CN109833317B - 法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用。本发明经过体外实验结果显示,法匹拉韦(T‑705)加入到感染CDV‑3及CDV‑11的Vero及DH82细胞中,均能产生明显的病毒抑制作用,体现出良好的抗病毒功效。且随药物浓度的增加,抗病毒效果逐渐增强。细胞感染病毒后12‑48h加入药物,仍能发挥显著的抗病毒功效,证明了法匹拉韦(T‑705)暴露后用药对不同动物来源的CDV都具有很好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒抑制剂法匹拉韦的应用,尤其涉及法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用,属于医药技术领域。
背景技术
犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)感染食肉科动物引起的一种急性、高度接触性传染病,该病传染性强、发病率和死亡率高、自然感染宿主广,其致死率与宿主种类有极大关系,经常引起大批犬、貂、狐等动物发病,病死率达30-80%,雪貂的死亡率高达100%,经济损失惨重。该病所引起的临床症状复杂多样,既可单独表现为呼吸道炎症、消化道炎症或神经系统症状,又可同时表现出以上两种或两种以上的混合症状。CD的典型临床症状是以双相热、急性鼻卡他、支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为主要特征。近年来,在临床上发现了大量表现为非典型症状的病例,仅表现为一般呼吸道、消化道疾病的临床症状,CDV检测为阳性,不及时进行特异性治疗,死亡率很高。此外,CD能够导致机体免疫抑制,引起其它病毒或细菌的混合感染,是当前养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。
犬瘟热病毒的自然感染宿主范围非常广泛,而且呈现不断扩大的趋势,已有传统的犬科、鼬科及浣熊科扩展到了食肉目的所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。野生动物老虎、狮子、豹和海豹等,甚至一些珍稀物种如大熊猫、小熊猫等都暴发过犬瘟热。CD的流行对犬、毛皮经济动物、野生动物的生命安全造成了严重威胁,给养殖户造成了巨大的经济损失。此外,人的变形性骨炎患者体内检测到了CDV的核酸,这提示犬瘟热有可能成为人兽共患传染病,因此该病引起了国内外学者的高度关注。
犬瘟热病毒(CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属成员,是单股负链不分节段RNA病毒,其基因组大小为15690bp,从3’到5’端依次编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大转录蛋白(L)。其中,L蛋白作为一个多功能酶活性单位,具有特异性的RNA聚合酶活性,含有病毒RNA合成所需的多种酶活性,如戴帽、甲基化、多聚A和蛋白酶活性,可参与复制和转录过程。
目前,尚无批准应用于治疗CDV的特异性药物。国内外对犬瘟热的预防仍然主要依赖于弱毒疫苗,而弱毒苗在使用过程中存在返祖、首免时受到母源抗体的干扰、引起一过性的免疫抑制和血小板减少、导致免疫动物发生脑炎等现象。随着犬瘟热感染宿主的范围不断扩大,研发能够有效防治各种动物感染犬瘟热病毒的特异性药物尤为重要。
法匹拉韦(favipiravir),化学式为C5H4FNO3,化学名为6-氟-3-羟基吡嗪-2甲酰胺,相对分子质量为157.10,商品名为Avigan,CAS号为259793-96-9,为白色或类白色粉末,是由日本富山化学研究开发,具有抗病毒活性,产品代码为T-705。T-705本身无抗病毒活性,在体内可快速转化为法匹拉韦核苷三磷酸(M6)形式,M6通过模拟鸟苷三磷酸(GTP)竞争性抑制病毒RNA依赖的RNA聚合酶,抑制病毒基因组复制和转录而发挥抗病毒作用,M6还可渗入病毒基因,通过诱发致命性的突变发挥抗病毒作用。法匹拉韦对流感病毒表现出良好的药效,同时对艾滋病毒、SARA、黄热病毒以及埃博拉等其他具有RNA依赖的RNA聚合酶的病毒具有良好的抗病毒效果。但迄今为止尚未有法匹拉韦抑制麻疹病毒属病毒的相关报道。
法匹拉韦的化学结构式
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用。
本发明技术方案如下:
法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用。
本发明所述的犬瘟热病毒为副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒种;优选的,所述的犬瘟热病毒为源于犬和水貂的CDV-3毒株及CDV-11毒株。
根据本发明法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用,其中,所述药物的剂型为临床上或药学上可接受的任一剂型。优选的,所述药物的剂型为粉剂、注射液、胶囊或口服液。
根据本发明优选的,本发明法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用,法匹拉韦可单独使用或者和其他药物联合使用。
为实现本发明目的,本发明进行了一系列的体外实验,设置了五个时间点,利用间接免疫荧光实验,分别检测了在不同时间点感染不同犬瘟热毒株的细胞经药物处理后,其病毒滴度的变化情况。同时,通过利用CCK-8试剂盒,检测了不同药物浓度下细胞的存活率,从而推断药物对不同细胞活性的影响,结果详见实施例。
本发明的有益效果:
本发明为法匹拉韦提供了新的药用价值,本发明经过体外实验结果显示,法匹拉韦(T-705)加入到感染CDV-3及CDV-11的Vero及DH82细胞中,均能产生明显的病毒抑制作用,体现出良好的抗病毒功效。且随药物浓度的增加,抗病毒效果逐渐增强。细胞感染病毒后12-48h加入药物,仍能发挥显著的抗病毒功效,证明了法匹拉韦(T-705)暴露后用药对犬来源和水貂来源的CDV都具有很好的抑制效果。且法匹拉韦(T-705)对Vero、DH82具有低毒性,副作用小。
附图说明
图1为本发明中CDV在Vero细胞和DH82细胞中的免疫荧光染色鉴定图;
图2为本发明中CDV在Vero细胞和DH82细胞中的增殖曲线;
图3为本发明中不同浓度T-705对Vero及DH82细胞活性的影响曲线;
图4为本发明中不同细胞系接种不同CDV毒株并加入T-705,病毒滴度变化情况;
图5为本发明中不同细胞系暴露于病毒后各时间点加入T-705,病毒滴度变化情况;
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述,但本发明所保护范围不限于此。
以下实施例中使用的试验材料:
法匹拉韦(T-705)购自瀚香生物科技,DMEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium)购自Gibco公司,胎牛血清(Fetal Bovine Serum)购自Gibco公司,CCK-8(CellCounting Kit-8)试剂盒购自Dojindo公司,小鼠CDV N蛋白单克隆抗体购自Vmrd公司,488标记山羊抗鼠IgG购自Proteintech公司。
DH82细胞为犬巨噬细胞源的细胞,购自美国ATCC,Vero细胞为非洲绿猴肾细胞,购自国家实验细胞资源共享平台。CDV-11毒株购自齐鲁动物保健品有限公司;CDV-3毒株购自中国农业科学院特产研究所。
实施例1:法匹拉韦(T-705)犬瘟热病毒抑制实验
实验方法如下:
1.药物的配置及稀释
T-705以终浓度为5mg/ml溶于DMEM培养基,依次倍比稀释为1250,625,312.5,156.25,78.125μg/ml,储存于四度,一周内用完。
2.病毒滴度测定
Vero细胞传入96孔板中长满至80%-90%,将病毒样品用细胞维持液(DMEM中含2%FBS)以10倍递次稀释成不同的稀释度,从10-1到10-8,将96孔细胞培养板中的细胞生长液吸出后,向Vero细胞中接种不同稀释度的病毒,每孔接种100μl,放置于37℃,5%CO2孵箱中培养3天。弃细胞上清,每孔加入冷丙酮100μl固定负二十度过夜。弃丙酮,PBS清洗三次;用PBS稀释的鼠CDV N蛋白一抗每孔加入50μl抗体,37℃作用1h;用PBS稀释的488标记山羊抗鼠IgG二抗,37℃作用1h,弃上清,PBS清洗三次,用荧光显微镜观察并且存照。结果按Karber法计算TCID50。
3.CDV生长曲线的测定
将Vero及DH82细胞铺满6孔细胞培养板中待细胞长至单层,按病毒感染复数等于0.1的量感染病毒,分别于细胞感染病毒后1、2、3、4天将细胞与上清液放置于负八十度,反复冻融三次收毒。按1.2方法测定病毒滴度。
结果显示,Vero细胞接种CDV-3和CDV-11后间接免疫荧光实验呈现明显荧光,对照未接毒细胞无荧光出现。见图1A-F。分别在细胞感染病毒后0h,24h,48h,72h,96h收获病毒测定病毒滴度,在Vero细胞中,CDV-3和CDV-11的病毒滴度均于感染病毒后72h达到峰值,分别达到105.5和106.6TCID50/mL,72h-96h病毒滴度继续维持达到平台期。在DH82细胞中,CDV滴度持续上升,CDV-3和CDV-11滴度均在96h达到峰值105.5TCID50/mL。见图2。
4.细胞活性测定
在96孔板中生长满80%-90%的单层Vero和DH82细胞,弃细胞上清液,每孔加入200μl含有不同浓度T-705(0,78.125,156.25,312.5,625,1250μg/ml)的DMEM培养基,37℃培养96h后,每孔加入10μl CCK-8并于37℃避光孵育2h。测定450nm处的吸光度。细胞活性通过加药实验孔与对照孔吸光度的比值来表示。
结果显示,T-705在浓度为625μg/mL和1250μg/mL时,Vero细胞活性有轻微下降,各浓度T-705对DH82细胞活性无显著影响。T-705在所测浓度范围内,对Vero及DH82细胞具有低毒性,且T-705在两种细胞上的致半数细胞毒性浓度(CC50)均大于1250μg/mL。见图3。
5.病毒抑制实验
Vero及DH82细胞分别传入六孔板,待细胞长满至80%-90%,弃细胞上清液,每孔加入2.5ml含有不同浓度T-705(0,78.125,156.25,312.5,625,1250μg/ml)的DMEM培养基,同时按病毒感染复数(MOI)等于0.1的量感染病毒。设置五个不同加药时间点,分别于细胞接种病毒后12h,24h,36h,48h后弃细胞上清液,分别加入不同浓度T-705,37℃培养,统一于接毒后96h将细胞及上清液放置于负八十度,反复冻融三次收毒。测定病毒样品的病毒滴度。
结果显示,T-705能够显著抑制CDV-3及CDV-11在Vero及DH82细胞中的增值,且抑制效果与药物浓度呈剂量依赖关系。我们发现,在CDV-3-Vero,CDV-11-Vero,CDV-3-DH82和CDV-11-DH82实验组中,T-705浓度为78.125μg/mL时可以完全抑制病毒的增值。半数抑制浓度(IC50)分别为25.2μg/ml,7.05μg/ml,33.54μg/ml和16.97μg/ml。SI指数(SI=CC50/IC50)分别超过49.6,177.3,37.27和73.66(见表1)。结果表明T-705可以有效抑制CDV-3,CDV-11在Vero及DH82细胞中的增殖。见图4。
表1本发明中T-705对不同CDV毒株在不同细胞上的抑制情况
a CC50±SD是致半数细胞毒性浓度.
b IC50±SD是半数病毒抑制浓度.
c SI是筛选指数=CC50/IC50.
T-705于细胞感染病毒后12h-48h加入,与感染病毒后0h加入相比,其病毒抑制效率有所降低,但仍可以有效抑制病毒的复制,除Vero细胞感染CDV-11后48h加入78.125μg/ml T-705,其余实验组加药后病毒滴度均显著下降(P<0.05)。此外,细胞感染病毒后12h-48h加入药物,相同时间点时不同药物浓度对病毒抑制效率影响不大。见图5。
6.统计分析方法
用GraphPad Prism 6软件分析各组数据,以均数±标准差表示,多组数据比较用ANOVA(Dunnett's t-test)检验,P<0.05有统计学意义。*,P<0.01;**,P<0.0001。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,本发明创造并不限于所述实施例,悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (4)
1.法匹拉韦在制备抑制犬瘟热病毒增殖药物中的应用,所述的犬瘟热病毒为源于犬和水貂的CDV-3毒株及CDV-11毒株。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为临床上或药学上可接受的任一剂型。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为粉剂、注射液、胶囊或口服液。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述法匹拉韦可单独使用或者和其他药物联合使用。
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