CN116334102B - 一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用 - Google Patents
一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用。本发明对鰤诺卡氏菌HP抗原序列进行了优化，并加入usp45TM8短肽，通过乳酸乳球菌PNZ8148表达载体高效表达鰤诺卡氏菌HP蛋白，制备Lactococcus lactis NZ9000pNZ8148‑HP作为加州鲈口服疫苗，具有高效的防治鰤诺卡氏菌病的免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用。
背景技术
鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是隶属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)诺卡氏菌属(Nocardia)，为革兰氏阳性、兼性细胞内病原菌。该菌可引起以皮肤溃疡、出血和内脏器官形成结节为特征的在内的多种鱼类慢性肉芽肿疾病。大口黑鲈诺卡氏菌病的潜伏期长、发病率高、症状变化缓慢，无特效的可治疗药物，导致患病鲈鱼出现大量死亡，给加州鲈养殖业造成了巨大的经济损失。
大口黑鲈(Micropterus Salmoides)，又名加州鲈，是重要的淡水养殖品种，有生长速度快且对环境适应强等优点。近年来，随着养殖规模不断增加，加州鲈病害问题日益严重，特别是诺卡氏菌类疾病，导致加州鲈大规模爆发性死亡，造成巨大的经济损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大口黑鲈鰤诺卡氏菌融合蛋白，开发一种安全有效的大口黑鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗，为大口黑鲈的健康养殖提供保障。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料，所述相关生物材料为下述任一种：
(A1)含有所述抗原基因的表达盒；
(A2)含有所述抗原基因的重组载体；
(A3)含有(A1)所述表达盒的重组载体；
(A4)含有所述抗原基因的重组细胞；
(A5)含有(A1)所述表达盒的重组细胞；
(A6)含有(A2)所述重组载体的重组细胞；
(A7)含有(A3)所述重组载体的重组细胞。
本发明的第三方面，提供一种融合基因，所述融合基因包括本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因和usp45TM8基因。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因还包括连接序列和/或标签序列。
在本发明的一些实施方式中，所述连接序列如SEQ ID NO.5所示；所述标签序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第四方面，提供本发明第三方面所述融合基因的相关生物材料，其特征在于，所述相关生物材料为下述任一种：
(B1)含有所述融合基因的表达盒；
(B2)含有所述融合基因的重组载体；
(B3)含有(B1)所述表达盒的重组载体；
(B4)含有所述融合基因的重组细胞；
(B5)含有(B1)所述表达盒的重组细胞；
(B6)含有(B2)所述重组载体的重组细胞；
(B7)含有(B3)所述重组载体的重组细胞。
本发明的一些实施方式中，所述重组细胞为重组乳酸乳球菌。
本发明的一些实施方式中，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000pNZ8148-HP，已于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021447。
本发明的第五方面，提供本发明第三方面所述的融合基因所编码的融合蛋白。
本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或本发明第二方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或本发明第三方面所述的融合基因或本发明第四方面所述的融合基因的相关生物材料或本发明第五方面所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗大口黑鲈鰤诺卡氏菌引起的疾病的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述大口黑鲈鰤诺卡氏菌引起的疾病包括：鱼类慢性肉芽肿疾病。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物，优选为疫苗。
在本发明的一些实施方式中，所述疫苗为口服疫苗。
本发明的第七方面，提供一种产品，所述产品中包含本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或本发明第二方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或本发明第三方面所述的融合基因或本发明第四方面所述的融合基因的相关生物材料或本发明第五方面所述的融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括佐剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物，优选为疫苗。
在本发明的一些实施方式中，所述疫苗为口服疫苗。
本发明的有益效果是：
申请人发现大口黑鲈鰤诺卡氏菌的低氧反应蛋白(hypoxic response protein,HP)是大口黑鲈鰤诺卡氏菌毒力的关键蛋白之一，也是开发大口黑鲈鰤诺卡氏菌疫苗的关键抗原蛋白。本发明对鰤诺卡氏菌HP抗原序列进行了优化在此基础上，将该序列与分子大小为78bp的usp45TM8短肽基因进行融合，通过乳酸乳球菌PNZ8148表达载体高效表达鰤诺卡氏菌HP蛋白，制备L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45TM8-HP作为加州鲈口服疫苗(武汉大学保藏中心保藏号：M 2021447)，并添加口服佐剂，通过饲料投喂免疫加州鲈鱼，并使用诺卡氏菌进行感染评价加州鲈疫苗的免疫保护效果，同时检测血液中抗体滴度的变化情况，以及荧光定量测定IgM抗体的变化情况，发现其可以高效用于诺卡氏菌的防治。
本发明的大口黑鲈鰤诺卡氏菌乳酸菌口服疫苗，使用了乳酸菌作为载体表达，与其它微生物载体表达的口服疫苗，具有以下明显的优势：第一，本研究中使用的乳酸菌表达载体是食品级的安全微生物，不存在其它弱毒疫苗、减毒活疫苗等隐藏的毒力返强的危险，也不存在其它类似芽孢杆菌表达系统中，芽孢杆菌对鱼体和人体的潜在危害。第二，本研究中外源蛋白在乳酸菌中表达后无需分离纯化，能降低疫苗生产的成本，比大肠杆菌等表达后需要纯化的疫苗成本低。第三，乳酸菌已证实在黏膜免疫中发挥免疫增强效应，能增强疫苗的免疫效果。第四，本研究中加州鲈口服疫苗非常适合于加州鲈鱼苗的养殖实践应用，因为鱼苗尺寸太小，难以进行疫苗注射免疫。第五，与加州鲈注射免疫相比，本研究中加州鲈口服疫苗能够极大地减少疫苗免疫的工作量和劳动力成本，提高养殖户使用疫苗的便利程度，而且也能减少鱼体应激和注射部位的不良反应。第六，与加州鲈浸泡免疫相比，浸泡免疫这种方式需要加强免疫，但是在养殖过程中很难把全部鱼从池塘中捞起来再次浸泡免疫(捞网会增加鱼的应激导致死亡)，而本研究中口服疫苗可以每天和佐剂、饲料一起搅拌后投喂加州鲈鱼，不需要全部鱼捞网，且多次投喂增强免疫，与浸泡免疫相比，具有较好的免疫效果和操作实用性。第七，为避免为胃的酸性环境等破坏，减少肠道中疫苗剂量和免疫原性，本发明使用了与Essai GR 01PR佐剂进行乳化从而包裹保护住口服疫苗的方法，使应用更加方便，可长期保存，也可现配现用。
相较于注射免疫的免疫方式，口服疫苗免疫使用更为方便，具有不受养殖时间、地点和免疫鱼的大小的限制，对鱼体无损伤、避免产生应激等优点，而且特别适合大口黑鲈这种鱼类使用。乳酸菌是人、动物和鱼的肠道微生物组成成分，为普遍公认的安全菌株，应用于食品工业中，作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。
本发明以人和动物无致病性且被公认为安全的食品级微生物——乳酸乳球菌作为宿主菌，基于该重组乳酸乳球菌制备的大口黑鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗，无论对于加州鲈还是加州鲈的消费者——人类来说都是安全的。而且，基于该重组乳酸乳球菌制备的口服疫苗制备过程简单，仅需经过简单的菌培养和菌体分离、重悬操作即可得到有效的口服疫苗，通过添加口服佐剂并通过饲料投喂免疫加州鲈，这非常适合于加州鲈鱼苗和成鱼的养殖实践应用，能够极大地减少疫苗免疫的工作量，提高养殖户使用疫苗的便利程度。
附图说明
图1为密码子优化后的序列与原序列对比。
图2为pNZ8148NcoI和HindIII双酶切电泳结果。
图3为重组质粒pNZ8148-usp45TM8-HP PCR扩增鉴定；
M.DNA maker；1、重组质粒pNZ8148-usp45TM8-hp；2.重组质粒pNZ8148-usp45TM8-HP；3.pNZ8148-HP；4.空白对照；5.阴性对照。
图4为重组质粒pNZ8148-usp45TM8-HP的HindIII酶切鉴定；
M.DNA maker；1、pNZ8148-usp45TM8-hp质粒经HindIII酶切；2.pNZ8148-USP45TM8-HP质粒经HindIII酶切；3.pNZ8148-HP质粒经HindIII酶切；4.pNZ8148质粒经HindIII酶切。
图5为诱导表达蛋白usp45TM8-HP Western blot的检测分析。诱导表达蛋白usp45TM8-HP Western blot的检测分析；
1.诱导的L.lactis NZ9000 pNZ8148；2.诱导的L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45TM8-HP；3.诱导的L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45TM8-hp。
图6为重组乳酸乳球菌口服疫苗免疫的相对免疫保护率。
图7为加州鲈血清ELISA抗体检测结果。
图8为加州鲈肾实时PCR IgM基因分析结果。
图9为加州鲈脾实时PCR IgM基因分析结果。
图10为加州鲈前肠实时PCR IgM基因分析结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
试剂与材料：
健康加州鲈(体长20±3cm，体重20±1g)，来自广东省水产良种场。
加州鲈鰤诺卡氏菌、pNZ8148质粒、HP标记的羊抗鼠抗体、鼠抗草鱼IgM抗体均为实验室保存。
L.lactis NZ9000，大肠杆菌MC1061感受态购买于REBIO。
TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit，TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit，TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit，In-Fusion试剂盒，Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TBPremix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)，PCR相关实验耗材购买于takara公司。
MagPure Universal RNA KF Kit购买于Magen公司。Anti-6×His抗体(HP)(ab1187)、辣根过氧化物酶(HP)标记的羊抗鼠抗体、TMB显色液等Western blot相关耗材购买于广州勤卓生物科技有限公司。BHI培养基、M17培养基、nisin、氯霉素购买于广州市康龙生物科技有限公司。
实施例1
1、乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞的制备
将L.lactis NZ9000划线在含0.5％葡萄糖的M17琼脂培养基上，30℃静置培养过夜。挑取活化过的乳酸乳球菌单菌落于含0.5％葡萄糖的M17液体培养基，30℃静置培养6h。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+1％甘氨酸的M17液体培养基，30℃静置培养过夜。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+0.5M蔗糖+2％甘氨酸的M17液体培养基，继续静置培养至OD 600＝0.5，4℃5000g离心15min弃上清。加入1体积预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬，4℃5000g离心15min弃上清。加入0.5体积预冷溶液(0.25体积0.5M蔗糖+10％和0.25体积50mM Na-EDTA(pH 7.5))重悬，冰浴15min，4℃5000g离心15min弃上清。加入0.01体积预冷溶液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬，分装-80℃保存备用。
2、重组表达载体的构建与鉴定
通过密码子优化加州鲈诺卡氏菌表面蛋白(HP)(GenBank:GEM25769.1)抗原基因，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示：
ACGACAGCACGCGACGTGATGCATGCTGGCGTAGAAACAATTACTGATACAGAAACTTTAGCACAAGCAGCCCGCAGAATGAGAGATTTAGATGTGGGGGCCCTTCCAGTTTGTGATTCACAAGATCGTCCAATTGGTATTTTAACTGACCGTGATATTATTGTTCGTTGTATTGCTGCTGAGCAGGACCCGGCTGGTGTTACTGCTGGAGCGCTTGCTCAAGGAGGCCTAGTAACCGTCGGTCCTGATAGAGACATTGATGATGTTCTTGCAATTATGCGTCGTTCTCGTATAAGACGGTTGCCTGTTCTCGAAGATGGACGTTTGGTCGGAATTATCACTGAAGGTGATATTGCTCGACGAATGCCAGAACAAACAGTTGGTGAATTTGTTGAAGGAGTATGCGCACCTTGGACA。
优化后的序列与原序列的序列对比结果图如图1所示，其中，第一个序列为优化的序列，第二个序列为原序列。在优化后的目的基因前端加上usp45TM8短肽形成融合蛋白，usp45TM8短肽的核苷酸序列为：ATGAAAAAAAAGGTGCTGAAGGCTCATTTAGCTGTGGTTGTGATGCTTACGACGGCAGCCCCGATTTCCAATGTTAAGGCC(SEQ IN NO.4)；融合蛋白中还包含连接序列和标签序列，其中连接序列为glycine linker：GGTGGCGGTGGCAGC(SEQ IN NO.5)，标签序列为histag：CATCATCACCATCACCAT(SEQ IN NO.6)；
融合蛋白的核苷酸序列为：ATGAAAAAAAAGGTGCTGAAGGCTCATTTAGCTGTGGTTGTGATGCTTACGACGGCAGCCCCGATTTCCAATGTTAAGGCC GGTGGCGGTGGCAGC ACGACAGCACGCGACGTGATGCATGCTGGCGTAGAAACAATTACTGATACAGAAACTTTAGCACAAGCAGCCCGCAGAATGAGAGATTTAGATGTGGGGGCCCTTCCAGTTTGTGATTCACAAGATCGTCCAATTGGTATTTTAACTGACCGTGATATTATTGTTCGTTGTATTGCTGCTGAGCAGGACCCGGCTGGTGTTACTGCTGGAGCGCTTGCTCAAGGAGGCCTAGTAACCGTCGGTCCTGATAGAGACATTGATGATGTTCTTGCAATTATGCGTCGTTCTCGTATAAGACGGTTGCCTGTTCTCGAAGATGGACGTTTGGTCGGAATTATCACTGAAGGTGATATTGCTCGACGAATGCCAGAACAAACAGTTGGTGAATTTGTTGAAGGAGTATGCGCACCTTGGACA CATCATCACCATCACCAT TAA(SEQ IN NO.2)；
氨基酸序列如SEQ IN NO.3所示：
(下划线为usp45TM8短肽；加粗为glycine linker；双下划线为HP蛋白；斜体为his tag)；
其中是为了方便蛋白检测分析在末端加上6×His标签，根据同源重组法原则添加pNZ8148载体的同源序列，合成usp45TM8-HP序列。pNZ8148质粒在30ug·mL-1氯霉素的LB液体培养基中37℃，180r·min-1过夜扩大培养，TaKaRa MiniBEST Plasmid PurificationKit提取pNZ8148质粒，NcoI和HindIII进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，从图中可以看出，pNZ8148质粒进行NcoI和HindIII双酶切，获得大小为3161bp的线性化质粒。
TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit纯化胶回收目的条带，酶切回收产物用于后续载体构建。
利用TaKaRa公司In-Fusion试剂盒，把usp45TM8-HP片段连接双酶切处理的pNZ8148，50℃反应组装15min，热激法转化MC1061感受态细胞。涂布在含30ug·mL-1氯霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，获得MC1061 pNZ8148-usp45TM8-HP。利用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R PCR鉴定，HindIII酶切阳性质粒，并送样至广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。
引物鉴定结果如图3和4所示，利用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R鉴定重组质粒，pNZ8148、HP序列未优化的pNZ8148-usp45TM8-hp、pNZ8148-usp45TM8-HP PCR预期扩增目的片段分别为281、778bp、778bp，与PCR结果大小一致，如图3所示。阳性克隆质粒pNZ8148、NZ8148-usp45TM8-hp、pNZ8148-usp45TM8-HP经HindIII酶切，其对应的线性化片段大小分别为3165、3664、3664bp，如图4所示。重组质粒测序结果与预测序列一致，成功构建了乳酸菌表达质粒pNZ8148-usp45TM8-HP。
实验所用引物合成于广州艾基生物技术有限公司，引物序列见表1。
表1引物信息
从MC1061 pNZ8148-usp45TM8-HP提取质粒pNZ8148-usp45TM8-HP。取1000ng质粒与100uL乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞混匀，加入预冷的2mm电击杯中，电击参数设置为2kV、200Ω、25uF，加入至900uL预冷的复苏液(M17+0.5％葡萄糖+0.5M蔗糖+20mm MgCl2+2mm CaCl2)中于冰上静止5min，30℃静置培养4h。最终涂布在终浓度为10ug·mL-1氯霉素的M17琼脂平板上，30℃培养36h，获得L.lactis NZ9000pNZ8148-usp45TM8-HP。阳性克隆在终浓度为10ug·mL-1氯霉素的M17液体培养基扩培后提取质粒，PCR扩增鉴定。
制备得到L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45TM8-HP已于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2021447；分类命名为：Lactococcuslactis NZ9000 pNZ8148-HP，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
3、重组乳酸乳球菌蛋白的表达和Western blot分析
将L.lactis NZ9000 pNZ8148-usp45TM8-HP于终浓度为10ug·mL-1氯霉素的M17液体培养基30℃静置过夜培养，按1:10取过夜培养物于终浓度为10ug·mL-1氯霉素的M17液体培养基培养至OD600＝0.5，加入总浓度为10ng·mL-1的nisin 30℃诱导培养4h，4℃5000g离心15min弃上清，等体积的PBS洗菌体两次，用超声波破碎(200W，每次工作时间2s，每次间隔5s，共20min)。
蛋白样品经处理后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白带从凝胶转移至醋酸纤维素膜上。一抗是Anti-6×His抗体(HP)(稀释浓度为1:3000)，二抗是含带HP标记的羊抗兔IgG(稀释浓度为1:5000)，将膜浸入新配制的显色溶液中，当条带或斑点出现后，终止反应，拍照保存。
结果见图5，从图5可以看出，重组表达载体的目的蛋白usp45TM8-HP的分子量理论值为19.36kDa。Western blot检测结果表明，在预期位置出现明显的免疫印迹，结果图5所示，说明重组pNZ8148-usp45TM8-HP和HP序列未进行优化的pNZ8148-usp45TM8-hp菌株都表达了加州鲈诺卡氏菌HP蛋白，可以看出经过优化密码子的蛋白表达量明显优于未经过优化密码子的蛋白表达量。
4、重组乳酸乳球菌口服免疫
收集的诱导表达的菌体用PBS稀释成2×1010cfu·mL-1的菌液，与Essai GR 01PR佐剂以重量比3:7混合乳化，乳化混合物与饲料以重量比1:4混合制备成口服疫苗。
试验例
将准备的306尾加州鲈随机分为4组，其中三组为81尾(免疫组)，一组63尾(作为空白对照)，暂养稳定后进行免疫实验。4个分组情况为：pNZ8148-usp45TM8-HP+Essai GR01PR+饲料(T1)、PNZ8148+Essai GR 01PR+饲料(T2)、Essai GR 01PR+饲料(T3)、饲料(空白)，连续免疫7天，免疫组每天50g喂养，免疫方式为隔周免疫，免疫三次。
1、重组菌口服免疫免疫保护效果评价
免疫结束后第28d对各组加州鲈进行腹腔注射诺卡氏菌攻毒，浓度为3×105cfu·mL-1，每尾的注射量为200μL，水温为(28±2)℃，连续统计各组鱼死亡情况。按照以下公式计算各组相对免疫保护率：RPS(％)＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
结果见图6。pNZ8148-usp45TM8-HP+Essai GR 01PR免疫组的相对免疫保护率为41.18％，与PNZ8148+Essai GR 01PR和Essai GR 01PR的相对免疫保护率存在极显著性差异(P<0.01)。
2、重组菌口服免疫加州鲈血清IgM抗体检测
免疫结束后的5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d每组随机选取三条加州鲈尾静脉采血，静置4℃过夜分离血清。采用ELISA测定血清IgM抗体水平：1:100稀释加州鲈血清，HP蛋白作为固定抗原；抗体是鼠抗草鱼IgM抗体(1:10000稀释)、HP标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)，使用酶标仪测定OD450的值。
应用ELISA检测加州鲈血清，酶标仪检测记录各反应孔的OD450值。见图7，结果显示，免疫之后加州鲈的血清特异抗体水平逐渐升高，与对照组相比能显著提高血清特异性抗体水平，与空白组抗体水平存在极显著性差异(P<0.01)。
3、重组菌口服免疫加州鲈肾脏IgM基因表达的检测
免疫结束后的5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d每组随机选取三条加州鲈采取肾、脾、前肠提取RNA检测IgM基因表达量，MagPure Universal RNA KF Kit提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录。以18S为内参基因，TBPremixEx TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行实时PCR。采用2-△△Ct方法，SPSS软件进行数据统计分析IgM基因与18S的相对表达量，引物见表1。
分别在免疫之后的5d、10d、15d、20d、25d、30d、35d采集加州鲈肾、脾、前肠实时PCR检测IgM基因。结果表明：HP抗原免疫后，鲈的肾、脾、前肠中IgM含量逐步提高，30d达到最高水平，与对照组比较差异极显著(P<0.01)，见图8、图9、图10。
本发明使用乳酸菌L.lactis NZ9000作为表达宿主，pNZ8148作为表达载体。乳酸菌现在已经广泛应用在食品、药物加工中，是安全级微生物。pNZ8148载体是乳酸菌表达载体，具有最有效的食品诱导表达系统乳链菌肽诱导的基因表达系统(Nisin-ControlldExpression System，NICE)。NICE系统有高效表达细菌、病毒抗原和一些毒性蛋白的能力，同时更具有安全性高、价格成本低、通用性等的优点。NICE系统表达诱导物nisin，是一种生物安全肽，对人体无毒副作用，因为进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失活，所以不会影响肠道的菌群平衡，是可作为天然安全的保鲜剂应用在食品工业中，以上使得乳酸菌能够作为食用性疫苗的传递载体。nisin对革兰氏阳性菌有一定抑制作用，高浓度使用可能会伤害宿主菌而导致蛋白表达量下降，通常使用亚致死剂量诱导NlCE系统中目标蛋白的表达。在大多数的乳酸菌表达载体的研究中，常用的nisin诱导表达浓度为10ng/mL，诱导表达时间为4～5h，诱导表达条件与表达宿主菌株、表达载体和表达的目的蛋白等等有关，本实验使用的nisin浓度是10ng/mL，诱导时间为4h，通过western-blot结果分析，具有较好的表达效果。
常见鱼类的免疫方法有浸泡、注射和口服等多种方法，其中注射免疫的方式的效果最佳，相对保护率能达到60％以上，但操作不方便，且应激等原因造成无法普遍应用各种养殖鱼类。本发明中，大口黑鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗的结果表明：口服疫苗与佐剂和饲料同时免疫之后，免疫之后加州鲈的血清特异抗体水平逐渐升高，与对照组相比能显著提高血清特异性抗体水平，与空白组抗体水平存在极显著性差异，此外IgM基因实时PCR结果表明，口服疫苗免疫后，加州鲈的肾、脾、前肠中IgM含量逐步提高，30d达到最高水平，与对照组比较差异极显著。根据免疫过后各种加州鲈鱼的存活情况计算相对免疫保护率，鰤诺卡氏菌乳酸菌载体口服疫苗加佐剂组的相对免疫保护率为41.18％，与无抗原表达的空载体加佐剂组合单纯佐剂组的相对免疫保护率存在极显著性差异，这与血清抗体水平结果一致。
本研究对鰤诺卡氏菌HP抗原序列进行了优化，并加入分子大小为78bp的usp45TM8短肽，通过乳酸乳球菌PNZ8148表达载体高效表达鰤诺卡氏菌HP蛋白，制备加州鲈口服疫苗，通过佐剂与饲料，投喂加州鲈鱼，口服免疫检测免疫效果。从结果来看，鰤诺卡氏菌口服疫苗的免疫效果明显高于对照组，本研究为加州鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗的研究提供了新的思路。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料，所述相关生物材料为下述任一种：
(A1)含有所述抗原基因的表达盒；
(A2)含有所述抗原基因的重组载体；
(A3)含有(A1)所述表达盒的重组载体；
(A4)含有所述抗原基因的重组细胞；
(A5)含有(A1)所述表达盒的重组细胞；
(A6)含有(A2)所述重组载体的重组细胞；
(A7)含有(A3)所述重组载体的重组细胞。
3.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因包括权利要求1所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因和usp45TM8基因。
4.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求3～4任一项所述融合基因的相关生物材料，其特征在于，所述相关生物材料为下述任一种：
(B1)含有所述融合基因的表达盒；
(B2)含有所述融合基因的重组载体；
(B3)含有(B1)所述表达盒的重组载体；
(B4)含有所述融合基因的重组细胞；
(B5)含有(B1)所述表达盒的重组细胞；
(B6)含有(B2)所述重组载体的重组细胞；
(B7)含有(B3)所述重组载体的重组细胞。
6.根据权利要求5所述的相关生物材料，其特征在于，所述重组细胞为重组乳酸乳球菌。
7.根据权利要求6所述的相关生物材料，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148-HP，保藏编号为CCTCC NO：M 2021447。
8.权利要求3～4任一项所述的融合基因所编码的融合蛋白。
9.权利要求1所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或权利要求2所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或权利要求3～4任一项所述的融合基因或权利要求5～7任一项所述的融合基因的相关生物材料或权利要求8所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗大口黑鲈鰤诺卡氏菌引起的疾病的产品中的应用。
10.一种产品，其特征在于，所述产品中包含权利要求1所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或权利要求2所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或权利要求3～4任一项所述的融合基因或权利要求5～7任一项所述的融合基因的相关生物材料或权利要求8所述的融合蛋白。
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