CN110669710B - 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗 - Google Patents

重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗 Download PDF

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Abstract

一种重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的sip基因和pgk基因的融合基因，所述融合基因是通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌的。所述融合基因具有由SEQ No.1所示的DNA序列。所述质粒载体是pNZ8148载体。所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌Lactococcus.lactis NZ9000。本发明还提供一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括上述重组乳酸乳球菌。所述重组乳酸乳球菌是利用乳酸链球菌素诱导后的重组乳酸乳球菌。所述疫苗是通过口服灌胃给药的疫苗。所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×1010cfu·mL‑1的所述重组乳酸乳球菌，给药剂量为200μL。

Description

重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
技术领域
本发明属于水生生物疾病防控的技术领域，具体涉及一种重组乳酸乳球菌和包含该重组乳酸乳球菌的罗非鱼无乳链球菌病疫苗。
背景技术
罗非鱼(Oreochromis sp.)是我国南方主要养殖鱼类之一，有食性杂、适应性广、繁殖能力强、生长速度快等优点。近年来，罗非鱼病害的爆发对罗非鱼产业造成巨大的损失，而且趋势越发严重，阻碍了罗非鱼产业的健康发展。罗非鱼病害的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，其中90％以上的临床菌株为无乳链球菌。
罗非鱼无乳链球菌病发生的主要原因有养殖水质差、养殖密度大、使用低质饲料等。该病的防治方法主要有药物、生态和免疫防治。化学药物防治是最直接、便捷方便的防控手段，但是长期使用化学药品容易产生耐药性，导致药物残留引起质量安全问题。
疫苗具有无残留、不易引起耐药性、安全高效等优点，可替代化学类药物作为罗非鱼链球菌病防控的重要途径，是罗非鱼病害防控的发展趋势。相较于其他的免疫方式，口服疫苗使用更为方便，具有不受养殖时间、地点和受体大小的限制，对鱼体无损伤等优点。
发明内容
一方面，本发明的目的在于提供一种重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的sip基因和pgk基因的融合基因，所述融合基因通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌。
优选地，所述融合基因具有SEQ No.1所示的DNA序列。
优选地，所述质粒载体是pNZ8148载体。
优选地，所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌NZ9000。
优选地，所述重组乳酸乳球菌存在乳酸菌肽的培养条件下能诱导表达分子量大小为92kDa的Sip-Pgk融合蛋白。所述重组乳酸乳球菌于2019年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2019576NZ9000 pNZ8148-sip-pgk Lactococcuslactis。
另一方面，本发明还提供一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括上述重组乳酸乳球菌。
优选地，所述重组乳酸乳球菌是在存在乳酸链球菌素的条件下诱导培养后的重组乳酸乳球菌。
优选地，所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗是通过口服灌胃给药的疫苗。
优选地，所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×1010cfu·mL-1的所述重组乳酸乳球菌，给药剂量优选为200μL。
附图说明
图1是sip和pgk扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2是sip-2和pgk-2扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是NcoI和HindIII双酶切pNZ8148后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4是重组质粒pNZ8148-sip、pNZ8148、pNZ8148-pgk、pNZ8148-sip-pgk的PCR扩增鉴定结果，其中，M：DNA分子量标准；1：pNZ8148-sip扩增产物；2：pNZ8148-sip质粒DNA对照；3、4：空白对照；5：pNZ8148扩增产物；6：pNZ8148质粒DNA；7：pNZ8148-pgk扩增产物；8：pNZ8148-pgk质粒DNA；9：pNZ8148-sip-pgk扩增产物；10：pNZ8148--sip-pgk质粒DNA。
图5是重组质粒pNZ8148-sip-pgk、pNZ8148-sip、pNZ8148、pNZ8148-pgk的HindIII酶切鉴定结果，其中，M：DNA分子量标准；1：Hind III酶切后的pNZ8148-sip-pgk；2：未酶切的pNZ8148-sip-pgk；3：Hind III酶切后的pNZ8148-sip；4：未酶切的pNZ8148-sip质粒；5：Hind III酶切后的pNZ8148；6：未酶切的pNZ8148质粒；7：未酶切的pNZ8148-pgk；8：HindIII酶切后的pNZ8148-pgk。
图6是针对诱导表达的蛋白Sip、Pgk和Sip-Pgk的Western-blot检测分析结果，其中，M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的L.lactis NZ9000pNZ8148-sip菌体破碎物，2、3：诱导后的L.lactis NZ9000pNZ8148-sip的破碎上清和沉淀；4：未诱导的L.lactisNZ9000pNZ8148-pgk菌体破碎物，5、6：诱导后的L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk的破碎上清和沉淀，7：未诱导的L.lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk菌体破碎物，8、9：诱导后的L.lactis NZ9000pNZ8148-sip-pgk破碎上清和沉淀；10：诱导后的L.lactisNZ9000pNZ8148，11：L.lactis NZ9000。
图7是示出重组乳酸乳球菌疫苗的相对免疫保护率结果的图。
具体实施方式
以下结合实施例以及附图对本发明的具体实施方式进行详细的说明。
膜表面蛋白(Surface immunogenic protein，Sip)和磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase，Pgk)是无乳链球菌中表达的重要蛋白，其中Sip在无乳链球菌定植和粘附机体细胞过程中起着至关重要的作用，Pgk是糖代谢活动的必需酶，磷酸甘油酸激酶的缺失容易引起无乳链球菌糖代谢紊乱从而使细菌无法生存。
本申请通过同源重组法将sip和pgk基因串联插入pNZ8148载体，构建了携带sip-pgk融合基因的重组质粒载体，并将该质粒载体导入到乳酸乳球菌中构建了重组乳酸乳球菌，利用含有sip-pgk融合基因的重组乳酸乳球菌制备罗非鱼无乳链球菌病疫苗。
为了更进一步地理解本申请的技术方案，现提供以下实施例。
实施例1：构建携带sip-pgk融合基因的重组质粒
从申请人所保存的无乳链球菌(WC1535)中扩增sip基因和pgk基因，以pNZ8148质粒作为载体质粒，构建携带sip-pgk融合基因的重组质粒。
扩增sip基因和pgk基因的PCR引物序列见下表1，其中目的基因引物末端添加加有6×His标签，选取pNZ8148的通用引物作为鉴定引物，所用引物合成于广州艾基生物技术有限公司，其中斜体标示的序列为pNZ8148载体质粒同源的15bp碱基序列，下划线标示的序列为6×His标签对应的碱基序列。
表1
Figure BDA0002161796530000041
将无乳链球菌WC1535在BHI培养基(购自于广州市康龙生物科技有限公司)中于37℃、180r·min-1下培养过夜。用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit提取无乳链球菌的基因组DNA。
以无乳链球菌基因组DNA为模板，PCR扩增sip、pgk、sip-2、pgk-2基因。扩增反应体系为：模板1μL，10×buffer 2μL，dNTP 0.2μL，上游下游引物各1μL，Ex taq酶0.2μL，ddH2O14.6μL。PCR扩增程序为：94℃10min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，sip、pgk、sip-2、pgk-2预期扩增片段大小分别为1353、1245、1335、1245bp，电泳检测结果如图1、2所示。用TaKaRa MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit从电泳凝胶中回收纯化PCR产物，回收产物用于后续载体构建。
用NcoI和HindIII对pNZ8148质粒进行双酶切，酶切反应体系和反应条件为：CutSmart 2μL，NcoI 0.5μL，HindIII 0.5μL，pNZ8148质粒DNA 3μL，ddH2O 14μL，37℃4h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小为3161bp的线性化质粒，如图3所示。用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit从电泳凝胶中回收纯化酶切后的线性化质粒DNA，酶切回收产物用于后续载体构建。
利用TaKaRa公司的In-Fusion试剂盒，将纯化的sip-2和pgk-2DNA片段与双酶切处理的线性化pNZ8148进行连接构建重组质粒载体pNZ8148-sip-pgk，把纯化的sip、pgk DNA片段分别与双酶切处理的线性化pNZ8148进行连接构建用作对照的质粒载体pNZ8148-sip和pNZ8148-pgk。接下来，热激法转化MC1061感受态细胞，将转化后的MC1061细胞涂布在含30ug·mL-1氯霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，对应获得MC1061pNZ8148-sip、MC1061pNZ8148-pgk和MC1061pNZ8148-sip-pgk。利用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R PCR筛选出阳性质粒(见图4)，进一步用HindIII酶切对阳性质粒进行鉴定，酶切结果如图5所示。酶切阳性的质粒进一步送样至广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。
用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit分别从MC1061pNZ8148、MC1061pNZ8148-sip、MC1061pNZ8148-pgk、MC1061pNZ8148-sip-pgk中提取pNZ8148、pNZ8148-sip、pNZ8148-pgk、pNZ8148-sip-pgk质粒DNA，分装并于-20℃保存备用，其中pNZ8148、pNZ8148-sip、pNZ8148-pgk将作为对照质粒载体用于构建对照的重组乳酸乳球菌。
实施例2：重组乳酸乳球菌的构建和融合基因表达的鉴定
首先，制备乳酸乳球菌(Lactococcus.lactis)NZ9000(L.lactis NZ9000)(购自于REBIO公司)感受态细胞。将乳酸乳球菌NZ9000单菌落于含0.5％葡萄糖的M17液体培养基(购自于广州市康龙生物科技有限公司)中、30℃静置培养6h。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+1％甘氨酸的M17液体培养基，30℃静置培养过夜。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+0.5mol·L-1蔗糖+2％甘氨酸的M17液体培养基，继续静置培养至OD600＝0.5。在4℃、5000g下将培养物离心15min之后弃上清，向菌体沉淀中加入1体积预冷溶液(0.5mol·L-1蔗糖+10％甘油)进行重悬，4℃5000g离心15min之后弃上清，向菌体沉淀中加入0.5体积的预冷溶液(0.25体积(0.5mol·L-1蔗糖+10％甘油)+0.25体积(0.05mol·L- 1Na-EDTA(pH 7.5)))进行重悬。将菌悬液冰浴15min，在4℃、5000g下离心15min之后弃上清。向菌体沉淀中加入0.01体积预冷的溶液(0.5mol·L-1蔗糖+10％甘油)并重悬，得到乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，分装并于-80℃保存备用。
实施例1中所制备的各质粒各取1000ng，与100μL上述制备的乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞混匀，转移到预冷的2mm电击杯中进行电击，电击参数设置为2kV、200Ω、25μF。将电击后的质粒与乳酸乳球菌NZ9000混合物转移到900μL预冷的复苏液(即，M17+0.5％葡萄糖+0.5mol·L-1蔗糖+0.002mol·L-1MgCl2+0.002mol·L-1CaCl2)中，先于冰上静置5min，然后30℃静置培养4h。最后将上述菌液涂布在含有终浓度为10μg·mL-1的氯霉素的M17琼脂平板上，30℃下培养36h，相应地获得重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000pNZ8148、L.lactisNZ9000pNZ8148-sip、L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk、L.lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk。重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000pNZ8148-sip-pgk于2019年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2019576 NZ9000pNZ8148-sip-pgk Lactococcuslactis。
接下来，对重组乳酸乳球菌中基因的表达进行鉴定，目的蛋白Sip、Pgk、Sip-Pgk融合蛋白的分子量理论值分别为48、44、92kDa。
将L.lactis NZ9000pNZ8148、L.lactis NZ9000pNZ8148-sip、L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk、L.lactis NZ9000pNZ8148-sip-pgk于终浓度为10μg·mL-1氯霉素的M17液体培养基30℃静置过夜培养，按1:10取过夜培养物于含有终浓度为10μg·mL-1氯霉素的M17液体培养基培养至OD600＝0.5，加入乳酸菌肽(nisin，购自于广州市康龙生物科技有限公司)至终浓度为10ng·mL-1，30℃下诱导培养4h。然后将诱导后的培养物在4℃、5000g下离心15min，弃上清，用等体积的PBS洗菌体沉淀两次，通过超声波对菌体沉淀进行破碎。超声波破碎条件为：200W，每次工作时间2s，每次间隔5s，共20min。利用CapturemTMHis-TaggedPurification Miniprep Kit分别纯化Sip、Pgk和Sip-Pgk融合蛋白，采用BCA测定纯化的蛋白浓度。
蛋白样品经处理后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白带从凝胶转移至醋酸纤维素膜上进行进一步的Western-blot检测。Western-blot检测所用的一抗是Anti-6×His
Figure BDA0002161796530000061
抗体(HRP)(货号是ab1187，购自于广州勤卓生物科技有限公司)(稀释浓度为1:3000)，二抗是辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(购自于广州勤卓生物科技有限公司)(稀释浓度为1:5000)。
Western blot检测结果表明，在预期位置出现明显的免疫印迹，如图6所示，说明重组菌L.lactis NZ9000pNZ8148-sip、L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk、L.lactisNZ9000pNZ8148-sip-pgk分别表达了目的蛋白Sip、Pgk、Sip-Pgk蛋白。纯化后的Sip、Pgk和Sip-Pgk融合蛋白的蛋白浓度分别为8.77、11.54、14.21mg·mL-1。
实施例3：重组乳酸乳球菌的免疫保护效果
从广东省罗非鱼良种场选取420尾健康罗非鱼，体长为8±1cm，体重为14±1g。
将这些罗非鱼随机分为12组，每组35尾，暂养稳定后进行免疫实验。把12组分成2个大组，6组为在首次免疫7天后进行第二次免疫，即二次免疫(第14天)，其余6组为在二次免疫(14天)的基础上7天后进行第三次免疫即三次免疫(第21天)，免疫方式为隔周免疫。
6个实验组分别为L.lactis NZ9000pNZ8148-sip-pgk(Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌疫苗)、L.lactis NZ9000pNZ8148-sip(Sip蛋白乳酸菌疫苗对照)、L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk(Pgk蛋白乳酸菌疫苗对照)、L.lactis NZ9000pNZ8148对照、L.lactis NZ9000对照和PBS对照。收集的菌体用PBS缓冲液稀释成2×1010cfu·mL-1的菌液，每次灌胃剂量为200μL，各个对照组灌胃等体积的相应菌液或溶液。
免疫结束后分别从每组中随机选取罗非鱼尾静脉采血，将血样在4℃下静置过夜后分离血清。采用ELISA测定血清中的IgM抗体水平：1:50稀释罗非鱼血清，无乳链球菌WC1535作为固定抗原；抗体是申请人自行制备和保存的HRP标记的兔抗尼罗罗非鱼IgM抗体(1:3000稀释)，使用酶标仪测定OD450的值。血清抗体效价表示为平均值±标准差(Mean±SD)，运用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，分析各实验组的相对免疫保护率及其抗体水平之间差异的显著性。结果见表2，与对照组相比，重组乳酸乳球菌疫苗二次免疫(14天)和三次免疫(21天)均能显著提高血清特异性抗体的水平，而且三次免疫(21天)的抗体水平显著高于二次免疫(14天)(P<0.05)。含有sip-pgk融合基因的重组乳酸乳球菌二次免疫(14天)和三次免疫(21天)所产生的抗体水平显著高于单独含有sip基因或pgk基因的重组乳酸乳球菌所产生的抗体水平(P<0.05)。
表2
Figure BDA0002161796530000071
Figure BDA0002161796530000081
*代表相同免疫时间各组与PBS对照组之间存在显著性差异(P＜0.05)；**代表相同免疫时间各组与PBS对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)。
免疫结束后第18天采用在血平板培养基上于28℃下培养的无乳链球菌WC1535进行人工感染实验，所用的细菌浓度为3×108cfu·mL-1。对各组实验鱼进行腹腔注射攻毒，每尾的注射量为100μL，水温为(28±2)℃，连续14天对各组鱼的死亡情况进行统计。取濒死鱼的脑、脾脏、肝脏和肾脏组织并从中分离培养无乳链球菌，来检查和判断死亡鱼的症状是否为无乳链球菌感染所致。
按照以下公式计算各试验组的相对免疫保护率：RPS(％)＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。结果如图7所示，结果显示免疫组中三次免疫(21天)的相对免疫保护率高于二次免疫(14天)，也就是说，三次免疫(21天)的免疫效果更好。在与仅含有sip或pgk基因的重组乳酸乳球菌相比，三次免疫(21d)含有sip-pgk融合基因的重组乳酸乳球菌的相对免疫保护率最高，为45.46％，显著高于仅含有sip或pgk基因的重组乳酸乳球菌的相对免疫保护率存在显著性差异(P<0.05)，与L.lactis NZ9000pNZ8148和L.lactis NZ9000的相对免疫保护率存在极显著性差异(P<0.01)。
在本申请中，根据线性化载体两端的序列，设计PCR上下游引物时在引物的5’端加上与线性化载体两末端同源的15bp碱基序列，即可与线性化载体两端的序列进行定向交换，从而使目的基因精确地连接到目的载体，还可以一次连接多段目的片段，相较于传统的克隆方法更有效地避免假阳性的出现，大大提高实验效率，节省时间。
本发明所提供的含有sip-pgk融合基因的重组乳酸乳球菌以及相应的疫苗是借助乳酸乳球菌NZ9000和乳酸菌表达载体pNZ8148而构建和制备的，乳酸乳球菌对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物，载体pNZ8148的诱导物nisin是一种生物安全肽，对人体无毒副作用，进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失活，不会影响肠道的菌群平衡。因此，本发明重组乳酸乳球菌以及基于该重组乳酸乳球菌制备的无乳链球菌疫苗，无论对于罗非鱼还是罗非鱼的消费者——人类来说都是安全的。
与仅含有sip基因或pgk基因的重组乳酸乳球菌相比，基于含有sip-pgk融合基因的重组乳酸乳球菌制备的疫苗能更显著地提高血清抗体水平，对罗非鱼的免疫保护效果优异，尤其是经三次口服灌胃免疫后的保护效果更优。这种口服疫苗更适用于罗非鱼养殖实践应用，可降低疫苗免疫的工作量，提高养殖户使用疫苗的便利程度。
以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗
<130> 461873
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2514
<212> DNA
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 1
atgaaaatga ataaaaaggt actattgaca tcgacaatgg cagcttcgct attatcagtc 60
gcaagtgttc aagcacaaga aacagatacg acgtggacag cacgtactgt ttcagaggta 120
aaggctgatt tggtaaagca agacaataaa tcatcatata ctgtgaaata tggtgataca 180
ctaagcgtta tttcagaagc aatgtcaatt gatatgaatg tcttagcaaa aataaataac 240
attgcagata tcaatcttat ttatcctgag acaacactga cagtaactta cgatcagaag 300
agtcatactg ccacttcaat gaaaatagaa acaccagcaa caaatgctgc tggtcaaaca 360
acagctactg tggatttgaa aaccaatcaa gtttctgttg cagaccaaaa agtttctctc 420
aatacaattt cggaaggtat gacaccagaa gcagcaacaa cgattgtttc gccaatgaag 480
acatattctt ctgcgccagc tttgaaatca aaagaagtat tagcacaaga gcaagctgtt 540
agtcaagcag cagctaatga acaggtatca ccagctcctg tgaagtcgat tacttcagaa 600
gttccagcag ctaaagagga agttaaacca actcagacgt cagtcagtca gtcaacaaca 660
gtatcaccag cttctgttgc cgctgaaaca ccagctccag tagctaaagt agcaccggta 720
agaactgtag cagcccctag agtggcaagt gttaaagtag tcactcctaa agtagaaact 780
ggtgcatcac cagagcatgt atcagctcca gcagttcctg tgactacgac ttcaccagct 840
acagacagta agttacaagc gactgaagtt aagagcgttc cggtagcaca aaaagctcca 900
acagcaacac cggtagcaca accagcttca acaacaaatg cagtagctgc acatcctgaa 960
aatgcagggc tccaacctca tgttgcagct tataaagaaa aagtagcgtc aacttatgga 1020
gttaatgaat tcagtacata ccgtgcggga gatccaggtg atcatggtaa aggtttagca 1080
gttgacttta ttgtaggtac taatcaagca cttggtaata aagttgcaca gtactctaca 1140
caaaatatgg cagcaaataa catttcatat gttatctggc aacaaaagtt ttactcaaat 1200
acaaacagta tttatggacc tgctaatact tggaatgcaa tgccagatcg tggtggcgtt 1260
actgccaacc actatgacca cgttcacgta tcatttaaca aagctaaatt gactgttaaa 1320
gacgttgatt tgaaaggtaa aaaagtcctc gttcgtgttg actttaatgt gcctttgaaa 1380
gacggcgtta tcactaacga caaccgtatc actgcggctc ttccaacaat caagtatatc 1440
atcgaacaag gtggtcgtgc tatcctcttc tctcaccttg gacgtgttaa agaagaagct 1500
gacaaagaag gaaaatcact tgcaccggta gctgctgatt tagctgctaa acttggtcaa 1560
gatgttgtat tcccaggtgt tactcgtggt gcaaaattag aagaagcaat caatgctttg 1620
gaagatggac aagttctttt ggttgaaaac actcgttttg aagatgttga cggtaagaaa 1680
gaatctaaga atgacgaaga acttggtaaa tactgggctt cacttggaga tggaatcttc 1740
gttaacgatg catttggtac agcacaccgt gctcatgcat caaacgtagg tatttcagca 1800
aacgttgaaa aagctgtagc tggtttcctt cttgaaaacg aaattgctta catccaagaa 1860
gcagttgaaa ctccagaacg cccattcgta gctattcttg gtggctcaaa agtttctgat 1920
aagattggtg ttatcgaaaa ccttcttgaa aaagctgata aagttcttat cggtggtggt 1980
atgacttaca cattctacaa agctcaaggt atcgaaatcg gtaactcact tgtagaagaa 2040
gacaaattgg atgttgctaa agacctcctt gaaaaatcaa acggtaaatt gatcttgcca 2100
gttgactcaa aagaagcaaa cgcatttgct ggttatactg aagttcgcga cactgaaggt 2160
gaagcagttt cagaagggtt ccttggtctt gacatcggtc ctaaatcaat cgctaaattt 2220
gatgaagcac ttactggtgc taaaacagtt gtatggaacg gacctatggg tgtctttgaa 2280
aaccctgact tccaagctgg tacaatcggt gtaatggacg ctatcgttaa acaaccaggc 2340
gttaaatcaa tcatcggtgg tggtgattca gcagcagctg ctatcaacct tggccgtgct 2400
gacaaattct catggatctc tactggtggt ggagcaagca tggaattgct cgaaggtaaa 2460
gtattaccag gtttggcagc attgactgaa aaacatcatc accatcacca ttaa 2514

Claims (6)

1.一种重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的sip基因和pgk基因的融合基因，所述融合基因通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌NZ9000，从而构建得到所述重组乳酸乳球菌，所述融合基因的序列是SEQ No.1所示的DNA序列，所述质粒载体是pNZ8148载体。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：
其保藏编号是CCTCC M 2019576。
3.一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括权利要求1或2所述的重组乳酸乳球菌。
4.根据权利要求3所述的罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其特征在于：
所述重组乳酸乳球菌是在存在乳酸链球菌素的条件下诱导培养后的重组乳酸乳球菌。
5.根据权利要求3或4所述的罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其特征在于：所述疫苗是通过口服灌胃给药的疫苗。
6.根据权利要求5所述的罗非鱼无乳链球菌疫苗，其特征在于：所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×1010 cfu·mL-1的所述重组乳酸乳球菌。
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