CN102283838B

CN102283838B - 乙氧基血根碱在制药中的应用

Info

Publication number: CN102283838B
Application number: CN2011102633791A
Authority: CN
Inventors: 尹革芬; 程永现; 毕峻龙; 吕青; 杨贵树; 李想
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Yunnan Agricultural University
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Yunnan Agricultural University
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: CN102283838A

Abstract

乙氧基血根碱在制备治疗动物病毒病药物中的应用，尤其是在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的，猪繁殖与呼吸综合征的药物中的，病毒基因表达抑制剂中的，抗病毒药物中的，抑制蓝耳病病毒的药物中的应用。乙氧基血根碱具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用，体外细胞药效实验显示具有确切的抗病毒效果。在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的治疗和控制中具有广泛的应用前景。所述的单体来源容易，成本低廉，具有极大的市场价值。

Description

乙氧基血根碱在制药中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及乙氧基血根碱在制备治疗动物病毒病药物中的应用，尤其是在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的应用，在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的，或是在制备病毒基因表达抑制剂中的，在制备抗病毒药物中的，以及在抑制蓝耳病病毒的药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome；PRRS)，又称为猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus；PRRSV)引起猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的接触性传染病。临床上以母猪的繁殖障碍与仔猪的呼吸道症状为主要特征，母猪的繁殖障碍表现为妊娠母猪晚期流产、死产、产弱仔以及木乃伊胎；仔猪的呼吸道症状表现为高热、呼吸困难等肺炎症状。世界动物卫生组织将其列为B类传染病[OIE动物疫病分类方法(2004-12-22)]，我国将其列为二类动物疫病[农业部动物疫病分类方法(1999-02-12)]。PRRS于1987年在美国首次发现临床病例，随后几年时间里，该病席卷了北美洲和欧洲大陆。自从上世纪90年代以来，该病毒几乎已传播世界上所有养猪的国家，据报道2005年之前美国每年因该病所造成的经济损失可达5.6亿美元。

疫苗的免疫接种仍然是控制该病发生和传播的有效途径，通过接种疫苗来控制PRRSV仍存在较多的问题。目前商品化灭活苗和弱毒苗尽管都可减轻临床症状，但不能阻止病毒的再次感染和病猪的排毒。同时，灭活疫苗虽然安全，但产生的保护力不强，往往需要反复多次的免疫接种；和灭活苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫反应持续时间较长，也较有效，但本身存在散毒问题，而且有返强的潜在危险。

本病目前尚无特效针对病毒的药物，主要采取综合防制措施及对症治疗。化学合成药物中替米考星药物在临床上对病毒起抑制作用，但效果有限。

中兽医学起源于我国古代，几千年来，中兽医学为保障我国畜牧业的健康发展起到了重要作用，中药主要来源于天然药物和加工产品，作为我国传统医学的宝贵财富，具有毒副作用较小，药源丰富，价格低廉等特点。纵观1981年到2002年期间世界上开发的人用新化学药物来看，约有60％的抗癌药物直接或间接来自自然界创造的天然产物，在抗感染领域更为明显，有超过75％的抗感染药物与天然来源相关，因此自然界是抗感染药物来源的巨大供体。鉴于此，中药正逐级成为病毒性疾病较为理想的治疗药物，如从清热解毒中药中发现了抗病毒活性成分绿原酸、从清热中药黄芩中发现了抗病毒活性黄芩苷类化合物、从清热利湿草药青叶胆中发现了抗肝炎病毒活性成分等。从天然资源中寻找新药或先导化合物是国内外新药研制中非常活跃的领域。其中有些具有非常强抗病毒作用的中草药已被开发应用于临床。

猪蓝耳病虽然由病毒引起，但与机体免疫也有关，由此造成感染后通常又会引起一系列病理变化，最终导致疾病恶化，因此防治策略以综合治疗为主。中草药或植物性药的特点是成分多，靶标多，通过协同发挥整体效应，因此与疾病的发生发展病理规律相一致，自古至今在防治人和兽疾病中发挥着独特而重要的作用。但关于其抗蓝耳病毒研究国外尚未见报道，国内报道较为少见。仅2006年胡梅等证实板蓝根，连翘，黄连水提物对蓝耳病毒有间接或直接杀灭作用，2008年蒲秀英等证实金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应，2008年王学兵等发现金银花的主要成分绿原酸对蓝耳病毒也有抑制作用，但云南多种特色民族药物抗PRRSV目前尚未见报道。

从传统中草药中分离提取的单体化合物是抗PRRSV药物一个重要的潜在来源。提取自天然中草药的很多小分子化合物具有新的结构特点和药物活性，在其它疾病如肿瘤治疗中比常规化疗药物副作用小。

小分子化合物乙氧基血根碱(EOSN)是由天然化合物血根碱在乙醇中的溶剂化物，血根碱主要来源于罂粟科多种植物，含量丰富。目前现有技术中尚未见关于乙氧基血根碱抗PRRSV感染效果及其机制的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供化合物乙氧基血根碱EOSN在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染药物中的应用，在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的，或是在制备病毒基因表达抑制剂中的，以及在制备抗病毒药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

结构式(I)所示的化合物乙氧基血根碱EOSN或其水合物或其药用盐在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，在制备病毒基因表达抑制剂中的应用，在制备抗病毒药物中的应用，

化合物乙氧基血根碱在制备治疗猪繁殖与呼吸综合症的药物中或在制备病毒基因表达抑制剂或在制备抗病毒药物中的应用优选的浓度为7.9～31.6μM。

所说的化合物乙氧基血根碱的药用盐，是指药学上可接受的盐，包括但不限于与有机酸如酒石酸或柠檬酸或甲酸或乙二酸，或是与无机酸如盐酸或硫酸或磷酸形成的盐。

EOSN在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的可能作用机制在于：在分子水平上，EOSN抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白ORF7基因的表达，从而抑制病毒的增殖与感染。

本发明所述的EOSN在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的的浓度为7.9～31.6μM。

与现有技术相比，本发明具有下述的优益效果：

1.目前尚无治疗PRRSV感染的特效药物，高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控制措施研究中的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致病分子机制的深入认识，使得疫苗研究处于了一个瓶颈时期，因此，寻找新的抗病毒策略，已成为目前猪蓝耳防制研究中的热点。EOSN具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用，体外细胞药效实验显示具有确切的抗病毒效果。

2.本发明是关于小分子化合物EOSN在兽医临床上的用途。EOSN可为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪提供新的治疗药物，具有剂量适中，费用适中，用药方便，疗效显著，毒副作用小等优点。

本发明的化合物单体乙氧基血根碱EOSN或其水合物或其药用盐可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成年猪来说，每天1-1000mg比较合适。

经口服给药时，首先使化合物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。

附图说明

图1为单体乙氧基血根碱EOSN对Marc-145细胞的毒性作用示意图；

图2为单体乙氧基血根碱EOSN抑制PRRSV在Marc-145细胞增殖效果图；

图3为单体乙氧基血根碱EOSN对PRRSV核蛋白基因表达抑制率示意图。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，根据本发明的技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明的技术方案进行一些修改和改进，因此，在不偏离本发明技术方案基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。

实施例1：

待96孔细胞板(Corning公司)上的Marc-145细胞长至致密单层时，将化合物单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)用DMEM培养液做2倍连续稀释，顺次稀释5个梯度；每个梯度接种3个细胞孔，混合液总量为100μl，同时设正常细胞对照；37℃二氧化碳培养箱中培养3天后加入含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)的CCK-8检测试剂，再孵育4小时，然后用酶标仪测定其在450nm的吸光值(OD450)，根据OD值使用Reed-Much方得到EOSN对细胞的半数毒性浓度TC₅₀(50％toxic concentration)及最大无毒剂量TC₀(0％toxic concentration)值分别53.1μM为和31.6μM，参见图1。

实施例2：

将Macr-145细胞接种于96孔细胞板中，使之长满单层；将EOSN分别作2倍连续稀释，再将不同浓度提取物与300个TCID₅₀病毒液混合，然后将病毒药物混合液加入细胞中，同时设正常细胞对照组(不含药物和病毒)，病毒对照组(只含病毒)，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，逐日观察病毒CPE(cytopathic effect)，PRRSV致Marc-145细胞CPE主要为引起细胞出现圆缩，聚集，最后脱落；培养72h后，不同处理组CPE变化的差异提示：EOSN在7.9～31.6μM浓度范围可抑制蓝耳病病毒在Marc-145细胞的增殖，明显降低病毒对细胞的损伤效应(CPE)，且作用效果呈剂量依赖性(图2)；根据细胞在72小时所出现的CPE变化，用Reed-Much方法计算得到药物有效抑制50％细胞出现病变(50％effective concentration，IC50)的浓度为7.9μM。

实施例3：

应用real-time RT-PCR方法检测药物对PRRSV ORF7基因mRNA表达的影响，使用RNA提取试剂RNAisoTMPlus提取药物组，病毒对照组的总RNA，将所提取总RNA使用iQ5 real time PCR仪(Bio-Rad)进行目的扩增，根据荧光定量所得的β-action基因和PRRSV ORF7基因CT值，用Pfaffl法计算实验组相对于病毒对照组的ORF7基因的表达比率。结果表明：化合物EOSN浓度分别为7.9、15.8、31.6μM时，蓝耳病毒ORF7 mRNA表达量明显低于病毒对照组(P＜0.05)，提示化合物可剂量依赖性的对病毒mRNA的表达具有抑制作用，，如图3所示。

实施例4：

EOSN对蓝耳病毒的治疗指数(TI)见表1。

表1化合物EOSN对PRRSV的TI值

根据TI＝TC₅₀/IC₅₀计算公式，计算得到EOSN的TI＝6.72，大于2，提示EOSN对于蓝耳病毒有较好的抑制效果。

从上述实施例的结果，可以得出下述结论：在分子水平上，EOSN在7.9～31.6μM范围内，能够抑制蓝耳病毒的结构蛋白ORF7基因的表达，进而抑制病毒增殖。在细胞水平上，EOSN在无毒剂量(TC0)31.6～7.9μM浓度范围内具有抑制蓝耳病病毒增殖的作用，且药物治疗指数TI＝6.72＞2，证明药物有开发价值。

制剂实施例1：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

制剂实施例2：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

制剂实施例3：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

制剂实施例4：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。

制剂实施例5：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

制剂实施例6：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

制剂实施例7：

用单体乙氧基血根碱EOSN(由血根碱在乙醇中结晶而得)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims

1.如下结构式（I）所示的化合物乙氧基血根碱或其药用盐在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，

2.如下结构式（I）所示的化合物乙氧基血根碱或其药用盐在制备抑制蓝耳病病毒的药物中的应用，