CN115184605A - 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒 - Google Patents

基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115184605A
CN115184605A CN202111146621.7A CN202111146621A CN115184605A CN 115184605 A CN115184605 A CN 115184605A CN 202111146621 A CN202111146621 A CN 202111146621A CN 115184605 A CN115184605 A CN 115184605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
syphilis
solution
kit
detecting
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111146621.7A
Other languages
English (en)
Inventor
柯吴坚
魏然
刘雅惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center
Original Assignee
Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center filed Critical Dermatology Hospital Of Southern Medical University Guangdong Provincial Dermatology Hospital Guangdong Skin Disease Prevention Center China Leprosy Control Research Center
Priority to CN202111146621.7A priority Critical patent/CN115184605A/zh
Publication of CN115184605A publication Critical patent/CN115184605A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，公开一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，包括以下组分：(1)样本稀释液；(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。本发明利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒TP0136重组蛋白，建立检测TP0136抗体的荧光素酶免疫共沉淀方法，并组装成试剂盒，基于梅毒感染者TP0136抗体水平来区分梅毒病期，有利于指导临床合理用药，避免过度治疗，为梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。

Description

基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说是一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体苍白球亚种(Treponema pallidum subsp.pallidum)感染所致的一种性传播疾病。流行病学数据显示，全球共有2500万人感染梅毒，每年梅毒新发病例超过1100万。此外，证据表明梅毒的先天传播是发展中国家导致胎儿和围产儿死亡的首要原因；而梅毒感染会增加人免疫缺陷病毒传播和获得，因此梅毒是重要的全球性健康问题。
根据感染梅毒的时间分为早期梅毒(2年内)和晚期梅毒(2年以上)。但由于临床超过70％的梅毒感染者缺乏临床表现，被称为潜伏感染。不同病期梅毒治疗方案不同，但由于潜伏梅毒缺乏临床表现，患者往往不知道具体感染时间，因此对梅毒进行正确分期有利于帮助临床指导治疗和后续的随访。
目前常用的梅毒诊断检测方法有两种:(1)非梅毒螺旋体抗体检测；(2)梅毒螺旋体抗体检测。然而，以上这些方法均无法区分梅毒感染时间，无法正确诊断出患者是早期或晚期感染，影响的临床的诊断与治疗。
因此，亟需开发一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒。利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒TP0136重组蛋白，建立检测TP0136抗体的荧光素酶免疫共沉淀方法，并组装成试剂盒，基于梅毒感染者TP0136抗体水平来区分梅毒病期，有利于指导临床合理用药，避免过度治疗，为梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，包括以下组分：
(1)样本稀释液；
(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136抗原组成的融合蛋白液；
(3)proteinA/G包被的酶标板；
(4)洗涤液；
(5)荧光素酶底物。
优选地，所述样本稀释液为2％脱脂牛奶。
优选地，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得TP0136抗原基因片段；
b、将获得的TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
融合蛋白液是稀释后的融合蛋白，这个稀释液也就是细胞裂解液，只是在细胞裂解之前要要保证融合蛋白的浓度，所以用量少。裂解后再调整至使用浓度，调整浓度后的融合蛋白液再放置试剂盒中，这样试剂盒检测过程就方便了(不需要再去检测蛋白的浓度)。
优选地，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
优选地，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4 PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
优选地，所述洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，加水定容至1L，灭菌。
优选地，所述荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用荧光素酶免疫共沉淀法，根据荧光强度可以用于检测梅毒发病时期，该方法快速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
本发明通过检测TP0136抗体水平区分梅毒感染时期，弥补了梅毒分期诊断检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不对本发明要求保护范围的构成限制。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常规的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例
一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，包括以下组分：(1)样本稀释液；(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。
其中，样本稀释液为2％脱脂牛奶。
融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得TP0136抗原基因片段；
b、将获得的TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒(PlasmidPlus Midi Kit，Qiagen)提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量(条带无拖尾现象，条带大小正确)，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度(OD260/OD280＝1.8～2.0时纯度高，质粒浓度ng/ml＝OD260×50ng/ml×稀释倍数)；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核酸转染试剂(lipofectamine 2000，invitrogen)：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
融合蛋白液是稀释后的融合蛋白，这个稀释液也就是细胞裂解液，只是在细胞裂解之前要要保证融合蛋白的浓度，所以用量少。裂解后再调整至使用浓度，调整浓度后的融合蛋白液再放置试剂盒中，这样试剂盒检测过程就方便了(不需要再去检测蛋白的浓度)。
上述步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4 PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，加水定容至1L，灭菌。
荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
下面对本实施例的一些细节作详细介绍：
1、TP(Nichols株)的培养和基因组DNA的提取
将TP(Nichols株)接种于3月龄新西兰兔睾丸，接种前保证每只兔的梅毒血清学试验检测结果阴性，予以不含抗生素的饲料和水喂养，4周后无菌取兔睾丸浸于无菌生理盐水并清洗后，用无菌剪刀将睾丸组织剪碎后置于EP管中，通过暗视野显微镜鉴定，若发现白色、折光力强、纤细的螺旋状微生物，螺旋整齐，具有蛇行、旋转、伸缩等缓慢而规律的运动方式，即可判为Tp。
经鉴定后的组织样本按照基因组DNA提取试剂盒说明书操作：(1)在EP管中按1:1比例加入BufferATL使组织细胞裂解；(2)吸取20μl蛋白酶K加入EP管；(3)加入200μl样本充分混匀；(4)加入200μl BufferAL，涡旋振荡15s充分混匀；(5)56℃孵育10min；(6)10000rpm离心2min，取上清；(7)加入200μl无水乙醇，涡旋振荡15s充分混匀，取上清；(8)将上清转移至吸附柱，8000rpm离心1min；(9)弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，加入500μlBufferAW1，8000rpm离心1min；(10)弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，加入500μl BufferAW2，14000rpm离心3min；(11)弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，14000rpm离心1min；(12)弃去滤液和收集管，将吸附柱放入新的收集管，开盖3min；(13)向吸附柱内悬空滴加30μlBufferAE，室温静置1min，8000rpm离心1min，-20℃保存。
2、PCR扩增
(1)引物的设计与合成
从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查询TP0136的基因序列(NC_000919)，根据引物设计原则，结合载体质粒pNLF1-N酶切位点，利用Primer Premier6.0软件遵循引物设计原则设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
(2)PCR扩增
以Tp DNA为模板，分别以TP0136为引物，PCR反应总体积为20μl，扩增体系如下：
1)DNA模板0.2μl
2)Upstream Primer(P1)0.4μl
3)Downstream Primer(P2)0.4μl
4)ddH2O 9μl
5)
Figure BDA0003285735100000051
HS DNAPolymerase 10μl
扩增体系总体积20μl。以上操作需在冰上进行，旋涡振荡混匀后短暂离心。PCR扩增参数设置：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸1min，共45个循环；最后72℃延伸10min，终止反应。扩增产物取5μl，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，剩余产物保存于-20℃冰箱备用。
(3)PCR扩增产物初步鉴定
取5μl PCR产物加入1μl 6×loading buffer，混匀，以100V电压在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后，置于凝胶成像系统中进行观察，并保存结果。
3、真核表达体系pNLF1-N-TP0136构建
将纯化回收后TP0136PCR扩增产物与pNLF1-N载体分别经Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切后进行连接，构建重组质粒pNLF1-N-TP0136。
(1)pNLF1-N质粒双酶切，酶切反应体系40μl，反应体系如下：
1)pNLF1-N 12μl
2)Eco RⅠ2μl
3)XbaⅠ2μl
4)10×Buffer 4μl
5)ddH2O 20μl
反应体系总体积40μl。振荡混匀后置于水浴锅内反应2h。
(2)PCR回收产物双酶切，酶切反应体系40μl，反应体系如下：
1)TP0136回收产物18μl
2)Eco RⅠ2μl
3)XbaⅠ2μl
4)10×Buffer 4μl
5)ddH2O 14μl
反应体系总体积40μl。振荡混匀后置于水浴锅内反应2h。
酶切结束后应用DNA纯化回收试剂盒对目的片段进行回收，操作步骤遵循试剂盒说明书。
应用分光光度计检测目的片段回收产物的浓度，根据载体与待连接的目的片段摩尔比为1:6，连接反应体系15μl，反应体系如下：
1)酶切后的pNLF1-N 5.5μl
2)酶切后的目的片段2μl
3)DNALigation solution 7.5μl
反应体系总体积15μl，振荡混匀，16℃连接12h。
4、连接产物的转化
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli DH5α感受态细胞100μl，置于冰中；
(2)预热水浴锅至42℃；
(3)加入连接产物5μl至E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰上孵育30min；
(4)42℃热激感受态细胞90s；
(5)立即转移至冰上放置2min；
(6)加入800μl 37℃预温好的无抗性LB液体培养基；
(7)37℃200rpm摇床中复苏1小时；
(8)在超净工作台中，取100μl均匀涂抹于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃倒置孵育过夜。
5.重组菌的筛选鉴定
(1)挑选10个单个菌落接种于500μl含有AMP的LB液体培养基中，37℃150rpm摇床中培养5h；
(2)重组菌的PCR鉴定：用PCR扩增验证转化子，扩增体系如下：
1)菌液1μl
2)Upstream primer(P1)0.2μl
3)Downstreamprimer(P2)0.2μl
4)Taq DNAPolymerase 5μl
5)ddH2O 3.6μl
总体积10μl。
PCR扩增参数设置：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸1min，共45个循环；最后72℃延伸10min，终止反应。扩增产物取5μl，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。取5μl PCR产物加入1μl 6×loading buffer，混匀，以100V电压在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。将转化正确的菌液取5μl接种于含有AMP的LB液体培养基，37℃200rpm培养过夜。
(3)重组质粒的提取：按照质粒小提试剂盒说明书进行操作：1)取5ml菌液，12000rpm离心1min，弃去上清液；2)向装有菌体沉淀的EP管中加入150μl溶液P1，涡旋振荡混匀；3)向EP管中加入150μl溶液P2，温和翻转使菌体裂解；4)向EP管中加入300μl溶液P5，立即温和翻转使充分混匀。12000rpm离心2min；5)收集上清液加入吸附柱CP3内，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液；6)向吸附柱CP3内加入300μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，重复此步骤；7)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min；8)吸附柱CP3开盖后放置于室温5min晾干吸附柱内残余漂洗液；9)将吸附柱CP3置于新的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置5min，12000rpm离心2min，将离心后得到的溶液重新加入吸附柱内，再次离心以增加回收效率。
(4)重组质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定。
6.序列测定
由上海生工生物科技有限公司对重组质粒pNLF1-N-TP0136碱基序列进行检测。测序结果通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与已公布的基因序列进行比对。
7.细胞转染(脂质体介导法)
(1)转染前1d接种He La细胞，细胞融合度达80％时进行转染；
(2)A液50μl：4μl Lipofectamine 3000+46μl Opti-MeM，B液50μl：3μl P3000+重组质粒+Opti-MeM；
(3)将A、B液混合后静置5min；
(4)每孔加入A、B混合液和900μl Opti-MeM，混匀，37℃培养48h。
8.细胞裂解物的制备：
(1)从待测细胞孔中将培养液吸出，用PBS仔细漂洗2次，Trypsin 37℃消化2min，1ml培养液终止消化；
(2)将细胞吸入离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；
(3)加入500μl PBS漂洗，12000rpm离心1min，弃上清；
(4)加入150μl/孔裂解液放置30min。12000rpm离心4min，取上清。细胞裂解物于-80℃保存。
9.包板：
(1)96孔白板中每孔加入50μl protein G(5μg/ml)，4℃包被过夜。PBST洗板1次；
(2)封闭：每个包被孔中加入300μl封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃孵育1h。
10.试剂盒的检测操作流程如下：
(1)加样：每孔中加入50μl以1:100样本稀释液稀释后的梅毒血清，每个样本重复3个孔，同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照；
(2)孵育：37℃恒温箱孵育1h；
(3)洗板：洗涤液洗板5次；
(4)加裂解液：每孔加入50μl以1:100样本稀释液稀释后的TP0136裂解液；
(5)孵育：37℃恒温箱孵育30min；
(6)洗板：洗涤液洗板5次；
(7)显色：避光，每孔中加入50μl furimazine荧光素酶底物；
(8)结果判读：使用Gaomax荧光光度计读取样本荧光值(light units，LU)，LU大于2000000判读为早期梅毒，结果小于等于1400000判读为晚期梅毒，结果介于1400000至2000000期间判读为灰区，需重复检测。
11.本发明试剂盒的诊断效能评价
根据血清学检查将63例梅毒患者分为早期梅毒组(感染梅毒小于2年)和晚期梅毒组(感染梅毒大于或等于2年)，其中早期梅毒组30例，晚期梅毒组33例，应用本发明试剂盒对两组患者的血清进行检测，早期梅毒患者血清样本的检测结果为2731531LU(95％CI，2013667-2694226)，晚期梅毒患者血清样本的检测结果为1201561LU(95％CI，1015958-1397697)。与晚期梅毒组相比，早期梅毒患者血液显著升高，二组之间分别相差2.27倍，差异具有统计学意义(P<0.01)。进一步根据ROC曲线计算本发明试剂盒对血液样本诊断早期梅毒的敏感度和特异度分别为81％和82％，曲线下面积为83％。LU大于2000000判读为早期梅毒，结果小于等于1400000判读为晚期梅毒，结果介于1400000至2000000期间判读为灰区，需重复检测。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)样本稀释液；
(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136抗原组成的融合蛋白液；
(3)proteinA/G包被的酶标板；
(4)洗涤液；
(5)荧光素酶底物。
2.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为2％脱脂牛奶。
3.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得TP0136抗原基因片段；
b、将获得的TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；
f、在10cm2细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，
下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。
5.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4 PBS溶解为1μg/mL的浓度；
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，加水定容至1L，灭菌。
7.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。
CN202111146621.7A 2021-09-28 2021-09-28 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒 Pending CN115184605A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111146621.7A CN115184605A (zh) 2021-09-28 2021-09-28 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111146621.7A CN115184605A (zh) 2021-09-28 2021-09-28 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115184605A true CN115184605A (zh) 2022-10-14

Family

ID=83512286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111146621.7A Pending CN115184605A (zh) 2021-09-28 2021-09-28 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115184605A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042678A (zh) * 2023-02-08 2023-05-02 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） 一种用于检测神经梅毒的融合蛋白及其试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042678A (zh) * 2023-02-08 2023-05-02 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） 一种用于检测神经梅毒的融合蛋白及其试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Roberts et al. Comparison of microscopy, culture, and conventional polymerase chain reaction for detection of Blastocystis sp. in clinical stool samples
CN115184593A (zh) 一种基于tp0136nh亚型的神经梅毒诊断试剂盒
CN116042678A (zh) 一种用于检测神经梅毒的融合蛋白及其试剂盒
CN111518740A (zh) 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法
KR20130044217A (ko) 녹농균 혈청형 분석법 및 키트 및 상기 방법 및 키트에 유용한 올리고뉴클레오타이드 서열들
CN115184605A (zh) 基于tp0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒
CN107828769A (zh) 一种耐热裂解酶MMPpgh和编码此酶的多核苷酸
CN107973857B (zh) 一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用
CN107746876B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测方法
CN106771250B (zh) 一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒
CN112062858A (zh) 一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法
CN105859891B (zh) Gfp-cd19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用
CN111197098A (zh) 一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法
CN108660144A (zh) 一种牛支原体多功能蛋白CDNPase
CN114317720B (zh) hsa_circ_0066715基因的应用及其检测方法
CN112877345B (zh) 一种半胱氨酸脱硫酶tp0614的基因及其重组蛋白与应用
CN113150086B (zh) 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用
CN109134654B (zh) 一种靶向egfr二聚化界面的单链抗体及其应用
CN115073559A (zh) 重组的非洲猪瘟病毒ep153r亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用
CN110885794A (zh) 一种马疱疹病毒1型及其应用
CN109456388B (zh) 提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护的脂肽及其激发机体免疫应答的方法和制剂
CN111190016A (zh) 一种绵羊多胎性状的elisa快速检测方法和应用
CN114395545B (zh) 一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶
CN117487004B (zh) 抗冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用
CN116769040B (zh) 鼠抗gdh杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination