CN114839368A

CN114839368A - 一种猪盖他病毒间接elisa抗体检测方法及其试剂盒

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Publication number: CN114839368A
Application number: CN202210358533.1A
Authority: CN
Inventors: 魏建超; 马志永; 孙卿; 张妍; 邱亚峰; 李蓓蓓; 李宗杰; 刘珂; 邵东华
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2022-08-02

Abstract

本发明提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒，属于病毒检测技术领域。鉴于现场检测过程中缺少快速检测GETV特异性抗体的方法，本发明建立一种盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是将合成的E2基因克隆至原核表达载体pCold I中构建重组质粒pCold I‑E2，通过对重组质粒pCold I‑E2进行IPTG低温诱导蛋白表达，然后包被纯化好的E2蛋白即可用于GETV特异性抗体的快速检测。实验证实，本发明制备得到的重组E2蛋白具有良好抗原性，所建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、稳定的特点，非常适宜于GETV抗体的现场检测。

Description

一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒，属于病毒检测技术领域。

背景技术

盖他病毒(Getahvirus，GETV)最早于1955年从马来西亚的蚊子体内所分离得到，被命名为GetahvirusMM2021。至今已发现该病毒广泛分布于亚洲、东欧和澳大利亚等地区；从热带气候到北部冻原，从北半球到南半球，GETV分布呈生态系统多样性。

GETV主要是靠媒介传播，其中蚊子是主要媒介。血清学的证据显示，GETV抗体普遍存于脊椎动物的血液中。GETV的致病机理十分复杂，它的主要宿主是脊椎动物中的马和猪。1980，首次证明了赛马的发病与盖他病毒有直接关系。赛马呈现高烧不退，直肠温度持续38.5℃-40℃，全身长有红斑，后腿红肿行动不便。仔猪感染GETV后，可引起仔猪厌食，皮肤红变，震颤，甚至死亡，妊娠母猪感染GETV后会引起母猪繁殖障碍，出现流产，产生死胎、木乃伊胎或产生畸形胎、弱胎等。

由于GETV可导致马、猪患病，但现有文献尚不能使人们充分了解该病毒在我国猪群和人类中的流行情况和临床特点，更不清楚GETV对人类的致病性，导致难以获得对其疫苗和靶向抗病毒药物研究的许可。由于生活环境的多样性，使得GETV能够快速变异，并通过蚊虫进行传播，所以有必要加强对GETV监测与防控，建立准确而特异的GETV快速检测技术，对其进行实时观测和进一步研究。

临床检测需要满足快速灵敏、操作简便、重复性良好、消耗时间较短、可大批量操作和易于标准化等特点。而当前针对GETV的检测方法虽然有很多，如病毒分离最准确，但耗时比较长；血凝抑制试验、中和实验虽不需要昂贵仪器，但费力又费时且可能与其他甲病毒之间存在交叉反应。

GETV为单链线形正股RNA，长度约为11-12kb。它编码4种非结构蛋白nsP1，nsP 2、nsP 3、nsP4和5种结构蛋白E1、E2、E3、6K、衣壳蛋白Cap。E基因所编码的E蛋白则是 GETV最关键的蛋白，E1和E2基因保守性强，所编码的蛋白共同构成了GETV的包膜蛋白，包膜蛋白除了含有GETV的糖基化位点外还具有宿主细胞受体和抗体的识别位点。E2蛋白作为一种重要的蛋白质日益受到关注。基于此，特提出本发明。

发明内容

近年来猪群中GETV流行不断加重，而现场检测过程中缺少快速检测GETV特异性抗体的方法，因此本发明提供一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是将合成的E2基因克隆至原核表达载体pCold I中构建重组质粒pCold I-E2，通过对重组质粒pCold I-E2进行 IPTG低温诱导蛋白表达，然后包被纯化好的E2蛋白即可用于GETV特异性抗体的快速检测。本发明通过实验证实，本发明制备得到的重组E2蛋白具有良好的抗原性，所建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、稳定的特点，非常适宜GETV抗体的现场检测。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以E2基因作为目的基因，采用人工直接合成抗原结构域进行原核表达制备得到重组E2抗原，以E2蛋白为包被抗原，建立了间接 ELISA抗体检测方法。

上述所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法中，重组E2抗原的制备方法具体包括如下步骤：

(1)将合成基因pUC57-E2质粒和表达载体pColdⅠ(+)空载体进行EcoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切，获得具有粘性末端的E2基因和pCold Ⅰ，依次将各组分加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴5h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段；E2蛋白的编码氨基酸序列如SEQ.No:1所示，E2蛋白的氨基酸序列如SEQ.No:2所示；

(2)鉴定正确的胶回收产物目的基因GETV-E2和表达载体pCold Ⅰ用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，后将产物转化感受态细胞BL21，菌液均匀涂于含有氨苄霉素的LB琼脂平板进行培养；

(3)阳性克隆质粒的酶切鉴定：挑取单菌落，使用含氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，37℃ 200rpm震荡10-12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用EcoR I和Xba Ⅰ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，使用EcoR I单酶切克隆菌做阴性对照，双酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，将所含阳性条带的菌液进行测序；

(4)IPTG诱导E2蛋白的表达

取测序正确的阳性菌液逐级接种到含氨苄霉素的LB肉汤培养基，37℃200rpm震荡过夜，至OD＝0.4-0.6，加入5μl 0.1mmol/L IPTG于18℃低温诱导过夜,即可诱导E2蛋白的表达。

优选地，步骤(1)中pUC57-E2质粒酶切反应体系组成为pUC57-E2 45μl，EcoR Ⅰ 2μl，Xba I 2μl，10×M Buffer 10μl，ddH₂O 41μl；pColdⅠ(+)酶切反应体系组成为pColdⅠ(+)35μl，EcoR Ⅰ 1μl，Xba Ⅰ 1μl，10×M Buffer 8μl，ddH₂O 35μl；

优选地，步骤(2)中连接反应体系为GETV-E2 4μl，pCold Ⅰ 1μl，5×LigationBuffer2μl，T4 DNA Ligase 2μl，ddH₂O 1μl；

优选地，步骤(3)中酶切反应体系组成为pCold I-E2 5μl,EcoR I 1μl，Xba I 1μl， 10×M Buffer 2μl，DdH₂O 11μl。

上述所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法中，重组E2抗原在包被之前需进行分离纯化，其具体包括如下步骤：将菌液在转速条件为5000rpm下离心5min得到细菌沉淀，使用缓冲液吹散，置于在冰上超声破碎，离心后得到包涵体沉淀，使用含有尿素的缓冲液纯化含有重组E2抗原的包涵体，使用镍离子螯合层析柱纯化得到的重组E2抗原。

上述所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法中，使用碳酸盐缓冲液将重组E2蛋白稀释并包被。具体包括如下步骤：向重组E2蛋白稀释中加入碳酸盐缓冲液，放入4℃冰箱过夜，弃去包被液，使用PBST洗涤3次后加入1％BSA进行封闭，封闭结束后，洗涤并加入一抗血清进行孵育，孵育结束后洗涤，向其中加入羊抗猪HRP标记二抗进行孵育，洗涤后加入TMB底物显色液37℃避光显色5-10min，加入H₂SO₄终止显色，酶标仪上测定OD_450nm值。

优选地，间接ELISA抗原包被量为6.13μg/mL，一抗稀释度为1∶100；抗原包被条件为 4℃12h；封闭时间为37℃1h；一抗血清孵育条件为37℃1h；酶标二抗的最佳稀释度为 1∶10000，作用条件为37℃1h。

一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其包括：(1)重组E2蛋白；(2)碳酸盐缓冲液；(3)一抗血清；(4)羊抗猪HRP标记二抗。

本发明所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法可以在早期检测人和多种动物血清中是否存在GETV抗体。基于此，本发明提供一种上述方法在生物体内GETV抗体早期检测中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下有益的技术效果：

(1)本发明参考GenBank(EU015066)Getah virus SH05-6中结构蛋白E2的全基因组序列，对其进行密码子优化后人工合成该基因。将合成的E2基因克隆至原核表达载体pCold I 中，成功构建重组质粒pCold I-E2。通过对重组质粒pCold I-E2进行IPTG低温诱导蛋白表达，SDS-PAGE和Western Blot分析，结果可见在相对分子质量46KD处出现目的条带，与预期相符，且蛋白表达量占大肠杆菌表达总量的80％，E2基因在大肠杆菌低温表达系统中获得了高效表达。对E2蛋白进行纯化，并优化了纯化条件，最终获得了高纯度的盖他病毒 E2蛋白。

(2)通过包被纯化好的E2蛋白，初步建立检测盖他病毒E2蛋白的间接ELISA方法，之后通过优化条件最终建立了ELISA方法，并评价该方法的敏感性、特异性、重复性和符合率。结果显示，此种间接ELISA抗体检测方法，其灵敏度高达1:12800；与日本乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒等猪的主要病毒阳性血清无交叉反应；所检测的样品在不同批次内的变异系数在3.29％-5.81％之间，而在同一批次不同时间段内的变异系数在2.25％-6.16％之间，均小于10％，说明该方法重复性良好；与间接免疫荧光实验的符合率94.96％。可见，本发明制备的重组E2蛋白具有良好抗原性，建立的间接ELISA抗体检测方法具有灵敏、特异、稳定的特点，适宜于GETV抗体的现场检测。

附图说明

图1重组质粒pCold I-E2蛋白的诱导表达以及Western Blot分析，其中M:蛋白质分子质量标准；1：重组菌株(pColdⅠ-E2)未诱导表达的SDS-PAGE；2:重组菌株(pColdⅠ-E2)诱导表达后的SDS-PAGE；3：重组菌株(pColdⅠ-E2)诱导表达的上清SDS-PAGE；4：重组菌株(pColdⅠ-E2)诱导表达的包涵体SDS-PAGE；5:纯化后的E2蛋白；6：重组菌株(pColdⅠ- E2)未诱导表达的Western Blot(一抗为鼠源His单抗，二抗为羊抗鼠-IgG-HRP)；7：纯化后的E2蛋白的Western Blot(一抗为鼠源His单抗，二抗为羊抗鼠-IgG-HRP)；8：纯化后的E2 蛋白的Western Blot(一抗为GETV阳性血清抗，二抗为羊抗猪-IgG-HRP)；9：重组菌株 (pColdⅠ-E2)未诱导表达的Western Blot t(一抗为GETV阳性血清抗，二抗为羊抗猪-IgG- HRP)

具体实施方式

为进一步描述本发明，以下通过具体实施例进一步说明本发明的检测方法，但本领域技术人员应能知晓，所述实施例不以任何方式限定本发明的专利保护范围。

本发明以下实施例中，所使用的耗材来源如下所述：本实验所用的克隆菌E.coliDH5α，表达菌E.coli BL21(DE3)均由中国农业科学院上海兽医研究所公共卫生实验室保存； PMD18-T Simple Vector购自大连宝生物有限公司；原核表达质粒pCold Ⅰ由中国农业科学院上海兽屋研究所公共卫生实验室保存；原核克隆载体PUC57由北京金唯智有限公司提供。

日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)阳性血清由中国农业科学院上海兽医研究所保存；猪GETV阳性血清和猪GETV阴性血清由中国农业科学院上海兽医研究所保存，相关背景信息见表1。337份猪临床血清由中国农业科学院上海兽医研究所采集，相关的背景信息见附录。

表1 猪JEV阳性血清和猪GETV阴、阳性血清背景信息

下述实施例目的基因片段1278bp由北京金唯智有限公司合成并提供；PCR引物由上海 nvitrogen公司合成；质粒DNA小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；蛋白质预染Marker和ECL发光试剂盒购自美国Thermo scientigic公司；DNA分子质量标准，上样缓冲液购自上海天更生物有限公司；镍离子亲和柱购自美国BIO-RAD生命医学产品有限公司；T4连接酶，限制性内切酶以及相应的buffer均购自大连Takara有限公司；HRP标记羊抗兔IgG购自美国Sigma Aldrich公司；鼠源His单抗购自Abmart生物医药(上海)有限公司。

实施例1重组质粒pColdⅠ-E2的原核表达载体的构建

(1)E2主要的抗原结构域的密码子优化与基因合成

参考GETV SH05-6株(Gen Bank：EU015066)的结构蛋白E2序列，选取主要的抗原结构域，彩色下划线表示抗原结构域A、B和C，其两侧是beta-ribbon连接。按照大肠杆菌的密码子优化并合成基因序列(全长共编码292个氨基酸)。其编码氨基酸序列如SEQ.No:1所示，其氨基酸序列如SEQ.No:2所示。上述优化后的E2基因序列由上海华津生物科技有限公司合成后，直接克隆到质粒pUC57中获得含有合成E2基因质粒pUC57-E2。

为了获得具有粘性末端的E2基因和pColdⅠ，先将含有合成E2基因质粒pUC57-E2和表达载体pColdⅠ(+)空载体进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，依次将各组分加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴5h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段，载体酶切反应体系表2和表3所示。

表2 pUC57-E2质粒酶切反应体系组成

表3 pColdⅠ(+)质粒载体酶切反应

(2)表达载体pColdⅠ和目的基因E2的连接、转化

将步骤(1)中鉴定正确的胶回收产物目的基因GETV-E2和表达载体pCold Ⅰ用T4DNA 连接酶于16℃连接过夜，后将产物转化感受态细胞BL21，连接体系如下：

表4 表达载体pCold Ⅰ和目的基因E2的连接反应体系

(3)连接产物转化感受态细胞：取感受态细胞BL21，加入以上连接产物(不应超50ng)，混匀，冰浴30min；后置42℃水浴锅，准确计时90秒(此时不能摇动转化管)；计时结束转化管迅速置于冰上2-3min；后向转化管中加入800μl LB肉汤，37℃震荡60min；4℃，5000rpm离心2-3min，留下200μl菌液吹打均匀，使用灭菌涂布棒将菌液均匀涂于含有氨苄霉素的LB琼脂平板上，室温正面放置平板3-5min直到菌液被琼脂平板完全吸收，37℃培养箱中倒置平板培养过夜。

其中感受态细胞E.coli DH5α的制备方法具体包括下述步骤：

a、在培养平皿内挑取一个单菌落接种于装有4Ml LB肉汤的灭菌试管中，于巧37℃振荡培养过夜；

b、按照1:100比例将培养物转移至200mL的灭菌LB肉汤三角瓶中，于37℃下振荡培养 1-2h，使其OD＝0.4-0.6，此时细菌处于对数生长期；

c、在超净工作台中将菌液转移到已预冷的50mL无菌离心管中，放置于在冰上10min。预冷低温低心机，4℃，4000rpm离心10min，弃上清收集菌体沉淀；

d、在无菌离心管中加入30mL冰冷的0.1M CaCl₂溶液，并轻轻吹打，冰浴放置0.5-1h。 4℃，4000rpm离心10min弃去CaCl₂溶液收集菌体沉淀；

e、每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，重浮的E.coli DH5α每100μl 分装于无菌的EP管中；此时的感受态细胞可直接进行转化操作，如需保存则加入无菌甘油使其终浓度为20％-30％，放于-80℃保存。

(4)阳性克隆质粒的酶切鉴定

挑取单菌落，置5mL含1％氨苄青霉素的LB肉汤中，37℃200rpm震荡10-12h。后用小量质粒提取试剂盒进行质粒提取，保留500μl菌液备用测序。使用EcoR I和Xba Ⅰ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，EcoR I单酶切克隆菌做阴性对照，具体酶切体系如下：

表5 重组质粒酶切反应体系

将双酶切后产物琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，将所含阳性条带的菌液取部分送生工上海生物工程有限公司测序，其余菌液冻存备用，阳性质粒命名为pColdⅠ–E2。

实施例2 重组质粒pColdⅠ-E2的原核表达及表达鉴定

(1)IPTG诱导E2蛋白的表达：取测序正确的阳性菌液接种5ml LB肉汤中(100g/mL氨苄霉素)，37℃200rpm震荡过夜。取过夜培养菌液以1:50体积比转接于5mL含1％氨苄青霉素的新鲜的LB肉汤培养基中，37℃200rpm继续培养1-2h，使其OD＝0.4-0.6，后加入5μl0.1mmol/L IPTG于18℃低温诱导过夜，同步设立不加IPTG诱导的菌液及加IPTG的空载体转化的菌液作为对照。

(2)pCold–E2蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析有无表达

蛋白的前期处理:取IPTG诱导和未诱导的菌液各500μl，12000rpm离心1min，弃上清收集菌体沉淀。向EP管中加入无菌的160μl PBS重悬菌体，再向每支EP管中加入40μl 5×SDS-PAGE电泳上样buffer混匀，置于沸腾的水中煮10min。

SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达：E2蛋白的蛋白质分子质量为46kd，根据蛋白大小选择12％的分离胶，分离胶选择见表6所示。按所需浓度的配置好SDS-PAGE凝胶，配方见表7，表8所示。具体操作步骤如下：安装好电泳仪，在槽中加入电极泳缓冲液，按一定顺序在加样孔中加入10μl样品。根据电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般选用1.5mm间隙10孔的上样量<20μl/孔。打开电源将电压调到80V，30min，直到可看见样品呈现一条直线排列于胶体分界线上，然后再将电压调到120V，1-1.5h直到样品电泳到胶底部为止。将凝胶取下放入容器中，加入考马斯亮蓝染色液染色0.5-1h后将染色液倒出，加入脱色液脱色，每30min换一次脱色液，加速脱色直到胶体完全透明为止。脱色完成后，可使用凝胶成像仪进行拍照、分析、估算蛋白分子质量。

表6 分离胶体浓度的选择

表7 12％分离胶配方

表8 5％浓缩胶配方

实施例3重组E2蛋白的分离纯化

通过SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，本发明所表达的pColdⅠ–E2蛋白以包涵体形式存在，所以选用含有尿素的缓冲液进行纯化操作。

(1)包涵体的前期处理

a.提前低温诱导200ml阳性克隆菌，表达过夜后，将菌液放置于离心机中，5000rpm离心5min，弃上清，得到细菌沉淀；

b.向沉淀加入40ml的binding buffer，吹打开菌体沉淀，且不应有菌体块漂浮于液体中，放于在冰上超声(30-45min，工作3s，停2s，70％功率)，直到液体呈现白色，即菌体破碎包涵体释放；

c.将超声后的菌液放于低温离心机中，4℃，8000rpm，离心30min，弃上清，得到包涵体沉淀；

d.加入30ml含2M尿素的binding buffer洗涤包涵体沉淀，4℃，8000rpm，离心30min，弃去上清，留下沉淀再次洗涤；

e.加入30ml含4M尿素的binding buffer洗涤包涵体沉淀，4℃，8000rpm，离心30min，弃去上清，留下沉淀再次洗涤；

f.30ml含6M尿素的binding buffer重悬包涵体沉淀，放于4℃冰箱过夜溶解沉淀；

g.过夜溶解后放于低温离心机中，4℃，8000rpm，离心30min，弃沉淀，收集上清。

(2)蛋白的纯化及洗脱

a.用0.22μm的滤膜过滤上清及所用试剂，并置于冰上备用；

b.将His Trap镍离子柱安装到亲和层析纯化仪中，本实验使用的是5ml镍离子柱将流速调至4ml/min，并使用超纯水赶出管中所有气泡；

c.依次加入50ml含6M尿素的Elution Buffer，50ml 20％乙醇清洗His Trap镍离子螯合层析柱；

d.依次加入50ml 1M NaOH，50ml H₂O清洗His Trap镍离子螯合层析柱；(5)依次加入 25ml 0.1M EDTA，50mlH₂O清洗His Trap镍离子螯合层析柱；

e.加入25ml 0.1M NiSO₄重新填充镍离子螯合层析柱，用50ml H₂O His Trap镍离子螯合层析柱；

f.用25ml含6M尿素的Binding Buffer平衡His Trap镍离子螯合层析柱；

g.过滤后的上清过柱上样，上样时的流速调至2ml/min；

h.加入30ml含6M尿素的Binding Buffer平衡His Trap镍离子螯合层析柱；(10)加入30ml 含6M尿素的Wash Buffer清洗蛋白；

i.加入含6M尿素的Elution Buffer洗脱蛋白，使用1.5ml收集蛋白，每管1ml。收集的蛋白保存于-80℃冰箱中。

(3)Western Blot分析重组蛋白的活性

如上SDS-PAGE凝胶电泳结束后，弃去胶中无用部分。将用NC膜、两块海绵垫、下层胶、六张滤纸浸泡在转印缓冲液，用镊子依次夹取海绵垫、三层滤纸、胶、NC膜、三层滤纸、海绵垫置于电泳夹板，用玻璃棒小心赶出气泡。将夹板夹紧安放于转印电泳槽中， 240mA转印2h-2.5h，转印过程中注意用冰袋辅助降温；待转印结束后，带手套将膜置于封闭液中室温下封闭1-2h或4℃封闭过夜；封闭结束后倒出封闭液，TBST对膜洗涤3次 30min，每10min更换一次TBST(期间用TBST按1:5000稀释His标签的鼠源单抗为一抗)；洗涤结束，加入提前稀释好的一抗，用量为能覆盖膜即可，常温作用1h或4℃过夜；回收一抗，TBST液洗涤3次，期间每隔10min换一次洗涤液；加入1:10000稀释的兔抗鼠 HRP-IgG二抗，室温摇床作用1.5h；弃二抗，TBST再次洗涤，5次，期间每隔10min换一次洗涤液；参照ECL化学发光试剂盒操作进行显色；待条带显现后，放入清水漂洗、定影液定影3-5min后，清水漂洗晾干，标定Marker后进行后续分析。

(4)蛋白浓度的测定

(1)根据样品数量，配制BCA工作液(A:B＝50:1)，混匀。BCA工作液室温24h内稳定。

(2)PBS完全溶解蛋白标准品，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按下表加入到96孔板中，加用于稀释标准品的溶液至20ul。

表9 加样表

(3)在96孔板的样品孔中加入18ul稀释液，再加2ul样品。

(4)各孔中加入200ulBCA工作液，37℃，30min。也可室温2h或60℃30min。

(5)测定A562nm的OD值。根据标准曲线计算样品浓度。

实施例4重组质粒pCold I-E2蛋白的诱导表达、纯化及免疫原性分析

将鉴定好的重组质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后收集菌体，菌体经过超声破碎分别收集上清和沉淀，沉淀经如上处理后得到包涵体蛋白，同时设置未经IPTG诱导pColdⅠ- E2作为阴性对照。结果显示，出现了相对分子质量约为46kd的目的条带，即是重组蛋白E2，表明重组质粒pColdⅠ-E2在BL21中表达成功，且蛋白表达在包涵体中。见图1的泳道1-4。

将处理好的pColdⅠ-E2阳性菌液，经6M尿素的1×Binding Buffer对包涵体溶解过夜后，使用亲和层析纯化仪对表达蛋白进行纯化，以未诱导的pColdⅠ-E2作为阴性对照，经SDS- PAGE凝胶电泳检测纯化结果。结果显示纯化后的蛋白条带单一，纯度高。结果参见图1中的泳道5。

重组pColdⅠ-E2蛋白Western Blot分析其免疫原性：将纯化的pColdⅠ-E2目的蛋白常规处理后经SDS-PAGE电泳，后使用商品化的鼠源His单抗以及GETV阳性血清作为一抗进行 Western Blot分析。如图所示，重组E2在46KD处出现目条带，且条带单一，说明本发明纯化的目的蛋白具有免疫原性，能与GETV抗体结合，可以进行后续研究。见图1的泳道6、 7、8、9。

实施例3基于原核表达重组盖他病毒E2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

(1)包被抗原、封闭液、一抗血清、酶标二抗和底物作用条件的确定

最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定：用包被液(重组E2蛋白稀释)将重组E2蛋白稀释并包被，分别稀释成196.00、98.00、49.00、24.50、12.25、6.13、3.06μg/mL共7个浓度，每孔加入100μL的抗原包被液后放入4℃冰箱过夜。次日取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5min，洗涤完成后，弃掉洗涤液，加入100μL/孔1％BSA进行封闭，放置于37℃封闭1h。封闭结束后，洗涤并加入GETV阳性及阴性血清，血清分别按1： 100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200共6个稀释度进行稀释，倍比稀释后进行方阵滴定，并放置于37℃孵育1h。把液体拍掉，进行洗涤，之后每孔加入100μL羊抗猪 HRP标记二抗(1：10000稀释)，37℃孵育1h。洗涤后加入TMB底物显色液100μL/孔， 37℃避光显色5-10min后，每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止显色，在酶标仪上读取各孔 OD_450nm值，比较GERV阴阳性血清的OD_450nm值和P/N值，从而确定最适抗原包被浓度和血清稀释度。

表10 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定

最适抗原包被条件的确定：以最适抗原浓度包被酶标板，每孔加入100μL抗原包被液，然后进行抗原包被条件的优化。将ELISA板包被孔分成4组，第一组：4℃，包被8h；第二组：4℃，包被10h；第三组：4℃，包被12h；第四组：4℃，包被14h。比较这4组的 GETV阴性和阳性血清OD_450nm值和P/N值，以确定最佳的包被条件。

表11 最适抗原包被条件的确定

最适封闭条件的确定：以最佳抗原浓度及最佳包被条件包被抗原后，将ELISA板包被孔分组，进行封闭条件的优化。用1％BSA分别在37℃条件下封闭30min；室温条件下封闭30min；37℃条件下封闭60min；室温条件下封闭60min。比较这几组的GETV阴性和阳性血清OD_450nm值和P/N值，以确定最佳的封闭条件。

表12 最适封闭条件的确定

血清的最佳作用条件的确定：在确定好最佳抗原浓度、最佳包被条件、最适封闭条件后，需要进行血清最佳作用条件的试验。将ELISA板包被分组，将血清按比例稀释好后，分别在37℃条件下封闭30min；室温条件下封闭30min；37℃条件下封闭60min；室温条件下封闭60min。比较这几组的GETV阴性和阳性血清OD_450nm值和P/N值，以确定血清的最佳作用条件。

表13 血清的最佳作用条件的确定

最适酶标二抗稀释度以及孵育条件的确定：确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、包被条件、以及封闭条件后，需要对酶标抗体的稀释度和孵育条件进行优化。HRP标记的羊抗猪抗体分别按1：2000、1：40 000、1:5000、1:6000、1:10000的稀释度行稀释，同时在每个稀释度分别在37℃条件下孵育30min；室温条件下孵育30min；37℃条件下孵育60min；室温条件下孵育60min。比较酶标抗体不同稀释倍数不同孵育条件下GETV阴性和阳性血清的OD_450nm值和P/N值，确定最佳酶标抗体稀释度以及孵育条件。

表14 最适酶标二抗稀释度以及孵育条件的确定

结果显示，经试验确定间接ELISA抗原最佳包被量为6.13μg/mL，一抗最佳稀释度为 1∶100；抗原最佳包被条件为4℃12h；最佳封闭时间为37℃1h；一抗血清最佳孵育条件为37℃1h；酶标二抗的最佳稀释度为1∶10000，最佳作用条件为37℃1h。

(2)阴阳性临界值的确定

按照前面优化好的条件包被抗原，以48份阴性的猪血清为样品，测定其OD_450nm的值，计算平均值(AV)和标准差(SD)，并利用计算公式cut-off＝AV+3SD来确定阴阳临界值。

对48份猪GETV阴性血清的OD_450nm值进行统计学分析，阴性血清OD_450nm的平均值X＝0.206，标准差SD＝0.025，根据公式计算：

(SD)，得出阴阳性临界值为0.265。因此，当被检血清的OD_450nm值≥0.265时，判定为阳性，反之则为阴性。

表15 阴阳临界值的确定

实施例4猪GETV间接ELISA抗体检测方法的性能测定

(1)特异性实验

以最优条件包被重组E2蛋白后，分别将JEV、PRRSV猪源阳性血清作1：100稀释，同时以GETV阳性血清和CIAV阴性血清为对照，稀释好的血清按100μL/孔加入酶标孔内，具体的实验操作步骤按优化后的试验条件进行。最后根据OD_450nm的值，进行结果判定。

表16 特异性实验结果

用建立的ELISA方法对GETV、JEV、PRRSV等阳性血清进行检测，结果显示，重组 E2蛋白抗原与不同病毒阳性血清反应后，OD450nm值均＜0.265，可见重组E2蛋白抗原不与上述病原的阳性血清发生非特异性结合，表明建立的ELISA方法具有较好的特异性。

(2)敏感性实验

以最佳的包被条件包被抗原，将GETV阳性血清分别按1：100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1：51200、1:102400、1：204800共12个稀释度进行稀释，用建立的GETV间接ELISA抗体检测方法进行检测，根据测定的OD_450nm值，对这种方法进行分析，比较该方法的敏感性。

表17 敏感性实验

将GETV阳性血清分别按1：100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、 1:12800、1:25600、1：51200、1:102400、1：204800共12个稀释度进行稀释，结果显示，当阳性血清稀释度为1∶12800时，OD450nm值也大于0.265，判定为阳性，说明建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性。

(3)重复性实验

选取6份血清样品，利用建立的GETV间接ELISA抗体检测方法对同一批次包被的3个不同ELISA板进行批内重复性试验；另采用3个不同批次包被的ELISA板，用该检测方法对上述6份血清样品进行批间重复性试验。计算它们的批内或批间变异系数(CV＝(标准差SD/平均值AV)×100％)，评估该检测方法的重复性。

表18 批间内重复性实验

表19 批间重复性试验

应用所建立的ELISA方法进行批内重复性试验和批间内重复性试验，进行统计学分析。结果显示，批内重复性试验最大变异系数为5.81％，批间内重复性试验最大变异系数为 6.16％，均小于10％，表明所建立的ELISA方法具有较好的重复性。

(4)符合率实验

根据收集的337份临床猪血清样品，分别用建立的GETV间接ELISA抗体检测方法和间接免疫荧光实验进行检测，计算GETV间接ELISA抗体检测方法和间接免疫荧光实验的符合率。符合率(％)＝(真阳性+真阴性)/(真阳性+真阴性+假阳性+假阴性)×100％。

表11 符合率评价结果

结果显示：这两种方法检测结果的符合率为94.96％(320/337)，详细结果见表11。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海

分中心)

<120> 一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法及其试剂盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA sequence for E2 protein

<400> 1

gcatactgtg cggactgtgg cgacggccaa ttttgttact ctccagtcgc tatcgaaaaa 60

attcgcgatg aagcttccga cggcatgatc aagattcaag tagcagcgca gattggtatc 120

aacaaaggtg gcacccatga gcacaacaaa atccgttata tcgccggtca cgacatgaaa 180

gaagctaacc gtgacagcct gcaggtgcac actagcggcg tgtgcgctat ccgtggcact 240

atgggccatt tcatcgttgc atattgcccg ccgggcgacg aactgaaagt tcagttccag 300

gacgccgagt ctcacaccca ggcttgcaaa gttcagtaca agcacgcccc gggcggcggt 360

ggctccccgc cggatatccc ggatattacc ctgctgtccc agcaaagcgg taacgtgaaa 420

atcactgctg gcggcaaaac catccgctat aactgcacct gcggctccgg taacgtcggc 480

actacctctt ccgacaaaac gattaactct tgcaagatcg cacagtgcca cgcggcggtc 540

acgaaccacg ataaatggca gtacaccagc tccttcgtgc cgcgcgcgga ccagctgtcc 600

cgtaaaggca aggttcatgt tccgttccca ctgactaaca gcacctgccg tgtaccggtt 660

gctcgtgcgc cgggtgttac ttacggcaag cgtgaactga cggttaaact gcacccggac 720

cacccgacgc tgctgacgta ccgttctctg ggtgccgacc ctcgtccgta tgaagaatgg 780

attgatcgtt acgtggaacg taccatccct gttaccgaag atggtatcga atatcgctgg 840

ggcaacaacc cgcctgtacg tctgtgggca cagctg 876

<210> 2

<211> 292

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> amino acid sequence for E

<400> 2

Ala Tyr Cys Ala Asp Cys Gly Asp Gly Gln Phe Cys Tyr Ser Pro Val

1 5 10 15

Ala Ile Glu Lys Ile Arg Asp Glu Ala Ser Asp Gly Met Ile Lys Ile

20 25 30

Gln Val Ala Ala Gln Ile Gly Ile Asn Lys Gly Gly Thr His Glu His

35 40 45

Asn Lys Ile Arg Tyr Ile Ala Gly His Asp Met Lys Glu Ala Asn Arg

50 55 60

Asp Ser Leu Gln Val His Thr Ser Gly Val Cys Ala Ile Arg Gly Thr

65 70 75 80

Met Gly His Phe Ile Val Ala Tyr Cys Pro Pro Gly Asp Glu Leu Lys

85 90 95

Val Gln Phe Gln Asp Ala Glu Ser His Thr Gln Ala Cys Lys Val Gln

100 105 110

Tyr Lys His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Asp Ile Pro Asp

115 120 125

Ile Thr Leu Leu Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Ala Gly

130 135 140

Gly Lys Thr Ile Arg Tyr Asn Cys Thr Cys Gly Ser Gly Asn Val Gly

145 150 155 160

Thr Thr Ser Ser Asp Lys Thr Ile Asn Ser Cys Lys Ile Ala Gln Cys

165 170 175

His Ala Ala Val Thr Asn His Asp Lys Trp Gln Tyr Thr Ser Ser Phe

180 185 190

Val Pro Arg Ala Asp Gln Leu Ser Arg Lys Gly Lys Val His Val Pro

195 200 205

Phe Pro Leu Thr Asn Ser Thr Cys Arg Val Pro Val Ala Arg Ala Pro

210 215 220

Gly Val Thr Tyr Gly Lys Arg Glu Leu Thr Val Lys Leu His Pro Asp

225 230 235 240

His Pro Thr Leu Leu Thr Tyr Arg Ser Leu Gly Ala Asp Pro Arg Pro

245 250 255

Tyr Glu Glu Trp Ile Asp Arg Tyr Val Glu Arg Thr Ile Pro Val Thr

260 265 270

Glu Asp Gly Ile Glu Tyr Arg Trp Gly Asn Asn Pro Pro Val Arg Leu

275 280 285

Trp Ala Gln Leu

290

Claims

1.一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以E2基因作为目的基因，采用人工直接合成抗原结构域进行原核表达制备得到重组E2抗原，以E2蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。

2.根据权利要求1所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组E2抗原的制备方法具体包括如下步骤：

(3)阳性克隆质粒的酶切鉴定：挑取单菌落，使用含氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，37℃200rpm震荡10-12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用EcoR I和Xba Ⅰ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，使用EcoR I单酶切克隆菌做阴性对照，双酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，将所含阳性条带的菌液进行测序；

(4)IPTG诱导E2蛋白的表达：取测序正确的阳性菌液逐级接种到含氨苄霉素的LB肉汤培养基，37℃200rpm震荡过夜，至OD＝0.4-0.6，加入5μl 0.1mmol/L IPTG于18℃低温诱导过夜,即可诱导E2蛋白的表达。

3.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中pUC57-E2质粒酶切反应体系组成为pUC57-E2 45μl，EcoRⅠ2μl，Xba I 2μl，10×M Buffer10μl，ddH₂O 41μl；pColdⅠ(+)酶切反应体系组成为pColdⅠ(+)35μl，EcoR Ⅰ 1μl，Xba Ⅰ 1μl，10×M Buffer 8μl，ddH₂O 35μl；步骤(2)中连接反应体系为GETV-E2 4μl，pCold Ⅰ 1μl，5×Ligation Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 2μl，ddH₂O 1μl；步骤(3)中酶切反应体系组成为pCold I-E2 5μl,EcoR I 1μl，Xba I 1μl，10×M Buffer 2μl，DdH₂O 11μl。

4.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，重组E2抗原在包被之前需进行分离纯化，其具体包括如下步骤：将菌液在转速条件为5000rpm下离心5min得到细菌沉淀，使用缓冲液吹散，置于在冰上超声破碎，离心后得到包涵体沉淀，使用含有尿素的缓冲液纯化含有重组E2抗原的包涵体，使用镍离子螯合层析柱纯化得到的重组E2抗原。

5.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，使用碳酸盐缓冲液将重组E2蛋白稀释并包被，其具体包括如下步骤：向重组E2蛋白稀释中加入碳酸盐缓冲液，放入4℃冰箱过夜，弃去包被液，使用PBST洗涤3次后加入1％BSA进行封闭，封闭结束后，洗涤并加入一抗血清进行孵育，孵育结束后洗涤，向其中加入羊抗猪HRP标记二抗进行孵育，洗涤后加入TMB底物显色液37℃避光显色5-10min，加入H₂SO₄终止显色，酶标仪上测定OD_450nm值。

6.根据权利要求2所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，间接ELISA抗原包被量为6.13μg/mL，一抗稀释度为1∶100；抗原包被条件为4℃12h；封闭时间为37℃1h；一抗血清孵育条件为37℃1h；酶标二抗的最佳稀释度为1∶10000，作用条件为37℃1h。

7.权利要求1所述的猪盖他病毒间接ELISA抗体检测方法在生物体内GETV抗体早期检测中的应用。

8.一种猪盖他病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其包括：(1)重组E2蛋白；(2)碳酸盐缓冲液；(3)一抗血清；(4)羊抗猪HRP标记二抗。