG；
下游引物：CCTCGGGGCACCTGAACCTCTC
qpcr程序：
4.用2-△△t法处理的数据见下表：
结果表明：服药第一天，各组IFITM3表达量基本一致；服药第三天，第六组IFITM3表达量已有显著变化；服药第五天，各组IFITM3表达量达到最高峰，除第五组IFITM3表达量与前两天有显著差异外，第一至四组IFITM3表达量与前两天差异不显著，但第六组IFITM3表达量与前两天差异极显著。
说明单味中药促进IFITM3基因表达的作用与空白组无显著差异，复方中药促进IFITM3表达作用与空白组以及各单味中药组均有极显著差异。即中药在刺激IFITM3基因表达的过程是一个协同过程，通过药物复合使药物效价实现一加一大于二的效应。
本发明通过五种中药以合理的剂量配伍，显著提高对IFITM3基因的表达量。
验证实施例3抗禽流感病毒的中药及其复方制剂的体外筛选
禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和疾病的综合征，该病毒能感染多种家禽和野禽，引起或不引起发病。目前对于该病的防治，以预防为主，多采用疫苗免疫接种注射的方法，偶有采用药物治疗，多采用金刚烷胺类药物、利巴韦林和神经氨酸酶抑制剂，由于神经氨酸酶抑制剂价格比较昂贵，因此在禽类上应用比较少，应用上述药物治疗禽流感，很容易导致禽流感病毒产生耐药性，如果这些药物不合理的使用，还容易造成药物残留问题，影响动物源性食品的公共卫生，而中药由于其成分天然的合理性，病毒对其不易产生耐药性，在动物源性食品中不会形成有害残留，越来越受到了人们的重视。
目前国内外筛选抗流感病毒中药常采用的实验方法有体外实验、动物实验、鸡胚培养及预防和治疗效果实验。
体外实验又分抑制病毒复制试验、细胞存活率与受损程度试验、膜融合试验、蛋白质合成作用试验、RNA合成作用试验及唾液酸酶活性试验。
抑制病毒复制试验是检验中药能否减少流感病毒的复制生长的一种试验，测定方法是把流感病毒和细胞一起培育，然后加入中药，再与对照组比较，观察加入中药的试验组是否产生较少的空斑形成、产生较小程度的红细胞凝集作用、降低唾液酸酶的活性。
细胞存活率与细胞受损程度试验是让细胞与流感病毒接触，经过一段时间后在显微镜下观察细胞受损害的程度，比较以中药处理和对照试验的细胞经流感病毒感染后的存活率或生长情况，便可知道该中药是否能减少病毒对细胞的损害。
膜融合试验主要是测试药物能否抑制病毒与膜的融合能力，当荧光标记的病毒与入工制的脂质体融合后荧光会增加，荧光强度的改变可以作为融合作用的指标，如果病毒与脂质体融合作用减低，则可推断病毒与细胞膜融合能力减少。
蛋白质合成作用试验是利用同位素标记物甲硫氨酸掺入作指标，比较试验组和对照组的HA、NA和核蛋白的蛋白质合成作用。
RNA合成作用试验是使用同位素标记物尿昔三磷酸掺入作指标，进行凝胶电泳和放射自显影术。
唾液酸酶活性试验是利用PNP-NeuAc作为底物，测定在405urn的吸光率，并计算对硝基苯酚(PNP)的释出量，以此作为唾液酸酶活性的指标。
动物体内实验方法一般采用鼻内喷淋方式把流感病毒送入动物(如小鼠)的呼吸道，呼吸道是最常感染流感病毒的地方。实验组用鼻内喷雾方式送入中药(腹腔内或皮下给药方式亦有人采用)，定时记录动物的存活率，亦可经过一段时间后取得实验组和对照组动物的肺脏，制备匀浆，测定其中病毒的红细胞凝集作用和唾液酸酶活性，作为比较病毒数量或活性的指标。
鸡胚培养是把病毒接种到鸡蛋内的尿囊腔中培养，实验组的鸡蛋内加入中药，经过一段时间后(如48小时)，取出尿囊液，测定病毒的数量或活性。
预防和治疗效果的实验方法是使细胞或动物先接受中药的处理，再行接触流感病毒，观察中药能否增加细胞或动物对抗流感病毒的能力。
近几年来一些专家学者对中药抗流感病毒进行了研究，但是对禽流感病毒的研究还处于空白状态，究其原因可能一是受到试验条件的限制，二是禽流感从来没有象近几年来这样频繁的暴发，而且已经有感染人并导致死亡的事件发生。本试验主要目的是通过体外筛选对禽流感病毒有抑制作用的中药及复方，为临床防治禽流感提供理想的可治疗药物。
1材料与方法
1.1单味中药
鱼腥草100克野菊花100克大青叶100克连翘100克
上述药物分别用水煎煮，过滤，收集药液，浓缩至0.5克生药/毫升，灭菌备用，4℃冰箱静置过夜。黄芩100克，先用开水浸泡30分钟，过滤，收集药液，滤渣加水煎煮，过滤，收集药液，合并2次所得滤液，其后方法同前述药物。上述药物均购自五山茶山药品行。
1.2复方中药
复方1由黄芩20金银花30大青叶10鱼腥草30组成。
复方2由黄芩20金银花30野菊花10鱼腥草30组成。
复方3由黄芩20金银花30大青叶10连翘18鱼腥草30组成。
各组药物除了黄芩之外，其它药物混合先煎煮，至煮沸，再加入黄芩，文火煎煮至沸腾后20分钟，过滤得到药液A；药渣再加水煎煮，至沸腾后20分钟，过滤得到药液B；合并2次滤液并浓缩到0.5g生药/ml。
1.3中成药
抗病毒口服液广州市香雪制药股份有限公司
双黄连口服液东莞市亚洲制药厂
清开灵口服液广州明兴制药有限公司
板蓝根冲剂广州市白云山中药厂
黄芪多糖口服液，广东省农科集团前沿动保公司产品。
1.4鸡胚10日龄非免疫鸡胚，550个，购自广州市沙田鸡场。每组8个胚。
1.5毒株禽流感病毒H9N2标准株。鸡胚尿囊液的HA效价为8log2。
1.6试验方法
1.6.1剂量的选择
依据实验1中药及其复方制剂对鸡胚毒性的实验结果，按鸡胚全部存活的最高药液浓度为正式实验的起始浓度，即按1克生药/毫升的浓度进行实验。同时设生理盐水对照组和西药对照组。
1.6.2中药复方对流感病毒(H9N2株)增殖的抑制作用测定
①同途径预防组每个鸡胚先尿囊腔接种中药0.2ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后以同样的方法尿囊腔内接种病毒0.1ml。
②同途径治疗组每个鸡胚先尿囊腔接种病毒0.1ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后以同样的方法尿囊腔内接种中药0.2ml。
③异途径预防组每个鸡胚先卵黄囊接种中药0.2ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后尿囊腔内接种病毒0.1ml。
④异途径治疗组每个鸡胚先尿囊腔接种病毒0.1ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后卵黄内接种中药0.2ml。
⑤西药对照组每个鸡胚先尿囊腔接种西药金刚烷胺0.2ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后以同样的方法尿囊腔内接种病毒0.1ml。
⑥感染对照组每个鸡胚尿囊腔接种病毒0.2ml。
⑦生理盐水对照组每个鸡胚先尿囊腔接种生理盐水0.2ml，37℃恒温箱内培养1h后取出，然后以同样的方法尿囊腔内接种病毒0.1ml。
上述鸡胚在37℃恒温箱中继续孵化，每天照视2～3次，弃去24小时内死胚。收取72小时内活胚和24-72小时死胚的尿囊液，低温保存备用。以血凝(HA)试验检测每组鸡胚尿囊液的病毒滴度。
2结果
各种药物对流感病毒(H9N2株)增殖的抑制作用测定结果见下表以及图2至图9。
与感染对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
结果显示，单味中药连翘对禽流感病毒H9N2无论是同途径还是异途径预防治疗均有显著或极显著地效果(P<0.05或P<0.01)；中药复方3在72小时内对鸡胚的存活效果类似于单味连翘，但是从HA效价的测定结果看，效果似乎优于连翘；中药复方2同途径治疗和异途径预防对鸡胚的存活效果显著高于感染对照组(P<0.05)，其各种途径的预防治疗的HA效价均显著低于感染对照组(P<0.05)；中药复方1对感染禽流感H9N2病毒的鸡胚保护作用效果不理想，但是从HA效价的测定结果看，有不同程度的抗病毒作用；实验中应用的各种中成药对禽流感病毒H9N2感染鸡胚，无明显保护作用，其HA效价与感染对照组无明显差异；鱼腥草、大青叶、连翘虽然对鸡胚无明显保护作用，但从HA效价的测定结果看，有不同程度的抗病毒作用；野菊花对禽流感H9N2病毒增殖的抑制作用不明显。
复方1的实验结果表明对禽流感H9N2株病毒感染的鸡胚有保护作用，但是效果不显著，不同的途径抗禽流感病毒存在细微差别，有抑制病毒H9N2增殖的作用，分析复方1的组成(黄芩、鱼腥草、大青叶、金银花)，不难看出单味药应用时，对鸡胚成活的保护率为0％，而组成复方后结果为25％，并且HA效价有明显的下降趋势，这说明复方1的配伍中各种药物在抗H9N2禽流感病毒的作用中发挥了协同增效的组合效应。
复方2由黄芩、鱼腥草、野菊花、金银花组成，从对感染鸡胚的成活率以及HA效价来看，复方2优于复方1，而复方2与复方1的唯一差别是复方2中应用了野菊花而复方1应用的是大青叶，但是从单味药分析野菊花的效果差于大青叶，这说明复方2的配伍比复方1更合理，虽然单独应用野菊花时，不表现抗H9N2禽流感病毒的作用，但在复方应用时表现出协同增效作用。
复方3有黄芩、鱼腥草、大青叶、金银花、连翘等组成，对提高感染鸡胚的保护率和降低HA效价，效果明显优于复方1和2，与复方1的药物组成差别在于复方3增加了连翘，与复 方2的差别在于减掉野菊花增加大青叶和连翘，连翘单独应用时，就具有明显地H9N2病毒的作用，对感染鸡胚的保护率甚至优于复方3，但是从HA效价的结果看，似乎没有复方3效果 好，但是HA效价的测定能真实反应药物的抗病毒作用，因此从微生物学的角度看，复方3的 效果优于连翘。
从复方中的各单味药看，除了连翘抗H9N2病毒效果明显之外，其他各药效果不一，但是在组成复方之后，显现出了明显地抗病毒作用，这也表现出中药复方配伍的奥妙。
各种中成药体外抗禽流感病毒效果分析
抗病毒口服液具有清热解毒的功效。从本次实验结果看，抗病毒口服液对禽流感H9N2病毒没有抑制作用，也有资料报道在鸡胚体外抗病毒口服液对甲3型流感病毒IFV株、亚甲型流感病毒鼠适应的FM1株以及新城疫病毒NDVⅡ系毒株有明显的抑制或杀灭作用，在鸡胚内对鸡胚尿囊液HA效价有明显抑制趋势，但无统计学意义，与本实验中HA效价的结果相符。
验证实施例4中药及其复方对人工感染禽流感鸡的治疗效果观察
1材料与方法
1.1药物
中药复方
由鸡胚内的抗病毒实验结果选择中药复方3进行实验，连翘:黄芩:金银花:鱼腥草:大青叶按1.8:2:3:3:1混合煎煮，先煎连翘，鱼腥草，大青叶,金银花，至煮沸，再加入黄芩，文火煎煮至沸腾后20分钟，过滤得到药液A；药渣再加水煎煮，至沸腾后20分钟，过滤得到药液B；合并2次滤液并浓缩到0.5g生药/ml。
连翘
煎煮成浓度为0.5克生药/毫升的口服液制剂。
1.2实验动物
岭南黄鸡，120只，购自广东省农业科学院畜牧研究所。饲养至40日岭，随机分为4组，中药复方组、连翘组、攻毒对照组、空白对照组，30只/组，进行实验。
1.3毒株
选用H5N1禽流感标准毒株，效价为2-8。
1.4实验方法
将病毒做4倍稀释，每只鸡肌肉注射0.1毫升，同时药物治疗组分别饮用1％浓度的中药复方口服液或连翘口服液，攻毒对照组不给任何药物治疗，空白对照组饮用日常用水并分开饲养。连续用药5天，观察至12天，记录各组的发病症状、死亡率。
2各组对感染H5N1禽流感病毒鸡的治疗结果见下表和图10。
与攻毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
各攻毒组在接种病毒12小时后出现排绿色稀粪、精神沉郁的症状；72小时后连翘组和攻毒对照组各出现1只死亡，剖检可见肠道出血、腺胃乳头肿胀，气管有大量黏液；96小时后，中药复方组和连翘组各有1只死亡，攻毒对照组死亡3只，各组精神沉郁症状进一步加剧，采食量减少，剖检中药复方组和连翘组死亡鸡可见肠道出血、腺胃乳头肿胀，气管有大量黏液，攻毒对照组的鸡出现头肿胀现象，剖检死亡鸡可见腺胃、肌胃交界出血，肌胃溃烂；120小时后中药复方与连翘组有3只死亡，攻毒对照组死亡4只；144小时各治疗组未见死亡，攻毒对照组死亡4只，但是各组还表现精神沉郁的状态；168小时后，中药复方组未出现死亡，连翘组死亡1只，攻毒对照组死亡5只；192小时后，中药复方组出现2只死亡，连翘组死亡5只，攻毒对照组死亡6只；216小时后，中药复方组出现1只死亡，连翘组未见死亡，攻毒对照组死亡2只，治疗组精神状态好转，饮食增加，攻毒对照组精神饮食状态无明显改观；240小时到288小时，中药复方组出现2只死亡，连翘组未见死亡，攻毒对照组死亡1只，各治疗组精神状态、饮食恢复正常，攻毒对照组精神沉郁，饮食无明显提高，排绿色稀粪。
3结果分析
3.1治疗效果分析
从实验结果看出，鸡只单纯接种禽流感H5N1病毒出现死亡高峰的时间在120小时至192小时之间，这期间死亡的鸡占整个死亡总数的50％以上，本实验是在死亡高峰到来之前停止用药，如果坚持用药至发作期结束即192小时，能否改变这种情况有待于进一步实验；本实验只是通过肌肉注射一种方式感染病毒，如果采用其它途径攻毒，效果如何有待于研究。
3.2中药及复方作用的分析
连翘在治疗人工感染禽流感H5N1病毒中显示了良好的作用，鸡胚内抗病毒实验也显示其能抑制病毒的增殖。在动物体内表现的良好效果，可能与连翘的抗炎解热、保肝作用有关，资料报道连翘有显著的抗炎作用，能抑制炎性渗出、水肿，如抑制巴豆油性肉芽囊的渗液量，抑制大鼠蛋清性足跖肿胀，对炎性屏障形成非但不抑制反而增强之，能明显减少32P标记的红细胞从囊内的渗出；含连翘的多种复方制剂，如银翘散、复方连翘注射液、清胆注射液等也具有显著的抗炎作用，能抑制炎症早期的毛细血管通透性增加、渗出及水肿。但连翘抗炎作用的有效成分尚不明；连翘还具解热作用，曾报道4克/千克体重灌服可抑制枯草浸液所致家兔发热，以连翘为主药的多种复方制剂，如银翘散、复方连翘注射液等也对多种致热原所致发热有显著解热作用；连翘注射液能显著拮抗内毒素所致家兔发热；对于四氯化碳所致大鼠急性肝损伤，连翘有明显保护作用，能使SG-PT明显降低，并能减轻肝细胞的变性、坏死，促进肝细胞内肝糖原、核糖核酸含量恢复正常。人工接种病毒后，病毒侵入机体细胞，产生毒素，一方面连翘可以抑制病毒增殖，另一方面连翘通过发挥其抗炎、清热、保肝作用，来缓解产生的毒素对机体的伤害作用，从而达到抗病毒的作用，提高机体的抗感染能力。连翘常与金银花配伍使用，如银翘散、双黄连口服液等，中医学认为金银花质体轻扬，气味芬香，既能清气分之热，又能解血分之毒；连翘轻清上浮，善走上焦，以泻心火，破血结，散气聚，消痈肿，二药伍用，并走于上，轻清升浮宣散，清气凉血，清热解毒的力量增强。二药参合，还能流通气血，宣导十二经脉气滞血凝，以消肿散结止痛。
中药复方由黄芩、金银花、大青叶、连翘、鱼腥草等组成，这些药物大多性味苦寒，具有清热解毒作用。清热解毒法是中医或中兽医的重要治则之一，属于治疗八法中的“清”法，它在温热病的治疗中运用十分广泛。基于此，相当长时间以来，人们常把清热解毒与抗菌消炎等同起来，把清热解毒药与抗生素相提并论。然而，目前大量临床实践表明，清热解毒法可单独运用或配合它法治疗多种疾病，许多非温热病的治疗中常可见到清热解毒法的应用：而且，目前大量实验研究也证明，许多清热解毒药的抗菌消炎作用并不强，却对很多感染性疾病有很好的疗效。因此，单纯用抗菌消炎作用来解释清热解毒作用是不全面的，清热解毒法及其方药是通过调节机体的许多功能活动而表现出广泛的治疗和调理作用的。现代研究认为清热解毒药具有抗菌抗病毒的作用，清热解毒类药物以及以该类药组成的复方，大都具有一定程度的抗菌抗病毒作用，不过其作用范围和强度并不相同，如金银花、连翘、蒲公英、黄连等对革兰氏阳性菌和阴性菌都有一定抑制作用，对皮肤真菌和流感病毒甲型也有抑制作用；临床研究发现，清瘟败毒饮、黄连解毒汤对乙肝病毒有明显抑制作用。这也是清热解毒类药物以及以该法组成的复方广泛用于感染性疾病和传染性疾病的基础。值得注意的是，清热解毒法的抗病原菌有时与临床疗效并不一致，提示该作用可能是通过其他机制获得的。清热解毒药还具有降解内毒素、解热、抗炎的作用；能清除自由基，正常情况下机体也可以产生自由基，机体通过自身的作用可以清除，不会对机体造成危害，病理情况下机体产生过多的自由基，严重损害组织细胞，可以视为机体的“毒”，清热解毒药能够协助机体清除过多的自由基；清热解毒药能够增强和调节机体的免疫功能，其作用主要是通过增强外周白细胞的吞噬能力、提高血清总补体的水平、提高单核吞噬细胞的吞噬能力、促进补体的形成、提高网状内皮系统的吞噬能力、提高淋巴细胞的转化能力和溶菌酶的活力来实现的；此外还具有保护和修复组织器官、维护其正常功能的作用，如保肝作用。本实验的中药复方除了本身具有的抗病毒作用外，其发挥作用离不开上述几个方面的作用，至于其最终机理是什么有待于进一步探讨。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药，其特征在于：由包括以下重量份数的组分制成：金银花30、鱼腥草30、大青叶10、连翘18、黄芩20；
制备方法包括的步骤如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08Mpa和30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL。
2.根据权利要求1所述的一种抗鸡新城疫病毒病和禽流感的中兽药的制备方法，其特征在于，包括的步骤如下：
(1)按配方用量加入金银花、鱼腥草、大青叶和连翘四种药材，用水浸泡30分钟，用水量以药材被浸没即可，然后煎煮至沸腾；
(2)再按配方用量向步骤(1)沸腾的液体中加入黄芩，文火继续煎煮，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液A；药渣加水继续煎煮，用水量以药渣被浸没即可，至沸腾后20分钟，过滤，得到药液B；
(3)将步骤(2)的药液A和药液B合并，得到药液；
(4)在0.08Mpa和30℃的条件下，真空减压浓缩至药液中的生药含量为0.5克生药/mL。
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