CN110117569A - 一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法 - Google Patents

一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，且公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，包括以下步骤：S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号：AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS‑F和LpS‑R用于扩增PCV3 Cap基因序列，片段长度为789bp。该表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp12表达PCV3 Cap蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发3型猪圆环病毒口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性。

Description

一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体为一株表达猪圆环病毒3型Cap 基因的重组植物乳酸菌的制备方法。
背景技术
猪圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属的单链环状DNA病毒；已知病毒的基因型为PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是一种细胞污染物，无致病性。PCV2是断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征和生殖障碍等相关疾病的主要致病原，这种与PCV2相关疾病被命名为猪圆环病毒相关疾病。2016年美国科研人员利用宏基因组测序发现3型猪圆环病毒，临床上表现为PDNS样，繁殖障碍和多系统炎症。目前，PCV3已经在世界范围内广泛传播，Zheng等检测山东省PCV3的感染率为59.46％(132/222)，和PCV2的共感染率为39.39％ (52/132)；Ku等收集辽宁、江西和重庆地区疑似病料，PCV3猪场感染率为 68.6％(24/35)，PCV2和PCV3的感染率分别为62.2％(138/222)和34.7％ (77/222)，共感染率为15.8％(35/222)；表明我国分布范围广、感染率较高。 Jiang等拯救感染性PCV3DNA克隆用于动物实验，同时PCV3感染能引起PDNS 样并可导致40％的仔猪死亡，证明PCV3的致病性与危害性，具有极为重大的公共卫生意义。然而，目前对于PCV3感染机制仍然知之甚少。鉴于PCV2在养猪业造成的高经济损失，PCV3的防控预案应当及时建立。
乳酸菌是一类无芽孢、G+和发酵产物为乳酸的细菌统称，具有益生菌特性、无内毒素和细胞外分泌等特征，由于乳杆菌广泛存在于动物、植物和人类胃肠道等多种生态环境中，具有遗传多样性；能够耐受胃酸和胆盐等极端环境；具有较强的黏附定植肠道上皮细胞的能力。鉴于其安全性，乳杆菌作为基因工程菌表达异源蛋白已经得到广泛验证，如干酪乳杆菌表达PEDV的N 蛋白，植物乳杆菌NC8表达H9N2的NP蛋白。
目前市场上针对PCV2的基因工程亚单位疫苗都是以Cap蛋白为靶蛋白，倪能能等利用植物乳杆菌表达PCV2Cap蛋白，目前未见植物乳杆菌表达PCV3 Cap蛋白报道，根据基因组序列分析发现PCV3与PCV2Cap蛋白相似性仅为 37％，在亲缘关系上同蝙蝠或犬类更为接近，针对PCV2Cap蛋白的疫苗能否对PCV3产生交叉保护作用值得考虑，因此针对PCV3的疫苗仍然有待深入发明。
发明内容
本发明提供了一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，具备构建的重组乳杆菌具有潜在黏膜免疫应用价值，为开发PCV3新型口服疫苗鉴定基础的优点，解决了背景技术中提到的问题。
为实现以上目的，本发明提供如下技术方案予以实现：一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号： AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS-F和LpS-R用于扩增PCV3Cap 基因序列，片段长度为789bp；
S2：PCV3D基因扩增，以本实验保存的pGH-PCV3D质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定，采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经 PCR检测，验证正确后送至公司测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌 Lp12，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌Lp12： pSIP411-PCV3D及植物乳杆菌Lp12分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽 SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定,将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5-8min。12％ SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析： 5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的羊抗兔二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL 显影观察并拍照；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证，1％重组植物乳杆菌接种于液体 MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3 遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC 标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
S7：外源基因表达的流式细胞分析，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS 培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
可选的，S1中通用引物SF01和SR01扩增pSIP411及其衍生载体，长度片段为1552bp，用于筛选阳性菌落。
可选的，S2中的反应体系：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物Lps-F、LpS-R各1ul，无菌水补足25ul。反应条件：94℃ 15s， 55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并按照胶回收试剂盒进行回收产物。
可选的，目的基因的扩增与鉴定，PCR扩增产物PCV3D片段经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了1条约789bp的特异条带，与预期大小相符合。
可选的，重组表达质粒的构建与鉴定，通过无缝克隆技术构建含有PCV3D 的重组质粒pSIP411-PCV3D(图2)，将该质粒电转入克隆宿主菌乳球菌NZ3900 后，在含有红霉素抗性的平板上挑取多个单克隆，提取阳性质粒送公司测序鉴定。经公司测序正确后，重组质粒再次电转入表达宿主菌植物乳杆菌Lp12 中，挑取3个单克隆进行菌液PCR鉴定和植物乳杆菌Lp12作为阴性对照。1％琼脂糖凝胶电泳可见1552bp的目的条带，与预期相符合(图3)。表明重组质粒成功电转入植物乳杆菌Lp12中，验证正确的重组植物乳杆菌命名为Lp12：pSIP411-PCV3D。
可选的，外源基因表达的Western Blot鉴定，将鉴定正确的重组植物乳杆菌进行诱导表达，加入SppIP(50ng/mL)诱导剂，再继续培养6h。在空质粒的植物乳杆菌Lp12中加诱导剂和未加诱导剂，重组菌中未加诱导剂的蛋白中均未检测到蛋白条带，而重组植物乳杆菌加诱导剂结果可见30KDa左右的特异性条带，结果表明Cap基因在植物乳杆菌Lp12中成功表达。
可选的，外源基因表达的免疫荧光分析，通过免疫荧光，对细菌表面的抗原进行鉴定，植物乳杆菌Lp12未见荧光，而重组植物乳杆菌Lp12： pSIP411-PCV3D可见单个菌体荧光，进一步表明目的基因能够在植物乳杆菌 Lp12中表达。
可选的，流式细胞分析，通过流式细胞术对植物乳杆菌Lp12和重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D进行鉴定分析，植物乳杆菌Lp12为0.57％，重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D的阳性率为47.9％。
本发明提供了一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，具备以下有益效果：
1、该表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep优化的PCV3Cap基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp12表达PCV3Cap蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发3型猪圆环病毒口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达PCV3Cap蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性。
2、该表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，本发明经宿主菌筛选，选用良好的宿主植物乳杆菌Lp12，通过改造pSIP411表达载体及表达蛋白基因，成功表达PCV3Cap蛋白，本发明亦通过1320信号肽将异源抗原表达在细胞壁上，以提高提呈效率，荧光检测效果充分证明了其良好的表面展示能力，FYPSYHSTPQRP用于表面蛋白的靶向作用，可更加有效的将表面抗原传递给抗原提呈细胞，增强针对靶位点的粘膜免疫应答，提高免疫原性，利于机体的免疫系统发挥作用，本发明构建的重组乳杆菌具有潜在黏膜免疫应用价值，为开发PCV3新型口服疫苗鉴定基础。
附图说明
图1为本发明的PCV3D基因PCR扩增产物示意图；
图2为本发明的重组质粒pSIP411-1320-PCV3D示意图；
图3为本发明的重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D的验证示意图；
图4为本发明的Western Blot检测PCV3D在植物乳杆菌Lp12中的诱导表达示意图；
图5为本发明的免疫荧光鉴定重组菌表面表达示意图；
图6为本发明的流式细胞分析重组菌表达示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号： AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS-F和LpS-R用于扩增PCV3 Cap 基因序列，片段长度为789bp；
S2：PCV3D基因扩增，以本实验保存的pGH-PCV3D质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定，采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经 PCR检测，验证正确后送至公司测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌 Lp12，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌Lp12： pSIP411-PCV3D及植物乳杆菌Lp12分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽 SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定,将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5-8min。12％ SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析： 5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的羊抗兔二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL 显影观察并拍照；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证，1％重组植物乳杆菌接种于液体 MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3 遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC 标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
S7：外源基因表达的流式细胞分析，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS 培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
其中，S1中通用引物SF01和SR01扩增pSIP411及其衍生载体，长度片段为1552bp，用于筛选阳性菌落；引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。引物信息见表1。
表1本实验中用到的引物
其中，S2中的反应体系：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物Lps-F、LpS-R各1ul，无菌水补足25ul。反应条件：94℃ 15s， 55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并按照胶回收试剂盒进行回收产物。
其中，目的基因的扩增与鉴定，PCR扩增产物PCV3D片段经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了1条约789bp的特异条带，与预期大小相符合(图1)
其中，重组表达质粒的构建与鉴定，通过无缝克隆技术构建含有PCV3D 的重组质粒pSIP411-PCV3D(图2)，将该质粒电转入克隆宿主菌乳球菌NZ3900 后，在含有红霉素抗性的平板上挑取多个单克隆，提取阳性质粒送公司测序鉴定。经公司测序正确后，重组质粒再次电转入表达宿主菌植物乳杆菌Lp12 中，挑取3个单克隆进行菌液PCR鉴定和植物乳杆菌Lp12作为阴性对照。1％琼脂糖凝胶电泳可见1552bp的目的条带，与预期相符合(图3)。表明重组质粒成功电转入植物乳杆菌Lp12中，验证正确的重组植物乳杆菌命名为Lp12：pSIP411-PCV3D。
其中，外源基因表达的Western Blot鉴定，将鉴定正确的重组植物乳杆菌进行诱导表达，加入SppIP(50ng/mL)诱导剂，再继续培养6h。在空质粒的植物乳杆菌Lp12中加诱导剂和未加诱导剂，重组菌中未加诱导剂的蛋白中均未检测到蛋白条带，而重组植物乳杆菌加诱导剂结果可见30KDa左右的特异性条带(图4)，结果表明Cap基因在植物乳杆菌Lp12中成功表达。
其中，外源基因表达的免疫荧光分析，通过免疫荧光，对细菌表面的抗原进行鉴定，由图5可知植物乳杆菌Lp12未见荧光，而重组植物乳杆菌Lp12： pSIP411-PCV3D可见单个菌体荧光，进一步表明目的基因能够在植物乳杆菌 Lp12中表达。
其中，流式细胞分析，通过流式细胞术对植物乳杆菌Lp12和重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D进行鉴定分析，见图6可知植物乳杆菌Lp12为0.57％，重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D的阳性率为47.9％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1:引物设计及合成，根据GenBank中PCV3基因序列(登录号：AYM55798.1)，利用Primer5.0软件设计引物LpS-F和LpS-R用于扩增PCV3 Cap基因序列，片段长度为789bp；
S2：PCV3D基因扩增，以本实验保存的pGH-PCV3D质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定，采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经PCR检测，验证正确后送至公司测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌Lp12，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D及植物乳杆菌Lp12分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定,将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5-8min。12％SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析：5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的羊抗兔二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL显影观察并拍照；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
S7：外源基因表达的流式细胞分析，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S1中通用引物SF01和SR01扩增pSIP411及其衍生载体，长度片段为1552bp，用于筛选阳性菌落；
3.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S2中的反应体系：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs2ul，模板1ul，引物Lps-F、LpS-R各1ul，无菌水补足25ul。反应条件：94℃15s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并按照胶回收试剂盒进行回收产物。
4.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：目的基因的扩增与鉴定，PCR扩增产物PCV3D片段经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了1条约789bp的特异条带。
5.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：重组表达质粒的构建与鉴定，通过无缝克隆技术构建含有PCV3D的重组质粒pSIP411-PCV3D(图2)，将该质粒电转入克隆宿主菌乳球菌NZ3900后，在含有红霉素抗性的平板上挑取多个单克隆，提取阳性质粒送公司测序鉴定。经公司测序正确后，重组质粒再次电转入表达宿主菌植物乳杆菌Lp12中，挑取3个单克隆进行菌液PCR鉴定和植物乳杆菌Lp12作为阴性对照。1％琼脂糖凝胶电泳可见1552bp的目的条带，与预期相符合。表明重组质粒成功电转入植物乳杆菌Lp12中，验证正确的重组植物乳杆菌命名为Lp12：pSIP411-PCV3D。
6.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：外源基因表达的Western Blot鉴定，将鉴定正确的重组植物乳杆菌进行诱导表达，加入SppIP(50ng/mL)诱导剂，再继续培养6h。在空质粒的植物乳杆菌Lp12中加诱导剂和未加诱导剂，重组菌中未加诱导剂的蛋白中均未检测到蛋白条带，而重组植物乳杆菌加诱导剂结果可见30KDa左右的特异性条带，结果表明Cap基因在植物乳杆菌Lp12中成功表达。
7.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：外源基因表达的免疫荧光分析，通过免疫荧光，对细菌表面的抗原进行鉴定，植物乳杆菌Lp12未见荧光，而重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D可见单个菌体荧光，进一步表明目的基因能够在植物乳杆菌Lp12中表达。
8.根据权利要求1所述的一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：流式细胞分析，通过流式细胞术对植物乳杆菌Lp12和重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D进行鉴定分析，植物乳杆菌Lp12为0.57％，重组植物乳杆菌Lp12：pSIP411-PCV3D的阳性率为47.9％。
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