CN111518740A - 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法 - Google Patents

一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111518740A
CN111518740A CN202010417403.1A CN202010417403A CN111518740A CN 111518740 A CN111518740 A CN 111518740A CN 202010417403 A CN202010417403 A CN 202010417403A CN 111518740 A CN111518740 A CN 111518740A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cov
sars
lactobacillus plantarum
recombinant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010417403.1A
Other languages
English (en)
Inventor
金宁一
李昌
王茂鹏
田明尧
李乐天
鲁会军
李霄
付婷婷
许汪
郝嘉翼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Original Assignee
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences filed Critical Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority to CN202010417403.1A priority Critical patent/CN111518740A/zh
Publication of CN111518740A publication Critical patent/CN111518740A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，且公开了一种表达SARS‑CoV‑2主要抗原基因S的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep以及优化的SARS‑CoV‑2 S基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp18表达SARS‑CoV‑2 S蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发SARS‑CoV‑2口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达SARS‑CoV‑2 S蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性,也为SARS‑CoV2病毒口服疫苗的研发提供了前提。

Description

一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体为一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法。
背景技术
SARS-CoV-2作为引起新冠肺炎(coronavirus disease 2019， COVID-19)的致病原，截止目前，全球感染人数超过70万，造成冠状病毒感染历史的最大规模流行。该病毒能够高度亲和病毒受体ACE2，导致人群中极高的传染性，而SARS-CoV-2的刺突蛋白S相比于SARS-CoV S对受体具有更高的亲和性，这也导致其成为第七种感染人类的冠状病毒，且感染性最强。大量研究表明冠状病毒S基因不但是病毒受体的唯一结合蛋白，而且其免疫原性强，是最适合作为候选疫苗开发的抗原物质。尽管已经有多家企业和科研机构开展了疫苗的研究工作，但是目前仅有基于腺病毒载体的新冠疫苗获批进入临床研究阶段。因此，新冠疫苗的研发仍处于初始阶段，而且缺乏有效的表达系统用于黏膜递送。
乳酸菌是一类无芽孢、G+和发酵产物为乳酸的细菌统称，具有益生菌特性、无内毒素和细胞外分泌等特点，其在胃肠道中广泛存在，能够耐受胃酸和胆盐等极端环境；具有较强的黏附定植肠道上皮细胞的能力。鉴于其安全性，乳杆菌作为基因工程菌表达异源蛋白已经得到广泛验证，如干酪乳杆菌表达PEDV的N蛋白，植物乳杆菌NC8表达H9N2的NP蛋白。因此，依赖乳酸菌载体表达和递送系统具有安全、高效、诱导机体粘膜免疫的特点。
发明内容
本发明提供了一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法，具备构建的重组乳杆菌具有潜在黏膜免疫应用价值，为开发SARS-CoV-2新型口服疫苗鉴定基础的优点，解决了背景技术中提到的问题。
为实现以上目的，本发明提供如下技术方案予以实现：
一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌，其特征在于，整合有SARS-CoV-2S基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1:引物设计及合成；
S2：SARS-CoV-2 S基因扩增，以本实验保存的pGH-SARS-CoV-2 S 质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌 Lp18；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证；
S7：外源基因表达的流式细胞分析。
可选的，S1中所述引物的序列如SEQ ID No.2～5所示。
可选的，S2的反应体系为：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物F01、R01各1ul，无菌水补足25ul。反应条件： 94℃15s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。
可选的，S3具体为：采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素 (浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经PCR检测，验证后测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌Lp18，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定。
可选的，S4具体为：pSIP411-SARS-CoV-2-S及植物乳杆菌Lp18 分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽SppIP(浓度为 50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用。
可选的，S5具体为：将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5-8min。 12％SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析：5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体,或者兔源Anti-SARS-CoV-2 S抗体(北京孚德，1： 500)或者阳性患者血清(1：500)4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP 标记的二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL显影观察并拍照。
可选的，S6具体为：1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3 遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3 遍，FITC标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
可选的，S7具体为：1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3 遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3 遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
本发明提供了一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，具备以下有益效果：
1、该表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，通过本发明选用植物乳杆菌表达含1320信号肽和DCpep优化的 SARS-CoV-2 S基因，选择乳球菌NZ3900作为克隆中间宿主，获得高含量的重组质粒；再使用植物乳杆菌Lp18表达SARS-CoV-2S蛋白，建立有效的制备及鉴定方法，优化检测手段，为开发SARS-CoV-2口服候选疫苗奠定理论基础，本发明建立了重组表达SARS-CoV-2S蛋白的植物乳杆菌，丰富了植物乳杆菌表达异源蛋白的可行性。
2、该表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，本发明经宿主菌筛选，选用良好的宿主植物乳杆菌Lp18，通过改造pSIP411表达载体及表达蛋白基因，成功表达SARS-CoV-2S蛋白，本发明亦通过1320信号肽将异源抗原表达在细胞壁上，以提高提呈效率，荧光检测效果充分证明了其良好的表面展示能力，FYPSYHSTPQRP 用于表面蛋白的靶向作用，可更加有效的将表面抗原传递给抗原提呈细胞，增强针对靶位点的粘膜免疫应答，提高免疫原性，利于机体的免疫系统发挥作用，本发明构建的重组乳杆菌具有潜在黏膜免疫应用价值，为开发SARS-CoV-2新型口服疫苗鉴定基础。
附图说明
图1为本发明的SARS-CoV-2S基因PCR扩增产物示意图；
图2为本发明的重组质粒pSIP411-1320-SARS-CoV-2S示意图；
图3为本发明的重组植物乳杆菌Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2-S 的验证示意图；
图4为本发明的Western Blot检测SARS-CoV-2S在植物乳杆菌 Lp18中的诱导表达示意图；
图5为本发明的免疫荧光鉴定重组菌表面表达示意图；
图6为本发明的流式细胞分析重组菌表达示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本研究通过构建表达DC靶向肽修饰的新冠病毒SARS-CoV-2 S基因载体，经电转和诱导表达，在表面展示肽1320的作用下，提呈在植物乳杆菌Lp18表面。所制备的重组植物乳杆菌Lp18能够表达 SARS-CoV-2 S，而且流式细胞及免疫荧光分析发现，该抗原可提呈于细菌表面，增强免疫效果，可作为COVID19的候选疫苗应用于临床研究，尤其在黏膜免疫诱导方面具有明显优势。
请参阅图1-6。
实施例1
一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，包括以下步骤：
S1:引物设计及合成，根据GenBank中SARS-CoV-2 S基因序列(登录号：MN908947)，利用Primer5.0软件设计引物F01和R01用于扩增SARS-CoV-2S基因序列，片段长度为4129bp；
S2：SARS-CoV-2S基因扩增，以本实验保存的pGH-SARS-CoV-2S 质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定，采用无缝克隆技术将 S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900 中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经PCR检测，验证正确后送至公司测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌Lp18，涂布于含红霉素(浓度为 20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01 和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌 Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2-S及植物乳杆菌Lp18分别1％接种于新鲜 MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当 OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量 PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定,将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，沸水煮5-8min。12％SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析：5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体,或1：500兔源Anti-S抗体(北京孚德)，或1：500患者血清，4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL显影观察并拍照；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗 4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
S7：外源基因表达的流式细胞分析，1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
其中，S1中通用引物SF01和SR01扩增pSIP411及其衍生载体，长度片段为1552bp，用于筛选阳性菌落；引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。引物信息见表1。
表1本实验中用到的引物
Figure BDA0002495543420000081
其中，S2中的反应体系：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物F01、R01各1ul，无菌水补足25ul。反应条件： 94℃15s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并按照胶回收试剂盒进行回收产物。
效果例：
目的基因的扩增与鉴定，PCR扩增产物SARS-CoV-2S片段经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了1条约4129bp的特异条带，与预期大小相符合(图1)
重组表达质粒的构建与鉴定，通过无缝克隆技术构建含有 SARS-CoV-2S的重组质粒pSIP411-SARS-CoV-2S(图2)，将该质粒电转入克隆宿主菌乳球菌NZ3900后，在含有红霉素抗性的平板上挑取多个单克隆，提取阳性质粒送公司测序鉴定。经公司测序正确后，重组质粒再次电转入表达宿主菌植物乳杆菌Lp18中，挑取3个单克隆进行菌液PCR鉴定和植物乳杆菌Lp18作为阴性对照。1％琼脂糖凝胶电泳可见4733bp的目的条带，与预期相符合(图3)。表明重组质粒成功电转入植物乳杆菌Lp18中，验证正确的重组植物乳杆菌命名为Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2S。
外源基因表达的Western Blot鉴定，将鉴定正确的重组植物乳杆菌进行诱导表达，加入SppIP(50ng/mL)诱导剂，再继续培养6h。在空质粒的植物乳杆菌Lp18中加诱导剂和未加诱导剂，重组菌中未加诱导剂的蛋白中均未检测到蛋白条带，而重组植物乳杆菌加诱导剂结果可见150KDa左右的特异性条带(图4)，结果表明S基因在植物乳杆菌Lp18中成功表达。
外源基因表达的免疫荧光分析，通过免疫荧光，对细菌表面的抗原进行鉴定，由图5可知植物乳杆菌Lp18未见荧光，而重组植物乳杆菌Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2-S可见单个菌体荧光，进一步表明目的基因能够在植物乳杆菌Lp18中表达。
流式细胞分析，通过流式细胞术对植物乳杆菌Lp18和重组植物乳杆菌Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2S进行鉴定分析，见图6可知植物乳杆菌Lp18为2.5％，重组植物乳杆菌Lp18：pSIP411-SARS-CoV-2S 的阳性率为37.5％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物。
序列表
<110> 申请人
<120> 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtttgtct tcttagtttt attgccacta gtctcaagtc agtgtgttaa tttgactacc 60
cggacgcaat tacccccagc atacactaat agtttcacac gtggtgttta ttacccagac 120
aaagttttcc ggagttcagt tttacattca acgcaggact tgtttttacc gttctttagt 180
aatgttacgt ggttccatgc tattcacgtc agtgggacca atggtactaa gcggtttgat 240
aacccagtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgcta gtacggagaa gagtaacatc 300
attcggggct ggatttttgg tacgacttta gatagtaaga cccagtcact attgattgtt 360
aataacgcta cgaatgtcgt tattaaagtc tgtgaatttc aattctgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa gaataacaaa agttggatgg aaagtgagtt ccgggtttat 480
tcaagtgcga acaattgcac gtttgaatat gtcagtcagc cgtttttgat ggacttagaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaacttgcgg gaattcgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatct atagtaagca cacgccgatt aatttagtgc gtgatttgcc acagggtttt 660
agtgctttag aaccattggt tgatttacca atcggtatta acatcactcg gtttcaaacg 720
ttattggctt tacatcggag ttatttgact ccaggtgatt caagttcagg ttggacagct 780
ggtgccgcag cttattacgt gggttatttg caaccacgga cgtttctatt aaaatataac 840
gaaaatggaa ccattacgga tgctgtcgac tgtgcattag acccgttgtc agaaacaaag 900
tgtacgttga aaagtttcac ggttgaaaaa ggaatctatc aaacgtcaaa ctttcgtgtc 960
caaccaacgg aatcaattgt tcggtttcca aatattacga acttgtgccc atttggtgaa 1020
gtttttaacg ccacccggtt tgcaagtgtt tatgcttgga accgcaagcg gatcagtaac 1080
tgtgttgctg attattcagt cctatataat agtgcatcat tcagtacgtt taagtgttat 1140
ggagtgagtc caactaaatt gaatgattta tgctttacga atgtctatgc agattcattt 1200
gtcattcgtg gtgatgaagt ccgtcaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga cgattttaca ggctgcgtta tcgcttggaa tagtaacaat 1320
ttagatagta aggttggtgg caattataac tacctgtatc ggttgtttcg caagagtaat 1380
ttgaaaccgt ttgagcgcga tatttcaacg gaaatctatc aggccggtag tacgccatgt 1440
aatggcgttg aaggttttaa ttgttacttt ccattacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttatcaacc ataccgggtt gtcgttttga gttttgaatt actacatgct 1560
ccagcaactg tttgtggacc gaaaaagtca acgaatttgg ttaaaaacaa gtgtgtcaat 1620
tttaacttca atggtttaac aggcacgggt gttttgactg agagtaacaa aaagtttctg 1680
ccattccagc aatttggccg tgatattgct gacacgactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acgttagaga tcttggacat tacgccatgt tcatttggtg gcgtcagtgt tattacgcca 1800
ggaacaaata cgagtaacca ggttgctgtc ttgtatcagg atgttaactg cacggaagtc 1860
ccagttgcta ttcatgcaga tcaattaact ccgacgtggc gtgtttattc aacaggtagt 1920
aatgtttttc aaacgcgtgc aggctgttta attggggctg aacatgtcaa taactcatat 1980
gagtgtgaca ttcccatcgg tgcaggcatc tgcgctagtt atcagactca aacgaattca 2040
ccacggcgcg cacgtagtgt tgctagtcaa tcaatcattg cctacacgat gtcattaggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta cagtaataac agtatcgcca ttcccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cggaaattct accagtgtca atgaccaaga cgtcagtcga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagt aatttgttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acgcaattaa accgtgcttt aacgggaatc gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca gatttacaaa acgccaccga ttaaagattt tggtggcttc 2400
aatttttcac aaatcttacc agatccgtca aaaccaagta agcggtcatt tattgaagat 2460
ctattgttca acaaagtgac attagcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
ttaggtgata ttgcagctcg ggacttaatt tgtgcacaaa agtttaacgg cttgactgtt 2580
ttaccaccgt tgttaacgga tgaaatgatt gctcaataca cgagtgcact gttagcgggt 2640
acaatcacta gtggttggac ctttggcgca ggtgctgcgt tacaaattcc atttgctatg 2700
caaatggctt atcggtttaa tggtattgga gttacgcaga atgttttgta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagacag tttgtcaagt 2820
acggctagtg cgttaggaaa attgcaagat gtggtcaacc agaatgcaca agctttaaac 2880
acgttggtta aacaattaag ttcaaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ttgtcacgtt tagacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg atcggttgat cacaggccga 3000
ttacaaagtt tgcagacgta tgtgactcag caattaattc gggctgcaga aatccgggct 3060
agtgcgaatt tggccgctac gaaaatgtca gagtgtgtgt taggacaatc aaaacgggtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatttgatg tcattcccac agtcagcacc gcatggtgtt 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtcccagca caagaaaaga acttcacgac tgctccagcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttccg cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcact 3300
cactggtttg tgacgcaacg gaatttttat gaaccacaaa tcattacgac cgacaacacg 3360
tttgtgtcag gtaactgtga tgttgtcatc ggaattgtca ataacacagt ttatgatcca 3420
ttgcaaccgg aattagactc attcaaggaa gagttagata aatattttaa gaatcatacg 3480
tcaccagacg ttgatttagg tgacatcagt ggcattaatg cttcagttgt caacattcaa 3540
aaagaaattg accgcttgaa tgaggttgcc aagaacttaa atgaaagttt gatcgattta 3600
caagaattag gaaagtatga gcagtatatc aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
attgctggct tgattgccat cgttatggtg acgattatgt tgtgctgtat gaccagttgt 3720
tgctcatgtc tcaagggctg ttgctcatgt ggaagttgtt gcaaatttga tgaagacgat 3780
agtgagccag tgttgaaagg agtcaagtta cattacacgt aa 3822
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattacaagg agattttagc catggagatt ttagccatg 39
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggccgttgc ggcgtactat gataactcgg ataaaataaa actgacttgt aacggatc 58
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttcccaca cgcatttcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attctgctcc cgcccttatg 20

Claims (9)

1.一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌，其特征在于，整合有SARS-CoV-2S基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1:引物设计及合成；
S2：SARS-CoV-2S基因扩增，以本实验保存的pGH-SARS-CoV-2S质粒为模板，进行PCR；
S3：重组乳杆菌表达质粒的构建及鉴定；
S4：重组乳杆菌的诱导表达，挑取转化后的阳性重组植物乳杆菌Lp18；
S5：重组乳杆菌表达产物的鉴定；
S6：外源基因表达的间接免疫荧光验证；
S7：外源基因表达的流式细胞分析。
3.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S1中所述引物的序列如SEQ ID No.2～5所示。
4.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S2的反应体系为：Ex Taq酶0.5ul，buffer2.5ul，dNTPs 2ul，模板1ul，引物F01、R01各1ul，无菌水补足25ul。反应条件：94℃15s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。
5.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S3具体为：采用无缝克隆技术将S2中的胶回收产物连接到pSIP411载体中，电转化到乳球菌NZ3900中，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的M17固体平板上，30℃培养过夜；挑取单个菌落经PCR检测，验证后测序，重组表达质粒再次电转入植物乳杆菌Lp18，涂布于含红霉素(浓度为20ug/mL)的MRS固体平板上，37℃培养过夜；挑取单个菌落，用SF01和SR01通用引物进行克隆PCR鉴定。
6.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S4具体为：pSIP411-SARS-CoV-2-S及植物乳杆菌Lp18分别1％接种于新鲜MRS液体培养基(红霉素浓度为20ug/mL)，37℃静置培养过夜，当OD值为0.3-0.5时，添加诱导肽SppIP(浓度为50ng/mL),继续培养6h，4000rpm离心收集重组植物乳杆菌，重组植物乳杆菌用等量PBS冲洗3遍去除MRS培养基，再用等量PBS重悬，使用等量玻璃珠研磨机研磨，收集蛋白液体，-80℃保存备用。
7.根据权利要求2所述的一种SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S5具体为：将制作好的重组乳杆菌表达的蛋白液体取适量，加入5xSDS-PAGE LoadingBuffer混合均匀，沸水煮5-8min。12％SDS-PAGE电泳后，通过半干式转膜转印PVDF膜上用于Western Blot分析：5％的脱脂乳室温震荡封闭2h，PBST洗3次；1:5000兔源Anti-HA标签抗体,或者兔源Anti-SARS-CoV-2S抗体(北京孚德，1：500)或者阳性患者血清(1：500)4℃过夜孵育，PBST洗5次；HRP标记的二抗孵育1h，PBST洗5次；ECL显影观察并拍照。
8.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S6具体为：1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍。一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1：5000孵育2h，PBS清洗4遍，进行制片，油镜下观察外源基因的表达情况。
9.根据权利要求2所述的一种表达SARS-CoV-2S基因的重组植物乳酸菌的制备方法，其特征在于：S7具体为：1％重组植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中(红霉素浓度为20ug/mL)，培养6h后收集菌体用等量PBS洗3遍，一抗用含1:5000的兔源Anti-HA标签抗体孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记的二抗1:5000孵育2h，PBS清洗4遍，取适量菌体用于流式细胞仪进行分析。
CN202010417403.1A 2020-05-18 2020-05-18 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法 Pending CN111518740A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010417403.1A CN111518740A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010417403.1A CN111518740A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111518740A true CN111518740A (zh) 2020-08-11

Family

ID=71906721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010417403.1A Pending CN111518740A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111518740A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877351A (zh) * 2020-04-14 2021-06-01 文利新 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用
CN113930438A (zh) * 2021-09-28 2022-01-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重组的耻垢分枝杆菌、疫苗及其应用
CN114717342A (zh) * 2022-04-11 2022-07-08 郑州大学第一附属医院 用于预测新冠肺炎患者一年后中和抗体水平的肠道微生物基因标志物及其应用
WO2022171904A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Livingmed Biotech S.R.L. Genetically modified clostridium strains expressing recombinant antigens and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110117569A (zh) * 2019-05-14 2019-08-13 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法
CN111088407A (zh) * 2020-02-20 2020-05-01 无锡市申瑞生物制品有限公司 一种检测冠状病毒rna的试剂盒及方法
CN111088283A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110117569A (zh) * 2019-05-14 2019-08-13 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法
CN111088407A (zh) * 2020-02-20 2020-05-01 无锡市申瑞生物制品有限公司 一种检测冠状病毒rna的试剂盒及方法
CN111088283A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL: "Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (2019-nCoV) (SARS-CoV-2)", 《EMBL》 *
JONG-SOO LEE等: "Mucosal Immunization with Surface-Displayed Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein on Lactobacillus casei Induces Neutralizing Antibodies in Mice", 《JVIROL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877351A (zh) * 2020-04-14 2021-06-01 文利新 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用
WO2022171904A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Livingmed Biotech S.R.L. Genetically modified clostridium strains expressing recombinant antigens and uses thereof
CN113930438A (zh) * 2021-09-28 2022-01-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重组的耻垢分枝杆菌、疫苗及其应用
CN114717342A (zh) * 2022-04-11 2022-07-08 郑州大学第一附属医院 用于预测新冠肺炎患者一年后中和抗体水平的肠道微生物基因标志物及其应用
CN114717342B (zh) * 2022-04-11 2023-07-07 郑州大学第一附属医院 用于预测新冠肺炎患者一年后中和抗体水平的肠道微生物基因标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111518740A (zh) 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法
CN111676181B (zh) 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用
CN107529534B (zh) 一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用
Stephenson et al. Transformation of, and heterologous protein expression in, Lactobacillus agilis and Lactobacillus vaginalis isolates from the chicken gastrointestinal tract
CN109402069A (zh) 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN111875676A (zh) 非洲猪瘟病毒免疫原的p49突变蛋白、重组载体、大肠杆菌基因工程菌及制备方法和应用
CN108956985B (zh) 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN111458501A (zh) 用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接elisa试剂盒及其制备方法和应用
CN113444743A (zh) 含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法
KR100720755B1 (ko) 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물
US11767356B1 (en) Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof
WO2023142647A1 (zh) 一种新型hpv治疗性核酸疫苗
CN110205323A (zh) 表达猪3型干扰素的表达基因、重组表达载体、重组乳杆菌及其制备方法和应用
CN114540377B (zh) 柱状黄杆菌vi型分泌系统效应分子及其免疫蛋白及应用
CN113881617B (zh) 靶向树突状细胞表达h7n9禽流感ha1抗原的重组乳酸菌及其应用
CN113304254A (zh) 一种微小隐孢子虫Cp15重组侵入型乳酸菌活载体疫苗
CN110669714B (zh) 肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用
CN115184605A (zh) 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒
CN107586788A (zh) 一种pMG36e‑pgsA‑gp85重组质粒的构建方法
CN109504643B (zh) 整合四拷贝功能性f18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
CN110117569A (zh) 一株表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组植物乳酸菌的制备方法
CN108588096B (zh) 东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4及其编码的蛋白
CN112011555A (zh) 一种调控沙门氏菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用
NZ520600A (en) Novel therapeutic compositions for treating infection by Lawsonia spp
CN109781973A (zh) 羊传染性胸膜肺炎间接elisa检测诊断试剂制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination