JP2020518663A - 豚サーコウイルス3型免疫原性組成物、その調製方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
先行技術の不足を解決するために、本発明は、豚サーコウイルス3型関連疾患を予防及び/又は治療する免疫原性組成物を提供する。当該免疫原性組成物は、豚サーコウイルス3型に対して効果的な防御を提供でき、著しい免疫特性を表している。
1.病理材料の由来
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が9.4%増加し、受胎率が1.2%低下し、ミイラ変性胎子が8.2%増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を現した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、PCV2感染により流産が引き起こされる症状と一致している。母豚から観察された臨床表現及び流産症状全体として、豚サーコウイルス2型による繁殖障害疾患と一致するが、全ての母豚の腎臓、リンパ節、肺、皮膚及び死胎を含む異なる組織を免疫組織化学及び定量PCRによりPCV2、PRRSV、PPV、CSFV、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ検査を行った結果、いずれも陰性であった。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
病理材料を1:10(体積比)でDMEM培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して3回にかけて凍結融解させた後、12000r/min下で15min遠心し、上清液を収集し、上清液を0.22μm膜フィルターを経て濾過し、ろ液をPK15細胞上で継代させて、37℃で1h培養し、2%仔ウシ血清を含有するDMEM培養液を入れ替えるように加え、37℃に置いて5日間培養する。ウイルスを収穫し、2回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを含有する培養液を収穫する。
上記のステップにおけるウイルス培養物を取って、核酸抽出キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、サーコウイルス種の特異的プライマーを使ってPCR増幅同定を行い、その結果、2000bpターゲットバンドがPCR増幅されたことが示された。PCR生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列及びアミノ酸配列は、既に報道された他のサーコウイルスとのホモロジーがいずれも50%より小さいことが示された。然しながら、国際ウイルス分類委員会の標準によると、サーコウイルスのうち同一種類に属するウイルスは75%より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジー及びCapタンパク質70%より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。従って、これは新しい豚サーコウイルスであることが確定でき、現在、豚の体で発見された第3の種類のサーコウイルスでもある。
1.PCV3ウイルスDNAの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、T4 DNA LigaseはBioLab社から入手可能であり、pET28aプラスミドはNovagen社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
最適化されたCapタンパク質遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技株式会社に送って完全配列合成を行い、pET28aプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドpG−Tf2とを大腸菌BL21(DE3)に共形質転換させ、モノクローンを選んで100μg/mlのカナマイシン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、陽性クローンはpET28a−PCV3−Cap/pG−Tf2発現菌株である。
実施例2で調製されたpET28a−PCV3−Cap/pG−Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株を50〜100μg/mlのカナマイシン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地に接種する。一方、LB培地に分子シャペロンタンパク質の誘導発現に用いられる5〜10ng/mlのテトラサイクリンが含有され、接種量は1%(V/V)であり、37℃で振盪培養する。OD600=0.4〜0.6である場合、28℃で30分間放置する。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、その最終濃度が0.1〜1.0mMになるようにし、28℃で24時間振盪培養させる。培養が完了した後、菌体を収集し、PBS(塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2g、りん酸水素二ナトリウム1.44g、リン酸二水素カリウム0.24gでpHが7.4になるように調整し、1Lに定容する)で菌体を再懸濁し、超音波破砕を行い、遠心して上清を取る。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の25%に達し得、エンドトキシンの含有量は0.28×105EU/mlである。
1.5ml遠沈管に0.5mlの可溶性Capタンパク質を含有する処理すべき上清溶液及び最終濃度が1%(V/V)であるトリトンX−114(Triton X−114)(添加量は5μlである)を加え、渦流振盪で均一に混ぜ合わせる。均一に混ぜ合わせられたサンプルを氷上で5分間放置する。サンプルが冷却された後、遠沈管を直ちに37℃水浴に入れて5min温浴させて、新しい二相を形成させる。そして、サンプルを37℃で60s遠心させる。遠心後、標的タンパク質は上層に残る一方、エンドトキシンを含有する非イオン界面活性剤は油滴の形状で遠沈管の底部に残留し、これにより二相が分離される。エンドトキシンを除去する全体の操作は3回循環される。測定の結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は0.008×105EU/mlに低下する。一方、200KV透過型電子顕微鏡により60000倍まで拡大させて、5%リンタングステン酸ネガティブ染色を経て、炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたPCV3ウイルス様粒子を観察し、その結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を現した。
実施例4の方法に従って純化されたCapタンパク質を水溶性アジュバントGelアジュバントMontanide(登録商標)Gel(フランスSEPPIC社)に徐々に加え、加える過程で絶え間なく回転数が800rpmである乳化機で12min撹拌して均一に混ぜ合わせる。免疫原性組成物の具体的な配合は表2を参照することにする。
28〜30日齢の仔豚に対してELISA検査を行った結果、PCV2、PCV3抗原、抗体がいずれも陰性である健康な仔豚25匹を5匹/群になるようにランダムに五つの群に分け、実施例5で調製された豚サーコウイルス3型Capタンパク質免疫原性組成物で免疫する。第1〜4の群の仔豚はそれぞれ免疫原性組成物1〜4で免疫し、第5の群は免疫せずにウイルスチャレンジする比較群とする。各免疫群の仔豚に免疫原性組成物2ml/匹を注射し、ウイルスチャレンジ比較群の仔豚に生理食塩水2ml/匹を接種する。免疫後28日目に各群にウイルスチャレンジを行い、ウイルスチャレンジの分量は豚サーコウイルス3型SG株(Porcine Circovirus type 3、strain SG、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はCCTCC NO.V201712であり、寄託日付は2017年3月23日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である)105.0TCID50/匹である。ウイルスチャレンジ後、各群の仔豚を連続して観察し、ウイルスチャレンジ後25日目に全ての試験豚を解剖して、各群の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表3を参照することにする。
28〜30日齢の仔豚に対してELISA検査を行った結果、PCV2、PCV3抗原、抗体がいずれも陰性である健康な仔豚50匹を5匹/群になるようにランダムに10個の群に分け、第6〜10の群を実施例5で調製された豚サーコウイルス3型Capタンパク質免疫原性組成物1に免疫させ、第11〜15の群は免疫せずにウイルスチャレンジ比較群とする。各々の免疫群の仔豚に免疫原性組成物2ml/匹を注射し、比較群の仔豚に生理食塩水2ml/匹を接種する。免疫してから28日後にウイルスチャレンジを行い、第6の群及び第11の群の仔豚は、最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス3型HN12ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第7の群及び第12の群の仔豚は、最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス3型JS08ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第8の群及び第13の群の仔豚は、最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス3型JL11ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第9の群及び第14の群の仔豚は、最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス3型CQ04ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第10の群及び第15の群の仔豚は、最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス3型GD05ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は105.0TCID50/匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、ウイルスチャレンジしてから25日後に全ての試験豚を解剖して、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表4を参照することにする。
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が8.9%増加し、受胎率が1.4%低下し、ミイラ変性胎子が8.5%増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を現した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有している。臨床表現症状のある母豚から38匹の妊娠した母豚を選んで、19匹/群になるようにランダムにA群、B群の二つの群に分ける。A群は、免疫原性組成物接種群であり、A群は実施例5で調製された豚サーコウイルス3型Capタンパク質免疫原性組成物1に免疫させ、B群はブランクとして比較群である。免疫群に免疫原性組成物2ml/匹を注射し、ブランクである比較群に生理食塩水2ml/匹を接種する。2つの群の母豚の仔豚生産状況を統計し、その結果は表5を参照することにする。
Claims (14)
- 豚サーコウイルス3型免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス3型Capタンパク質又は免疫量の前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体と、獣医学的に許容可能な担体とを含む豚サーコウイルス3型免疫原性組成物。 - 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質は、SEQ ID No.1が示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質含有量は、20μg/ml以上である請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質含有量は、20μg/ml〜100μg/mlである請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質含有量は、20μg/ml〜50μg/mlである請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質含有量は、30μg/ml〜50μg/mlである請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体は、組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記獣医学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは、(1)水酸化アルミニウム、サポニン、アブリジン、DDA、(2)アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との重合体、(3)水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン又は水中油中水型エマルジョン、或いは(4)Montanide(登録商標)Gelを含む請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 前記アジュバントはMontanide(登録商標)Gelであり、前記アジュバントの使用量は体積比で5〜20%である請求項8に記載の免疫原性組成物。
- 前記アジュバントの使用量は体積比で10%である請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1に記載の免疫原性組成物を調製する方法であって、
前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子をクローンし、前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子を発現担体に組み換えて、前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体を得るステップ(1)と、
前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体が分子シャペロンの発現担体とともに大腸菌に共形質転換させ、前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質を発現するステップ(2)と、
前記発現された豚サーコウイルス3型Capタンパク質を分離し、非イオン界面活性剤を使用して処理してエンドトキシンを除去するステップ(3)と、
前記エンドトキシンが除去された豚サーコウイルス3型Capタンパク質をアジュバントと均一に混ぜ合わせ、乳化させて、前記免疫原性組成物を得るステップ(4)とを含む方法。 - 前記ステップ(1)において、前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体は組み換えpET28aプラスミドであり、
前記ステップ(2)において、前記分子シャペロンの発現担体はpG−Tf2であり、前記大腸菌は大腸菌BL21(DE3)であり、
前記ステップ(3)において、非イオン界面活性剤はTriton(トリトン)X−114である請求項11に記載の方法。 - 請求項1乃至10のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の豚サーコウイルス3型関連疾患を予防及び/又は治療する医薬の調製における用途。
- 豚サーコウイルス3型Capタンパク質であって、
その配列はSEQ ID No.1が示すヌクレオチド配列によりコードされる豚サーコウイルス3型Capタンパク質。
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