CN115721654B - 藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用 - Google Patents

藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用，本发明属于医药技术领域。本发明实验明，藜芦碱能高效够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，抑制含有新冠病毒S蛋白的假病毒感染细胞，且细胞毒性较低，因此本申请提供了藜芦碱在制备抗病毒的药物中的应用，为防治新冠病毒提供了新的思路。

Description

藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用。
背景技术
冠状病毒属于具有阳性单链RNA基因组的包膜病毒。冠状病毒分为α-CoVs、β-CoVs、γ-CoVs和δ-CoVs四个属[1]。严重急性呼吸综合征-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)引起一种称为2019年冠状病毒病(COVID-19)的呼吸道疾病，其传播导致大流行，最常见的临床特征包括咳嗽、发热和感染性肺炎，严重者出现急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡[2]。目前尚无特异性抗新型冠状病毒药物，针对新型冠状病毒的药物靶点研究特异性阻断新冠病毒入侵的药物小分子尚待研发。
目前，已有多个新冠药物上市，比如病毒RNA聚合酶抑制剂瑞德西韦，莫奈拉韦等，作为核苷类似物能够抑制病毒RNA的复制[3]；米非诺韦通过抑制网格蛋白介导的内吞作用，抑制病毒包膜和宿主细胞质膜的膜融合，阻止病毒进入宿主细胞；奈玛特韦和利托那韦抑制新冠病毒的主要蛋白酶3CL蛋白酶对病毒RNA翻译的多聚蛋白的加工[4]。已证实抗疟药氯喹和羟氯喹可抑制ACE2的末端磷酸化并升高内体中的pH值抑制膜融合，从而预防病毒感染，目前正在进行临床试验[5]。
SARS-CoV-2的刺突糖蛋白在病毒感染性中起着重要作用。SARS-CoV-2利用刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合从而感染宿主细胞，刺突糖蛋白可能是阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞的良好靶标[6]，以S蛋白和ACE2为靶点进行药物筛选，通过阻断S蛋白与ACE2的结合抑制新冠病毒感染[7]，并采用细胞实验检测抑制病毒入侵效果，是研究新型冠状病毒入侵抑制剂的重要途经。
天然产物是抗病毒药物的重要来源。目前有文献报道千金藤素作为一种天然存在的植物生物碱，能够靶向新冠病毒的入侵阶段，显著抑制病毒和宿主细胞的结合[8]，在动物体内毒性较低，对人体无明显副作用。此外，藜芦碱是从植物中分离提取的一种生物农药杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，以及降低血压、强心、抗血栓、改善脑循环和抗寄生虫感染等药理作用[9]。藜芦碱对人、畜毒性低、残留低、不污染环境、药效持久，是目前引起人们重视的，有广泛应用前景的一种生物农药。然而目前还未有关于藜芦碱抗病毒的报道。
参考文献
[1]Seyed Hosseini,E.；Riahi Kashani,N.；Nikzad,H.；Azadbakht,J.；HassaniBafrani,H.；Haddad Kashani,H.The novel coronavirus Disease-2019(COVID-19):Mechanism of action,detection and recent therapeutic strategies.Virology2020,551,1-9.DOI:10.1016/j.virol.2020.08.011.
[2]Samudrala,P.K.；Kumar,P.；Choudhary,K.；Thakur,N.；Wadekar,G.S.；Dayaramani,R.；Agrawal,M.；Alexander,A.Virology,pathogenesis,diagnosis and in-line treatment of COVID-19.Eur J Pharmacol 2020,883,173375.DOI:10.1016/j.ejphar.2020.173375From NLM Medline.
[3]Ohashi,H.；Watashi,K.；Saso,W.；Shionoya,K.；Iwanami,S.；Hirokawa,T.；Shirai,T.；Kanaya,S.；Ito,Y.；Kim,K.S.；et al.Potential anti-COVID-19agents,cepharanthine and nelfinavir,and their usage for combinationtreatment.iScience 2021,24(4),102367.DOI:10.1016/j.isci.2021.102367From NLMPubMed-not-MEDLINE.
[4]McKee,D.L.；Sternberg,A.；Stange,U.；Laufer,S.；Naujokat,C.Candidatedrugs against SARS-CoV-2and COVID-19.Pharmacological Research 2020,157.DOI:10.1016/j.phrs.2020.104859.
[5]Wang,N.；Han,S.；Liu,R.；Meng,L.；He,H.；Zhang,Y.；Wang,C.；Lv,Y.；Wang,J.；Li,X.；et al.Chloroquine and hydroxychloroquine as ACE2blockers to inhibitviropexis of 2019-nCoV Spike pseudotyped virus.Phytomedicine 2020,79,153333.DOI:10.1016/j.phymed.2020.153333From NLM Medline.
[6]Ou,X.；Liu,Y.；Lei,X.；Li,P.；Mi,D.；Ren,L.；Guo,L.；Guo,R.；Chen,T.；Hu,J.；et al.Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV.Nat Commun 2020,11(1),1620.DOI:10.1038/s41467-020-15562-9From NLM Medline.
[7]Tai,W.；He,L.；Zhang,X.；Pu,J.；Voronin,D.；Jiang,S.；Zhou,Y.；Du,L.Characterization of the receptor-binding domain(RBD)of 2019novelcoronavirus:implication for development of RBD protein as a viral attachmentinhibitor and vaccine.Cell Mol Immunol 2020,17(6),613-620.DOI:10.1038/s41423-020-0400-4From NLM Medline.
[8]Fan,H.H.；Wang,L.Q.；Liu,W.L.；An,X.P.；Liu,Z.D.；He,X.Q.；Song,L.H.；Tong,Y.G.Repurposing of clinically approved drugs for treatment ofcoronavirus disease 2019in a 2019-novel coronavirus-related coronavirusmodel.Chin Med J(Engl)2020,133(9),1051-1056.DOI:10.1097/CM9.0000000000000797From NLM Medline.
[9]Kim,D.；Kwon,W.；Park,S.；Kim,W.；Park,J.K.；Han,J.E.；Cho,G.J.；Yun,S.；Han,S.H.；Kim,M.O.；et al.Anticancer effects ofveratramine via thephosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase/mechanistic target ofrapamycin and its downstream signaling pathways in human glioblastoma celllines.Life Sci 2022,288,120170.DOI:10.1016/j.lfs.2021.120170From NLM Medline.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用。
本发明提供了藜芦碱或藜芦碱衍生物在制备抗冠状病毒的药物中的应用，所述藜芦碱的结构式如式I所示；
优选的，所述藜芦碱衍生物包括藜芦碱水合物或藜芦碱的盐形式。
优选的，所述藜芦碱的盐形式包括以下一种或几种：藜芦碱的醋酸盐、藜芦碱的甲酸盐、藜芦碱的盐酸盐、藜芦碱的磷酸盐和藜芦碱的硫酸盐。
本发明提供了一种阻断冠状病毒S蛋白和ACE2结合的抑制剂在制备抗冠状病毒的药物中的应用，所述抑制剂为藜芦碱或藜芦碱衍生物，所述藜芦碱的结构式如式I所示；
优选的，所述藜芦碱或藜芦碱衍生物联合番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I和去氢番木瓜碱II中的一种或几种在制备抗冠状病毒的药物中的应用。
优选的，所述冠状病毒包括新冠病毒SARS-COV-2。
优选的，所述抗冠状病毒包括预防冠状病毒感染。
本发明提供了一种抗病毒药物，以藜芦碱或藜芦碱衍生物为活性成分和医学上可接受的辅料；
所述藜芦碱的结构式如式I所示；
优选的，所述活性成分还包括番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I和去氢番木瓜碱II中的一种或几种。
本发明提供了藜芦碱或藜芦碱衍生物在制备抗冠状病毒的药物中的应用。本发明构建新冠假病毒筛选模型，获得用S蛋白包裹报告基因Luciferase或GFP的新冠假病毒，同时构建稳定表达ACE2蛋白的A549细胞株作为宿主细胞。采用新冠假病毒感染549-ACE2细胞株，模拟病毒侵染过程，本发明通过添加藜芦碱能有效阻断S蛋白和ACE2的结合，从而阻断假病毒对宿主细胞的感染。实验结果表明，化合物藜芦碱具有抑制新冠假病毒侵染细胞的能力，IC50为4.46μmol/L。同时，细胞毒性实验表明，藜芦碱作用A549-ACE2细胞的IC50值为18.68μmol/L，具有细胞给药安全性。
附图说明
图1为实施例1中化合物藜芦碱在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的感染率统计图；
图2为实施例1中化合物藜芦碱在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的抑制率统计图；
图3为实施例2中不同浓度的藜芦碱对A549-ACE2细胞的毒性作用结果；
图4为实施例3中化合物番木瓜碱在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的感染率统计图；
图5为实施例3中化合物番木瓜碱在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的抑制率统计图；
图6为实施例4中不同浓度的藜芦碱对A549-ACE2细胞的毒性作用结果。
具体实施方式
本发明提供了藜芦碱或藜芦碱衍生物在制备抗冠状病毒的药物中的应用，所述藜芦碱的结构式如式I所示；
在本发明中，藜芦碱(Veratrine，CAS号:8051-02-3)，分子式为C36H51NO11，分子量为673.8。在本发明实施例中，所述藜芦碱购自陕西省宝鸡辰光生物科技有限公司。
在本发明中，所述藜芦碱衍生物优选包括藜芦碱的盐形式。所述藜芦碱的盐形式优选包括以下一种或几种：藜芦碱的醋酸盐、藜芦碱的甲酸盐、藜芦碱的盐酸盐、藜芦碱的磷酸盐和藜芦碱的硫酸盐。本发明对所述藜芦碱的盐形式的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物碱盐形式的制备方法即可。本发明对所述藜芦碱的水合物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的化合物的水合物的制备方法即可。
在本发明中，所述抗冠状病毒优选包括预防冠状病毒感染。所述冠状病毒优选包括新冠病毒SARS-COV-2。在本发明实施例中，在细胞水平上，所述藜芦碱对新冠假病毒的IC50为4.46μmol/L。细胞毒性实验表明，藜芦碱作用A549-ACE2细胞的的IC50值为18.68μmol/L。
在本发明中，实验验证了番木瓜碱(Carpaine)、伪番木瓜碱(Pseudocarpaine)、去氢番木瓜碱I(Dehydrocarpaine I)和去氢番木瓜碱II(Dehydrocarpaine II)(结构式如下)均具有阻断阻断冠状病毒S蛋白和ACE2结合的能力，抑制新冠病毒活性IC50依次为5.48μmol/L、8.21μmol/L、24.3μmol/L、30.65μmol/L。因此，所述藜芦碱或藜芦碱衍生物优选联合番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I和去氢番木瓜碱II中的一种或几种在制备抗冠状病毒的药物中的应用。
鉴于藜芦碱通过阻断冠状病毒S蛋白和ACE2结合达到抗病毒的作用，因此，本发明提供了一种阻断冠状病毒S蛋白和ACE2结合的抑制剂在制备抗冠状病毒的药物中的应用，所述抑制剂为藜芦碱或藜芦碱衍生物，所述藜芦碱的结构式如式I所示；
本发明提供了一种抗病毒药物，以藜芦碱或藜芦碱衍生物为活性成分和医学上可接受的辅料；所述藜芦碱的结构式如式I所示；
在本发明中，所述活性成分优选还包括番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I和去氢番木瓜碱II中的一种或几种。
在本发明中，所述药物的剂型包括以下一种或几种：注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂和乳剂。所述药物还包括医学上可接受的辅料。所述辅料包括以下一种或几种：稀释剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和增效剂。所述药物通过口服、经皮、静脉或肌肉注射等途径给药。
下面结合实施例对本发明提供的藜芦碱在制备抗冠状病毒的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料说明：
建立新冠假病毒筛选模型，在293T细胞中运用慢病毒包装体系(pCMVΔ8.2+pCMV3-SARS-Cov-2-S+pBOB-Luciferase/GFP)获得用S蛋白包裹报告基因Luciferase或GFP的新冠假病毒。其中S蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1(atgtttgtgttcctggtgctgctgccactggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccaccaggacccaacttcctcctgcctacaccaactccttcaccaggggagtctactaccctgacaaggtgttcaggtcctctgtgctgcacagcacccaggacctgttcctgccattcttcagcaatgtgacctggttccatgccatccatgtgtctggcaccaatggcaccaagaggtttgacaaccctgtgctgccattcaatgatggagtctactttgccagcacagagaagagcaacatcatcaggggctggatttttggcaccaccctggacagcaagacccagtccctgctgattgtgaacaatgccaccaatgtggtgattaaggtgtgtgagttccagttctgtaatgacccattcctgggagtctactaccacaagaacaacaagtcctggatggagtctgagttcagggtctactcctctgccaacaactgtacctttgaatatgtgagccaaccattcctgatggacttggagggcaagcagggcaacttcaagaacctgagggagtttgtgttcaagaacattgatggctacttcaagatttacagcaaacacacaccaatcaacctggtgagggacctgccacagggcttctctgccttggaaccactggtggacctgccaattggcatcaacatcaccaggttccagaccctgctggctctgcacaggtcctacctgacacctggagactcctcctctggctggacagcaggagcagcagcctactatgtgggctacctccaaccaaggaccttcctgctgaaatacaatgagaatggcaccatcacagatgctgtggactgtgccctggacccactgtctgagaccaagtgtaccctgaaatccttcacagtggagaagggcatctaccagaccagcaacttcagggtccaaccaacagagagcattgtgaggtttccaaacatcaccaacctgtgtccatttggagaggtgttcaatgccaccaggtttgcctctgtctatgcctggaacaggaagaggattagcaactgtgtggctgactactctgtgctctacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgttatggagtgagcccaaccaaactgaatgacctgtgtttcaccaatgtctatgctgactcctttgtgattaggggagatgaggtgagacagattgcccctggacaaacaggcaagattgctgactacaactacaaactgcctgatgacttcacaggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtgggaggcaactacaactacctctacagactgttcaggaagagcaacctgaaaccatttgagagggacatcagcacagagatttaccaggctggcagcacaccatgtaatggagtggagggcttcaactgttactttccactccaatcctatggcttccaaccaaccaatggagtgggctaccaaccatacagggtggtggtgctgtcctttgaactgctccatgcccctgccacagtgtgtggaccaaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtgaacttcaacttcaatggactgacaggcacaggagtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccaacagtttggcagggacattgctgacaccacagatgctgtgagggacccacagaccttggagattctggacatcacaccatgttcctttggaggagtgtctgtgattacacctggcaccaacaccagcaaccaggtggctgtgctctaccaggatgtgaactgtactgaggtgcctgtggctatccatgctgaccaacttacaccaacctggagggtctacagcacaggcagcaatgtgttccagaccagggctggctgtctgattggagcagagcatgtgaacaactcctatgagtgtgacatcccaattggagcaggcatctgtgcctcctaccagacccagaccaacagcccaaggagggcaaggtctgtggcaagccagagcatcattgcctacacaatgagtctgggagcagagaactctgtggcttacagcaacaacagcattgccatcccaaccaacttcaccatctctgtgaccacagagattctgcctgtgagtatgaccaagacctctgtggactgtacaatgtatatctgtggagacagcacagagtgtagcaacctgctgctccaatatggctccttctgtacccaacttaacagggctctgacaggcattgctgtggaacaggacaagaacacccaggaggtgtttgcccaggtgaagcagatttacaagacacctccaatcaaggactttggaggcttcaacttcagccagattctgcctgacccaagcaagccaagcaagaggtccttcattgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggctgatgctggcttcatcaagcaatatggagactgtctgggagacattgctgccagggacctgatttgtgcccagaagttcaatggactgacagtgctgcctccactgctgacagatgagatgattgcccaatacacctctgccctgctggctggcaccatcacctctggctggacctttggagcaggagcagccctccaaatcccatttgctatgcagatggcttacaggttcaatggcattggagtgacccagaatgtgctctatgagaaccagaaactgattgccaaccagttcaactctgccattggcaagattcaggactccctgtccagcacagcctctgccctgggcaaactccaagatgtggtgaaccagaatgcccaggctctgaacaccctggtgaagcaactttccagcaactttggagccatctcctctgtgctgaatgacatcctgagcagactggacaaggtggaggctgaggtccagattgacagactgattacaggcagactccaatccctccaaacctatgtgacccaacaacttatcagggctgctgagattagggcatctgccaacctggctgccaccaagatgagtgagtgtgtgctgggacaaagcaagagggtggacttctgtggcaagggctaccacctgatgagttttccacagtctgcccctcatggagtggtgttcctgcatgtgacctatgtgcctgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccatgatggcaaggctcactttccaagggagggagtgtttgtgagcaatggcacccactggtttgtgacccagaggaacttctatgaaccacagattatcaccacagacaacacctttgtgtctggcaactgtgatgtggtgattggcattgtgaacaacacagtctatgacccactccaacctgaactggactccttcaaggaggaactggacaaatacttcaagaaccacaccagccctgatgtggacctgggagacatctctggcatcaatgcctctgtggtgaacatccagaaggagattgacagactgaatgaggtggctaagaacctgaatgagtccctgattgacctccaagaactgggcaaatatgaacaatacatcaagtggccatggtacatctggctgggcttcattgctggactgattgccattgtgatggtgaccataatgctgtgttgtatgacctcctgttgttcctgtctgaaaggctgttgttcctgtggctcctgttgtaagtttgatgaggatgactctgaacctgtgctgaaaggagtgaaactgcactacacctga)所示；具体构建方法见参考文献(hu 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NO:2，atgtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttcttggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcaggctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctacagtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatatgaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagaggagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagattaaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaattggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaaccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccgagaagttctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttcagaaagcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaatggacgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgctaagaaatggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccattggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgattgttgggactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtggatgaaaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgtgaccccgcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaagaagcactttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaaactgttcaatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatgaatgtaaggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaattcttttgtgggatggagtaccgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaagcatatgaatggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaaaatcagatgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcactgcacctaaaaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatgctttccgtctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttccatatggctgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcggaagaagaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatccaggattccaaaacactgatgatgttcagacctccttttag)的病毒液，该病毒液侵染A549细胞后，通过细胞单克隆筛选以及鉴定，建立A稳定表达ACE2蛋白的A549细胞株(549-ACE2细胞)，具体构建方法如下：第一天将293T细胞铺板至六孔板，保证第二天包病毒时细胞密度约90％，包病毒体系如下，每孔DNA量：pCMVΔ8.2μg，pCMV3-SARS-Cov-2-S 0.5μg，pBOB-Luciferase/GFP 2μg，与50μl不加血清和抗生素的DMEM培养基混合，将3倍量的PEI与50μl不加血清和抗生素的DMEM培养基后，将DNA管与PEI管混合均匀后，静置25min后，加入换成5％血清的DMEM的293T细胞，培养箱中培养8h后，换液成30％血清含抗生素的培养基继续培养，36h用0.45um滤器过滤获得病毒液，-80℃冰箱保存。
实施例1
化合物藜芦碱在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的抑制效果
1实验方法
将对数生长期的A549-ACE2细胞从直径10cm的培养皿消化下来根据细胞密度用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基稀释至105个/mL的细胞悬浮液，将细胞混合均匀后接种到96孔板中，每孔加入100μL细胞悬浮液，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
在293T细胞中运用慢病毒包装体系获得由S蛋白包裹报告基因Luciferase形成的安全性较高的新冠假病毒液。
将A549-ACE2细胞接种到96孔板上，24h后加药，同时进行病毒侵染，病毒液与培养基以2：3比例混合，得到假病毒溶液，将藜芦碱用培养基和病毒液的混合液稀释成浓度为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM，每孔100μL，同时设空白组(培养基)、阴性对照组(DMSO)、阳性对照组(千金藤素Ceph和氯喹CQ)，加药侵染72h后使用荧光酶标仪检测492nm处的荧光发射值。
统计各组荧光强度值，使用GraphPad Prism8软件，以抑制剂浓度为横坐标，对应的感染率为纵坐标，结果如图1所示，以抑制剂浓度的对数值为横坐标，对应的抑制感染率为纵坐标，结果如图2所示，可以得到该化合物藜芦碱对新冠假病毒的抑制能力，IC50为4.46μmol/L。
实施例2
藜芦碱对A549-ACE2细胞的毒性作用
1实验方法
1.1将对数生长期的A549-ACE2细胞从直径10cm的培养皿消化下来后，将稀释至105个/mL的细胞悬浮液混合均匀后接种到96孔板中，每孔100μL体积，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
1.2细胞给药
藜芦碱用DMSO溶解，母液浓度为10mM，之后用DMEM培养基进一步稀释成浓度为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM，96孔板中每孔加入100μL，每个剂量组设3个平行孔，同时设空白组和对照组，放入培养箱中培养，加药后48h进行细胞毒性检测。
1.3MTT检测藜芦碱的细胞毒性
1、药物分别处理48h后，弃掉培养基，每孔加入10μLMTT溶液，培养箱中孵育4h后弃去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，并于摇床摇晃10min充分溶解甲臜结晶，用酶标仪于490nm处测OD值。
2、酶标仪读取490nm波长的吸光值(OD490)。计算得到实验组(即加药组)相对于对照组的细胞存活比率。
使用GraphPad Prism8计算细胞存活率如公式A所示和IC50值；
细胞存活率(％)＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％
公式A
结果如图3所示，藜芦碱作用A549-ACE2细胞的IC50值为18.68μmol/L。
实施例3
化合物番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I或去氢番木瓜碱II在不同浓度下对新型冠状病毒感染A549-ACE2细胞的抑制效果
1实验方法
将对数生长期的A549-ACE2细胞从直径10cm的培养皿消化下来后，根据细胞密度用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基稀释至105个/mL的细胞悬浮液，将细胞混合均匀后接种到96孔板中，每孔加入100μL细胞悬浮液，在周围孔中加入相同体积的PBS缓冲液，轻轻拍打培养板的周围，使细胞分布均匀，待细胞沉淀到培养板底部后放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
在293T细胞中运用慢病毒包装体系获得由S蛋白包裹报告基因Luciferase形成的安全性较高的新冠假病毒液。
将A549-ACE2细胞接种到96孔板上，24h后加药，同时进行病毒侵染，将病毒液与培养基以2：3比例混合，获得假病毒溶液，将番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I或去氢番木瓜碱II用培养基和病毒液的混合液稀释成浓度为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM，每孔100μL，同时设空白组(培养基)、阴性对照组(DMSO)、阳性对照组(千金藤素Ceph和氯喹CQ)，加药侵染72h后使用荧光酶标仪检测492nm处的荧光发射值。
统计各组荧光强度值，使用GraphPad Prism8软件，以抑制剂浓度为横坐标，对应的感染率为纵坐标，结果如图4所示；以抑制剂浓度的对数值为横坐标，对应的抑制感染率为纵坐标，结果如图5所示。各化合物对新冠假病毒的抑制能力见表1。
表1番木瓜碱及其类似物抑制新冠病毒活性
编号 化合物 抑制新冠病毒活(IC50)
1 番木瓜碱 5.48μmol/L
2 伪番木瓜碱 8.21μmol/L
3 去氢番木瓜碱I 24.3μmol/L
4 去氢番木瓜碱II 30.65μmol/L
实施例4
番木瓜碱对A549-ACE2细胞的毒性作用
1实验方法
1.1将对数生长期的A549-ACE2细胞从直径10cm的培养皿消化下来后，将稀释至105个/mL的细胞悬浮液混合均匀后接种到96孔板中，每孔100μL体积，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
1.2细胞给药
番木瓜碱用DMSO溶解，母液浓度为10mM，之后用DMEM培养基进一步稀释成浓度为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM，96孔板中每孔加入100μL，每个剂量组设3个平行孔，同时设空白组和对照组，放入培养箱中培养，加药后48h进行细胞毒性检测。
1.3MTT检测番木瓜碱的细胞毒性
1、药物分别处理48h后，弃掉培养基，每孔加入10μLMTT溶液，培养箱中孵育4h后弃去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，并于摇床摇晃10min充分溶解甲臜结晶，用酶标仪于490nm处测OD值。
2、酶标仪读取490nm波长的吸光值(OD490)。计算得到实验组(即加药组)相对于对照组的细胞存活比率。
使用GraphPad Prism8计算细胞存活率和IC50值，细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％。
结果见图6，番木瓜碱作用A549-ACE2细胞的IC50值为35.08μmol/L。
综上，藜芦碱能高效够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，抑制含有新冠病毒S蛋白的假病毒感染细胞，且细胞毒性较低，由此说明藜芦碱能够用于预防和/或治疗新冠病毒的感染，进而用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。同时化合物番木瓜碱、伪番木瓜碱、去氢番木瓜碱I或去氢番木瓜碱II具有不同程度抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合的能力，因此可以与藜芦碱联合作为活性成分发挥抗新冠病毒的作用，同时制备抗冠状病毒的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.藜芦碱或藜芦碱衍生物在制备抗冠状病毒的药物中的应用，所述藜芦碱的结构式如式I所示；
式I
所述藜芦碱衍生物为藜芦碱水合物或藜芦碱的盐形式；
所述冠状病毒为新冠病毒SARS-COV-2。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述藜芦碱的盐形式为以下一种或几种：藜芦碱的醋酸盐、藜芦碱的甲酸盐、藜芦碱的盐酸盐、藜芦碱的磷酸盐和藜芦碱的硫酸盐。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗冠状病毒包括预防冠状病毒感染。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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杨秀伟编著.《中药成分的吸收、分布、代谢、排泄、毒性与药效 下册》.中国医药科技出版社,2006,(第1版),1759-1761页. *

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