CN115778991A - 诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。属于抗轮状病毒药物技术领域。诃子林鞣酸有抗轮状病毒生物合成的作用，无抗轮状病毒吸附和直接杀灭作用，可抑制VP6的基因表达发挥抗RV的作用，通过网络药理学分析，表明诃子林鞣酸作用于轮状病毒相关的基因。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：涉及诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物的应用，是申请人首次研究发现诃子林鞣酸具有抗轮状病毒的作用，填补了抗轮状病毒药物的空白，具有深远的意义和价值。其中，研究显示，抗轮状病毒的药物中，诃子林鞣酸的摩尔浓度为1μM～10μM。
Description
技术领域
本发明涉及抗轮状病毒药物技术领域，更具体的说是涉及诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。
背景技术
轮状病毒(rotavirus，RV)是呼肠孤病毒家族(Reoviridae)的一员，其外表为二十面体形结构，三层同心蛋白外衣壳包围着由11条dsRNA构成的基因组，负责编码6种结构蛋白和6种非结构蛋白。RV是导致婴幼儿腹泻的主要病原体，RV的高度传染性和致病性对整个社会造成极大的危害。目前临床缺乏特效药物，唯一一种在美国上市的RV疫苗RotaTeq，价格非常昂贵，且由于RV毒株的变异性、多样性使其预防毒株的范围有限，如何防治RV感染是重大的难题。
诃子林鞣酸(Chebulinic acid)是从诃子中分离出的酚酸类结构，其可作为天然的M.tuberculosis DNA gyrase抑制剂，也能抑制SMAD-3phosphorylation和H+K+-ATPase的活性。在抗病毒方面，诃子林鞣酸对单纯疱疹病毒2(HSV-2)具有抗病毒活性。同时据文献报道，诃子林鞣酸对结肠癌与急性髓性白血病均有一定的作用。
但目前尚无Chebulinic acid抗RV作用报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。
进一步的，诃子林鞣酸可以抗轮状病毒生物合成。
进一步的，诃子林鞣酸可以抑制VP6的基因表达发挥抗轮状病毒的作用。
一种抗轮状病毒的药物，包括诃子林鞣酸。
进一步的，诃子林鞣酸的浓度为1～10μM。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用，是申请人首次研究发现诃子林鞣酸具有抗轮状病毒的作用，填补了抗轮状病毒药物的空白，具有深远的意义和价值。其中，研究显示，抗轮状病毒的药物中，诃子林鞣酸的摩尔浓度为1μM～10μM。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为诃子林鞣酸的化学结构式；
图2为本发明实施例1中正常MA104细胞；
图3为本发明实施例1中RV感染48h后的MA104细胞；
图4为本发明实施例1中Chebulinic acid对细胞的毒性结果，其中正常组代表未用药组；与正常组组相比，***p<0.001，****p<0.0001；
图5为本发明实施例1中Chebulinic acid抗RV吸附作用，其中，与Ribavirin组比较，****p<0.0001；
图6为本发明实施例1中Chebulinic acid对RV直接杀灭作用，其中，与Ribavirin组比较，*p<0.05，**p<0.01；
图7为本发明实施例1中Chebulinic acid对RV抗生物合成作用；
图8为本发明实施例1中Chebulinic acid抑制RV感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的作用，其中与病毒组相比，****p<0.0001；
图9为本发明实施例2中轮状病毒PPI网络图；
图10为本发明实施例2中“药物-靶点”网络图；
图11为本发明实施例2中RV与Chebulinic acid的维恩图；
图12为本发明实施例2中RV与Chebulinic acid的交集基因网络图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中所用材料与仪器如下：
表1实验细胞株和试剂
表2主要仪器
主要试剂配制方法如下：
Chebulinic acid母液：称取Chebulinic acid标准品5.7mg，纯度≥98％，批号：RFS-L10402007031，在超净台内加1mL细胞级DMSO溶解，用一次性无菌针管将药液通过0.22μM滤膜过滤除菌，配置母液为10mM。
DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)：在超净工作台内将50mL胎牛血清和5mL双抗依次加入400mL的高糖DMEM培养基中，充分混匀后分装至标记好的50mL离心管中，封口，4℃保存。
10μg/mL不含EDTA的胰酶：不含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液和不含胎牛血清的DMEM培养基以1:250体积比的比例稀释至10μg/mL。
RV生长维持液：10μg/mL不含EDTA的胰酶和不含胎牛血清的DMEM培养基以1:10体积比的比例稀释至1μg/mL。
统计数据分析：
所有实验均重复三次。实验数据采用均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS软件统计数据，两组间比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。得到的数据结果以平均值±标准差的形式表示。数据分析采用统计分析软件Graphpad prism8.01进行Mann–Whitney统计。
实施例中选用Wa株RV，因为其对人的易感性更好。
实施例1
(1)RV感染MA104细胞
将病毒置于37℃水浴锅中融化，经过胰蛋白酶预处理30min后，将病毒溶液加入到生长到80～90％的MA104细胞中，RV感染所用的细胞培养基中不添加血清。病毒感染后的MA104细胞会发生细胞病变CPE(Cytopathic effect)，当病变程度达到75％时，-20℃冰箱中冻存。重复冻存和融化过程3次后，低温离心，收取上清，即为所得病毒液。重复上述过程，扩增RV。
正常MA104细胞和RV感染48h后的MA104细胞如图2、3所示，可以看出，正常MA104细胞形状为三角形或梭形，细胞轮廓明显清晰；感染RV后的MA104细胞，细胞发生明显病变，细胞边界变得模糊，细胞间距离增大，最后细胞完全脱落，漂浮。
(2)CCK8法检测Chebulinic acid对MA104细胞的毒性
根据Chebulinic acid常用药物浓度范围，本实验在1～25μM之间进行细胞毒性预实验。取对数生长期的MA104细胞于显微镜下观察，细胞形态均一饱满，边缘清晰且数量达到80％时，进行消化、离心和重悬，混悬液进一步稀释后取10μL于血细胞计数板上计数，计算所需细胞体积。随后在96孔板中细胞铺板，每孔加100μL细胞混悬液，细胞密度为8×104个/mL。待细胞贴壁成单层时，药物组给药，正常组加入等体积的DMEM(不含血清)。孵育48h后，CCK8试剂检测Chebulinic acid的细胞毒性。每孔加入1/10体积的CCK8溶液，培养箱中孵育，90min后，在振荡10s450nm波长条件下检测并记录吸光度。细胞的相对存活率公式为：
{(A实验组-A空白)/(A对照组-A空白)×100％}。
结果如图4所示，Chebulinic acid药物浓度在1～10μM之间，对细胞均没有药物毒性且平均存活率为95％以上。与N组相比，Chebulinic acid在1～10μM时药物组细胞活力与N组无明显差异。因此我们选取的Chebulinic acid的实验药物浓度为1～10μM。
(3)CCK8法检测Chebulinic acid抗RV的三种作用以及对RV感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响
为了研究Chebulinic acid是否具有体外抗RV感染的作用，在MA104细胞模型上从Chebulinic acid抗RV病毒的吸附、直接灭活和生物合成三种作用，以及对RV感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响进行相关实验。
①Chebulinic acid抗RV吸附作用
在生长至单层的MA104细胞的96孔培养板内加入药液，每个药液重复6孔，每孔100μL。阳性对照组中加入等体积的利巴韦林(Ribavirin)，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积DMEM培养液(不含血清)。37℃、5％CO2孵育2h。将药液吸出，除正常细胞对照组以外加入100TCID50的病毒(病毒与10μg/mL胰酶37℃作用30min)，每孔100μL，37℃、5％CO2孵育2h，将病毒吸出，加入细胞维持液，每孔200μL，37℃、5％CO2孵育连续观察。培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，90min后于450nm波长下检测并记录吸光度。重复实验3次。病毒抑制率公式：
{(A药物组-A病毒组)/(A正常组-A病毒组)×100％}。
结果如图5所示。与Ribavirin组相比，Chebulinic acid组在1μM、5μM、10μM下抗RV的抑制率无明显的升高，有统计学差异，最高抑制率仅为5％左右，表明Chebulinic acid无明显抗RV的吸附的作用。
②Chebulinic acid对RV的直接杀灭作用
将药物与100TCID50的病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30min)等体积混合作用2h。用PBS将细胞冲洗2次后将其加入到生长至单层MA104细胞的96孔培养板内。阳性对照组中将Ribavirin与RV进行与上述相同的操作，正常细胞对照组、病毒对照组均只加入等体积DMEM(不含血清)。37℃、5％CO2孵育2h，然后将混合液吸出，加入细胞维持液，每孔100μL，37℃、5％CO2孵育连续观察，培养48h后用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，90min后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。病毒抑制率公式：
{(A药物组-A病毒组)/(A正常组-A病毒组)×100％}。
结果如图6所示。与Ribavirin组相比，各Chebulinic acid组对RV抑制率较低，统计学比较有显著性差异，表明Chebulinic acid无明显对RV直接杀灭的作用。
③Chebulinic acid抗RV合成作用
将100TCID50病毒液(病毒与10μg/mL胰酶作用30min)加入到生长至单层的MA104-2细胞96孔培养板内，每孔100μL，之前用PBS将细胞冲洗2次。设细胞正常对照，加入等体积DMEM培养液。37℃、5％CO2孵育2h，然后将病毒液吸出，分别加入不同浓度药液和Ribavirin，每孔100μL，设病毒对照，只加入细胞维持液，每孔100μL。37℃、5％CO2孵育连续观察。连续培养48h后，用CCK-8试剂盒检测。每孔加入1/10体积的CCK-8溶液，培养箱中孵育，90min后于450nm波长下检测并记录吸光度。计算药物的病毒抑制率，重复实验3次。病毒抑制率公式：
{(A药物组-A病毒组)/(A正常组-A病毒组)×100％}。
结果如图7所示。与Ribavirin组相比，Chebulinic acid在1μM，5μM，10μM对RV的抑制率达到了80.01％，75.26％，61.86％。统计学比较无明显差异，表明Chebulinic acid与Ribavirin对RV有明显的抑制合成作用，表明Chebulinic acid对RV有明显的抑制合成作用。
④Chebulinic acid对RV感染MA104细胞中结构蛋白VP6基因表达的影响
实验方法如下：
(1)总RNA的提取及定量；
(2)引物序列设计；
(3)逆转录反应；
(4)采用SYBR Green I荧光标记，实时定量PCR检测VP6基因的表达。
结果如图8所示，与RV组相比，Chebulinic acid组在1μM、5μM、10μM浓度下VP6表达量均明显降低，有统计学差异，其中Chebulinic acid在5μM时抑制VP6的表达最为显著。表明Chebulinic acid的通过抑制VP6的基因表达发挥抗RV的作用。
综上，Chebulinic acid有抗RV生物合成的作用，无抗RV吸附和直接杀灭作用，可通过抑制VP6的基因表达发挥抗RV的作用。
实施例2 Chebulinic acid抗轮状病毒网络药理学研究
(1)RV靶点PPI网络图的构建
在Genecards、OMIM、Disgenet数据库中找寻RV的靶点，并将搜集的靶点通过STRING网站构建轮状病毒PPI网络图(图9)。
(2)构建Chebulinic acid“药物-靶点”网络图
通过Swisstargetprediction、Pharmmapper数据库搜集Chebulinic acid的相关基因，并将搜集的靶点通过Cytoscape软件绘制“药物-靶点”网络图(图10)。
(3)通过维恩图构建交集基因网络图
将RV靶点与Chebulinic acid靶点通过维恩图(图11)得到相关的交集基因，并将得到的交集基因通过Cytoscape软件绘制交集基因网络图(图12)。
通过网络药理学分析，表明Chebulinic acid作用于RV相关的基因。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.诃子林鞣酸在制备抗轮状病毒药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，诃子林鞣酸可以抗轮状病毒生物合成。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，诃子林鞣酸可以抑制VP6的基因表达发挥抗轮状病毒的作用。
4.一种抗轮状病毒的药物，其特征在于，包括诃子林鞣酸。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，诃子林鞣酸的浓度为1～10μM。
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