CN109303916B - 焦亡相关蛋白gsdmd在制备菌蜕疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用。本发明构建了含有焦亡相关蛋白GSDMD编码基因的溶菌质粒，将其转入肠炎沙门氏菌中，在阿拉伯糖诱导下使细菌裂解，成功获得了沙门氏菌新型菌蜕疫苗。实验证明，GSDMD介导的溶菌具有极长的持续期，裂解率达到99.9985％以上。采用本发明制备得到的新型菌蜕免疫小鼠后，可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，诱导了保护性免疫应答并且能够保护实验动物抵抗沙门氏菌感染，说明本发明制备得到的沙门氏菌菌蜕疫苗具有良好的免疫保护效果。

Description

焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及溶菌基因及其在制备疫苗中的应用，特别涉及焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用，本发明还涉及含有编码该蛋白基因的溶菌质粒以及该溶菌质粒在制备菌蜕疫苗中的用途，本发明属于基因工程与免疫学技术领域。
背景技术
菌蜕(Bacterial ghost)是一种没有细胞浆和核酸的细菌空壳。将溶菌基因在细菌中表达，该基因编码蛋白可在细菌外壳形成跨膜孔道结构，在渗透压作用下使菌内胞质内容物通过孔道排出，形成一种空的细菌外壳。菌蜕不具毒力作用，使用安全，是一种绿色疫苗，具有良好的保护效力。菌蜕疫苗具有佐剂性质，可以使其增强免疫反应，如T细胞的活化和黏膜免疫。菌蜕能非特异性增强抗原呈递细胞呈递抗原的能力，且与树突状细胞接触后可增强树突状细胞活化T细胞的能力。这些作为免疫佐剂的特性使菌蜕可以成为优良的免疫佐剂，将其作为灭活疫苗、亚单位疫苗的佐剂能有效的增强疫苗的免疫效果。菌蜕的外膜上存在蛋白质、脂多糖和菌毛，这些免疫刺激复合物被机体的免疫受体识别后，可以引起先天免疫，同时进一步刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。另外，菌蜕可以将特异性抗原递呈给抗原递呈细胞，使DC活化T细胞的能力明显增强，能增加很多细胞因子引起机体产生特异性免疫应答作用。特别适合作为黏膜免疫的疫苗，可以同时引起体液免疫和细胞免疫。对于外源靶抗原，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。菌蜕上面有菌毛、纤毛等，可以有效结合一些外源物质，还可以定位细胞和组织等，能够有效地对疾病做出预防，且具有治疗作用。利用基因工程手段，可以将外源抗原蛋白插入菌蜕的内膜、外膜或周质等多个部位，构建重组菌蜕多价疫苗。菌蜕也可作为药物传递系统。菌蜕可作为药物递送载体用于装载药物，使药物在患处发挥作用。该方法不但增加了局部药物浓度，同时减少了用药剂量和副作用，菌蜕还具有使药物作用持久而稳定的缓释作用。菌蜕也可以作为亚单位疫苗和DNA疫苗的载体。因此菌蜕载体的出现改进了药物或疫苗的递送方式。而菌蜕的制备常使用发酵方法，而发酵时只需控制温度即可产生菌蜕，无需其他复杂仪器和操作步骤。发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干后保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。节省了时间、节约了资源，无需特定环境储存，减少反复冻融带来的损失。菌蜕为新型疫苗的研制提供了新的模式，是动物用疫病疫苗研制的一个发展方向，其在动物疫苗的研制开发上将会有更加广阔的应用前景。
传统菌蜕的制备，采用噬菌体phiX174的E基因作为溶菌基因，因其安全性问题，噬菌体phiX174的E基因的高效表达要受到严格的控制。另一方面，本发明的前期研究发现，phiX174的E基因作为溶菌基因其持续期最多只能够达到4h，以往的研究对表达系统进行了诸多优化，虽然大大提高了溶菌效率，但也一直存在细菌裂解持续期短的问题，导致菌蜕产率较低。为了解决这一问题，本发明另辟蹊径，首次将编码焦亡相关蛋白GSDMD(gasderminD)的基因作为溶菌基因，在沙门氏菌内诱导表达，裂解持续期能够达到8h，裂解率能够达到99.9985％以上。GSDMD属于Gasdermin蛋白家族，是经典和非经典炎症小体激活后诱导的细胞焦亡所必需的。GSDMD可稳定存在于细胞质中，在接受炎性半胱氨酸蛋白酶刺激后，GSDMD裂解形成的N端结构域能嵌入细胞膜，在脂质膜上形成孔道，是细胞焦亡直接的且唯一的效应器。N端结构域的脂质选择特性使其只能从真核细胞内部破坏细胞膜，在细胞内诱导细胞焦亡、杀死胞内细菌。并且当N端结构域从细胞内释放后，能为胞外细菌所激活且不对其他真核细胞造成损害。这一选择活性能避免组织损伤，控制细菌感染。
本发明克服了以往菌蜕制备过程中裂解持续期短的瓶颈问题，极大的提高了菌蜕产率。并且所制备的新型菌蜕可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，诱导保护性免疫应答，具有良好的免疫保护效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供焦亡相关蛋白GSDMD、编码该蛋白核苷酸序列以及含有该核苷酸序列的溶菌质粒在制备菌蜕疫苗中的应用；
本发明的目的之二是提供一种制备细菌菌蜕的方法。
本发明上述目的是通过以下技术方案实现的：
首先，本发明提出了焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用。
进一步的，本发明还提出了编码焦亡相关蛋白GSDMD的核苷酸序列以及含有该核苷酸序列的溶菌质粒在制备菌蜕疫苗中的应用。
其中，优选的，编码焦亡相关蛋白GSDMD的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
然后，本发明提出了一种制备细菌菌蜕的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有编码焦亡相关蛋白GSDMD核苷酸序列的溶菌质粒；
(2)将该溶菌质粒转化到细菌中，得到含有溶菌质粒的转化子；
(3)将该转化子增殖；
(4)加入L-阿拉伯糖诱导溶菌基因的表达，收集形成的菌体，得到菌蜕。
其中，优选的，步骤(1)中，编码焦亡相关蛋白GSDMD的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
其中，优选的，步骤(2)中，所述的细菌为沙门氏菌菌株。
其中，优选的，步骤(3)中，该转化子在37℃增殖。
其中，优选的，步骤(4)中，L-阿拉伯糖的终浓度为0.2％w/v。
进一步的，本发明还提出了由以上任何一项方法制备得到的菌蜕。
更进一步的，本发明还提出了所述的菌蜕在制备疫苗中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果主要体现在：
1、本发明首次将编码焦亡相关蛋白GSDMD的基因作为溶菌基因，用于制备新型菌蜕。GSDMD不对其他真核细胞造成损害，能避免组织损伤，控制细菌感染；
2、本发明克服了以往菌蜕制备过程中裂解持续期短的瓶颈问题，裂解持续期能够达到8h，裂解率能够达到99.9985％以上，极大的提高了菌蜕产率。并且所制备的新型菌蜕可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，诱导保护性免疫应答，具有良好的免疫保护效果。
附图说明
图1为pSDiGc-GSDMD质粒的酶切鉴定结果；
M：DNA Maker 2000plus 1：pSDiGc-GSDMD酶切产物
图2为肠炎沙门氏菌SM6的溶菌曲线；
A：初始OD600nm为0.4；B：初始OD600nm为0.6；
图3为扫描电镜结果；
A：正常沙门氏菌；B：新型菌蜕(SEM20000×)；C、D：新型菌蜕(SEM50000×)；
图4为透射电镜结果；
A：正常沙门氏菌(TEM20000×)；B：新型菌蜕(TEM20000×)
图5为免疫后血清特异性抗体检测结果；
图6为免疫后IL-2分泌水平检测结果；
图7为免疫后IL-4分泌水平检测结果；
图8为免疫后IFN-γ分泌水平检测结果。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1：溶菌质粒的构建
1目的基因的扩增
对GenBank中GSDMD基因进行密码子优化，以便在沙门氏菌中表达，核酸片段由苏州金唯智公司合成。设计引物如下：
GSDMD-U(5'-CACGAATTCATGCCTAGCGCATTTG-3')
GSDMD-L(5'-AAAGTCGACATCACTCAGCAGGCTC-3')
上、下游引物5'端分别引入了EcoR I和Sal I限制性酶切位点。以所合成核酸片段为模板扩增GSDMD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR扩增反应体系为50μL，其中：去离子水22μL，PrimeSTAR MAX Premix(2×)25μL；10μM的上下游引物各1μL；核酸片段1μL(含12.5ng DNA)。扩增的循环参数为：1)94℃20s，55℃10s，72℃20s，30个循环；2)72℃5min。琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收基因片段。
采用EcoR I和Sal I对GSDMD基因片段和pSDiGc质粒分别进行双酶切，酶切反应体系如下：基因片段或质粒15μL；EcoR I 2μL；Sal I 2μL；10×Thermo ScientificFastDigest buffer 5μL；灭菌去离子水26μL，总体积50μL，37℃水浴1h，胶回收基因片段及线性载体。
所用pSDiGc载体的骨架为购买自Addgene的pDiGc质粒，将pDiGc第2830-2891位碱基片段替换为agatcctctagatttaagaaggagatatacatatggaattcagatctgtcgacggcggcggcggctcc，新片段含有EcoR I和Sal I酶切位点。
2目的基因的酶切
将GSDMD基因片段与pSDiGc载体进行酶切反应，酶切体系如下(50μL)：DNA 15μL，10×buffer 5μL，EcoRI 2μL，SalI 2μL，灭菌水26μL。将酶切反应体系放入37℃水浴，酶切1h，将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。
3目的基因与载体的连接与转化
将酶切回收后的GSDMD基因片段与pSDiGc载体片段进行连接，10μL体系如下：T4连接酶1μL，10×buffer 1μL，目的基因片段6μL，载体2μL，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。
4溶菌质粒的鉴定
提取质粒，对溶菌质粒pSDiGc-GSDMD使用EcoRI和SalI进行双酶切，结果如图1所示，得到预期大小为828bp的条带。
实施例2新型菌蜕的制备
1溶菌质粒的电转化及鉴定
本实施例中沙门氏菌菌种Sm6系由本研究室自发病鸡群分离得到，其他沙门氏菌菌种也适用本发明。将重组质粒pSDiGc-GSDMD电转化肠炎沙门氏菌SM6，具体操作步骤如下：将冻存于-80℃冰箱肠炎沙门氏菌SM6的感受态细胞置于冰上融解；取1.5μL质粒加入感受态细胞，混匀后冰上结合10min；将质粒与感受态细胞的混合物转入遇冷的电转杯中，擦干电转杯金属面的水；设置电转仪电转参数为2500V/cm、200Ω、25μF、5.0ms；电击后，向电转杯中加入37℃预热的LB培养基，吸出放入1.5mLEP管中，37℃180r/min震荡培养1-1.5h；将复苏的菌液5000r/min离心5min，弃去上清，剩余100μL，重悬；将重悬菌液涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃温箱倒置培养过夜；待过夜培养的平板长出菌落后，挑取疑似阳性菌落，接种于氨苄抗性LB培养基中，震荡培养，进行菌液PCR鉴定。
2不同菌液浓度的溶菌动力学试验及新型肠炎沙门氏菌菌蜕裂解率的计算
将含溶菌质粒pSDiGc-GSDMD的肠炎沙门氏菌SM6，接种于氨苄抗性LB培养基，37℃摇床200rpm震荡培养过夜。过夜培养后1：100转接5管10mL氨苄抗性LB培养基，37℃震荡培养至OD600nm值分别达0.4、0.6左右。向每管中加入终浓度为0.2％w/v的阿拉伯糖诱导，每20min检测各管培养物的OD600nm，直到OD600nm数值稳定。分别取诱导前的菌液和诱导后的菌液进行稀释，诱导前菌液进行106稀释，诱导后的菌液进行102倍稀释，稀释后涂板，37℃温箱倒置培养过夜，记录每个平板上菌落个数，计算活菌数(CFU/mL)。按照下列公式计算裂解率：裂解率＝(1－诱导后CFU/诱导前CFU)×100％。进行三次平行试验。
结果如图2所示，加入阿拉伯糖诱导后，pSDiGc-GSDMD的溶菌一直持续至试验结束，长达8h。当OD600nm为0.4时，诱导前为7.0×107CFU/mL，诱导后CFU为728CFU/mL，裂解率为99.9989％；当OD600nm为0.6时，诱导前为1.1×108CFU/mL，诱导后CFU为1.6×103CFU/mL，裂解率为99.9985％。经计算，裂解率均达到99.9985％以上。
3新型肠炎沙门氏菌菌蜕的电镜观察
分别取未溶菌和溶菌后的新鲜菌液制备样品进行扫描电镜和透射电镜观察。从图3扫描电镜结果可以看出，菌体表面产生溶菌孔道，内容物排出，菌体表面皱缩，仍保持细菌的基本形态。从图4透射电镜结果可以看出，大部分细菌内容物已排出，只保留细菌的外壳。
实施例3新型菌蜕的免疫效果
1疫苗的制备
灭活苗的制备：将冻存于-80℃的肠炎沙门氏菌SM6划线于沙门氏菌显色培养基，37℃温箱倒置培养12-18h，挑取单个菌落，涂布于LB平板上，37℃温箱倒置培养12-18h，用灭菌PBS将菌苔洗下，调整浓度，加入1.5‰的甲醛进行灭活，灭活48h，并不时摇晃，调整使终浓度为5×108cfu·mL-1。
灭活苗加佐剂的制备：取灭活苗与弗氏佐剂等体积混合，最终浓度为5×108cfu·mL-1。
新型菌蜕疫苗：按照实施例2，将加入阿拉伯糖诱导后的菌液经6000r/min离心10min，弃上清。灭菌PBS洗涤三次，菌体沉淀用1/100体积的无菌去离子水重悬，室温静置24h，将菌蜕疫苗调整浓度到5×108cfu·mL-1。
菌蜕疫苗：将冻存于-80℃的含有溶菌质粒pBV-E(溶菌质粒pBV-E参照公开号为CN104353072A，发明名称为“细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用”的专利申请制备)的肠炎沙门氏菌SM6划线于沙门氏菌显色培养基，37℃温箱倒置培养12-18h，挑取单个菌落，于LB液体培养基过夜培养，次日按1:100转接到液体LB培养基中，37℃培养至指定OD600nm时，升温到42℃诱导，诱导后的菌液经6000r/min离心10min，弃上清。灭菌PBS洗涤三次，菌体沉淀用1/100体积的无菌去离子水重悬，室温静置24h，将菌蜕疫苗调整浓度到5×108cfu·mL-1。
2疫苗的无菌性检验
将制备的灭活苗、菌蜕疫苗和新型菌蜕疫苗分别各取100μL涂布于LB平板，37℃温箱倒置过夜，观察是否有细菌生长。
3免疫与攻毒
6-8周龄的BALB/C雌性小鼠100只，分成5组，每组20只。分别为灭活苗组、灭活苗+佐剂组、菌蜕组、新型菌蜕组和对照组。免疫途径为背部皮下多点，免疫剂量为5×108cfu，对照组注射等体积PBS，共免疫三次。
挑取若干个肠炎沙门氏菌SM6单个菌落，涂布于无抗LB平板上，37℃培养过夜，无菌PBS将菌苔洗下，调整浓度，每只小鼠的攻毒剂量为5LD50。三免一周后进行攻毒，攻毒途径为腹腔注射。攻毒后每天观察临床症状，计算疫苗的保护率。解剖攻毒7d后未死亡小鼠，观察并记录其病理变化。
试验结果如表1所示，灭活苗组的保护率位30％，灭活苗+佐剂组的保护率为70％，菌蜕疫苗组的保护率为100％，新型菌蜕疫苗组的保护率为100％，PBS对照组全部死亡。
表1免疫保护结果
Figure BDA0001824312960000071
Figure BDA0001824312960000081
病理结果为：对照组肝脏局部灶状坏死，坏死灶内可见散在出血；脾脏淋巴细胞显著减少，可见坏死；肺局部肺泡膈轻度增宽，上皮细胞轻度增生，少量淋巴细胞浸润；肾脏间质可见少量淋巴细胞浸润；肠黏膜上皮内可见少量嗜中性粒细胞浸润。灭活苗组肝脏近被膜处局部可见肝细胞坏死，坏死灶周围可见少量多核巨细胞浸润；脾脏白髓淋巴细胞减少；肺血管周可见水肿，伴少量散在出血；肾脏和肠物无病理变化。灭活苗+佐剂组肝脏肉芽肿性变化。嗜中性粒细胞灶状浸润，伴坏死；脾脏淋巴细胞轻度坏死减少；肺泡膈轻度增宽，上皮细胞轻度增生；肾脏无明显病理变化；肠绒毛长度轻度变短。菌蜕组肝脏汇管区可见少量淋巴细胞浸润，实质内可见上皮样细胞小灶状聚集；心脏、脾脏、肺、肾脏、肠无病理变化。新型菌蜕组肝细胞变性，部分坏死；其他组织器官无病理变化。
4抗体水平检测
挑取新鲜肠炎沙门氏菌单菌落，接种于5mL无抗LB液体培养基，37℃220r/min震荡培养过夜，过夜培养后1:100转接100mL LB液体培养基中，37℃震荡培养8h。6000r/min离心10min收集菌体，将细菌沉淀PBS洗涤3次，用10mL的50MmTris-Cl(pH8.0)重悬沉淀，进行超声处理。4℃10000r/min离心20min，保留上清。
随机选取一免二周、二免二周、三免一周和对照组的小鼠各3只，眼球采血，将取出的血液装入1.5mL离心管中，37℃放置1h，后放在4℃过夜，4℃，4000rpm/min，离心5min，分离血清，小心将血清移入另一离心管中，于-20℃保存。根据间接ELISA方法，预实验确定超声抗原最佳包被浓度为10μg/ml，待检血清最佳稀释倍数为1:100，为一抗；二抗为辣根过氧化物酶标记(HRP)的羊抗鼠IgG，具体操作如下：
(1)将超声上清用稀释液CBS稀释后，每孔50μL，4℃包被过夜。
(2)弃掉包被液，拍干，加入PBST洗涤3次，每次5min，拍干。
(3)5％的脱脂乳封闭，每孔150μL，37℃封闭1h。
(4)弃掉封闭液，拍干，加入PBST洗涤3次，每次5min，拍干。
(5)将之前分离的小鼠血清用PBST进行1:100稀释后，每孔50μL，37℃孵育1h。
(6)弃液，加入PBST洗涤3次，每次5min，拍干。
(7)每孔加用PBST稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG各50μL，37℃孵育1h。
(8)弃液，加入PBST洗涤3次，每次5min，拍干。
(9)每孔加入TMB显色液50μL，室温避光显色10min后，每孔加入50μL2M H2SO4终止。
(10)酶标仪测定450nm的OD值。
检测结果如图5所示，各实验组抗体水平呈现上升趋势，一免过后，灭活苗组、灭活苗+佐剂组、菌蜕组、新型菌蜕组与对照组相比差异极显著(P<0.001)，新菌蜕组与灭活组差异极显著(P<0.001)，与灭活苗+佐剂组、菌蜕组差异不显著。二免过后，各实验组抗体水平上升明显，灭活苗组、灭活苗+佐剂组、菌蜕组、新型菌蜕组与对照组相比差异极显著(P<0.001)，新菌蜕组与灭活苗组差异极显著(P<0.001)，与其他实验组差异显著(P<0.01)。三免后，灭活苗组、灭活苗+佐剂组、菌蜕组、新型菌蜕组与对照组相比差异极显著(P<0.001)，新菌蜕组与灭活苗组差异极显著(P<0.001)，与灭活苗+佐剂组、菌蜕组差异不显著。
5 IL-2分泌水平的检测
用细胞因子检测试剂盒进行IL-2含量的检测，具体操作步骤如下：
(1)将IL-2细胞因子检测试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。
(2)取出标准品冻干粉，向其中加入1mL标准品稀释液，盖好盖子后室温静置10min，轻轻晃动，避免起泡，配制后标准品浓度为8000pg/ml。将标准品稀释到1000pg/ml，之后倍比稀释，使标准品浓度分别为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/mL，标准品稀释液为空白孔。
(3)将检测溶液A和检测溶液B分别用检测溶液A稀释液和检测溶液B稀释液1：100进行稀释，充分混匀。
(4)将洗涤液用去离子水进行30倍稀释，充分混匀。
(5)向预包板中依次加入梯度稀释的标准品各100μL，同时设置空白孔，加入100μL标准品稀释液，其余孔加入待测试验组样品和PBS对照组样品，之后酶标板覆膜，37℃孵育1h。
(6)弃去酶标板内液体，甩干。
(7)每孔各加入100μL检测溶液A，酶标板覆膜，37℃孵育1h。
(8)弃去酶标板内液体，甩干，用洗涤液洗涤，每次2min，反复洗板3次，拍干。
(9)每孔各加入100μL检测溶液A，酶标板覆膜，37℃孵育1h。
(10)弃去酶标板内液体，甩干，用洗涤液洗涤，每次2min，反复洗板5次，拍干。
(11)每孔各加入90μL TMB显色液，酶标板覆膜，37℃避光显色，待标准孔前4孔有明显蓝色梯度变化，即可终止。
(12)每孔各加入50μL终止液终止反应，轻晃酶标板混匀。
(13)用酶标仪读取450nm波长下的各孔OD值。
检测结果如图6所示，一免二周，各实验组IL-2水平都显著提高，与对照组相比产生了极差异显著(P<0.01)。菌蜕组IL-2水平最高，新型菌蜕组次之，再次是灭活苗+佐剂组，灭活苗组最低。各试验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗产生的差异显著(P<0.01)，与灭活苗+佐剂组和菌蜕组差异不显著。二免二周时，各试验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗组差异显著(P<0.05)，与灭活苗+佐剂组和菌蜕组差异不显著。而三免时，各实验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗组差异显著(P<0.01)，与其他两组差异不显著。
6 IL-4分泌水平的检测
用细胞因子检测试剂盒进行IL-4含量的检测，具体操作步骤如下：
(1)将IL-4细胞因子检测试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。
(2)取出标准品冻干粉，向其中加入1mL标准品稀释液，盖好盖子后室温静置10min，轻轻晃动，避免起泡，配制后标准品浓度为500pg/mL。将标准品进行倍比稀释，使标准品浓度分别为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/mL、7.8pg/mL，标准品稀释液为空白孔。
其余步骤同IL-2分泌水平的检测。
检测结果如图7所示，一免二周时各实验组IL-4水平有了显著提高，与对照组相比差异极显著(P<0.001)。新型菌蜕组与灭活苗+佐剂组、菌蜕组差异不显著。二免二周时，各实验组IL-4水平明显提高，与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗组差异显著(P<0.01)，与灭活苗+佐剂组和菌蜕组差异不显著。而三免时，各实验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗组、灭活苗+佐剂组差异极显著(P<0.01)，菌蜕组差异不显著。
7 IFN-γ分泌水平的检测
用细胞因子检测试剂盒进行IFN-γ含量的检测，具体操作步骤如下：
(1)将IFN-γ细胞因子检测试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。
(2)取出标准品冻干粉，向其中加入1mL标准品稀释液，盖好盖子后室温静置10min，轻轻晃动，避免起泡，配制后标准品浓度为4000pg/mL。将标准品稀释到1000pg/mL后进行倍比稀释，使标准品浓度分别为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mLl、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/mL，标准品稀释液为空白孔。
其余步骤同IL-2分泌水平的检测。
检测结果如图8所示，一免二周时各实验组IFN-γ水平有了显著提高，与对照组相比差异极显著(P<0.001)。一免二周时，新型菌蜕组与灭活苗、灭活苗+佐剂组、菌蜕组差异不显著。二免二周时，各试验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新菌蜕组与灭活苗+佐剂组、菌蜕组差异不显著，新型菌蜕组与灭活苗组差异显著(P<0.05)。三免时，各实验组与对照组差异极显著(P<0.001)，新型菌蜕组与灭活苗差异极显著(P<0.001)，与灭活苗+佐剂组差异显著(P<0.01)，与菌蜕组差异不显著。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
哈尔滨维科生物技术开发公司
<120> 焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用
<130> KLPI180878
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 828
<212> DNA
<213> GSDMD
<400> 1
atgcctagcg catttgagaa agtggttaag aatgtgatta aagaagttag cggtagccgc 60
ggcgatctga ttccggttga tagcctgcgc aacagcacca gctttcgccc gtactgtctg 120
ctgaaccgca aattcagcag cagccgtttt tggaaaccgc gctacagctg cgtgaacctg 180
agcatcaaag atatcctgga accgagtgca ccggagccgg aaccggaatg tttcggcagc 240
ttcaaggtta gcgacgtggt tgatggcaac attcaaggcc gcgttatgct gagcggcatg 300
ggcgaaggca aaattagtgg cggcgcagcc gttagcgata gcagcagcgc cagcatgaat 360
gtgtgcatct tacgcgtgac ccagaaaacc tgggagacca tgcagcatga acgccatctg 420
cagcagccgg agaataaaat cctgcagcag ctgcgcagtc gcggtgacga cctgttcgtg 480
gtgaccgaag tgctgcagac caaagaagaa gttcagatta ccgaagttca cagccaggaa 540
ggtagcggcc agttcacctt accgggtgcc ctgtgtctga aaggtgaagg caaaggtcac 600
cagagccgca agaaaatggt gaccatcccg gccggcagca ttctggcatt tcgtgtggcc 660
caactgctga tcggcagcaa atgggacatc ctgctggtga gcgatgaaaa acagcgcacc 720
ttcgaaccga gcagtggcga tcgcaaagca gtgggtcagc gccatcatgg tctgaatgtg 780
ctggcagcac tgtgcagcat cggtaagcag ctgagcctgc tgagtgat 828

Claims (8)

1.焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用。
2.含有编码焦亡相关蛋白GSDMD核苷酸序列的溶菌质粒在制备菌蜕疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：编码焦亡相关蛋白GSDMD的核苷酸序列为SEQID NO: 1所示。
4.一种制备细菌菌蜕的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）构建含有编码焦亡相关蛋白GSDMD核苷酸序列的溶菌质粒；
（2）将该溶菌质粒转化到细菌中，得到含有溶菌质粒的转化子；
（3）将该转化子增殖；
（4）加入L-阿拉伯糖诱导溶菌基因的表达，收集形成的菌体，得到菌蜕。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，编码焦亡相关蛋白GSDMD的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的细菌为沙门氏菌菌株。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，该转化子在37℃增殖。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，L-阿拉伯糖的终浓度为0.2%w/v。
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Pore formation by GSDMD is the effector;Moritz M Gaidt;《The EMBO Journal》;20160829;第35卷(第20期);2167-2169 *

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