CN107854499A - 诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用，以藏药为研究对象，筛选出诃子水提物在MDBK细胞模型上对BVDV有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用，为BVD病的防治和药物研发奠定了基础，其优点在于发现诃子的新型药理作用，可作为防治BVDV和/或清除BVDV感染的候选药物，可单独使用，也可以组方使用。

Description

诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药工程技术领域，具体涉及诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用。

背景技术

牛病毒性腹泻(BVD)又叫做牛病毒性腹泻-黏膜病，该病是由于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的急性传染病，在我国将其列为二类传染病。临床症状包括发热、食欲不振、腹泻及典型的黏膜损伤。各个年龄段的牛均易感。但主要侵害6-24个月的青年牛。依据病毒RNA的核苷酸序列比对，目前BVDV至少有2种基因型，BVDV-1和BVDV-2，每一种基因型又可分为细胞病变型和非细胞病变型。血清学调查显示，BVDV呈现全球性分布。

在受精阶段感染BVDV时，可导致母牛妊娠率降低；在胚胎发育的前4个月感染BVDV时，可导致胚胎自溶、流产、发育迟缓或持续性感染，这样的病牛一出生即为PI牛，可终身带毒。但胚胎发育到4-6个月感染时，可造成眼睛的先天性畸形，有时会出现木乃伊胎、死胎、早产或弱犊。

而且值得注意的是持续感染非致细胞病变型BVDV的牛是该病毒的自然宿主，而持续感染牛是BVDV的主要传染源，可通过分泌物和排泄物排出大量BVDV,进而感染易感牛群。而且感染BVDV后，造成免疫抑制，加重继发感染。

灭活疫苗和弱毒疫苗对BVD是有效的。但存在使用限制或不足：1)因为BVDV对胎儿易感并可出现免疫抑制现象，因此对妊娠母牛和表现临床症状的牛，不推荐使用弱毒疫苗。2)灭活疫苗可用于妊娠母牛，但保护期较短，需要多次免疫接种。3)目前不同的基因型和亚基因型之间的抗原变异程度尚不清楚，这种抗原差异会影响疫苗接种的免疫保护效果。4)但持续感染牛再次感染致细胞病变型BVDV时，就会引起粘膜病。致细胞病变型BVDV通常是内源性的，但外源性包括其他牛以及弱毒疫苗。对于持续感染的牛，用疫苗免疫有风险，所以一般采用淘汰检测PI牛的方式净化牛场。目前BVDV的治疗尚无有效的治疗药物。

所以基于BVDV防控的难点和免疫的限制，研发能抑制和杀灭病毒的药物成为众多研究者的热点之一。藏药是我国传统中药学的重要组成部分,具有独特的理论体系和浓厚的民族特色，有着悠久的历史和临床应用基础，但药物的一些新用途和新的药理药效作用仍有待于进一步挖掘研究。《晶株本草》上记载，诃子是治疗多种疾病的最佳药。牛病毒性腹泻病是1946年首先发生于美国，后传入我国的一种传染病，传播速度较快，目前在牛场已广泛流行。诃子对防治BVDV是否有效尚未可知。

发明内容

本发明的目的就是针对上述BVDV疫苗的使用限制和防治药物的缺乏，提供了诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用，可作为防治BVDV和/或清除BVDV感染的候选藏药。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用。

进一步的，上述的应用，所述抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物为诃子的水提物。

进一步的，上述的应用，诃子水提物的制备方法为：按照料液重量比1:10取诃子加入水中，采用水提法进行提取30min，然后将提取液浓缩成200mL，经冻干机冻干成粉后密封，4℃避光保存备用。

进一步的，上述的应用，诃子水提物对牛肾细胞MDBK的最大安全浓度为1mg/mL，抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV的药物浓度为1mg/mL。

本发明建立了以牛肾细胞(MDBK)为载体，BVDV细胞致病模型的药物体外筛选技术。

确定了诃子对MDBK细胞的最大安全浓度1mg/mL，并且为抗病毒效果最佳时药物的浓度；相应的半数中毒浓度CC50分别为6.383mg/mL。

本发明还提供了根据病毒的致病机制，分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

诃子的新型抗病毒作用，对BVDV有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。诃子直接杀伤BVDV病毒的有效率为52.43％，与利巴韦林相当(51.06％)；诃子对BVDV的治疗指数为10.41,高于利巴韦林(10.00)。

本发明的有益效果为：本发明提供的诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用，以藏药为研究对象，筛选出诃子水提物在MDBK细胞模型上对BVDV有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用，为BVD病的防治和药物研发奠定了基础，其优点在于发现和诃子的新型药理作用，可作为防治BVDV和/或清除BVDV感染的候选药物，可单独使用，也可以组方使用。

附图说明

图1显示为诃子抗BVDV损伤MBDK细胞的作用。

其中，A：正常的MDBK细胞；B：病毒对照组(BVDV感染MDBK细胞)；C:药物试验组(诃子抗BVDV对MDBK细胞的作用)。

具体实施方式

实施例1：

药物实施例：

藏药诃子购自兰州市黄河中药材市场，取100g诃子加入1L水，采用水提法进行提取30min，然后将提取液浓缩成200mL左右，经冻干机冻干成粉后密封，4℃避光保存备用。

实施例2：

应用实施例：

(1)毒株和细胞的准备：

BVDV病毒株是NADL美国标准毒株，购自中国兽医药品监察所，经增殖后备用。牛肾细胞(MDBK)细胞株购自上海和园生物技术股份有限公司，复苏培养后备用。

(2)药物工作液的配制：

按照实施例1准备药物，在上细胞试验前，采用二倍稀释法将相应保存的藏药冻干粉用3％细胞维持液配制成以下10个浓度：256mg/mL、128mg/mL、64mg/mL、32mg/mL、16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL；阳性对照药物选用利巴韦林，购自索莱宝生物有限公司。在细胞试验前，将利巴韦林干粉则稀释256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，用0.22μm微滤膜过滤除菌，4℃避光保存备用。

(3)病毒TCID₅₀的测定：

将MDBK消化后以每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液；将BVDV连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1-10^-10)接种于长满单层MDBK细胞的96孔板，每孔100μL，置于细胞培养箱中吸附2h，并每间隔20min缓慢摇动一次使毒液吸附均匀，弃去病毒液后每孔加细胞维持液100μL，放入37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞CPE的情况，以及详细记录细胞病变孔数。本试验同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待CPE不再继续时判定结果。细胞病变孔是50％以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按以下公式(Reed-Muench氏法)计算病毒TCID₅₀。

距离比例＝(大于50％病变率的百分数-0.5)/(大于50％病变率的百分数-小于50％病变率的百分数)

lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+大于50％病变率的稀释度的对数。

结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变(CPE)所示，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，5天后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数，并计算出不同浓度的CPE比率，然后按Reed-Muench氏法计算出BVDV TCID₅₀为10^-4.67/0.1mL，表示将原BVDV病毒液稀释10^4.67倍后接种100mL于MDBK细胞可使50％的细胞发生明显的细胞病变。

(4)药物对MDBK细胞最大安全浓度的测定：

消化MDBK，加入细胞生长液，按每孔1×10⁵个/mL的密度接种于96孔板中，培养箱中培养成单层细胞后，弃去生长液；将二倍稀释成不同浓度的药物稀释液加入到培养的单层细胞中，每个药液梯度100μL/孔，每个浓度设8个重复，置于培养箱中继续培养培养72h，并逐日观察细胞病变程度和病变孔数。本试验同时还设置正常细胞对照组和空白对照组。待CPE不再继续时，用PBS洗涤液洗涤细胞板3次，再每孔加入10mL的CCK8试剂，于37℃、5％CO₂条件下继续培养4h，在450nm波长处用酶标仪测定各组细胞的吸光度(OD值)。计算细胞病变率的公式为：细胞病变率(％)＝[(细胞对照组平均OD值-试验加药组平均OD值)/细胞对照组平均OD值]×100％。然后利用GraphPad Prism^TM软件计算药物的半数中毒浓度(CC₅₀)和最大安全浓度(MNTC)。

结果：利巴韦林在256μg/ml浓度下的细胞生长速度比正常细胞对照组减慢了3倍，但未出现细胞病变；诃子出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定诃子和利巴韦林的最大安全浓度分别为1mg/mL、2μg/mL,并且在此浓度下，受试细胞形态学正常，与对照组无明显差异(P＞0.05)。经分析软件分析，诃子半数中毒浓度为6.383mg/mL，而利巴韦林的半数中毒浓度20μg/mL。

(5)不同浓度药物稀释液的配制：

根据药物对MDBK细胞最大安全浓度的测定结果，采用二倍倍比稀释法用3％的细胞维持液将诃子和利巴韦林以相应的最大药物安全浓度为基准(诃子1mg/mL；利巴韦林2μg/ml)相应的配制成5个药物浓度，并用0.22μm微滤膜进行过滤除菌，4℃下避光保存备用。

(6)药物对BVDV的直接杀伤作用：

将等量的100·TCID₅₀ BVDV病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO₂培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加100μL细胞维持液继续培养72h，逐日观察并详细记录每个细胞孔CPE结果。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设8个重复，待病毒对照组CPE不再继续时，然后进行CCK8细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗BVDV的有效率。计算药物的抗病毒有效率的公式为：药物的抗病毒有效率(％)＝[(试验加药组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)]×100％。然后利用SPSS 22.0软件对组间病毒抑制率及其病毒滴度的差异性进行相关性分析；采用GraphPad Prism^TM软件计算药物半数有效浓度(EC₅₀)。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数(TI)。

结果:诃子与BVDV预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，药物对BVDV直接杀伤作用的细胞活力检测结果如图1所示。通过CCK8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对BVDV直接杀伤作用的有效抑制率，如表1所示。从表中可以看出，在这种作用式下，诃子对BVDV均表现出有一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。相比同种药物的其他浓度组，诃子和利巴韦林均在最大药物安全浓度时有相对较高的有效抑制率，分别是52.43％、51.06％。通过分析软件，计算出诃子和利巴韦林的半数有效浓度EC₅₀分别为0.613mg/mL、2μg/ml，并按照公式计算出相应的治疗指数TI分别为10.41和10.00，表明诃子对BVDV均具有一定的直接灭活的作用。

表1

注：与病毒对照组相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，

(7)药物对BVDV的吸附阻断作用：

按每孔1×10⁵个/ml的细胞密度将消化好的细胞接种到96孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，并加入以最大安全浓度内2倍倍比稀释的药液，37℃培养4h后，弃去培养液，PBS洗涤3遍，加入100·TCID₅₀病毒液，100μl/孔，吸附2h后，每15min摇晃一次，弃去病毒液，PBS清洗3遍，之后加入细胞维持液继续培养，逐日观察CPE并记录病变孔数。本试验同时还设置病毒对照组、正常细胞对照组、空白对照组，每个浓度设8个重复。待病毒对照组不再继续出现CPE时，进行CCK8细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：CPE观察结果显示：药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。CCK8试剂盒细胞活力检测结果显示，4种药物对BVDV的有效抑制率均在20％以下，表明诃子和利巴韦林均不能阻止BVDV对MDBK细胞的吸附作用。

(8)药物对BVDV复制阻断作用：

将MDBK细胞消化好后按每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔板中，待长成单层细胞后加入100·TCID₅₀病毒液，每孔100μl，37℃吸附2h后，间隔15min摇晃一次，弃上清液，PBS洗涤3遍，每孔加入100μl含药最大安全浓度内2倍倍比稀释的维持液继续培养，逐日在倒置显微镜下观察并记录CPE结果。本试验同时还设置病毒对照组、正常细胞对照组、空白对照组，每个浓度设8个重复。待病毒对照组CPE不再继续时，进行CCK8细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗BVDV有效率。

结果：CPE观察结果显示：病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。CCK8试剂盒活力检测检测结果显示，诃子对BVDV的有效抑制率在15％以下，表明诃子不能阻断BVDV在MDBK细胞中的复制作用。而利巴韦林在2μg/ml和1μg/ml浓度时测的细胞病变率与病毒对照组相比差异显著(P＜0.05)，但细胞病变率均小于30％，表明该作用方式下的利巴韦林对BVDV则有微弱的复制阻断作用。

本发明以牛肾细胞(MDBK)为载体，在BVDV细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现诃子的新型抗病毒作用，对BVDV有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.诃子在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物为诃子的水提物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，诃子水提物的制备方法为：按照料液重量比1:10取诃子加入水中，采用水提法进行提取30min，然后将提取液浓缩成200mL，经冻干机冻干成粉后密封，4℃避光保存备用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，诃子水提物对牛肾细胞MDBK的最大安全浓度为1mg/mL，抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV的药物浓度为1mg/mL。