CN113046384A - 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，通过本发明，本发明构建携带腺苷酸环化酶的重组质粒pS‑DacA，将该质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120，形成重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS‑DacA)。当DacA在猪霍乱沙门氏菌裂解载体中表达时，则催化ATP形成c‑di‑AMP。口服给药后，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS‑DacA)进入宿主免疫细胞，释放c‑di‑AMP，激活宿主STING通路达到广谱抗病毒的效果。重组菌株rSC0120(pS‑DacA)被证实可以在巨噬细胞和小鼠体内激活STING通路，引起巨噬细胞和小鼠的抗病毒状态，抵抗PRRSV和PRV的攻击。该重组菌株具备广谱抗病毒的效力，适用于临床上各种动物病毒的防治。

Description

一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法
技术领域
本发明涉及一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，属于重组菌株技术领域。
背景技术
STING(干扰素基因刺激因子，stimulator of interferon genes)是目前药物研发的一个非常热门的靶点。STING激动剂是指可以与STING蛋白结合并激活其下游天然免疫应答的化合物，这类化合物通常为两分子的核苷酸或腺苷酸聚合物，例如：c-di-GMP，c-di-AMP等。近年来，STING激动剂在抗肿瘤领域的应用颇为广泛。Emily P等人的研究表明，人和小鼠STING激动剂ADU-S100减轻了携带胰腺导管腺癌(PDA)的小鼠的局部和远端肿瘤负担。尽管STING激动剂在肿瘤治疗领域被广泛研究，但关于STING激动剂在抗病毒领域的研究及应用却很少见。Tina M.Sali等人利用人工合成的STING激动剂G10在人细胞中引起抗病毒状态，使细胞抵抗甲病毒的攻击，该研究表明STING激动剂在抗感染领域具备一定的应用和开发潜力。
目前，STING激动剂的给药方式依赖佐剂或者基因枪的加持，这与STING蛋白的特性有关。STING蛋白是一种胞内蛋白，在体外施用STING激动剂时，须使STING激动剂与细胞内的STING蛋白结合才能使激动剂发挥作用。这就需要借助佐剂或基因枪等介质将STING激动剂运送至细胞内，如此才能使两者结合，从而诱导后续的药物反应。目前常用于递送STING激动剂的方法是阳离子佐剂包裹递送或基因枪注射。而这两种方法均存在明显的缺陷。就阳离子佐剂来说，该佐剂通常为高分子的纳米材料。这种材料很难在机体内被代谢排出，且有一定的细胞毒性，增加了给药风险。使用阳离子佐剂呈递STING激动剂时会对机体细胞造成损伤。就基因枪来说，基因枪注射技术门槛高，给药成本高。与STING激动剂结合时，推广应用性差。特别是在兽药领域，高昂的成本几乎难以被市场接受。此外，利用阳离子佐剂或者基因枪都难以靶向天然免疫细胞，这些STING激动剂大多数被运输至注射部位或者给药部位，而STING蛋白主要存在于树突细胞和巨噬细胞这两种天然免疫细胞中，上述两种给药方式无法靶向这两种天然免疫细胞。这使得STING激动剂的效果大打折扣。因此开发一种廉价高效的递送STING激动剂的新技术对于其应用，尤其自兽医领域的推广具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有问题，要解决的技术问题为：STING蛋白主要存在于树突细胞和巨噬细胞这两种天然免疫细胞中，而沙门氏菌的靶细胞正是树突细胞和巨噬细胞。因此，利用沙门氏菌呈递STING激动剂也许能够将STING靶向运输至这两种天然免疫细胞中，使得STING激动剂与天然免疫细胞中的STING蛋白充分结合，从而充分激活下游STING通路，提高药物利用率。此外，一般情况下，重组细菌载体中的有效成分难以穿越细菌细胞壁释放到宿主细胞内发挥作用。而本发明中所用于递送STING激动剂的猪霍乱沙门氏菌裂解载体具备程序性的裂解功能。本发明拟通过沙门氏菌对免疫细胞的强侵袭能力，程序性裂解的功能，将STING激动剂在沙门氏菌中表达，并通过裂解释放到宿主细胞质中，与宿主细胞内的STING蛋白结合，激活STING通路，诱导抗病毒天然免疫应答。STING激动剂在肿瘤治疗领域被广泛研究，而关于通过减毒裂解特性的沙门氏菌靶向递送STING激动剂在抗病毒领域的研究及应用却很少见。本发明利用重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体递送STING激动剂，并评价重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体在猪巨噬细胞和小鼠中的抗病毒效力。
为解决上述问题，提供一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法。
本发明的技术方案是：一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步：
以单核李斯特杆菌NH1株(Genbank ID：1358004970)的全基因序列为模板。设计合成不含“ACA”碱基序列的DacA碱基片段：ATGGACTTTTCCAATATGAGTATCCTTCACTATTTAGCGAATATTGTAGATATTTTGGTGGTTTGGTTCGTAATTTATAAGGTTATCATGCTTATCCGCGGCACGAAAGCCGTCCAGCTGTTGAAGGGGATTTTCATTATTATTGCCGTCAAGTTACTTAGCGGCTTCTTCGGATTGCAGACGGTGGAATGGATTACTGATCAAATGCTGACTTGGGGTTTCTTAGCCATTATCATTATCTTTCAACCGGAATTGCGTCGTGCCCTGGAGACTTTGGGGCGTGGCAATATCTTTACCCGCTATGGATCACGCATTGAGCGTGAGCAGCACCACCTTATTGAGTCTATTGAAAAGTCCACGCAATATATGGCGAAGCGTCGCATTGGAGCTTTGATCTCTGTGGCTCGTGATACCGGCATGGACGACTATATCGAGACTGGCATTCCGCTTAATGCGAAAATCTCATCGCAATTATTGATTAATATCTTCATCCCCAATACCCCTCTTCACGATGGCGCAGTGATCATTAAAGGTAACGAGATCGCGAGCGCTGCCAGTTATCTGCCATTGTCCGACTCGCCGTTTCTTTCTAAGGAGCTGGGAACTCGCCATCGTGCCGCATTAGGGATTTCCGAGGTGACCGATTCAATCACCATCGTTGTCAGCGAGGAAACGGGTGGGATTTCCCTTACGAAGGGAGGCGAACTGTTCCGTGATGTATCCGAAGAAGAATTGCATAAGATTTTGCTTAAAGAGCTGGTGACTGTCACGGCTAAAAAACCAAGCATTTTCTCCAAATGGAAAGGAGGTAAGTCCGAGTGA，该片段长度为822bp。
第二步：
将DacA碱基片段与pYA3493质粒同时经EcoR I和HindⅢ双酶切，并将酶切产物经T4连接酶连接后转化rSC0002感受态细胞，形成重组表达质粒pS-DacA。
第三步：
利用化学转化法将重组pS-DacA质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体菌株rSC0120中，构建广谱抗病毒的重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)株。
本发明方法先进科学，通过本发明，本发明构建携带腺苷酸环化酶的重组质粒pS-DacA，将该质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120，形成重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)。当DacA在猪霍乱沙门氏菌裂解载体中表达时，则催化ATP形成c-di-AMP。口服给药后，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)进入宿主免疫细胞，释放c-di-AMP，激活宿主STING通路达到广谱抗病毒的效果。重组菌株rSC0120(pS-DacA)被证实可以在巨噬细胞和小鼠体内激活STING通路，引起巨噬细胞和小鼠的抗病毒状态，抵抗PRRSV和PRV的攻击。该重组菌株具备广谱抗病毒的效力，适用于临床上各种动物病毒的防治。
如图1，在体外培养递送环二腺苷酸合酶DacA的重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)，此时在rSC0120(pS-DacA)菌体内合成环二腺苷酸合酶DacA，在DacA的催化作用下，细胞内的ATP生成c-di-AMP。将含有大量c-di-AMP的沙门氏菌施用于细胞或小鼠后，沙门氏菌进入宿主细胞内，通过基因调控，载体菌发生程序性裂解，将c-di-AMP释放到宿主细胞质中。这些c-di-AMP与STING蛋白结合后激活STING通路。STING通路被激活后会导致宿主细胞释放抗病毒效应因子，这些效应因子会对细胞或环境中的病毒进行杀伤，从而达到抗病毒的效果。
附图说明
图1为本发明原理图。
图2为质粒pS-DacA双酶切鉴定图；
其中，M：DL5000 DNAmarker；1-3：pS-DacA阳性质粒双酶切。
图3为质粒pS-DacA结构图。
图4为rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)PCR鉴定图；
图中，M：DL2000 DNA marker；1-5：rSC0120(pS-DacA)克隆株PCR鉴定；6-10：rSC0119(pS-DacA)克隆株PCR鉴定。
图5CDA的浓度图；
图中，A为rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)菌体中CDA的浓度图；5B为rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)培养上清中CDA的浓度图。
图6为感染后各时间段rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)组3D4/21细胞上清中CDA的浓度图。
图7为利用Westren Blot检测感染后各时间段rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)在3D4/21细胞诱导STING蛋白表达特性图。
图8为利用ELISA检测感染后各时间段rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)组3D4/21细胞培养上清中I型干扰素的浓度图。
图9为利用ELISA检测相应菌株感染组小鼠I型干扰素分泌水平(A：血清；B：脾脏；C：肝脏；D：肠道)图。
图10A为病毒滴度图；
图中，A为不同比例的重组沙门氏菌rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)接种组3D4/21cGAS-/-细胞中PRV的病毒滴度图；B为不同比例的重组沙门氏菌rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)接种组3D4/21cGAS-/-细胞中PRRSV的病毒滴度图。
具体实施方法
实施1 rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)的构建与鉴定；
1.1 pS-DacA质粒的构建与鉴定；
以单核李斯特杆菌NH1株(Genbank ID：1358004970)的全基因序列为模板。设计合成不含“ACA”碱基序列的DacA碱基片段。将上述片段与pYA3493质粒同时经EcoR I和HindⅢ双酶切，并将酶切产物经T4连接酶连接。连接产物转化至工程菌大肠杆菌rSC0002中，挑取克隆株，通过双酶切和测序鉴定，双酶切鉴定结果如图2。
双酶切和测序鉴定均正确克隆株为阳性克隆株，命名为rSC0002(pS-DacA)，提取rSC0002(pS-DacA)中的pS-DacA质粒备用。
1.2重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)与重组猪霍乱沙门氏菌载体rSC0119(pS-DacA)的构建与鉴定；
将pS-DacA质粒转化至rSC0120、rSC0119感受态细胞，形成重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)与普通载体rSC0119(pS-DacA)。同时将pYA3493质粒转化至rSC0120、rSC0119感受态细胞形成空载体对照rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)。挑取转化后的克隆子进行PCR鉴定(上游引物：5’-GATGCTATTTTATAGGCG-3’；下游引物：5’-CGTTTTAAGCGCCGAGAG-3’)，经PCR鉴定正确(图4)后的阳性菌株冻存于-70℃冰箱备用。
实施2
rSC0120(pS-DacA)在体外合成c-di-AMP(CDA)并将CDA释放至胞外2.1rSC0120(pS-DacA)在NB培养基生长时合成并释放STING激动剂CDA重组细菌载体疫苗因其能够诱导机体产生黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的特点，已经被广泛用作递送保护性抗原和核酸疫苗的载体来预防某些传染病。但是重组到细菌载体疫苗中的保护性抗原和核酸难以穿越细菌细胞壁释放到宿主细胞内发挥作用。为了解决这一难题，本实验室开发了能够程序性裂解并释放胞内物质的猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120，本部分利用体外传代实验评价了猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)在体外合成并释放CDA的能力。
向rSC0119(ΔrelA::araC PBADlacIΔPmazE::TT araC PBADmazEΔpmiΔasdA)和rSC0120(ΔrelA::araC PBADlacIΔPmazE::TT araC PBADmazEΔpmiΔPlacmazFΔasdA)中引入编码环二腺苷酸合酶DacA的重组质粒pS-DacA，形成重组减毒载体rSC0119(pS-DacA)和重组裂解载体rSC0120(pS-DacA)。同时，向rSC0119和rSC0120中引入pYA3493空质粒载体，形成rSC0119(pYA3493)和rSC0120(pYA3493)，作为空载体对照。于-70℃冰箱取出rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)和rSC0119(pYA3493)在含0.2％阿拉伯糖的NB培养基上划线复苏。随后挑取上述单菌落分别于NB培养基中传代培养。第一次传代时添加终浓度为0.2％的阿拉伯糖，随后均不添加阿拉伯糖。利用甲醇提取菌体和培养上清中的CDA。使用液质联用的方法，在Vanquish UHPLC/TSQ Altis LC-MS/MS 6500液质联用仪上分离检测CDA。结果如图5所示，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)合成CDA的水平显著高于普通载体rSC0119(pS-DacA)(*:p<0.05；**:p<0.01)。同时，随着传代次数的增加，培养环境中阿拉伯糖的浓度减少，rSC0120(pS-DacA)的培养上清中所检测到的CDA浓度也随之增加。以上结果表明，随着环境中阿拉伯糖浓度的降低，rSC0120(pS-DacA)逐渐程序性裂解，主动释放细胞质中的CDA。这种裂解释放CDA的机制，使胞质内的CDA跨过细胞壁的阻碍，释放至细胞外。2.2rSC0120(pS-DacA)在猪肺巨噬细胞系3D4/21细胞中合成并释放c-di-AMP
于-70℃冰箱取出冻存的rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)和rSC0119(pYA3493)在含0.2％阿拉伯糖的LB培养基上划线复苏。随后挑取上述单菌落在含0.2％阿拉伯糖的LB培养基中37℃静置培养过夜，过夜培养物以1:100的比例接种于含0.2％阿拉伯糖的LB液体培养基中，摇菌至OD600＝0.85时离心收集菌体用于感染细胞。使用1MOI的重组猪霍乱沙门氏菌进行细胞感染实验，感染组别设置为rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)和PBS对照孔。于感染1h、6h、12h、24h利用洋地黄皂苷通透细胞膜，并用甲醇提取细胞培养上清中的CDA，将提取物在Vanquish UHPLC/TSQ Altis LC-MS/MS 6500系统上分离检测。检测结果如图6所示：rSC0120(pS-DacA)作用组细胞培养清中CDA浓度显著高于rSC0119(pS-DacA)作用组(*:p<0.05；**:p<0.01)。同时，随着感染时间的增加，rSC0120(pS-DacA)感染组的细胞培养上清中CDA的浓度也随之增加。而rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)和PBS对照组细胞培养清中则无法检出CDA。这表明rSC0120(pS-DacA)感染3D4/21细胞后可以大量合成CDA，同时将所合成的CDA释放到宿主细胞的细胞质中，这种释放机制是能显著提高CDA的表达量，并保障其可能在细胞质中高效与STING蛋白结合，以激活STING通路。
实施3
rSC0120(pS-DacA)在3D4/21细胞激活STING通路；
3.1rSC0120(pS-DacA)在敲低cGAS的猪肺巨噬细胞系3D4/21细胞上调STING的表达CDA可以激活STING通路，上调STING蛋白的表达。由于沙门氏菌感染细胞时，自身的DNA可能会上调cGAS的表达，激活后续的STING通路。因此为了证明是rSC0120(pS-DacA)表达的DacA催化产生的CDA激活的STING通路的影响，而非cGAS的作用，本发明通过慢病毒感染将猪巨噬细胞系3D4/21细胞的cGAS敲低，对rSC0120(pS-DacA)激活STING通路的特性进行了探究。将敲低cGAS的3D4/21细胞铺于24孔板内，每孔2.5×106个细胞。待细胞紧密贴壁后，使用1MOI的重组猪霍乱沙门氏菌rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)进行细胞感染实验，于感染1h、6h、12h、24h收集细胞悬液并提取细胞总蛋白，利用Anti-cGAS单克隆抗体，Anti-STING单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗，进行Westren Blot实验，随后用Image J分析cGAS和STING蛋白的浓度，相应蛋白浓度越高，表明其对应的信号活性越强。结果如图7示，相较于rSC0119(pS-DacA)的作用，rSC0120(pS-DacA)的作用使猪肺巨噬细胞的STING蛋白表达显著上调，且STING蛋白表达在12h达到峰值，此时rSC0120(pS-DacA)上调STING蛋白表达量为rSC0119(pS-DacA)组的9.6倍。这表明，随着rSC0120(pS-DacA)在3D4/21细胞中逐渐合成并释放CDA，STING通路也逐渐被激活，且相比非裂解载体，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)更显著地激活STING通路。结合前部分的研究，证实rSC0120(pS-DacA)能够在宿主细胞中主动程序性裂解，同时大量合成并释放自身胞质中的CDA。当CDA被释放至宿主细胞中，则充分与宿主细胞细胞质中的STING结合，显著上调STING的表达，激活STING通路。
3.2rSC0120(pS-DacA)在cGAS敲除的猪肺巨噬细胞系3D4/21细胞上调I型干扰素的表达与分泌I型干扰素是抗病毒天然免疫的主要效应因子，被证实可抑制多种病毒感染机体。因此，I型干扰素在临床上被广泛用于抗病毒治疗。
参照3.1中的方法进行重组猪霍乱沙门氏菌进行细胞感染实验。利用重组沙门氏菌非裂解载体rSC0119(pS-DacA)和重组沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)感染敲除cGAS的猪肺巨噬细胞系3D4/21细胞，并于感染1h、6h、12h、24h收集细胞培养上清，利用间接ELISA检测培养上清中I型干扰素IFN-β的分泌特性。结果显示：在感染后6小时、12小时或24小时，rSC0120(pS-DacA)感染组的细胞上清中所检测到的I型干扰素浓度均显著高于rSC0119(pS-DacA)感染组(**:p<0.01)。上述结果表明，较rSC0119(pS-DacA)，rSC0120(pS-DacA)具有显著增强的激活STING通路能力，诱导大量的I型感染素的表达与分泌。这可能是由于rSC0120(pS-DacA)在细胞中大量合成并释放CDA，从而诱导细胞分泌高水平的I型干扰素。
实施4
rSC0120(pS-DacA)在Babl/C小鼠诱导I型干扰素的表达分泌；
本实验室前期的研究表明，猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120可在小鼠淋巴组织定殖，并扩散至深层淋巴组织。这有利于裂解载体所携带的外源抗原或外源效应物大量的合成，并充分地激活宿主淋巴细胞，诱导优良的免疫应答。本部分用Babl/C做为动物模型，探究了rSC0120(pS-DacA)在动物机体内诱导I型干扰素表达和分泌的能力。
将50只Babl/C小鼠随机平均分为5组，各小组的每只小鼠分别口服1.2-1.5×109CFU的rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0119(pYA3493)活菌悬液，同时设置口服PBS对照组、口服rSC0119(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)的小鼠为空载体对照组，口服rSC0119(pS-DacA)的小鼠为重组普通载体组，口服rSC0120(pS-DacA)的小鼠为重组裂解载体组。口服菌液后1h、6h、24h分别采集各组小鼠血清，并利用间接ELISA的方法检测血清、肝脏、脾脏、肠道组织中IFN-β的浓度。结果显示：在给药6小时和12小时后，口服rSC0120(pS-DacA)的小鼠肝脏、脾脏、肠道、血清中的I型干扰素浓度均显著高于口服rSC0119(pS-DacA)的小鼠(*:p<0.05；**:p<0.01)。口服裂解空载体对照rSC0120(pYA3493)也可诱导小鼠肝脏、脾脏、肠道产生少量的I型干扰素并分泌到血清中。这可能是由于裂解载体自身释放的DNA亦可以cGAS依赖的方式痕量激活I型干扰素的表达。口服非裂解空载体rSC0119(pYA3493)的小鼠肝脏、脾脏、肠道、血清中均无法在灵敏度内检测出I型干扰素(试剂盒灵敏度为20pg/mL-5000pg/mL)。上述结果表明，rSC0120(pS-DacA)充分激活STING通路后，诱导大量的I型感染素的表达与分泌。这可能是由于rSC0120(pS-DacA)在小鼠大量合成并释放CDA，从而诱导小鼠分泌高水平的I型干扰素。
实施5
rSC0120(pS-DacA)在3D4/21cGAS-/-细胞抵抗PRV、PRRSV的感染；
参照实施2.2的方法准备重组猪霍乱沙门氏菌待进行细胞感染实验，分别设置以下实验组，感染rSC0119(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)为空载体对照组，感染rSC0119(pS-DacA)为非裂解载体组，感染rSC0120(pS-DacA)为重组裂解载体组。培养3D4/21cGAS-/-细胞消化后铺于24孔板内，每孔2.5×106个细胞。于37C,5％CO:培养箱过夜培养，第二天进行细菌感染实验；细胞在进行感染前用PBS洗2-3遍，每孔重新加入无血无抗DMEM使用0MOI、0.01MOI、0.1MOI、0.5MOI、1MOI进行细胞感染实验。感染30min后，移除上述生长培养基，每孔重新加入1.5mL含100μg/mL双抗的生长培养基，迅速放回培养箱继续培养。在上述各组沙门氏菌感染细胞24h时接入1MOlPRV(TCID50＝108.5/mL)或1MOlPRRSV(TCID50＝107.3/mL)，24h后收集细胞与细胞上清，反复冻融三次后用0.45滤器过滤并收集病毒。随后将所收集的病毒接种于PK15细胞(PRV)或Marc-145(PRRSV)细胞用于检测病毒液的TCID50。结果如图10所示：
当接种剂量为0.1MOI、0.5MOI和1MOI时，rSC0120(pS-DacA)接种组中PRV的病毒滴度显著低于rSC0119(pS-DacA)接种组(*:p<0.05；**:p<0.01)。当接种剂量为0.5MOI和1MOI时，rSC0120(pS-DacA)接种组中PRRSV的病毒滴度显著低于rSC0119(pS-DacA)接种组(*:p<0.05；**:p<0.01)。当接种剂量为1MOI时，rSC0119(pS-DacA)对PRV和PRRSV显示出轻微的抑制作用，但病毒滴度下降不显著。而rSC0119(pYA3493)与rSC0120(pYA3493)的接种均不抑制病毒的复制。值得注意的是，随着rSC0120(pS-DacA)的接种浓度逐渐升高，PRRSV、PRV病毒滴度逐渐降低。这提示，rSC0120(pS-DacA)对病毒的抑制作用与其接种剂量呈正相关。
实施6
rSC0120(pS-DacA)在Babl/C小鼠抵抗PRV的感染；
为了评价rSC0120(pS-DacA)在动物机体中的抗病毒效力，本部分利用Babl/C小鼠为动物模型，以PRV为模式病毒，进行动物保护性实验。分别设置以下实验组，口服rSC0119(pS-DacA)的重组普通载体组和口服rSC0120(pS-DacA)重组裂解载体组，以及口服rSC0119(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)空载体对照组，对各组小鼠所给药菌株的抗病毒效力进行评价。
参照实施2.1中的方法制备rSC0120(pS-DacA)、rSC0119(pS-DacA)、rSC0120(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)细菌悬液。将50只Babl/C小鼠随机平均分为5组，各小组的每只小鼠分别口服1.2-1.5×109CFU的上述细菌悬液，同时设置口服PBS对照组。口服上述菌液24h后进行攻毒，每只小鼠腹腔注射100μLPRV病毒(TCID50＝108.5/mL)，观察小鼠临床症状。
腹腔注射PRV病毒液后48h，口服PBS与空载体对照组rSC0119(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)以及普通重组载体组rSC0119(pS-DacA)的小鼠出现明显PRV感染临床症状：佝偻、震颤、狂躁、多动，并于72h后全部死亡，保护效率均为0％。而口服rSC0120(pS-DacA)未出现明显临床症状，且在30天的观察期内均未死亡，保护效率为100％(表1)。该结果表明小鼠口服给药rSC0120(pS-DacA)可以减轻或消除PRV所引起的小鼠临床病变，并使小鼠免受致死剂量PRV的攻击，而空载体rSC0119(pYA3493)、rSC0120(pYA3493)和普通载体rSC0119(pS-DacA)无法为小鼠提供针对致死剂量PRV的攻击。
表1 PRV攻毒后小鼠存活情况
Figure BDA0002988413900000111
综上所述，本发明构建携带腺苷酸环化酶的重组质粒pS-DacA，将该质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120，形成重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)。当DacA在猪霍乱沙门氏菌裂解载体中表达时，则催化ATP形成CDA。口服rSC0120(pS-DacA)后，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS-DacA)进入宿主淋巴组织，合成并释放CDA。被释放的CDA与宿主细胞中的STING蛋白相互作用，从而激活STING通路，诱导细胞或小鼠分泌高水平的I型干扰素，以抵抗PRRSV和PRV的攻击。该重组菌株具备广谱抗病毒的效力，适用于临床上PRRSV和PRV的防治，减少PRRSV和PRV对养殖业的产生的危害。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggactttt ccaatatgag tatccttcac tatttagcga atattgtaga tattttggtg 60
gtttggttcg taatttataa ggttatcatg cttatccgcg gcacgaaagc cgtccagctg 120
ttgaagggga ttttcattat tattgccgtc aagttactta gcggcttctt cggattgcag 180
acggtggaat ggattactga tcaaatgctg acttggggtt tcttagccat tatcattatc 240
tttcaaccgg aattgcgtcg tgccctggag actttggggc gtggcaatat ctttacccgc 300
tatggatcac gcattgagcg tgagcagcac caccttattg agtctattga aaagtccacg 360
caatatatgg cgaagcgtcg cattggagct ttgatctctg tggctcgtga taccggcatg 420
gacgactata tcgagactgg cattccgctt aatgcgaaaa tctcatcgca attattgatt 480
aatatcttca tccccaatac ccctcttcac gatggcgcag tgatcattaa aggtaacgag 540
atcgcgagcg ctgccagtta tctgccattg tccgactcgc cgtttctttc taaggagctg 600
ggaactcgcc atcgtgccgc attagggatt tccgaggtga ccgattcaat caccatcgtt 660
gtcagcgagg aaacgggtgg gatttccctt acgaagggag gcgaactgtt ccgtgatgta 720
tccgaagaag aattgcataa gattttgctt aaagagctgg tgactgtcac ggctaaaaaa 780
ccaagcattt tctccaaatg gaaaggaggt aagtccgagt ga 822
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgctattt tataggcg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttttaagc gccgagag 18

Claims (1)

1.一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1）、以单核李斯特杆菌NH1株的全基因序列为模板，设计合成不含“ACA”碱基序列的dacA碱基片段：ATGGACTTTTCCAATATGAGTATCCTTCACTATTTAGCGAATATTGTAGATATTTTGGTGGTTTGGTTCGTAATTTATAAGGTTATCATGCTTATCCGCGGCACGAAAGCCGTCCAGCTGTTGAAGGGGATTTTCATTATTATTGCCGTCAAGTTACTTAGCGGCTTCTTCGGATTGCAGACGGTGGAATGGATTACTGATCAAATGCTGACTTGGGGTTTCTTAGCCATTATCATTATCTTTCAACCGGAATTGCGTCGTGCCCTGGAGACTTTGGGGCGTGGCAATATCTTTACCCGCTATGGATCACGCATTGAGCGTGAGCAGCACCACCTTATTGAGTCTATTGAAAAGTCCACGCAATATATGGCGAAGCGTCGCATTGGAGCTTTGATCTCTGTGGCTCGTGATACCGGCATGGACGACTATATCGAGACTGGCATTCCGCTTAATGCGAAAATCTCATCGCAATTATTGATTAATATCTTCATCCCCAATACCCCTCTTCACGATGGCGCAGTGATCATTAAAGGTAACGAGATCGCGAGCGCTGCCAGTTATCTGCCATTGTCCGACTCGCCGTTTCTTTCTAAGGAGCTGGGAACTCGCCATCGTGCCGCATTAGGGATTTCCGAGGTGACCGATTCAATCACCATCGTTGTCAGCGAGGAAACGGGTGGGATTTCCCTTACGAAGGGAGGCGAACTGTTCCGTGATGTATCCGAAGAAGAATTGCATAAGATTTTGCTTAAAGAGCTGGTGACTGTCACGGCTAAAAAACCAAGCATTTTCTCCAAATGGAAAGGAGGTAAGTCCGAGTGA，该片段长度为822bp；
步骤2）、将dacA碱基片段与pYA3493质粒同时经EcoR I和HindⅢ双酶切，并将酶切产物经T4连接酶连接后转化rSC0002感受态细胞，形成重组表达质粒pS-DacA；
步骤3）、利用化学转化法将重组pS-DacA质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体菌株rSC0120中，构建广谱抗病毒的重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120株。
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