CN109456388B - 提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护的脂肽及其激发机体免疫应答的方法和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，以及一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法和制剂，脂肽包括LP1或LP2；所述LP1为PamCys‑Peptide；所述LP2为Pam₂Cys‑Peptide；Peptide为肽段SPHIIETNEV。方法为将脂肽与重组HpaA混合后作用于机体。制剂包括重组HpaA和脂肽。本发明通过生物信息学预测了天然HpaA脂质化位点，根据其激活TLR2活性部位的结构，合成了两个新型脂肽LP1和LP2，无明显细胞毒性，激活TLR2活性呈现剂量依赖，可显著增强重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染的保护作用。

Description

提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护的脂肽及其激发机体 免疫应答的方法和制剂

技术领域

本发明涉及生物免疫技术领域，并且更具体地，涉及到一种可提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，以及一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法和制剂。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是上消化道的主要致病菌，并已经被世界卫生组织列为胃癌发生的I类致病因子。H.pylori在我国成人的感染率为50％-80％，以每年1％-2％的速度递增，并且传统治疗方案的疗效不佳，因此预防H.pylori感染具有重要的临床意义。H.pylori在胃内定植的关键环节是黏附，HpaA是其主要黏附素之一。相关基因组学的研究表明，HpaA与其它蛋白质并无明显同源序列。因此，HpaA已成为H.pylori重组疫苗的热门候选抗原。

重组疫苗抗原具有纯度高、特异性高、安全性好等优点，但其免疫原性弱，只有与佐剂合用才能激起强烈而有效的免疫保护应答。已有研究表明，在大肠杆菌内重组表达的HpaA具有一定的抗原性和免疫原性，但激发人体免疫应答的效果并不十分理想，对抵抗H.pylori感染的保护作用也比较有限。

天然HpaA为脂蛋白，脂蛋白可以激动Toll2样受体(Toll-like receptor 2,TLR2)，从而启动细胞内信号传导，激活固有免疫反应以及建立适应性免疫反应。脂蛋白还具有很强的活化巨噬细胞和单核细胞的能力，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应，可能促进机体的免疫应答，在一定程度上发挥佐剂作用。而重组HpaA末端缺乏了脂质化修饰可能是其免疫原性弱以及保护作用不理想的主要原因。

综上所述，寻求一种可以有效改善免疫原性弱以及保护作用不理想的物质或方法，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供一种可提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，以及一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法和制剂，其能解决现有技术的重组HpaA激发人体免疫应答的效果并不十分理想，对抵抗H.pylori感染的保护作用也比较有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明公开了一种提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，包括LP1或LP2；

所述LP1的结构式为：

所述LP2的结构式为：

其中，Peptide为肽段SPHIIETNEV。

进一步地，所述脂肽采用固相合成法反应得到。

进一步地，所述LP1合成路线为：

进一步地，所述LP2的合成路线为：

进一步地，所述脂肽在水溶液中可形成胶束。

另一方面，本发明还公开了一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法，将上述的脂肽与重组HpaA混合后得到混合液，将所述混合液作用于机体。

进一步地，所述作用于机体的方式为肌注或滴鼻。

进一步地，所述混合液为LP1与重组HpaA的混合液，或者LP2与重组HpaA的混合液。

进一步地，所述脂肽与重组HpaA混合后，重组HpaA终浓度为0.5mg/mL，所述脂肽终浓度为0.1mg/mL。

第三方面，本发明还公开了一种制剂，其包括重组HpaA和上述的脂肽。

本发明的有益效果是：

本发明通过生物信息学预测了天然HpaA脂质化位点，根据其激活TLR2活性部位的结构，合成了两个新型脂肽LP1和LP2，无明显细胞毒性，激活TLR2活性呈现剂量依赖，可显著增强重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染的保护作用。

附图说明

图1为本发明实施例1的LP1的质谱图；

图2为本发明实施例1的LP2的质谱图；

图3为本发明实施例1的LP1的电镜结果；

图4为本发明实施例1的LP2的电镜结果；

图5为本发明实施例2的LP1与LP2细胞毒性试验结果；

图6为本发明实施例3的LP1与LP2体外TLR2激活活性；

图7为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA肌注免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平的影响；

图8为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA滴鼻免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平的影响；

图9为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA肌注免疫小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体水平的影响(与重组HpaA组相比，*p<0.5)；

图10为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA滴鼻免疫小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体水平的影响(与重组HpaA组相比，*p<0.5)；

图11为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA肌注免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ水平的影响；

图12为本发明施例6的LP1与LP2对重组HpaA滴鼻免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ水平的影响(与重组HpaA组相比，**p<0.05)；

图13为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA肌注免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IL-4水平的影响；

图14为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA滴鼻免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IL-4水平的影响；

图15为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA肌注免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IL-17水平的影响；

图16为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA滴鼻免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IL-17水平的影响(与重组HpaA组相比，*p<0.5)；

图17为本发明实施例6的LP1与LP2对重组HpaA免疫小鼠胃内H.pylori定植量的影响(与重组HpaA组相比，*p<0.5)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开了一种提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，包括LP1或LP2；所述LP1为：Pam Cys-Peptide；所述LP2为：Pam₂Cys-Peptide；其中，Peptide为肽段SPHIIETNEV。

上述脂肽采用固相合成法反应得到。

具体地，所述LP1合成路线为：

所述LP2的合成路线为：

上述脂肽在水溶液中可形成胶束，大小均匀，直径约为200nm，脂肽形成的胶束在维度上与微生物相当，可能更好地被抗原递呈细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应。

本发明还公开了一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法，将上述的脂肽与重组HpaA混合后得到混合液，将所述混合液作用于机体。所述作用于机体的方式为肌注或滴鼻。所述混合液为LP1与重组HpaA的混合液，或者LP2与重组HpaA的混合液。所述脂肽与重组HpaA混合后，HpaA终浓度为0.5mg/mL，所述脂肽终浓度为0.1mg/mL。

本发明还公开了一种制剂，其包括重组HpaA和上述的脂肽。

一.本发明所述实施例的材料、试剂和来源：

1.HK-2细胞(人肾皮质近曲小管上皮细胞)ATCC，由申请人冻存；

2.3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(货号：M6494)Invitrogen，；

3.HEK-Blue^TM mTLR2细胞(货号：hkb-mtlr2)，HEK-Blue^TM Detection(货号：hb-det2)Invivogen；

4.DMEM高糖培养基(货号：SH30022.01)HyClone；

5.PBS缓冲液粉末(pH 7.3)(货号：ZLI-9062)中杉金桥；

6.二甲基亚砜(DMSO)(货号：D5879)Sigma-Aldrich；

7.脱纤维兔血 Future广州未来生物科技有限公司；

8.两性霉素B(货号：A610030)；多粘菌素B(货号：A610318)；甲氧苄啶(货号：A614206)；万古霉素(货号：A600983)生工生物；

9.幽门螺杆菌液体培养基(货号：HB8674)青岛海博；

10.酪蛋白(货号：C6554)Sigma-Aldrich；

11.红细胞裂解液(货号：RT122)；可溶型单组分TMB底物溶液(货号：PA107)天根生物；

12.HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(货号：ZB-2305)中杉金桥；

13.山羊抗小鼠IgG2a heavy chain(HRP)(货号：ab97245)；山羊抗小鼠IgG1heavychain(HRP)(货号：ab97240)abcam；

14.Mouse IFN-γELISA Kit(货号：DKW12-2000)；Mouse IL-4 ELISA Kit(货号：DKW12-2040)；Mouse IL-17A ELISA Kit(货号：DKW12-2170)达科为生物；

15.PCR Forward Primer；PCR Reverse Primer；TaqMan Probe合成于英骏生物；

16.细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302-02)天根生物

17.重组HpaA蛋白由申请人通过基因工程方法制备(“幽门螺杆菌黏附素HpaA重组蛋白的表达、纯化及晶体生长”作者：郭玲，章金勇，刘东，马博，王书峰，倪兵，李海波，刘威，吴玉章.《免疫学杂志》,2015(11):986-990.)

其它的采用市售的分析纯试剂。

二.实施例

实施例1 LP1和LP2的化学合成及分析

经生物信息学分析(UniProt蛋白数据库)，天然HpaA有单棕榈酰化(Pam)和双棕榈酰化(Pam2)两种脂质化形式，故选取与脂质化部分直接相连的10个氨基酸片段(SPHIIETNEV)分别与Pam和Pam2进行化学偶联。LP1由棕榈酰氯与固定在树脂上的肽段SPHIIETNEV直接进行酯化反应得到。LP2经六步合成得到。

经高效液相色谱法(HPLC)检测，所合成的LP1的纯度为95.58％，LP2的纯度为95.14％。经质谱鉴定，LP1和LP2的结构正确，参见图1和图2。

透射电镜分析：

考虑到LP1和LP2为双亲性分子，一端为脂溶性的脂质，另一端为水溶性的肽段，在水溶液中可能自组装成胶束。用去离子水将LP1和LP2配制成质量浓度为0.1mg/mL的溶液，滴加在覆盖有碳膜的电镜铜网上，滤纸吸去多余液体后滴加一滴2％的磷钨酸染色，待风干后，用透射电镜观察LP1和LP2的形态和大小，判断是否其形成胶束。

经过透射电镜观察，结果证实LP1和LP2均可能形成胶束，形态呈椭圆形，大小均匀，直径约为200nm，如图3-4所示。脂肽形成的胶束在维度上与微生物相当，可能更好地被抗原递呈细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应。

实施例2 LP1和LP2的体外溶血性试验和体外细胞毒性试验

体外溶血性试验：

为评价LP1和LP2的体外安全性，采用分光光度法检测合成脂肽与兔红细胞接触后是否发生溶血现象。取脱纤维兔血于含有5-10mL生理盐水的离心管中，混匀后2500rpm离心5min，弃上清液，如此反复清洗至上清液无色透明。将洗涤好的红细胞用生理盐水配制成2％的细胞悬液。在试管中，将生理盐水、去离子水和相应浓度的合成脂肽(LP1或LP2)与2％的红血球悬液混合，37℃孵育3h，2000rpm离心5min，取上清液0.1mL加入96孔板中，用酶标仪测定上清液545nm的吸光度值(OD)。

体外细胞毒性试验：

为评价LP1和LP2的体外细胞毒性，取处于对数生长期的HK-2细胞，用0.25％胰蛋白酶消化、收集并离心。DMEM高糖培养基稀释，调节细胞数至5×10⁴个/mL。加入96孔板，180μL/孔，5％CO₂,37℃条件下培养12h，实验组分别加入系列梯度浓度的合成脂肽混悬液20μL，对照组加入等量的PBS，各组平行6孔。5％CO₂，37℃条件下培养48h，每孔加入20μL新鲜配制的5g/L MTT溶液，继续孵育4h，离心弃上清后加入200μL二甲亚砜，置于振荡器上振荡1min，以570nm为检测波长，620nm为校正波长，用酶标仪测定的吸光度(A)，计算细胞存活率(cell viability)，细胞存活率＝A_实验组/A_对照组×100％。

结论：

体外溶血实验结果显示在两种脂肽浓度低于200μg/mL时，红细胞溶血率均小于5％，溶血试验结果为阴性。同时，采用噻唑蓝比色法(MTT)测定LP1和LP2对HK-2的细胞毒性，在脂肽浓度达到200μg/mL时，HK-2细胞的存活率仍然保持在95％以上，表明合成脂肽无明显细胞毒性(如图5所示)。

实施例3 LP1和LP2对TLR2激活活性的评价

为评价所合成的新型脂肽分子体外TLR2激活活性，利用HEK-Blue ^TM mTLR2细胞(购自InvivoGen)对其激活作用进行检测。

配制HEK-Blue Detection溶液：将HEK-Blue^TM Detection溶于50mL无内毒素水中，旋涡震荡使其混合均匀，37℃静置1h，用0.2μm的滤器过滤至无菌管中2-8℃保存。

LP1和LP2激活TLR2活性的测定：实验前，细胞应50-80％贴壁。在平底96孔板中每孔加入20μL待测样本，以20μL去内毒素水作为阴性对照。将HEK-Blue^TM mTLR2细胞从培养箱取出并倒掉培养基，并用10mL预热的PBS冲洗。加入3mL预热的PBS后，37℃静置1-2min，轻轻拍打培养瓶使细胞脱落，重悬细胞并计数。用预热的HEK-Blue^TM Detection溶液制备细胞悬液，稀释至细胞浓度为2.8×10⁵cells/mL，并立即向每孔加入180μL细胞悬液(5×10⁴cells)，在37℃、5％CO₂条件下孵育14h，检测OD值(620nm)观察SEAP活性。结果如图6所示，LP1和LP2均能在体外激活TLR2，并且激活TLR2活性呈现剂量依赖关系。在浓度为1μg/mL和10μg/mL时，LP2激活TLR2的活性要显著高于LP1。在浓度为100μg/mL时，两者激活TLR2的活性相当。

实施例4分组与免疫

实验动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄。

实验分组：

共7组，每组5只小鼠：①单用重组HpaA肌注组；②重组HpaA+LP1肌注组；③重组HpaA+LP2肌注组；④单用重组HpaA滴鼻组；⑤重组HpaA+LP1滴鼻组；⑥重组HpaA+LP2滴鼻组；⑦PBS组。各组重组HpaA终浓度为0.5mg/mL，脂肽终浓度为0.1mg/mL。

实验方案：

每次免疫时，肌注组免疫量为100μg/只，滴鼻组免疫量为20μg/只。于第1、8、15、22、29天滴鼻免疫小鼠，第1、15、29天肌注免疫小鼠。末次免疫14天后进行H.pylori感染。

实施例5 H.pylori感染模型的建立

H.pylori的培养:

混合抗生素的配制：称取10mg甲氧苄啶，4mg两性霉素B，0.76mg多粘菌素，20mg万古霉素，以上四种抗生素均购自生工生物，溶于10mL灭菌蒸馏水并充分混匀，4℃保存。

培养基的配制：称取幽门螺旋杆菌液体培养基3.85g，加热搅拌溶解于93mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50-55℃时，加入5mL脱纤维兔血和1mL混合抗生素，混匀备用。称取幽门螺旋杆菌液体固体培养基5.2g，制作步骤同上，并倾入无菌平皿备用。

固体培养：从-80℃低温冰箱中取出一支H.pylori SS1菌种(购自西南医院)，室温自然融化，用L棒在固体培养基上均匀涂抹菌液，微需氧条件下(10％CO₂，5％O₂，85％N₂)37℃培养24h。

扩大培养：将固体培养基上的菌落刮下，转入小烧瓶中，微需氧条件下37℃培养24h。

浓缩菌液：将已经培养24h的菌液转入离心管，3000rpm离心10min，弃上清，沉淀用少量生理盐水重悬。待革兰染色检测合格后，取少量菌液在酶标仪上检测600nm吸光度值，以公式(1OD＝1.0×10⁹CFU/ml)调整菌液浓度为2×10⁹CFU/ml，备用。

H.pylori感染BALB/c小鼠：

小鼠采用灌胃进行感染，每天1次，连续4天。感染前断食、断水12h。感染时，每只小鼠每次灌胃200μL H.pylori SS1株菌液，灌胃后2h进食进水。感染后28天取胃、眼球血，眼球血制备血清，并分离脾淋巴细胞。

实施例6重组HpaA特异性抗体的ELISA检测

样本收集：

感染28天后，摘除小鼠眼球放血并用无菌离心管收集，4℃条件下3000rpm离心15min，收集血清于无菌EP管，-80℃保存。

配制溶液：

将1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠溶于1L一级水中，配制成pH 9.6的包被缓冲液；将0.5ml的Tween-20溶于1L PBS中，配制成PBST洗液；将PBST与酪蛋白按100ml：0.5g混匀，配制成抗体稀释液；将PBS与酪蛋白按100ml:1g混匀，配制成封闭液；将浓硫酸与一级水体积按1:8于通风橱中混匀，配制成终止液。

抗原包被：

在96孔酶标板上，每孔加入100μL包被液(重组HpaA浓度为10μL/mL的碳酸盐缓冲液)，4℃包被24h。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加250μL封闭液封闭，4℃孵育24h。使用自动洗板机洗板4次，每次3min，于4℃冰箱保存。

眼球血清特异性抗体IgG的检测：

为探究合成脂肽对机体的体液免疫应答水平的影响，将LP1和LP2分别与重组HpaA物理混合，通过肌注(图7)和滴鼻(图8)两种途径免疫小鼠。肌注组和滴鼻组小鼠分别按1：1000和1：50比例稀释血清。第一列每孔加入200μL血清稀释液，其余列每孔加入100μL抗体稀释液，进行1：1梯度稀释，37℃孵育1h。自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体稀释液(1:5000)100μL，37℃孵育40min。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入100μL可溶型单组分TMB底物溶液，室温避光反应15min。每孔加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应。用96孔酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

检测结果图7-8所示，肌注和滴鼻免疫后小鼠血清IgG抗体水平较单用重组HpaA组无明显提高，表明二者并不能对重组HpaA免疫小鼠的特异性IgG抗体水平产生显著影响。

眼球血清特异性抗体IgG1、IgG2a的检测：

为进一步探究合成脂肽与重组HpaA物理混合后可能增强的特异性细胞免疫应答类型，检测了血清中特异性IgG1和IgG2a的表达水平。肌注组小鼠按1：1000比例稀释血清，滴鼻组小鼠按1：50比例稀释血清。每孔加入100μL血清稀释液，重复2孔。37℃孵育1h，自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入山羊抗小鼠IgG2a heavy chain(HRP)稀释液(1:20000)或山羊抗小鼠IgG1heavy chain(HRP)稀释液(1:20000)100μL，37℃孵育40min。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光反应15min。每孔加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应。用96孔酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

结果如图9-10所示，LP2在肌注和滴鼻免疫时均可以显著提高血清中特异性IgG2a的表达水平(图10)，提示LP2与重组HpaA物理混合后可以提高Th1型细胞免疫应答。

实施例7小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ、IL-4和IL-17的表达水平检测

为评价合成脂肽诱导重组HpaA特异性细胞免疫应答的强度，检测了小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子的表达水平。脾淋巴细胞悬液制备：

无菌条件下取出小鼠脾脏，加入10mL PBS缓冲液研磨，以200目不锈钢筛网滤过，移入15mL离心管。1500rpm离心5min，弃上清。加入3mL红细胞裂解液，重悬10min。加入10mLPBS缓冲液洗涤，1500rpm离心5min，弃上清。加入10mL PBS缓冲液，重悬。吸取细胞悬液并计算活细胞数目。每孔加入1mL细胞悬液和50μL重组HpaA溶液(0.5mg/mL)于24孔板中，根据活细胞数目(10⁶/mL)加入细胞培养基(RPMI 1640：FBS＝9：1)。37℃、5％CO₂培养48h后，1500rpm离心5min，吸取上清，得到小鼠的脾淋巴细胞悬液，于-80℃保存。

细胞因子的检测：

小鼠脾淋巴细胞培养上清中细胞因子的表达均根据试剂盒说明书进行操作，所用试剂盒分别为Mouse IFN-γELISA Kit，Mouse IL-4 ELISA Kit，Mouse IL-17A ELISAKit。标准品孔加入100ul标准品倍比稀释液，样本孔加入100ul免疫后小鼠的脾淋巴细胞悬液，空白对照孔加入100μL Dilution buffer R(1×)。所有孔加入50μL 1％的Biotinylated antibody工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃孵育90min。自动洗板机洗板4次，每次3min。100μL/孔加入1％的Streptavidin-HRP工作液。盖上封板膜，37℃孵育30min。自动洗板机洗板4次，每次3min。100μL/孔加入TMB显色液，37℃避光反应15min。100μL/孔迅速加入Stop solution终止反应，立即用96孔酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

结果如图11-16所示，LP2与重组HpaA物理混合后免疫小鼠，肌注组IFN-γ水平较单用重组HpaA组高，但无统计学差异；滴鼻组IFN-γ和IL-17水平较单用重组HpaA组有显著提高，表明LP2在滴鼻免疫小鼠时可诱导较强的Th1型和Th17型细胞免疫应答。

实施例8 Real-time PCR检测小鼠胃内H.pylori定植量：

为探究合成脂肽是否能增强重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染的免疫保护作用，采用Real-time PCR法检测了小鼠胃内H.pylori定植量。

标本的处理：

末次感染后28天处死小鼠，沿胃大弯将小鼠胃剪开，平铺于干净玻璃平皿中，无菌PBS冲洗除去胃内容物，沿胃小弯剪取一半胃组织置于冻存管中，并将冻存管迅速放入液氮中保存。

细菌基因组的提取：

向存有胃组织的冻存管中加入1mL PBS，用迷你珠组织研磨器对胃组织标本进行破碎，8000rpm离心5min，弃上清收集沉淀；采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取匀浆沉淀中的基因组DNA，-80℃保存备用。同时抽提新培养的H.pylori SS1基因组DNA用作标准品的制备。

引物和探针的设计：

以提取的基因组DNA为模板，定量扩增H.pylori 16S rRNA的DNA片段的保守序列，计算小鼠胃内H.pylori的拷贝数。根据16s rDNA设计引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:3)如下：

P 1:5′-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3′(31bp)

P 2:5′-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3′(28bp)

TaqMan Probe:5′-FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA-3′

引物和探针均由英骏生物技术有限公司合成，PAGE纯化。

Real-time PCR反应体系配制和反应条件如表1所示。

表1

标准品制备：

以新提取的H.pylori SS1基因组DNA为模板，PCR条件扩增16S rDNA，胶回收PCR产物。通过紫外分光光度计测量回收产物中目的基因的浓度，并计算拷贝数。通过10倍梯度稀释，制备10³copies/μL、10⁴copies/μL、10⁵copies/μL、10⁶copies/μL和10⁷copies/μL的标准品。

H.pylori的定量测定：

以提取的细菌总DNA和5个浓度梯度的标准品为模板，利用以上反应条件进行real-time PCR检测。通过Bio-Rad CFX Manager软件绘制标准曲线，并获得线性回归方程，计算小鼠胃中H.pylori 16S rDNA的拷贝数。反应完毕后取9μL反应产物+1μL 10×DNALoading buffer混匀，1.5％琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段。

结果如图17所示，LP2滴鼻组小鼠胃内H.pylori定植量显著下降，明显低于其它组，差异有统计学意义，表明LP2滴鼻免疫小鼠可显著增强重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染的保护作用。

综上所述，本发明实施例所公开的可提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，以及一种激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答的方法和制剂，基于脂蛋白激活TLR2过程主要依赖于脂质部分以及与其相连的数个氨基酸，根据HpaA激活TLR2活性部位的结构，采用固相合成法合成两个新型脂肽LP1和LP2。经HPLC分析与质谱鉴定，二者纯度达标、结构正确，透射电镜下均可见直径约200nm的胶束，提示可能易被机体的免疫细胞识别和吞噬。合成脂肽浓度低于200μg/mL时，体外溶血试验中细胞溶血率小于5％，细胞毒性试验中细胞存活率大于95％，表明LP1和LP2体外安全性良好。LP1和LP2均能在体外激活TLR2，并且呈现剂量依赖性，提示模拟天然HpaA末端脂质化结构的合成脂肽可能通过激活TLR2来发挥免疫佐剂作用。LP2与重组HpaA物理混合滴鼻组小鼠胃内H.pylori定植量显著下降，并且血清IgG2a、脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-17细胞因子表达水平明显升高，提示LP2提高重组HpaA对H.pylori感染的免疫保护作用与特异性细胞免疫应答密切相关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护的脂肽及其激发机体免疫应答的方法和制剂

<130> ZH-2018258

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttgttagag aagataatga cggtatctaa c 31

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cataggattt cacacctgac tgactatc 28

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgccagca gccgcggt 18

Claims (9)

1.一种提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护作用的脂肽，其特征在于，包括LP2；

所述LP2的结构式为：

Peptide为肽段SPHIIETNEV。

2.根据权利要求1所述的脂肽，其特征在于，所述脂肽采用固相合成法反应得到。

3.根据权利要求1所述的脂肽，其特征在于，所述LP2的合成路线为：

4.根据权利要求1所述的脂肽，其特征在于，所述脂肽在水溶液中可形成胶束。

5.权利要求1所述的脂肽在制备激发机体对幽门螺旋杆菌免疫应答制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为脂肽与重组HpaA的混合液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述混合液中重组HpaA终浓度为0.5mg/mL，所述LP2的终浓度为0.1mg/mL。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂采用肌注或滴鼻方式。

9.一种制剂，其特征在于，包括重组HpaA和权利要求1所述的脂肽。

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